TWI777102B - 金針菇萃取物的水層萃取物的製備方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種小火菇屬萃取物與其化合物用於提升ATGL基因、LIPE基因、UCP1基因、及/或UCP2基因表現量、及/或抑制脂肪累積的用途。本發明之小火菇屬萃取物能有效促進代謝脂肪的活性，並有效減少脂肪細胞中脂肪油滴的堆積，以減少脂肪的堆積，進而達到減脂的功效。其中，該小火菇屬萃取物係小火菇屬以水、醇、或醇水混合物之溶劑所萃取而得，且該小火菇屬萃取物含有次黃嘌呤、或尿嘧啶之效性成分。

Description

金針菇萃取物的水層萃取物的製備方法及其用途

本發明係關於一種小火菇屬萃取物與其化合物用於提升ATGL基因、LIPE基因、UCP1基因、及/或UCP2基因表現量、及/或抑制脂肪累積的用途；其中，該化合物係為次黃嘌呤(Hypoxanthine)及/或尿嘧啶(Uracil)。

世界衛生組織(World Health Organization,WHO)以「傳染病」形容快速蔓延的肥胖，並稱其為「全球肥胖症」(Globesity)。隨著飲食習慣改變及生活品質改善，台灣的肥胖盛行率亦逐年上升，依據衛生福利部國民健康署所公布之國民營養健康狀況變遷調查，其中成人過重或肥胖盛行率高達百分之四十三左右，而男性與女性比率分別為百分之四十九及百分之四十。也就是說，台灣人中平均每兩個男性就有一個過重或肥胖，平均女性則兩至三個就有一個過重或肥胖，且其中就有20萬人以上已達病態型肥胖的標準，而須以手術進行治療。

肥胖會引起許多相關的合併症，如糖尿病、高血脂、睡眠呼吸中止、狹心症、退化性關節炎、尿酸過高，甚至某些癌症等，進而可能造成死亡，因此病態性肥胖病患的平均壽命比起正常體重者少了許多。目前治療肥胖最有效的方法為手術治療，另外合法藥物(目前只有羅氏鮮)、運動、熱量控制、及 低卡代餐等亦被證實是有效的方式。然而，除了手術治療之外，大部份的病患使用其他方法減肥，大多在減重治療結束後便會失去戒心而復胖，如此一瘦一胖的現象(溜溜球效應)而對身體的傷害更大。

綜上所述，因應現代人因生活及飲食習慣改變所面臨的肥胖及因肥胖造成之整體健康問題，且基於現代人生活水平提高且對於保健概念提高，研發一種能有效減少身體脂肪含量，且減緩復胖的機會之有效成分組成的組合物，著實有其必要性。

緣此，本發明之一目的在提供一種小火菇屬萃取物用於製備提升酸甘油酯脂解酶基因(Adipose triglyceride lipase,ATGL)基因、脂肪酶E(lipase E,LIPE)基因、及/或體解偶聯蛋白(Uncoupling Protein,UCP)基因表現量之醫藥組合物的用途，其中該小火菇屬萃取物係以一溶劑萃取一小火菇屬真菌所獲得，該溶劑為水、醇、或醇水混合物。

本發明之另一目的在提供一種醫藥組合物用於製備抑制脂肪累積之藥物的用途，其中該醫藥組合物包含一有效劑量之一次黃嘌呤、一尿嘧啶、或其組合，以及一藥學上可接受之載體。

在本發明之一實施例中，該溶劑為水，且該溶劑與該小火菇屬真菌之液固比為1-15：1-5，該萃取步驟係在70-100℃進行0.5-2小時。

在本發明之又一實施例中，該體解偶聯蛋白基因係體解偶聯蛋白1(Uncoupling Protein 1,UCP1)基因、體解偶聯蛋白2(Uncoupling Protein 2,UCP2)基因、或其二者之組合。

在本發明之又一實施例中，該小火菇屬萃取物係促進代謝脂肪的活性；且該小火菇屬萃取物之濃度至少為0.25mg/mL。

在本發明之又一實施例中，該小火菇屬萃取物中包含次黃嘌呤(Hypoxanthine)、尿嘧啶(Uracil)、或其組合。

在本發明之又一實施例中，該醫藥組合物中該次黃嘌呤、或該尿嘧啶係純化自小火菇屬萃取物；且該小火菇屬萃取物係以一溶劑萃取一小火菇屬真菌所獲得，且該溶劑係為水。

在本發明之另一實施例中，該醫藥組合物中該次黃嘌呤、或該尿嘧啶之濃度至少為40μg/mL。

本發明之小火菇屬萃取物的水層萃取物能顯著提升ATGL基因、LIPE基因、UCP1基因、及UCP2基因的表現量，能促進代謝脂肪的活性，因此進一步由該水層萃取物中純化出具有減脂功效的效性物質；而從本發明小火菇屬萃取物之水層萃取物中，純化出之化合物次黃嘌呤(Hypoxanthine)、及尿嘧啶(Uracil)皆能夠有效減少脂肪細胞中脂肪油滴的堆積，能減少脂肪的堆積，進而達到減脂的功效；其中，次黃嘌呤為抑制脂肪堆積功效最佳的化合物；而本發明亦首次證實次黃嘌呤之嘌呤骨架類型的化合物竟具有抑制脂肪累積的功效。因此，本發明之小火菇屬萃取物之水層萃取物以及從中純化出之化合物次黃嘌呤、及尿嘧啶可用於製備抑制脂肪累積之組合物的用途，且該組合物是一醫藥品、或一食品，可藉由口服等方式給予一個體。

以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

圖1係為本發明之一實施例的小火菇屬萃取物、該小火菇屬萃取物的正丁醇層萃取物、及該小火菇屬萃取物的水層萃取物調控ATGL基因、及LIPE基因之表現量的長條圖。** p值<0.01；*** p值<0.001。

圖2係為本發明之一實施例的小火菇屬萃取物、該小火菇屬萃取物的正丁醇層萃取物、及該小火菇屬萃取物的水層萃取物調控UCP1基因、及UCP2基因之表現量的長條圖。** p值<0.01。

圖3係為本發明之一實施例的小火菇屬萃取物之水層萃取物中純化出之TCI-FV-01之氫光譜圖。

圖4係為本發明之一實施例的小火菇屬萃取物之水層萃取物中純化出之TCI-FV-03之氫光譜圖。

圖5係為本發明之一實施例的小火菇屬萃取物之水層萃取物中純化出之TCI-FV-01、及TCI-FV-03減少脂肪堆積之功效的長條圖。* p值<0.05；** p值<0.01；*** p值<0.001。

本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。

使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差(SD)表示，各組之間的差異以學生t檢驗(student's t-test)分析。

本文所指小火菇屬(Flammulina)可為金針菇(Flammulina velutipes)、芬娜冬菇(Flammulina fennae)，較佳為金針菇真菌，金針菇又稱構菌、樸菇、冬菇、樸菰、凍菌、金菇等名。其菌柄細長，似金針菜，故稱金針菇，其是一種木材腐生菌，易生長在柳、榆、白楊樹等闊葉樹的枯樹幹及樹樁上，金針菇屬於低熱量的蔬菜，並含有鐵、鈣、鎂、鉀和多種微量元素，及大量維生素，是營養價值極高的食品。

如本文中所使用的，用語「小火菇屬萃取物」意為小火菇屬真菌與溶劑以1-5：1-15(w/w)比例經一特定時間與溫度萃取而得。

如本文中所使用的，用語「小火菇屬萃取物的正丁醇層萃取物」意為將前述之小火菇屬萃取物與以1：1(v/v)等比例混合的正丁醇(n-Butanol)與水進行混合，進行液相分配萃取，並將該正丁醇層萃取液經減壓濃縮進行乾燥所得之產物。

如本文中所使用的，用語「小火菇屬萃取物的水層萃取物」意為小火菇屬與以1：1(v/v)等比例混合的正丁醇(n-Butanol)與水進行混合，進行液相分配萃取，並將該水層萃取液經減壓濃縮進行乾燥所得之產物。

依據本發明，以管柱層析法(Column chromatography)及薄層層析法(Thin layer chromatography,TLC)自本發明之小火菇屬萃取物中，所純化出之二種化合物次黃嘌呤(Hypoxanthine)、及尿嘧啶(Uracil)，將於本文分別命名為TCI-FV-01、及TCI-FV-03。

本文所述之「有效濃度」或「有效量」係表示能有效提升ATGL基因、LIPE基因、UCP1基因、及UCP2基因的表現量、及/或能有效抑制脂肪細胞中脂肪油滴的堆積所需本發明之小火菇屬萃取物、次黃嘌呤、及/或尿嘧啶的濃度。有效濃度依所作用的對象而可能不同，但可藉由例如劑量遞增試驗(Dose escalation)以實驗決定其有效濃度。

依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)或局部地(topically)投藥的劑型，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、外部製劑(external preparation)以及類似之物。

依據本發明，醫藥品可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該醫藥上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它們的組合。

依據本發明，該醫藥品可以一選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。

依據本發明，食品產品可被當作食品添加物(food additive)，藉由習知方法於原料製備時添加，或是於食品的製作過程中添加，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。

依據本發明，食品產品的種類包括但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。

本發明提供一種小火菇屬萃取物與從其水層萃取物中純化出之化合物用於製備抑制脂肪累積之組合物的用途，本發明之小火菇屬萃取物能顯著提升ATGL基因、LIPE基因、UCP1基因、及UCP2基因的表現量，能促進代謝脂肪的活性；而純化自其中的次黃嘌呤、及尿嘧啶能夠有效減少脂肪細胞中脂肪油滴的堆積，能減少脂肪的堆積，進而達到減脂的功效。

同時，本發明用於製備抑制脂肪累積之組合物，亦可包含一有效量之選自於本發明之小火菇屬萃取物、次黃嘌呤、及尿嘧啶中任一項或其任意組合物，及一醫藥上可接受之載體，且該組合物係一醫藥品、或一食品。

以下將詳細說明本發明之小火菇屬萃取物之詳細萃取方法；該小火菇屬萃取物、其正丁醇層萃取物、及其水層萃取物提升ATGL基因、LIPE基因、UCP1基因、及UCP2基因表現量之功效的測試；次黃嘌呤、及尿嘧啶自該小火菇屬萃取物中純化之詳細方法；以及該二種化合物減少脂肪細胞中脂肪堆積之功效的測試，以證實本發明之小火菇屬萃取物與純化自其中的次黃嘌呤、及尿嘧啶分別能有效提升會促進代謝脂肪的活性之ATGL基因、LIPE基因、UCP1基因、及UCP2基因的表現量，並能同時有效減少脂肪細胞中脂肪油滴的堆積，能減少脂肪的堆積，進而達到減脂的功效。

化學分析材料

正己烷(n-hexane)、乙酸乙酯(Ethyl acetate)、丙酮(Acetone)、甲醇(Methanol)、乙醇(Ethanol)、正丁醇(n-butanol)、乙腈(Acetonitrile)、氯仿-d ₁ (氘化程度為99.5%)、甲醇-d ₆ (氘化程度為99.5%)、重水(Deuterium oxide，氘化程度大於99.8%)、及二甲基亞碸-d ₆ (Dimethyl sulfoxide-d ₆ ，氘化程度>99.9%)購自台灣默克公司。

化學分析儀器

化合物的分離係利用管柱層析法(Column chromatography)及薄層層析法(Thin layer chromatography,TLC)。中壓液相層析儀(Medium pressure liquid chromatography,MPLC)系統係為CombiFlash ^® Rf⁺(Teledyne ISCO,Lincoln,NE)；管柱係選用自Sephadex LH-20(Amersham Biosciences)、Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical)、Merck Kieselgel 60(40-63μm,Art.9385)、及Merck LiChroprep^® RP-18(40-63um,Art.0250)。高效液相層析儀(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)系統裝配Hitachi L-2310系列幫浦、Hitachi L-2420 UV-VIS偵測器(偵測波長為200nm至380nm)、及D-2000 Elite資料處理軟體；管柱係選用自分析級Discovery^® HS C₁₈(250×4.6mm,5μm；SUPELCO)與Mightysil RP-18 GP 250(250×4.6mm,5μm；Kanto Chemical)，以及半製備級Discovery^® HS C₁₈(250×10.0mm,5μm；SUPELCO)與製備級Discovery^® HS C₁₈(250×21.0mm,5μm；SUPELCO)。層析系統配備紫外燈UVP UVGL-25(波長為254nm及365nm)。薄層層析片係塗覆矽膠60 F₂₅₄(0.25mm；Merck)或RP-18 F_254S(0.25mm；Merck)之鋁片。

化合物的化學結構係以質譜法(Mass spectrometry,MS)及核磁共振光譜法(Nuclear magnetic resonance spectrometry,NMR)進行分析。具體而言，使用二維離子阱串聯傅立葉轉換質譜(Bruker amaZon SL system)及電噴灑離子化串聯質譜(ESI-MS/MS,Thermo Scientific Orbitrap Elite system)進行測定，單位為m/z；並使用400MHz Varian 400 FT-NMR取得一維與二維NMR光譜，以δ表示化學位移(Chemical shift)，其中單位為ppm；以四甲基矽烷(Tetramethylsilane,TMS)作為內部標準品(δ=0)；偶合常數(J)以Hz為單位，並以s表單峰(Singlet)，d表二重峰(Doublet)，t表三重峰(Triplet)，q表四重峰(Quartet)，p表五重峰，m表多重峰(Multiplet)，brs則表寬峰。

依據本發明，有關混合物之化學分離及化學結構分析的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

實施例1 本發明之小火菇屬萃取物的製備方法

在本發明一實施例中，將小火菇屬真菌以低於60℃之溫度進行烘乾後磨成粉末，在本發明一較佳實施例中，該小火菇屬真菌係為金針菇。再將該小火菇屬真菌粉末與水、醇、或醇水混合物之萃取溶劑以1-5：1-15之液固比混合，萃取溶劑較佳為水，均質後在溶劑中以70-100℃進行萃取0.5-2小時後，再以400mesh之濾網過濾獲得一濾液。最後，將該濾液於45-70℃進行減壓濃縮，得到本發明之小火菇屬萃取物。

實施例2 分離本發明之小火菇屬萃取物中提升脂肪代謝之基因表現量的效性物質

本發明實施例為分離本發明之小火菇屬萃取物中提升脂肪代謝之基因表現量的效性物質，先將10公升的本發明小火菇屬萃取物，與以1：1(v/v)等比例混合的正丁醇(n-Butanol)與水進行混合，並分成3次進行液相分配萃取，接著將該3次之正丁醇層萃取液合併後經減壓濃縮進行乾燥，並得到正丁醇層萃取物共6.4g；其餘水層萃取液則繼續經減壓濃縮進行乾燥，並得到水層萃取物共100.0g。接著，分別將該正丁醇層萃取物、及該水層萃取物初步地進行提升脂肪代謝基因表現量之功效測試。

以下功效測試係以小鼠骨髓基質細胞(Bone marrow stromal cells)OP9細胞進行該正丁醇層萃取物、及該水層萃取物於提升脂肪代謝基因表現量之功效的測試。該小鼠骨髓基質細胞係購自美國典型培養物保藏中心(ATCC^®)，編號CRL-2749^TM。該細胞於分化前係培養於前脂肪細胞擴增培養液(Pre-adipocyte Expansion Medium)，其中包含90%之MEMAM(Minimum Essential Medium Alpha Medium，購自Gibco，美國，12100-046)細胞培養液、20%之胎牛血清(Fetal Bovine Serum，購自Gibco，美國)，且加入0.1%之青黴素/鏈黴素(Penicillin-streptomycin，購自Gibco，美國)；並使用分化培養液(Differentiation Medium)使小鼠骨髓基質細胞進行分化，其中包含90%之MEMAM細胞培養液、20%之胎牛血清，且加入0.1%之青黴素/鏈黴素。

首先，將小鼠骨髓基質細胞分化成脂肪細胞，將1.5x10⁵個小鼠骨髓基質細胞培養於含有2mL上述前脂肪細胞擴增培養液之6孔培養盤中，於37℃下培養7天，且期間每3天更換一次新鮮之上述分化培養液，7天後以顯微鏡觀察脂滴的形成，確保細胞已完全分化，接著將細胞分成以下四組：(1)僅加入細胞培養液的控制組、(2)加入0.25mg/mL本發明之小火菇屬萃取物之原液的比較組、(3)加入7.7μg/mL本發明之小火菇屬萃取物之正丁醇層萃取物的實驗組、及(4)加入242.2μg/mL本發明之小火菇屬萃取物之水層萃取物的實驗組，並將該些組別之細胞分別於37℃下作用6小時後，測試各組OP9細胞中目標基因的表現量；首先，將該些OP9細胞以細胞裂解液(RB buffer，購自Geanaid公司，臺灣，Cat No.RBD300)回收細胞後，使用RNA萃取試劑套組(購自Geneaid公司，臺灣，Cat No.RBD300)分別收集該四組細胞內之RNA，接著利用SuperScript^® III反轉錄酶(購自Invitrogene公司，美國，編號18080-051)以2000ng之萃取RNA為模板，並以表1之組合引子及反轉錄酶進行反轉錄作用，以產生該些基因之mRNA所相應之cDNA產物，接著利用ABI StepOnePlus^TM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美國)，以及KAPA SYBR FAST(購自Sigma公司，美國，編號38220000000)將該六組反轉錄後產物分別以表一之組合引子進行定量即時聚合酶連鎖反應(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)試驗，條件為95℃反應1分鐘預熱後，再進行以下95℃反應15秒、58℃反應15秒、72℃反應30秒之總共40個循環的程序。用以定量ATGL基因、LIPE基因、PLIN1基因、PPARG基因、C/EBPA基因、GLUT4基因、UCP1基因、及UCP2基因之mRNA的表現量，其中定量數值係取由閾值循環數(Ct)，而目標基因的mRNA相對量係推導自方程式2^-△△Ct，其中△C_T=C_{T比較組或實驗組目標基因/控制組目標基因}-C_{T ACTB}(β-肌動蛋白，beta-actin)；△△C_T=C_{T比較組或實驗組目標基因}-C_{T控制組目標基因}； 各組中各基因的fold change則為2^-△△Ct。接著，再利用Excel軟體決定變異係數與是否在統計上具有顯著差異(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。

ATGL(Adipose triglyceride lipase)基因所編碼的蛋白質為三酸甘油脂水解酶(Adipose triglyceride lipase,ATGL)。三酸甘油酯為脂肪細胞之脂滴或脂肪體中的主要構造成分，亦為脂肪細胞中儲存能量的主要來源，而三酸甘油脂水解酶主要作用即為分解三酸甘油酯，三酸甘油酯水解酶存在於脂滴表面，被激活後三酸甘油脂水解酶會分解甘油三酯，為個體提供能量。因此，ATGL基因表現量上升，會促進脂肪細胞中脂肪的分解，並使其中脂肪累積量降低。

LIPE(lipase E)基因所編碼的蛋白質為脂肪酶，其具有長形(Long form)與短形(Short form)。長形主要表達在類固醇生成組織(例如睾丸中)，其主要功能為將膽固醇酯(Cholesteryl esters)轉化為游離的膽固醇，以利後續產生類固醇類激素。短形則主要表達在脂肪組織中，其主要功能為將存儲的三酸甘油酯水解成游離的脂肪酸。因此，LIPE基因表達量上升，會促進脂肪細胞中脂肪的分解，並使其中脂肪累積量降低。

UCP1(Uncoupling Protein 1)基因及UCP2(Uncoupling Protein 2)基因所編碼的蛋白質為體解偶聯蛋白(UCP)，其為線粒體陰離子載體蛋白(Mitochondrial anion carrier proteins,MACP)家族的成員之一，主要功能為將三磷酸腺核苷(Adenosine triphosphate,ATP)還原，並促進陰離子從線粒體的內膜向外轉移，及促進質子從外部到線粒體內膜的返迴轉移，並將過程中產生的能量以熱能釋放出來；其中，UCP1基因僅在棕色脂肪細胞中表達，棕色脂肪細胞該細胞含有大量的粒線體，能夠燃燒脂肪油滴以產生熱能；而UCP2基因則在許多組織中表達，且以骨骼肌表達量最高，被認為與非顫抖性生熱(Nonshivering thermogenesis)有關。因此，UCP1基因及UCP2基因的表現量上升，能夠促進脂肪的分解，並使脂肪的累積量降低。

本發明小火菇屬萃取物之正丁醇層萃取物、及水層萃取物提升ATGL基因、LIPE基因、UCP1基因、及UCP2基因之表現量的實驗結果如圖1及圖2所示。OP9細胞經本發明之小火菇屬萃取物作用後，相較於控制組，會顯著提升UCP1基因的表現量，然會卻反而會降低ATGL基因、LIPE基因、及UCP2基因的表現量，而PLIN1基因、PPARG基因、C/EBPA基因、及GLUT4基因的表現量均與控制組差異不大；經本發明小火菇屬萃取物之正丁醇層萃取物作用後，相較於控制組，反而會降低ATGL基因、LIPE基因、UCP1基因、及UCP2基因的表現量，而PLIN1基因、PPARG基因、C/EBPA基因、及GLUT4基因的表現量均與控制組差異不大；經本發明小火菇屬萃取物之水層萃取物作用後，相 較於控制組，皆能顯著提升ATGL基因、LIPE基因、UCP1基因、及UCP2基因的表現量，而PLIN1基因、PPARG基因、C/EBPA基因、及GLUT4基因的表現量均與控制組差異不大。該結果顯示本發明之小火菇屬萃取物的水層萃取物能藉由顯著提升ATGL基因、LIPE基因、UCP1基因、及UCP2基因四種與脂肪代謝相關基因的表現量，以促進代謝脂肪的活性，且並非任意與脂肪代謝相關的基因，皆能夠受到本發明之小火菇屬萃取物的水層萃取物調控。並且經由此結果可推測該水層萃取物中含有效性物質的機率較高，因此後續將以依據生物活性導引分離方法(Bioassay guided fractionation)追蹤其中的效性物質，並進行該些效性化合物的結構分析。PLIN1基因、PPARG基因、C/EBPA基因、GLUT4基因

首先，將水層萃取物共100.0g以Diaion HP-20(購自Mitsubishi Chemical，日本)為層析材料，以水與甲醇為混合溶劑並漸減極性，經管柱層析後共分離得到5個劃分層(F1-F5)，依據生物活性導引分離方法(Bioassay guided fractionation)追蹤其中的效性物質。再將第三個劃分層(F3)以矽膠管柱層析，其中沖提液為以14：1(v/v)比例混合之二氯甲烷與甲醇，並漸增極性沖提以進行純化，經管柱層析後再經薄層層析片(TLC)點片合併，總共得到3個次劃分層(F3-1-F3-3)。

接著，將第四個劃分層(F4)以矽膠管柱層析進行純化分離，其中沖提液為以5：1(v/v)比例混合之二氯甲烷與甲醇，總共得到6個次劃分層(F4-1-F4-6)。再將次劃分層F4-2以中壓液相層析儀(Medium pressure liquid chromatography,MPLC)進行純化，其中係使用以1：4比例混合之甲醇與水的混合溶液作為沖提相，共得到七個劃分層(F4-2-1-F4-2-7)，其中再將劃分層F4-2-1以再結晶方式分離得到共6mg之化合物TCI-FV-03(結構式請參照表二)；而劃分層F4-2-2則以HPLC進行純化分離，並以95：5比例混合之水與甲醇作為移動相，分離得到共10.0mg之化合物TCI-FV-01(結構式請參照表二)。

接著，將化合物TCI-FV-01及TCI-FV-03總共二個化合物皆經由核磁共振光譜儀(NMR)與質譜儀(MS)等分析後，再經由過去文獻比對其光譜資料，確定其化學結構，其名稱及結構式如表二所示，光譜資料則如圖3及圖4所示。其中該些化合物之化學名稱，分別為化合物TCI-FV-01係為次黃嘌呤(Hypoxanthine)；化合物TCI-FV-03則係為尿嘧啶(Uracil)。

實施例3 本發明小火菇屬萃取物中之化合物減少脂肪堆積之功效

本發明實施例以小鼠骨髓基質細胞OP9細胞進行從本發明之小火菇屬萃取物中分離出之化合物TCI-FV-01、及TCI-FV-03於減少脂肪堆積之功效的測試；其中，細胞中的脂質係以油紅O染色試劑(購自Sigma，美國)進行檢測，該染劑係以100%之異丙醇配置成3mg/mL的油紅O儲備溶液，並將該儲備溶液以ddH₂O配置成60%的作用溶液。

為測試本發明之小火菇屬萃取物中分離出之化合物TCI-FV-01、及TCI-FV-03於減少脂肪堆積之功效的再驗證，以抑制油滴累積活性平台進行測試，首先將小鼠骨髓基質細胞分化成脂肪細胞，將8x10⁴個小鼠骨髓基質細胞培養於含有500μL上述前脂肪細胞擴增培養液之24孔培養盤中，於37℃下培養7 天，且期間每3天更換一次新鮮之上述分化培養液，7天後以顯微鏡觀察脂滴的形成，確保細胞已完全分化，接著將細胞分成以下三組：(1)僅含細胞培養液之控制組、(2)加入40μg/mL化合物TCI-FV-01之實驗組、及(3)加入40μg/mL化合物TCI-FV-03之實驗組，並將各組分別於37℃培養7-10天，且同樣每3天更換一次新鮮之分化培養液。

接著，使用油紅O將細胞內的脂質染色，以評估本發明小火菇屬萃取物中化合物TCI-FV-01、及TCI-FV-03是否確實能減少脂肪堆積。首先，將培養基輕輕地取出，並在不影響貼附於培養基底部之細胞的情況下移除細胞培養液，並以1mL之磷酸鹽緩衝溶液(Phosphate buffered saline,PBS)清洗細胞兩次，再加入1mL之10%甲醛(購自Echo chemical，台灣，Cat.TG1794-4-0000-72NI)並於室溫下反應30分鐘以固定細胞，接著移除甲醛後以1mL之PBS輕輕地清洗細胞兩次，接著於每孔細胞內加入1mL之60%異丙醇(購自Echo chemical，台灣，PH-3101)反應1分鐘後，移除異丙醇並加入1mL之油紅O作用溶液，於室溫下反應1小時，接著移除油紅O溶液並迅速地以1mL之60%異丙醇進行脫色5秒鐘，再使用顯微鏡拍照並進行量化。接著，加入100%異丙醇於染色之細胞中，並置於振盪器上反應10分鐘以溶解油滴，接著取100μL溶液至96孔培養盤中，使用測量ELISA讀數器(BioTek)讀取各組之OD_510nm讀值，以量化各組細胞中油紅O的量。再利用Excel軟體進行Student t-test以決定各組樣本群體之間是否在統計上具有顯著差異(* p值<0.05；** p值<0.01；*** p值<0.001)。

本發明之小火菇屬萃取物之水層萃取物中分離出之化合物TCI-FV-01、及TCI-FV-03於減少脂肪堆積之功效再驗證的測試結果如表三及圖5所示，其中以控制組為100%。脂肪細胞經本發明之小火菇屬萃取物中分離出之化合物TCI-FV-01、及TCI-FV-03作用後，相較於控制組，能分別顯著降低其中油滴含量達53.8%、及60.1%；其中TCI-FV-01能降低46.2%之油滴累積，為功 效最佳之化合物；且TCI-FV-01為嘌呤骨架類型之化合物，本發明亦首次證實該種類物質具有優異的抑制脂肪細胞中油滴累積的功效。由該些結果顯示本發明之小火菇屬萃取物中純化出之化合物TCI-FV-01、及TTCI-FV-03能顯著降低脂肪細胞中脂肪的累積，未來可應用於減脂亦或代謝症候群相關疾病應用之組合物。

綜上所述，本發明之小火菇屬萃取物的水層萃取物能顯著提升ATGL基因、LIPE基因、UCP1基因、及UCP2基因的表現量，能促進代謝脂肪的活性，因此進一步由該水層萃取物中純化出具有減脂功效的效性物質；而從本發明小火菇屬萃取物之水層萃取物中，純化出之化合物次黃嘌呤(Hypoxanthine)、及尿嘧啶(Uracil)皆能夠有效減少脂肪細胞中脂肪油滴的堆積，能減少脂肪的堆積，進而達到減脂的功效；其中，次黃嘌呤為抑制脂肪堆積功效最佳的化合物；而本發明亦首次證實次黃嘌呤之嘌呤骨架類型的化合物竟具有抑制脂肪累積的功效。因此，本發明之小火菇屬萃取物之水層萃取物以及從中純化出之化合物次黃嘌呤、及尿嘧啶可用於製備抑制脂肪累積之組合物的用途，且該組合物是一醫藥品、或一食品，可藉由口服等方式給予一個體。

<110> 大江生醫股份有限公司

<120> 金針菇萃取物的水層萃取物的製備方法及其用途

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Claims (7)

1. 一種金針菇萃取物的水層萃取物的製備方法，包括：低溫烘乾金針菇並磨成一金針菇粉末；以一溶劑與該金針菇粉末混合並於70-100℃下進行萃取0.5-2小時後經由過濾及減壓濃縮而獲得一金針菇萃取物，其中該溶劑為水；以及將該金針菇萃取物、正丁醇與水進行混合並進行液相分配萃取而得到該金針菇萃取物的一水層萃取物，其中該正丁醇與該水的比例為1：1(v/v)，且該金針菇萃取物的該水層萃取物包含次黃嘌呤(Hypoxanthine)及尿嘧啶(Uracil)。
2. 如請求項1所述之製備方法，其中該金針菇萃取物的該水層萃取物具有提升三酸甘油酯脂解酶(Adipose triglyceride lipase,ATGL)基因、脂肪酶E(lipase E,LIPE)基因、及/或體解偶聯蛋白(Uncoupling Protein,UCP)基因表現量的能力，且該體解偶聯蛋白基因係體解偶聯蛋白1(Uncoupling Protein 1,UCP1)基因、體解偶聯蛋白2(Uncoupling Protein 2,UCP2)基因、或其二者之組合。
3. 如請求項1所述之製備方法，其中該金針菇萃取物的該水層萃取物具有抑制脂肪累積的能力。
4. 如請求項1所述之製備方法，其中該金針菇萃取物的該水層萃取物係促進代謝脂肪的活性。
5. 如請求項1所述之製備方法，其中該水與該金針菇萃取物之液固比為1-15：1-5。
6. 如請求項1所述之製備方法，其中該金針菇萃取物的該水層萃取物之濃度至少為242.2μg/mL。
7. 一種金針菇萃取物的水層萃取物用於製備抑制脂肪累積之醫藥品的用途，其中該金針菇萃取物的該水層萃取物包含一有效劑量之一次黃 嘌呤及一尿嘧啶的組合，以及一藥學上可接受之載體，其中該金針菇萃取物的該水層萃取物是以請求項1之製備方法所製成。

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