KR101935371B1

KR101935371B1 - 말톨, 이소소이아말로사이드 i 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101935371B1
Application number: KR1020180056547A
Authority: KR
Inventors: 양민혜; 최상호; 이상우; 백진협; 김수용; 금항; 리만의; 김기현
Original assignee: 부산대학교 산학협력단; 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2018-05-17
Filing date: 2018-05-17
Publication date: 2019-01-07

Abstract

본 발명은 말톨, 이소소이아말로사이드 I 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 아토피성 피부염 실험동물의 홍반, 출혈, 건조, 흉터, 태선화 및 짓무름 등의 아토피성 피부염 증상을 완화시키는 것으로 확인됨에 따라, 상기 말톨 또는 말톨 유도체 화합물을 아토피성 피부염 개선 또는 치료용 화장품, 약학조성물 및 건강식품으로 제공하고자 한다.

Description

말톨, 이소소이아말로사이드 I 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising maltol, isosoyamaloside I or mixture thereof}

본 발명은 말톨, 이소소이아말로사이드 I 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

아토피 피부염(atopic dermatitis)은 천식과 알레르기성 질환의 발달 전에 발생하는 만성적인 염증질환으로, 케모카인의 농도, 양적변화나 활성 정도에 따라 그 증상에 차이가 있으며, Th2 타입의 림프구가 병변부(lesional skin)로 침입하는 현상을 말하기도 한다. 아토피 피부염은 면역학적 요인에 의해 각질형성세포의 증식이 비정상적으로 일어나는 현상이라고 할 수 있는데, 각질형성세포를 IFN-γ(interferon-γ)나 TNF-α(tumor necrosis factor-α)에 노출시키면 TARC, MDC, CTACK 등의 케모카인이 비정상적으로 발현하는 것을 확인할 수 있다. 이러한 현상은 염증반응이 일어나면서 단핵구/T 세포(monocytes/T cells)가 피부로 침투되는 현상이 증가되기 때문이다.

아토피 피부염의 치료는 그 근원을 찾아 치료하는 것이 쉽지 않기 때문에, 완치를 목표로 하기보다는 유발인자를 피하고 적절한 치료를 통해 아토피 피부염의 증상을 조절해 나가는 것이 일반적이다. 아토피 피부염에 대한 처방은 스테로이드제, 항히스타민제, 항생제 등과 같은 약물요법이 주로 이루어지고 있는데, 스테로이드제(부신피질호르몬제)는 크게 소염작용과 면역억제 작용이 있으며 효과가 우수하지만, 장기간 바르면 피부약화, 전신호르몬증상, 중독성 등의 부작용이 나타날 수 있다. 항히스타민제는 비만세포에서 히스타민이 유리되지 못하도록 하여 가려운 증상을 경감시키나 임시방편으로 사용하는 것으로 장기간 복용시 불면, 불안, 식욕 감퇴 등의 부작용이 있을 수 있다. 따라서 아토피 피부염에 효과가 있으면서도 부작용이 없는 새로운 개념의 아토피 피부염치료 조성물 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2015-0025286호 (2015.03.10. 공개)

상기 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 천연물인 피뿌리풀 추출물로부터 분리된 말톨 또는 이소소이아말로사이드 I를 유효성분으로 함유하는 조성물을 아토피성 피부염 치료용 조성물로 제공하고자 한다.

본 발명은 말톨, 이소소이아말로사이드 I (isosoyamaloside I) 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명은 말톨, 이소소이아말로사이드 I (isosoyamaloside I) 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 말톨, 이소소이아말로사이드 I (isosoyamaloside I) 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.

본 발명은 피뿌리풀 추출물로부터 분리된 화합물인 말톨 또는 말톨 유도체인 이소소이아말로사이드 I을 유효성분으로 함유하는 조성물이 아토피성 피부염 실험동물의 홍반, 출혈, 건조, 흉터, 태선화 및 짓무름 등의 아토피성 피부염 증상을 완화시키는 것을 확인함에 따라, 상기 말톨 또는 말톨 유도체 화합물을 아토피성 피부염 개선 또는 치료용 화장품, 약학조성물 및 건강식품으로 제공하고자 한다.

도 1은 피뿌리풀 지상부로부터 분리된 말톨(1), 소이아말로사이드 I(soyamaloside I, 2) 및 이소소이아말로사이드 I (isosoyamaloside I, 3)의 구조이다.
도 2는 DNCB 유도성 아토피 동물 모델을 이용한 동물실험 과정을 설명하는 모식도이다.
도 3은 RBL-2H3 세포에서 PI로 유도된 염증성 IL-4 발현 및 β-헥소사미니다제(Hexosaminidase) 방출 억제 효과를 확인한 결과로, Comp. 1은 말톨, Comp. 2는 소이아말로사이드 I, Comp. 3은 이소소이아말로사이드 I 이다.
도 4는 DNCB 유도성 아토피 피부염 마우스에서 말톨의 아토피 피부염 저해 활성 확인한 결과로, CON은 대조군, DNCB는 0.1% DNCB 적용군, DNCB/maltol은 0.1% DNCB 적용 및 0.5% 말톨 적용군이다.
도 5는 DNCB 유도성 아토피 피부염 마우스에서 말톨의 피부장벽기능 개선활성을 확인한 결과로, CON은 대조군, DNCB은 0.1% DNCB 적용군, DNCB/maltol은 0.1% DNCB 적용 및 0.5% 말톨 적용군이다.
도 6은 헤마톡실린&에오신(A) 및 톨루이딘 블루(B)로 염색한 마우스 등 조직 병변의 조직병리학적 특성을 확인한 결과로, CON은 대조군, DNCB은 0.1% DNCB 적용군, DNCB/maltol은 0.1% DNCB 적용 및 0.5% 말톨 적용군이다.
도 7은 DNCB 유도성 아토피 피부염 마우스에서 말톨의 혈장 내 IgE/IL-4 저해 활성 확인한 결과로, CON은 대조군, DNCB은 0.1% DNCB 적용군, DNCB/maltol은 0.1% DNCB 적용 및 0.5% 말톨 적용군이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 말톨(maltol), 이소소이아말로사이드 I (isosoyamaloside I) 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.

상기 말톨 및 이소소이아말로사이드 I은 피뿌리풀(Stellera chamaejasme L.) 추출물로부터 분리된 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 피뿌리풀 추출물은 에틸 아세테이트(Ethyl acetate) 분획물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 이소소이아말로사이드 I은 하기 화학식 1로 표시될 수 있으며, 구체적인 화합물 명칭은 말톨 3-0-(4’-O-시스-p-쿠마로일)-β-D-글루코피라노사이드 [maltol 3-O-(4’-O-cis-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside]일 수 있다.

[화학식 1]

또한, 상기 말톨의 구체적인 화합물 명칭은 3-하이드록시-2-메틸-4-피론 (3-hydroxy-2-methyl-4-pyrone) 일 수 있다.

상기 말톨, 이소소이아말로사이드 I 또는 이들의 혼합물은 염증성 사이토카인의 발현 및 비만세포 또는 호염구의 탈과립을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 활성화된 비만 세포에서 분비되는 Th2 사이토카인인 IL-4 등은 전염증성 신호분자(pro-inflammatory signal molecule) 발현을 촉진시켜 알러지 반응을 일으킨다고 보고되어진 바, 본 발명의 피뿌리풀로부터 분리된 말톨, 소이아말로사이드 I 및 이소소이아말로사이드 I가 RBL-2H3 세포에서 PI로 유도된 IL-4의 발현에 미치는 영향을 확인하였다.

그 결과, 도 3A와 같이 PI 유도에 의해 활성화된 세포에서 IL-4가 3배 가까이 증가하는 것을 확인하였으며, 말톨을 10 μM 및 30 μM로 처리하였을 때 이러한 IL-4 mRNA 발현 증가가 각각 58% 및 67% 억제되었다. 또한, 신규화합물인 이소소이아말로사이드 I은 30 μM 농도에서 40%의 IL-4 억제활성이 나타나는 것이 확인되었다.

또한, 비만세포나 호염구의 과립 안에 존재하며 천식 및 비염과 같은 알러지 반응에 의해 세포 밖으로 분비되어 탈과립의 지표로 이용되고 있는 β-헥소사미니다제(Hexosaminidase)를 확인하기 위해, RBL-2H3 세포를 IgE로 감작시킨 후, DNP-BSA로 활성화시키고 말톨, 소이아말로사이드 I 및 이소소이아말로사이드 I의 β-헥소사미니다제 방출 수준을 확인하여 탈과립 억제 여부를 평가한 결과, 도 3B와 같이 IgE와 DNP-BSA에 의해 RBL-2H3 세포는 무처리군에 비해 약 3배 정도 탈과립이 증가하였으며, 말톨과 이소소이아말로사이드 I의 탈과립 억제능이 우수한 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 말톨, 이소소이아말로사이드 I 또는 이들의 혼합물은 우수한 아토피성 피부염 치료효과를 나타내는 것이 확인되었다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 말톨, 이소소이아말로사이드 I (isosoyamaloside I) 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 말톨, 이소소이아말로사이드 I (isosoyamaloside I) 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 말톨, 이소소이아말로사이드 I (isosoyamaloside I) 또는 이들의 혼합물의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 말톨, 이소소이아말로사이드 I (isosoyamaloside I) 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 유효성분인 말톨, 이소소이아말로사이드 I (isosoyamaloside I) 또는 이들의 혼합물 외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 썬 크림, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜,실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해 화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 말톨, 이소소이아말로사이드 I (isosoyamaloside I) 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 예방 또는 개선용 건강식품을 제공할 수 있다.

상기 건강식품은 상기 말톨, 이소소이아말로사이드 I (isosoyamaloside I) 또는 이들의 혼합물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강식품에 함유된 화합물의 유효용량은 상기 치료제의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제등을 들 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

< 실험예 1> 피뿌리풀 지상부로부터 말톨 및 말톨 유도체 분리

건조된 피뿌리풀 (Stellera chamaejasme L.)의 지상부 6.11 kg에 95% 에탄올(EtOH; 72 L)을 가하여 3시간 동안 3회 초음파 추출하였다. 상층액을 여과지로 여과한 후 40℃ 이하에서 감압 농축하여 569.8 g의 추출물을 수득하였다(수율: 9.3%). 수득한 피뿌리풀 지상부의 95% EtOH 추출물을 증류수 5 L에 현탁한 후, n-hexane (12 L), ethyl acetate (12 L), 및 n-butanol (6 L)로 순차적으로 분획하여 ethyl acetate 분획물 (20.8 g) 및 n-butanol (34.4 g) 을 수득하였다.

에틸 아세테이트(Ethyl acetate) 분획물에 대하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (CH2Cl2-MeOH 20:1 → MeOH 100%, gradient system)를 수행하여 13개의 소분획 (SCE1~SCE13)으로 나누었다. 소분획 SCE3 (868.4 mg)을 메탄올(MeOH)에 현탁한 후 여과지로 여과하여 화합물 1 말톨 (maltol, 3-hydroxy-2-methyl-4-pyrone, 81.5 mg)을 분리하였다.

또한, 소분획 SCE7 (229.1 mg)을 MeOH에 현탁한 후 여과지로 여과하여 결정 화합물 2 소이아말로사이드 I (soyamaloside I, 82.3 mg)을 분리하였으며, 여액에 대하여 Sephadex LH-20 (MeOH) 컬럼크로마토그래피를 수행하여 화합물 3 (isosoyamaloside I, 33.4 mg)을 분리하였다. 화합물 3 이소소이아말로사이드 I (isosoyamaloside I, maltol 3-O-(4’-O-cis-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside)는 천연에서 처음으로 분리·보고되는 신규화합물이다.

< 실험예 2> 세포배양 및 IL-4 mRNA 발현 억제능 확인

호염기구성 백혈병 세포(Rat basophilic leukemia cell)인 RBL-2H3 세포를 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank; Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였으며, 10% 태아소혈청(FBS; HyClone Laboratories, Logan, UT, USA)와 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin; PS; Hyclone)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle Medium; Hyclone)배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 조건하에 배양하였다. 6-웰 플레이트에 RBL-2H3 세포 3×10⁵ cells/well의 밀도로 분주한 뒤 배양기에서 16시간 배양한 후, 피뿌리풀로부터 분리한 성분 (maltol, soyamaloside I, isosoyamaloside I (10 μM))을 30분 동안 반응시켰다.

이후 최종농도 50 ng/ml의 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)와 1 μM Ionomycin(PI)을 가하여 9시간 반응시키고, PBS로 세척한 후 easy-BlueTM total RNA extraction Kit(iNTRON Biotechnology, Seoul, Korea)을 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 Agilent 2100 BioAnalyzer(Agilent Technologies, SantaClara, CA, USA)를 사용하여 무결성(integrity)을 확인하였다.

cDNA는 ImProm-II Reverse Transcription System(Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 합성하였으며, PCR은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. PCR 산물은 1.2% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기 영동한 후 유전자 발현 정도를 알아보았으며, 밴드의 강도는 SigmaGel(Jandel Scientific, san Fafael, CA, USA) 소프트웨어에 의해 분석 정량하였다.

사용된 프라이머(Primer)의 염기서열은 하기와 같다: IL-4 forward: 5’-ACC TTG CTG TCA CCC TGT TC-3’; IL-4 reverse: 5’-TTG TGA GCG TGG ACTCAT TC-3’; β-actin forward: 5’-TCA TCA CCA TCG GCA ACG-3’, β-actin reverse:5’-TTC CT GAT GTC CAC GTC GC-3’

< 실험예 3> 세포에서 β- 헥소사미니다제 (β- hexosaminidase ) 방출 억제능 확인

RBL-2H3 세포로부터 탈과립화 측정을 위해, 탈과립의 바이오마커인 β-헥소사미니다제(β-hexosaminidase) 분비 저해 활성을 확인하였다. 0.5 μg/ml 농도의 dinitropheny-immunoglobulin E(DNP-IgE)를 함유한 DMEM 배지를 사용하여, 24-웰 플레이트에 RBL-2H3 세포를 2×10⁵ cells/well의 밀도로 분주한 뒤, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 12시간 배양하였다.

각 세포들을 Siraganian buffer (119 mM NaCl, 5 mM KCl, 5.6 mM 글루코오스(glucose), 0.4 mM MgCl₂, 25 mM PIPES, 1 mM CaCl₂, 0.1% BSA, pH 7.2)로 2회 세척 한 다음, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 동일 버퍼로 10분간 전 배양한 후 피뿌리풀로부터 분리한 성분 말톨(maltol), 소이아말로사이드 I (soyamaloside I), 이소소이아말로사이드 I (isosoyamaloside I)을 10 μM로 희석시켜 세포에 처리하고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 30분 동안 반응시켰다.

이후 DNP-소혈청알부민 (DNP-BSA)을 최종 농도 100 μg/ml이 되도록 가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 2시간 반응시키고, ice bath에서 10분간 배양하여 반응을 종결시켰다. 상층액 40 μl를 96-웰 플레이트에 옮기고 기질 버퍼(2 mM 4-p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide, 0.05 M Sodium citrate, pH 4.5) 40 μl를 가하고 37℃에서 1시간 동안 배양시킨 다음 각 웰 당 정지 용액(stop solution; 0.1 M Na2CO3/NaHCO3, pH 10.5) 200 μl를 첨가하여 반응을 종결시키고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

< 실험예 4> 실험동물 준비

6주령 암컷 SKH-1 hairless mice를 오리엔트바이오(Orient Bio Inc.,Seongnam, Republic of Korea)로부터 분양받아 대조군 (CON), 0.1% 2,4-디니트로클로로벤젠 (2,4-dinitrochlorobenzene) 적용군 (DNCB), 0.1% DNCB 및 0.5% 말톨 적용군 (DNCB-maltol)으로 나누어 1주일간 환경 및 먹이 적응 기간을 거친 후 사용하였다.

물과 식이는 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 실험의 모든 과정은 KIST 동물실험윤리위원회의 허가(승인번호: KIST-2016-011)를 얻은 후 가이드라인에 의거하여 진행하였다.

< 실험예 5> DNCB 유도성 아토피 마우스 모델을 이용한 아토피성 피부염 개선효과 확인

피뿌리풀로부터 분리한 말톨의 아토피 염증 완화 효과를 in vivo에서 확인하기 위해 2,4-디니트로클로로벤젠 (DNCB)을 처리한 아토피 모델 마우스를 이용하여 도 2와 같은 과정으로 아토피성 피부염 개선효과를 확인하였다.

먼저, SKH-1 hairless mouse의 등에 용매(propylene glycol:EtOH=7:3)에 1% 농도로 녹인 DNCB를 매일 1회 1주일간 도포하고, 1주일 후부터 0.1%의 DNCB를 3일 간격으로 2주간 도포하여 아토피성 유사 피부염을 유발시켰다.

말톨의 아토피 피부염 개선효과를 측정하기 위해 0.5% 농도의 말톨을 매일 1회 2주간 도포하였다. 대조군 (CON)에는 DNCB 대신 증류수를 도포하고, 0.1% DNCB 적용군(DNCB)에는 부형제를 대조 시료로 사용하였다. 실험 개시 3주 후에 피부염 상태를 육안적으로 관찰하여 홍반, 부종, 찰과, 각질, 태선화 및 습진 정도를 평가하였다.

< 실험예 6> 경표피수분손실량 , 보습효과 및 피부 pH 확인

피부 장벽 상태를 평가하기 위해 경표피수분손실량을 Tewameter TM 210ⓡ (Courage-Khazaha, Koln, Germany)을 사용하여 확인하였으며, 보습효과 및 피부 pH는 SKIN-O-MAT (Cosmomed, Ruhr, Germany)를 이용하여 매주 측정하였다.

< 실험예 7> 피부 조직 채취 및 병리 검사

실험 종료 후 마우스의 등 쪽 부분의 피부를 적출하여 포르말린에 고정한 후 파라핀에 넣어 5 ㎛ 두께의 연속 절편 조직을 만들었다. 조직 부분을 사용하여 염증을 일으키는 표피(epidermis), 진피(dermis), 케라틴세포(keratinocytes), 호중구/호산구(neutrophils/eosinophis) 그 외 다른 세포와 부종을 식별하기 위해 헤마톡실린&에오신(hematoxylin and eosin; H&E) 염색을 수행하였으며, 비만 세포 (mast cells)를 염색하기 위해 톨루이딘 블루(toluidine blue) 염색을 수행하여 면역세포의 침윤을 관찰하였다.

< 실험예 8> 혈청 IgE 및 IL-4의 측정을 위한 ELISA 분석

마우스의 복부 대동맥에서 혈액을 채취하여 10,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 혈청을 수집하고 -70℃의 냉동고에 보관하였다. 상용화된 ELISA set(eBioscience, San Diego, USA)를 이용하여 혈청 IgE 및 IL-4를 측정하였다.

< 실험예 9> 통계처리

각 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었으며, 평균치 간의 유의성은 one-way analysis of variance (ANOVA)를 이용한 후 p 값이 0.05 미만일 때 유의한 것으로 판정하였다.

< 실시예 1> 말톨의 유도성 IL-4 저해 효과 및 IgE / DNP -BSA 유도성 탈과립 저해 효과 확인

활성화된 비만 세포에서 분비되는 Th2 사이토카인인 IL-4 등은 전염증성 신호분자(pro-inflammatory signal molecule) 발현을 촉진시켜 알러지 반응을 일으킨다고 보고되어진 바, 본 발명의 피뿌리풀로부터 분리한 말톨(maltol) 및 말톨 유도체 (소이아말로사이드 I, 이소소이아말로사이드 I)가 RBL-2H3 세포에서 PI로 유도된 IL-4의 발현에 미치는 영향을 확인하였다.

그 결과, 도 3A와 같이 PI 유도에 의해 활성화된 세포에서 IL-4가 3배 가까이 증가하는 것을 확인하였으며, 말톨을 10 μM 및 30 μM로 처리하였을 때 이러한 IL-4 mRNA 발현 증가가 각각 58% 및 67% 억제되었다. 또한, 신규화합물인 isosoyamaloside I은 30 μM 농도에서 40%의 IL-4 억제활성이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

한편, β-헥소사미니다제(Hexosaminidase)는 비만세포나 호염구의 과립 안에 존재하며 천식 및 비염과 같은 알러지 반응에 의해 세포 밖으로 분비되어 탈과립의 지표로 이용되고, 알러지 억제물질의 생리활성 측정에 사용되고 있으므로, RBL-2H3 세포를 IgE로 감작시킨 후, DNP-BSA로 활성화시키고 말톨, 소이아말로사이드 I 및 이소소이아말로사이드 I의 β-헥소사미니다제 방출 수준을 확인하여 탈과립 억제 여부를 평가하였다.

그 결과, 도 3B와 같이 IgE와 DNP-BSA에 의해 RBL-2H3 세포는 무처리군에 비해 약 3배 정도 탈과립이 증가하였으며, 말톨 > 이소소이아말로사이드 I > 소이아말로사이드 I 순서로 탈과립 억제능이 우수한 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 2> in vivo 에서 아토피성 피부염 개선효과 확인

Hairless 마우스의 등에 1% DNCB 용액을 제모 부위에 7일간 도포하여 아토피성 피부염을 유발하였으며, 1차 도포 후 7일째부터는 3일에 1회씩 2주간 0.5% 말톨을 도포한 후 0.1% DNCB 용액을 재차 도포하여 결과를 확인하였다.

그 결과, 도 4와 같이 DNCB 아토피성피부염 유발군의 경우 홍반, 건선, 짓무름 등이 골고루 발병하면서 전형적인 아토피성 피부염 변화가 관찰되는 반면, 0.5% 말톨투여군의 경우는 이러한 아토피성 피부염의 증상을 현저히 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 경표피수분손실량에 의한 피부 장벽 개선 효과를 확인한 결과, 도 5와 같이 말톨 투여군에서 경표피수분손실량이 현저히 개선되어 건조증이 대조군 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3> 조직병리학적 분석을 통한 아토피성 피부염 개선효과 확인

SKH-1 hairless 마우스의 등 조직을 헤마톡실린-에오신으로 염색하고 현미경으로 조직의 형태를 확인하였다.

그 결과, 도 6과 같이 DNCB을 처리한 대조군의 등 두께가 정상군의 3배 이상임을 확인하였으며, 정상군에 비해 혈관이 확장되어 있고 조직의 각질층 또한 확연히 두껍게 형성된 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 피부에 아토피가 발병하였을 때 비만세포가 침윤되어 분비된 TNF-α 등이 각질 형성세포의 NF-κB를 활성화시켜 피부의 각질을 두껍게 형성하기 때문에 발생되는 현상이다.

한편, 말톨을 처리한 마우스 실험군에서는 등 두께 증가 및 침윤된 임파구 수가 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 대조군에 비해 말톨 처리군이 혈관의 두께와 내부조직에 있어 훨씬 안정된 형태를 나타내었으며, 조직학 형태에서도 이들 성분이 아토피 피부염의 조직 보호 유지에 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 4> 아토피 피부염 마우스의 혈장 내 IgE 및 사이토카인( cytokine ) 분비에 미치는 영향 확인

IgE의 과발현은 아토피 질환의 가장 대표적인 표식으로, B 세포에서 생성되는 IgE는 IL-4와 Th2 세포에 의해서 생산이 더욱 촉진되므로, 3주간의 실험 후 SKH-1 hairless 마우스의 혈장으로부터 IgE 및 IL-4의 함량을 ELISA로 확인하였다.

그 결과, 도 7과 같이 DNCB을 처치한 대조군의 혈중 총 IgE 및 IL-4의 농도는 정상군의 8.8배 및 3.1배로 DNCB에 의해 IgE 및 IL-4의 생성이 현저히 촉진되는 것을 확인할 수 있었다. 반면 말톨을 처리하였을 경우, 혈중 IgE 및 IL-4 농도가 각각 67% 및 87%까지 감소되는 것이 확인되었다.

상기 결과로부터 말톨이 알러지와 관련된 IgE 및 Th2 사이토카인인 IL-4를 억제함으로써 T 임파구의 과도한 증식을 억제하여 아토피 피부염 등의 알러지 질환에 치료 효과를 나타내는 것이 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

화학식 1로 표시되는 이소소이아말로사이드 I (isosoyamaloside I)을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물.
[화학식 1]
청구항 1에 있어서, 상기 이소소이아말로사이드 I은 피뿌리풀(Stellera chamaejasme L.) 추출물로부터 분리된 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 피뿌리풀 추출물은 에틸 아세테이트(Ethyl acetate) 분획물인 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약학조성물은 말톨을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 이소소이아말로사이드 I (isosoyamaloside I)은 염증성 사이토카인의 발현 및 비만세포 또는 호염구의 탈과립을 억제하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물.
화학식 1로 표시되는 이소소이아말로사이드 I (isosoyamaloside I)을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
[화학식 1]
화학식 1로 표시되는 이소소이아말로사이드 I (isosoyamaloside I)을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 예방 또는 개선용 건강식품.
[화학식 1]