KR101673988B1 - 피부암의 치료 또는 전이 억제용 조성물 - Google Patents

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김기모
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한국 한의학 연구원
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Abstract

본 발명은 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 조성물에 관한 것이다. 상세하게는 지모 추출물과 티모사포닌 AⅢ가 마우스(B16-F10) 및 사람(WM-115) 세포에서 흑색종 세포의 폐 전이를 억제하고, 동물모델인 마우스(B16)에서 유발된 흑색종 세포의 항전이 효과를 확인함으로써, 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 약학 조성물, 건강기능 식품 조성물 및 피부 외용제로 제공하는 것이다.

Description

피부암의 치료 또는 전이 억제용 조성물{Composition for treating or inhibiting metastasis of skin cancer}
본 발명은 피부암의 치료 또는 전이 억제용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 조성물에 관한 것이다.
피부암은 피부에서 발생 되는 모든 암을 말하며, 비교적 흔한 암이지만 생명의 위험이 적기 때문에 위암, 간암, 폐암 등과 같이 중요하게 생각하지 않고 있다. 다른 부위의 암에 비해 복잡한 검사나 고가의 의료장비 등이 필요치 않고, 쉽게 육안으로 발견할 수 있으며 간단한 조직검사를 통해 진단할 수 있다. 많은 피부암 환자들이 처음 피부에 암이 발생했을 때 단순히 피부염 또는 점이나 종기로 간과하기 때문에 병원을 늦게 방문하여 조기 발견이 어려우므로 병의 완치가 어렵게 되고 가끔 생명을 잃는 경우가 있다. 피부암 중 흔하고 많은 비중을 차지하는 피부암으로는 기저(基底)세포 암종(Basal cell carcinoma, BCC)으로 약 80%에 달하며 그밖에도, 약 16%에 달하는 편평상피(扁平上皮)세포 암종(squamous cell carcinoma, SCC), 그리고 약 4% 해당하는 흑색종(melanoma)이 있다. 기저세포암종(BCC)과 편평상피세포 암종(SCC)를 합쳐서 비흑색종성 암종(nonmelanoma skin cancer, NMSC)라 일컫는다. 흑색종은 표피 내에 있는 멜라노사이트로부터 발생하는데 대부분이 전이암이나 사망에 이르게 하는 암 종이며, 2000년에는 47,000명이 새로운 흑색종으로 판명되었으며 이 중 7,700명이 사망하였다고 보고된 바 있다(R. T. Greenlee et al. Cancer J. Clin., 50: 7-33, 2000). 자외선에 의해 발생되는 흑색종은 자외선의 만성적인 노출에 의해서라기 보다는 극심한 선탠 등의 간헐적인 노출에 의해서 발생하는 것으로 추측되고 있다(B. A. Gilchrest et al. New Engl. J Med., 340: 1341-1348, 1999). 흑색종은 다른 피부암보다 예후가 나쁘기 때문에 조기 발견이 되더라도 재발이 흔하며 생명을 단축할 수 있다. 피부병변은 황갈색이나 검은색을 띄는 반점이나 결절로 나타나며, 보통 중년 이후에 태양 노출부에 의해 잘 발생한다. 때로는 손, 발가락 특히 엄지손, 발가락의 말단에서도 생기며 손발톱에 검은 색의 세로줄이 보일 수 있는데 이때에는 흑색종을 의심하여 철저한 조사를 하여야 한다.
그러나, 아직까지는 피부암의 치료 약물들이 단지 피부암의 증상만을 완화하는 것이고, 근본적인 치료약의 개발이 이루어지지 못했을 뿐만 아니라, 많은 부작용이 알려져 있어 현재까지는 피부암의 치료, 특히 피부암의 전이를 억제하는 치료제의 개발은 전무한 실정이다.
한편, 지모(知母, Anemarrhena asphodeloides Bunge)는 외떡잎식물 백합목 지모과의 여러해살이풀로서 지모과의 뿌리줄기를 사용하며, 원산지는 중국이며 우리나라에서는 황해도 지방에 고루 분포한다. 뿌리에서 잎들이 소복히 모여 자라나고 잎의 바깥 부분부터 외생엽, 정상엽, 내생엽으로 구분되며 가운데 부분의 정상엽이 가장 크기가 크며, 잎의 모양은 장협 피침형으로써 끝부분이 상당히 뾰족하다. 또한 잎은 단단한 편이며 겉 부분이 광택이 난다. 이러한 뿌리와 줄기에는 티모사포닌(Timosaponin), 치모닌(Chimonin), 프로코카테시산 (Prococathechi acid), 판토텐산(Pantothenic acid) 등이 함유되어 있으며, 해열 작용, 강심 작용, 이뇨 작용, 양허증, 항균 작용, 거담 작용, 진정 작용, 혈당강하 작용, 항암 작용이 있으며, 해열제로 사용된다.
지모 추출물 또는 티모사포닌 AⅢ를 유효성분으로 함유하는 약제들에 관한 기술로는 한국등록특허 제0316379호에 개시된 6~24중량부의 안중산(安中散)제제; 25~100중량부의 보화환(保和丸)제제; 그리고 각각 1~6중량부의 해표소, 계내금, 오공, 건칠, 반지련, 지모 및 0.25~1중량부의 목향으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 암치료용 한방조성물이 있고, 미국공개특허 제2010-0009017호에 지모 추출물을 사용하는 항암방법에 대하여 개시되어 있으며, 한국등록특허 제0722303호에 티모사포닌 에이, 지모추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 황체형성 호르몬 분비 촉진제에 관해 개시되어 있으나, 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 조성물에 대하여 언급된 기술은 보고된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 지모 추출물 및 티모사포닌 AⅢ가 흑색종이 유도된 마우스 및 사람 세포에서 전이를 억제하는 것과 동물모델인 흑색종이 유도된 마우스에서 암세포가 폐로 이동하는 것을 억제하는 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부암의 전이 억제용 건강기능 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 피부 외용제를 제공한다.
본 발명은 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 약학 조성물, 건강기능 식품 조성물 및 피부 외용제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 피부암, 특히 흑색종 세포가 폐로 전이되는 것을 억제하는 효과가 있는 것이다.
도 1은 지모 추출물의 피부암 전이 억제효능을 나타낸 도면으로, (A)는 H&E 염색 후, 이동한 세포를 현미경으로 관찰한 사진이고, (B)는 이동한 세포의 수를 그래프로 나타낸 것이다(*는 p값이 0.05 미만으로, TPA(12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate) 처리군 대비 10㎍/㎖의 지모 추출물 처리군이 암세포의 전이를 통계적으로 유의하게 감소시킨 것을 의미하고, **는 p값이 0.01 미만으로, TPA 처리군 대비 50㎍/㎖의 지모 추출물 처리군이 암세포의 전이를 통계적으로 유의하게 감소시킨다는 것을 의미한다).
도 2는 마우스(B16-F10)와 사람(WM-115) 세포에서 티모사포닌 AⅢ의 피부암 전이 억제 효능을 나타낸 도면으로, (A)는 H&E 염색 후, 이동한 세포를 현미경 관찰한 사진이고, (B)는 이동한 세포의 수를 그래프로 나타낸 것이다(*는 p값이 0.05 미만으로, TPA(12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate) 처리군 대비 50㎍/㎖의 티모사포닌 AⅢ 처리군이 암세포의 전이를 통계적으로 유의하게 감소시킨 것을 의미하고, **는 p값이 0.01 미만으로, TPA 처리군 대비 100㎍/㎖의 티모사포닌 AⅢ의 처리군이 암세포의 전이를 통계적으로 유의하게 감소시킨다는 것을 의미한다).
도 3은 동물모델에서 티모사포닌 AⅢ에 의한 암세포 전이 억제효과를 확인한 도면으로, (A)는 티모사포닌 AⅢ의 처리 여부에 따른 폐로 전이된 흑색종의 콜로니 수를 나타낸 폐의 사진이고, (B)는 폐로 전이된 암세포의 콜로니 수를 그래프로 나타낸 도면이다(**는 p값이 0.01 미만으로, 흑색종이 유도된 마우스의 폐에서 확인된 암세포 콜로니 수 대비 흑색종이 유도된 마우스에 티모사포닌 AⅢ를 투여한 마우스의 폐에서 확인된 암세포의 콜로니 수가 통계적으로 유의하게 감소되었다는 것을 의미한다).
도 4는 동물모델에서 티모사포닌 AⅢ에 의한 유전자 발현 억제효과를 확인한 도면으로, (A) NF-κB, (B) IKK-α 및 (C) COX-2의 유전자 발현량을 나타낸 것이다.
도 5는 티모사포닌 AⅢ의 화학 구조를 나타낸 도면이다.
본 발명은 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 지모 추출물의 추출용매는 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌 글리콜 및 헥산 중에서 선택된 하나 이상의 추출용매인 것이 바람직하며, 상기 저급 알코올로는 에탄올, 메탄올 또는 이소프로판올을 이용하는 것이 바람직하고, 더욱더 바람직한 추출용매는 에탄올을 이용하는 것이지만 이에 한정하지 않는다. 상기 티모사포닌 AⅢ는 하기 화학식 1로 이루어진 것이 특징이며, 효과를 상승시키기 위한 하기 화학식 1의 기능기의 변형은 얼마든지 가능하다.
Figure 112015055104724-pat00001
상기 피부암은 흑색종인 것이 특징이지만 이에 한정하지 않으며, 흑색종이 폐로 전이되는 것을 억제하는 것이 특징이다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 성분들 이외에 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 계면활성제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 주사 또는 피부에 도포하는 방법으로 투여할 수 있는 것이다. 본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
또한, 본 발명은 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부암의 전이 억제용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 지모 추출물 또는 티모사포닌 AⅢ를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 제조될 수 있다. 상기 지모 추출물 또는 티모사포닌 AⅢ를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 카라멜, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 중에서 선택된 어느 하나의 형태일 수 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다. 즉, 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 및 천연 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알킨산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한, 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 상기의 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 단당류, 말토스, 슈크로스와 같은 이당류, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 크게 중요하지 않지만, 본 발명의 조성물 100g에 대하여, 0.01 ~ 0.04g 인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.02 내지 0.03g을 포함하는 것이지만 이에 한정하지 않는다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 지모 추출물 또는 지모 추출물로부터 분리된 티모사포닌 AⅢ 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 함유하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 피부 외용제에 관한 것이다. 상기 피부 외용제는 크림 형태인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않으며, 국소적용에 적합한 제형으로, 분말제, 겔제, 연고제, 크림제 및 액제 중에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하며, 구체적으로는 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 형태로도 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
[재료 및 방법]
1. 지모 추출물의 제조
지모는 옴니허브로부터 구입하였고, 시료는 온도 5.5±0.3℃, 습도 55±5%로 유지되는 약재보관용 냉장고에서 보관을 하였다. 지모 추출물은 지모의 총 중량의 10배량의 부피에 해당되는 70% 에탄올을 사용하여 1시간씩 2회 환류냉각 추출하였다. 이후에, 여과지를 이용하여 획득한 여액을 감압농축기를 이용하여 용매를 제거함으로써 지모 추출물의 제조를 완성하였다.
2. 티모사포닌 AⅢ의 분리 및 구조 결정
지모로부터 티모사포닌 AⅢ를 분리하기 위해, 지모 추출물을 n-헥산(hexane), 에탄올 및 부탄올(n-BuOH)을 이용하여 분획한 후, n-BuOH 분획을 다이아이온(diaion) HP-20 레진을 이용하여 물과 메탄올의 기울기 용리[H2O:MeOH (100:0 내지 70:30)]를 이용하여 소분획(A1-A5)을 획득하였다. 상기 소분획(A4)을 LiChroprepRP-18 역상 레진을 물과 메탄올의 기울기 용리[H2O:MeOH (100:0 내지 50:50)]하여 티모사포닌 AⅢ를 분리하였다.
3. 세포배양
인간(WM-115) 및 마우스(B16-F10)의 흑색종 세포주를 미국 ATCC에서 구입하였으며, 마우스(B16-F10)의 흑색종 세포주는 DMEM(Dulbecco modified Eagle medium) 배지에 10%의 소혈청과 1%의 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 배지에서 배양하여 실험에 사용하였다. 또한, 인간(WM-115) 흑색종 세포는 EMEM(Eagle Minimum Essential Medium) 배지에 10%의 소혈청, 2mM의 글루타민, 1%의 비필수 아미노산(Non-Essential Amino Acids; NEAA)과 1%의 피루브산나트륨(Sodium Pyruvate; NaP)이 포함된 배지에서 배양하였다(37℃, 5% CO2 배양기). 세포가 단층을 형성하면 완충용액으로 세척한 후, 티로신(trypsin)-EDTA 용액을 처리하여 세포를 유리시켜 계대배양 하였다.
4. 세포이동분석( Migration assay )
사람 및 마우스 흑색종 세포에서 약물에 의한 화학주화성(chemotaxis) 억제작용을 확인하기 위해, 6.5mm의 직경 폴리카보네이트 필터(8μm pore size)가 장착된 Transwell 챔버를 이용하여 수행하였다(Corning Costar, Cambridge, MA, USA). 실험을 수행하기 전에 Transwell의 바닥을 젤라틴(gelatin)으로 코팅하여 상온에 보관 후, 1%의 소 혈청이 포함된 배지를 각각의 웰에 넣은 후, 세포를 1×105 cells/㎖으로 맞추고, 처리된 약물(티모사포닌 AⅢ)과 함께 upper well에 조심스럽게 넣은 다음 챔버를 37℃의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양 후, 배양된 세포를 고정하기 위해 H&E(hematoxylin and eosin) 염색한 다음, upper 표면에 있는 세포를 조심스럽게 면봉으로 제거하고 이동된 세포를 현미경 관찰하여(100×) 사진을 찍고 이동된 세포의 수를 카운트하였다.
5. 실험동물 및 시료투여
C57BL/6는 7주령의 수컷을 쌤타코바이오코리아(대한민국)로부터 구입하여 1주 동안 적응시킨 후 사용하였다. 적응기간 중 일반 상태를 관찰하여 건강한 상태의 동물을 실험에 사용하였다. 사육환경은 온도 23℃, 습도 50%, 명암주기 12시간 (07:00-19:00/조명시간)으로 유지하였다. 시험기간 중 실험동물은 폴리카보네이트(polycarbonate) 케이지(200×320×145mm, Three-shine Co., Daejeon, Korea)에 군당 9마리로 사육하였고 사료는 마우스 전용사료 5L79(Charles river, USA)를 자유급이 하였으며, 음수는 자외선으로 소독한 상수 도수를 자유 급이 하였다.
시료투여는 총 4개의 그룹인 1) 대조군(normal group), 2) 흑색종 세포(melanoma cells) 이식군, 3) 흑색종 세포 이식 및 약물 투여군(12.5 mg/kg/day), 4) 흑색종 세포 이식 및 약물 투여군(25 mg/kg/day)으로 나누어 실험을 하였고, 시료투여는 복강투여 하였다.
6. 생체 내 폐 전이 분석( In vivo lung metastasis assay )
티모사포닌 AⅢ의 항전이 효과를 확인하기 위하여, 5×104 cell/200㎕의 농도로 무혈청 배지(serum free media)에 희석시킨 흑색종 세포주인 B16-F10 세포를 마우스의 꼬리정맥에 주사하여 폐로 암세포(B1-F10 세포)가 전이된 모델 쥐를 만들고, 모델 쥐에 암세포 접종 다음날부터 14일간 약물(티모사포닌 AⅢ)을 각각 12.5mg/kg/day, 25 mg/kg/day로 복강 투여한 후, 폐를 적출하여 폐로 전이된 암세포의 수를 카운트하였다.
7. 생체 내 폐조직의 Real - Time PCR
티모사포닌 AⅢ에 의한 암전이 또는 항암효능 관련 유전자 발현억제를 확인하기 위하여, 동물의 폐조직에서 RNA를 추출하고 MicroRNA 역전사 키트를 사용하여 상보적 DNA를 얻었다. TaqMan RNA assays(Applied Biosystems)기법으로 Real-Time PCR system(QuantStudio 6, Applied Biosystems)을 이용하여 증폭하고, RNA를 정량측정하였다.
(1) RNA 추출
정상 C57BL/6 생쥐와 흑색종(B16-F10) 세포주를 이식한 마우스의 폐를 적출하여 500㎕의 Trizol을 넣고 조직파쇄기(homogenizer)로 세포들을 분쇄하였으며 여기에 100㎕의 클로로포름(chloroform)을 첨가한 후 15초간 다시 혼합하였다. 이를 얼음에 15 분간 방치한 후, 13,000rpm에서 원심 분리하였고 약 200㎕의 상층액을 회수하여 200㎕의 2-propanol과 동량 혼합 후, 천천히 흔들고 얼음에서 15분간 방치하였다.
이를 다시 13,000rpm에서 원심 분리한 후, 80%의 에탄올로 세척하고, 3분간 진공펌프로 건조하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 DEPC를 처리한 20㎕의 증류수에 녹여 75℃의 히팅블럭(heating block)에서 불활성화시킨 후, cDNA 합성에 사용하였다.
(2) 역전사(reverse transcription)
정상 C57bl/6 생쥐와 흑색종(B16-F10) 세포주를 이식한 마우스 폐조직에서 추출된 total RNA 3㎍을 75℃에서 10분 동안 변성시킨 다음 이에 2.5㎕의 10mM dNTPs mix, 1㎕의 random sequence hexanucleotides(25pmole/25㎕), RNA 저해제로서 1㎕의 RNase inhibitor(20 U/㎕), 1㎕의 100mM DTT, 4.5㎕의 5× RT 완충용액(250mM Tris-HCl, pH8.3, 375mM KCl, 15mM MgCl2)를 가한 후, 1㎕의 M-MLV RT(200 U/㎕)를 다시 가하고, DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20㎕가 되도록 하였다.
상기 20㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤, 2,000rpm에서 5초간 원심침강하여 37℃의 히팅블럭(heating block)에서 60분 동안 반응시켜 cDNA를 합성한 다음, 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 PCR에 사용하였다.
(3) 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-Time PCR)
실시간 중합효소 연쇄반응(Real-Time PCR)은 Applied Biosystems QuantStudio 6(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 수행하였다. mRNA 유전자 발현은 TaqMan probe(FAM dye-labeled, ABi, USA)를, 내부 표준(internal standard)으로 생쥐 HPRT probe set; Endogenous Control (VIC/MGB Probe, Probe limited) from Applied Biosystems를 사용하였고, 프라이머의 최종 농도가 200nM이 되도록 반응시켰다. 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-Time PCR)은 1) pre-denaturation으로 50℃에서 2분간; 2) 94℃에서 10분간; 3) 95℃에서 15초간 및 60℃에서 1분간, 40 cycles; 수행하는 조건으로 실시하였다.
실험군과 대조군의 내부 표준(internal standard)으로 HPRT(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase)를 사용하였다. 타겟 그룹의 상대적 정량(relative quantitative; RQ)은 Real-Time PCR 결과로부터 획득한 값을 하기의 수식에 적용하여 계산하였다.
yield(Y) = x(1+e)n
(x: starting quantity, n: number of cycles, e: efficiency)
실시예 1. 지모 추출물의 Melanoma cell line (B16-F10) 세포에서 암세포 전이 억제 확인
도 1에 개시한 바와 같이, TPA(12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate)를 처리하였을 때, 흑색종 세포의 전이가 일어남을 확인하였고, 지모 추출물을 처리하였을 때, 전이가 유의성 있게 억제됨을 확인할 수 있었으며, 약물 처리농도에 의존적으로 효과가 나타남을 확인하였다.
실시예 2. 지모로부터 분리된 티모사포닌 AⅢ에 의한 피부암 전이 억제 확인
도 2에 개시한 바와 같이, 지모 추출물로부터 분리한 유효성분인 티모사포닌 AⅢ를 처리하였을 때, 마우스(B16-F10) 및 사람(WM-115) 세포의 전이가 억제됨을 확인하였다. 상기 티모사포닌 AⅢ는 농도를 0, 10, 50, 100nM로 처리하였으며, 처리농도에 의존적으로 효과가 나타남을 확인하였다.
실시예 3. 동물모델에서의 티모사포닌 AⅢ에 의한 폐전이 억제 확인
도 3에 개시한 바와 같이, 마우스 B16 흑색종 세포를 이용하여 폐로의 전이 억제 효과를 관찰한 결과, 약물을 처리하지 않은 군에서는 흑색 암종의 콜로니의 크기나 숫자가 정상군에 비해서 증가하였음을 알 수 있었고, 티모사포닌 AⅢ를 처리한 군은 B16 흑색종 세포가 폐로 전이되는 정도가 티모사포닌 AⅢ의 양에 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다.
실시예 4. 동물모델에서의 티모사포닌 AⅢ에 의한 mRNA 발현량의 변화 확인
도 4에 개시한 바와 같이, 마우스에 B16 흑색종 세포를 이용하여 폐에서의 유전자 발현량을 관찰한 결과, 약물을 처리하지 않은 군에서는 NF-κB, IKK-α, COX-2의 유전자 발현량이 정상군에 비해서 증가하였음을 알 수 있었고, 티모사포닌 AⅢ를 처리한 군은 B16 흑색종 세포에 의한 NF-κB, IKK-α, COX-2의 유전자 발현량이 티모사포닌 AⅢ의 양에 의존적으로 억제됨을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 흑색종의 전이 억제용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 지모 추출물의 추출용매는 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌 글리콜 및 헥산 중에서 선택된 하나 이상의 추출용매인 것을 특징으로 하는 흑색종의 전이 억제용 약학 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 전이는 폐(lung)로의 전이인 것을 특징으로 하는 흑색종의 전이 억제용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 유효성분 이외에 추가로 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 것을 특징으로 하는 흑색종의 전이 억제용 약학 조성물.
  6. 삭제
  7. 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 흑색종의 전이 억제용 건강기능식품 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 증진제, 펙트산 및 그의 염, 알킨산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 및 탄산음료에 사용되는 탄산화제 중에서 선택된 하나 이상을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 흑색종의 전이 억제용 건강기능식품 조성물.
  9. 삭제
  10. 삭제
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