KR101235114B1 - 티모사포닌 ａ―ⅲ가 함유된 조성물의 용도 및 이의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 티모사포닌 Ａ―Ⅲ가 함유된 조성물의 용도 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 지모(Anemarrhena asphodeloides Bunge)로부터 티모사포닌 A-Ⅲ가 35 ~ 65%(w/w) 함유된 조성물을 제조하였고, 티모사포닌 A-Ⅲ(Timosaponin A-Ⅲ)가 35 ~ 65%(w/w) 함유된 조성물이 우수한 혈당강하 효과를 통한 제2형 당뇨병을 예방 및 치료하기 위한 용도, 5'AMP 활성화 단백질 인산화 효소(5'AMP-activated protein kinase, AMPK) 활성화를 통한 당뇨 및 비만 등을 포함한 대사성 질환의 예방 및 치료를 위한 용도, 알도스 환원효소 저해 및 최종 당산화물 생성 저해 기전을 통한 당뇨 합병증 예방 및 치료 용도에 관한 것이다.

티모사포닌 A-Ⅲ, 제2형 당뇨병, 당뇨 합병증, 혈당강하 효과, 5'AMP 활성화 단백질 인산화 효소 활성, 대사성 질환, 알도스 환원효소 저해, 당산화물 생성 저해, 지모

Description

티모사포닌 Ａ―Ⅲ가 함유된 조성물의 용도 및 이의 제조방법{The use of composition containing timosaponin A-Ⅲ, and its preparation method}

도 1은 db/db 마우스 모델에서의 지모 EA 분획(AA-EA) 및 지모 EA 세부분획 (EA-I ~ EA-V)의 혈당강하효과를 나타낸 그래프이다.

도 2는 db/db 마우스 모델에서의 티모사포닌 A-Ⅲ의 혈당 강하효과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 KK-Ay 마우스 모델에서의 티모사포닌 A-Ⅲ의 혈당 강하효과를 나타낸 그래프이다.

도 4는 티모사포닌 A-Ⅲ 함유 조성물의 db/db 마우스 모델에서의 혈당 강하효과를 나타낸 그래프이다[칼럼 C-2 : 티모사포닌 A-Ⅲ 약 37.6% 함유 조성물, 칼럼 E-2 : 티모사포닌 A-Ⅲ 약 62.4% 함유 조성물].

도 5는 티모사포닌 A-Ⅲ 함유 조성물의 db/db 마우스 모델에서의 체중변화를 나타낸 그래프이다[칼럼 C-2 : 티모사포닌 A-Ⅲ 약 37.6% 함유 조성물, 칼럼 E-2 : 티모사포닌 A-Ⅲ 약 62.4% 함유 조성물].

도 6는 티모사포닌 A-Ⅲ 함유 조성물의 AMPK에 대한 인산화(활성화) 효과를 나타낸 그래프이다[P.C : 양성 대조군, TA: 티모사포닌 A-Ⅲ, 칼럼 C-2 : 티모사포 닌 A-Ⅲ 약 37.6% 함유 조성물, 칼럼 E-2 : 티모사포닌 A-Ⅲ 약 62.4% 함유 조성물].

도 7은 티모사포닌 A-Ⅲ 함유 생약 조성물의 알도스 환원효소 저해 효과를 나타낸 그래프이다[SK-AAB : 지모 부탄올 분획, 칼럼 C-2 : 티모사포닌 A-Ⅲ 약 37.6% 함유 조성물, 칼럼 E-2 : 티모사포닌 A-Ⅲ 약 62.4% 함유 조성물].

도 8은 티모사포닌 A-Ⅲ 함유 조성물의 최종 당산화물 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다[SK-AAB : 지모 부탄올 분획, 칼럼 C-2 : 티모사포닌 A-Ⅲ 약 37.6% 함유 조성물, 칼럼 E-2 : 티모사포닌 A-Ⅲ 약 62.4% 함유 조성물].

도 9는 티모사포닌 A-Ⅲ의 ob/ob 마우스 모델에서의 체중 감소효과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 티모사포닌 Ａ―Ⅲ가 함유된 조성물의 용도 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 지모(Anemarrhena asphodeloides Bunge)로부터 티모사포닌 A-Ⅲ가 40 ~ 60%(w/w) 함유된 조성물을 제조하였고, 티모사포닌 A-Ⅲ(Timosaponin A-Ⅲ)가 40 ~ 60%(w/w) 함유된 조성물이 우수한 혈당강하 효과를 통한 제2형 당뇨병을 예방 및 치료하기 위한 용도, 5'AMP 활성화 단백질 인산화 효소(5'AMP-activated protein kinase, AMPK) 활성화를 통한 당뇨 및 비만 등을 포함한 대사성 질환의 예방 및 치료를 위한 용도, 알도스 환원효소 저해 및 최종 당산화물 생성 저해 기전을 통한 당뇨 합병증 예방 및 치료 용도에 관한 것이다.

미국 국립보건연구소(National Institutes of Health, NIH)의 보고서[the evidence report: clinical guideline on the identification, evaluation, and treatment of overweight and obesity in adults, 1999, NIH]에 의하면 비만과 관련된 질환 중의 하나인 제2형 당뇨병 환자가 약 1,570만 명에 이른다.

또한, 당뇨병 환자는 세계 보건 기구(WHO)에 의하면, 2025년에는 약 3억 명이 될 것으로 추정하고 있으며, 인슐린에 의한 혈당조절 기능을 상실한 제2형 당뇨병 환자는 현재 미국 전체 인구의 약 5.9%에 달한다고 알려져 있다[A. S. Wagman 등, Current Pharmaceutical Design,7, 417, 2001].

당뇨병은 혈액내의 고혈당 증상을 특징으로 하는 탄수화물 대사와 관련된 질병으로 제1형 당뇨병(인슐린 의존형 당뇨병; 당뇨 환자 중 약 10%)과 제2형 당뇨병(인슐린 비의존형 당뇨병; 당뇨 환자 중 약 90%)으로 분류될 수 있다[B. Set 등, Clin. Therapeu., 25, 1895, 2003; S. N. Davis 등, J. Diabetes Complications, 18, 367, 2004]. 제1형 당뇨병 환자는 선천성 또는 바이러스 침입이나 췌장의 심각한 손상으로 인해 췌장의 베타세포가 파괴되어 체내생성 인슐린 분비 능력이 아주 적거나 없고, 극도의 고혈당증으로 진전되며 케톤증 및 케토산증으로 진행되기 쉽다. 주로 소아시기에 급성으로 발병하며, 인슐린 투여에 의한 혈당 조절 치료법이 필수적이다. 반면, 제2형 당뇨병 환자는 성인층에서 유전, 비만, 스트레스, 호르몬 분비 이상. 약물 복용 등의 요인에 의해 발병하며, 인슐린 분비능 력을 갖고 있으나 매우 낮은 수준이거나 글루카곤과 같은 역작용 호르몬의 과다 분비로 균형을 잃은 상태이다. 이는 기저 상태와 자극에 대한 인슐린 분비장애, 간에서의 내인성 포도당 생성의 증가, 말초 조직에서의 당 이용도 저하로 나타나는 인슐린 저항성에 의해 발생하는 것으로 알려져 있고, 고혈당증으로 진전되지만 제1형 당뇨병 환자만큼 케톤증이나 케토산증에 민감하지는 않다. 제1형 당뇨의 경우, 식사 조절, 운동, 인슐린 투여로 혈당조절이 가능하지만, 제2형 당뇨의 경우는 그 이외에도 추가적으로 혈당강하제를 함께 복용해야 한다.

제2형 당뇨병(인슐린 비의존형) 환자들에게 사용되는 혈당강하제들은 그 작용기전에 따라 세 그룹으로 나뉠 수 있다. 첫 번째 그룹으로는 췌장의 베타세포를 자극하여 인슐린의 분비를 촉진시키는 것으로 설포닐요소(sulfonylurea)계와 메글리티나이드(meglitinide)계 약물이 있으며, 두 번째 그룹으로는 비구아니드(biguanide)계와 티아졸리딘다이온(thiazolidinedion)계 약물로 대표되는 인슐린감응제가 있다. 세 번째 그룹의 약물로는 당의 분해를 저해하여 장내 당의 흡수를 억제하는 것으로 아카보스(acarbose), 미글리톨(miglitol) 등의 약물이 존재한다. 바람직한 혈당강하제는 작용이 신속히 발현되어 식후의 과도한 혈당 상승을 막고, 그 후에는 짧은 시간 내에 그 효과가 소실되어 저혈당을 일으키지 않아야 하며, 또한 당뇨병에 수반되는 대사이상증상을 호전시킬 수 있어야 한다. 그런 점에서 상기 약물들은 완전하게 바람직하지 않으며 국내외적으로 증가일로에 있는 당뇨병을 적절히 치료하기 위해서는 보다 부작용이 적고 안전한 경구용 혈당강하제의 개발이 필요하다.

당뇨 동물 모델에서는 제1형 당뇨의 경우 알록산이나 스트렙토조토신 등을 이용한 약물 유발 모델이나, 당뇨 유발 동물을 여러 세대 동안 교배시켜 자연 발생적으로 제1형 당뇨를 유발시킨 NOD(non-obese diabetic) 마우스, BB(bio breeding) 랫트와 같은 모델 등이 있다. 이와 달리 제2형 동물 모델의 경우는 유전자 조작에 의한 모델이 매우 보편적으로 사용되어 지고 있으며, 대표적인 모델들로서 db/db 마우스(렙틴 수용체 결여에 의한 당뇨 모델), ob/ob 마우스(렙틴 결여에 의한 비만형 모델), 주커(zucker, 비만형 당뇨 모델) 랫트, OLETF(The Otsuka Long-Evans Tokushima fatty; 비만, 글루코스 저항형 당뇨 모델) 랫트, KK(비만형 당뇨 모델) 마우스, KK-Ay(비만형 당뇨, 고인슐린 혈증 모델) 마우스 등[S. Makino 등, Exp. Anim., 29, 1, 1980; A. F. Nakhooda 등, Diabetes, 26, 100, 1977; M. Nakamura 등, Diabetol., 3, 121, 1967; K. Kawano 등, Diabetes, 41, 1422, 1992; D. A. Rees 등, Diabetic Medicine, 22, 359, 2005]이 개발되어 이용되고 있다. 따라서, 각각의 동물모델(제1형, 제2형)들의 특징을 잘 파악하고 엄밀히 구분하여 사용하는 것이 매우 중요하다.

N. Nakashima 등은, 실험적 당뇨 모델에 사용되는 대표적 약물인 알록산(alloxan)과 스트렙토조토신(streptozotocin)을 이용한 당뇨 유발 랫트에서 슈도티모사포닌 A-Ⅲ(pseudotimosaponin A-Ⅲ), 프로토티모사포닌 A-Ⅲ(prototimosaponin A-Ⅲ), 티모사모닌 A-Ⅲ 등의 혈당강하 효과를 언급하였다[N. Nakashima 등, J. Nat. Prod., 56, 345, 1994]. 이외에도 티모사포닌 A-Ⅲ는 혈소판 응집 억제[A. Niwa 등, Yakugaku Zasshi 108, 555, 1988], 혈관 이완[G. Wang 등, Life Sci., 71, 1081, 2002] 등의 활성이 보고 되었다.

알록산과 스트렙토조토신은 글루코스 수송 단백질(GLUT-2)의 발현에 의해, 췌장의 베타 세포로 침투하여 DNA 파괴, NAD+ 고갈 등을 유발하고 췌장 베타 세포의 사멸을 일으킴으로써, 많은 연구에서 대표적인 제1형 당뇨 유발 약물로서 이용되어져 왔다[K. Bloch 등, Diabetes Metab Res Rev 21, 253, 2005; D. A. Rees 등, Diabetic Medicine, 22, 359, 2005; J. Kawada, Yakugaku Zasshi, 112, 773, 1992; V. M. F. Rastelli 등, Inflamm. Res., 54, 173, 2005; R. K. Cuman 등, Inflamm. Res., 50, 460, 2001; 도 1 참조].

알록산(alloxan : 5,5,-다이하이드록시-2,4,6 (1H, 3H, 5H)-피리미딘트리온)은 요산의 산화물 즉, 피리미딘 유도체로서 알록산 음이온이 사이토크롬 P-450 이 매개된 라디칼 반응에 의하여 췌장의 베타세포를 파괴시킨다[K. Bloch 등, Diabetes Metab Res Rev 21, 253, 2005; J. Kawada, Yakugaku Zasshi, 112, 773, 1992]. 그러나, 약물 자체의 독성과 그로 인한 유발 동물들의 폐사율이 높다는 단점이 지적되고 있으며, I. F. Federiuk 등은, 알록산 유발 당뇨 모델에서 발생되는 폐사율을 최소화 하기 위한 최적의 방법을 탐색하고자 알록산의 투여 방법과 용량에 따른 당뇨 유발 형태를 조사하였다. 그 결과, 알록산을 고농도(200 mg/kg)로 복강 투여하는 모델이 폐사율을 10% 정도로 낮추고, 제1형 당뇨가 70% 이상 유발되었다고 보고하였다[I. F. Federiuk 등, Compara. Med., 54, 252, 2004].

스트렙토조토신(streptozotocin: 2-데옥시-2-(3-메틸-3-나이트로소유레이도)-D-글루코피라노스)은 글루코스의 유도체로서, 강력한 알킬화(alkylating) 작용을 바탕으로 베타세포 내로 이동하여 미토콘드리아의 ATP 생성을 저해함으로써 세포내 축적된 ADP의 고농도로 인한 크산틴 산화효소(XOD: xanthine oxidase)의 간접적 활성화를 통하여 수퍼옥사이드(superoxide) 라디칼을 발생시키거나, 직접적으로 잔신 산화효소를 활성화시켜 수퍼옥사이드 라디칼을 발생시킴으로써 베타 세포에 산화적 손상을 입힌다[D. A. Rees 등, Diabetic Medicine, 22, 359, 2005; J. Kawada, Yakugaku Zasshi, 112, 773, 1992].

스트렙토조토신을 이용하여, 제2형 당뇨를 유발했다는 보고들이 있으나, 이러한 문헌들은 대부분 덱사메타손(dexamethasone)[S. J. Giddings 등, Diabetes, 34, 235, 1985], 니코틴아미드(nicotinamide)[S. Ozyazgan 등, Pharmacol., 74, 119, 2005] 등의 약물과 병용 투여를 하거나, 최소 1 ~ 2 주 이상 고지방 식이(high fat diet)를 병행[R. de Souza Santos 등, Clin. Chim. Acta., 2005, Epub ahead of print; M. J. Reed 등, Metabolism, 49, 1390, 2000; F. Zhang 등, Exp. Anim., 52, 401, 2003]하여 유발시킬 수 있다는 보고였다. 즉, 투여량, 투여방법에 상관없이 스트렙토조토신 단독으로 유발되는 당뇨 유형은 제1형으로서, 이에 대한 반론의 여지는 없는 것으로 사료된다. 이러한 스트렙토조토신 유발 당뇨모델과 분명히 구분하여야 할 모델로는, 생후 2일된 신생아 상태의 랫트를 대상으로 한 네오네이탈 스트렙토조토신(neonatal streptozotocin, 이하 'n-스트렙토조토신'이라 칭함) 당뇨 유발 모델이 있다[I. Degirmenci 등, J. Ethnopharmacol., 97, 555, 2005; D. N. Umrani 등, Clin. Exp. Hypertens., 25, 221, 2003]. n-스트렙토조토신 당뇨 유발 모델은 스트렙토조토신을 이용한 제2형 당뇨 유발모델로서 많은 연구에서 사용되어지고 있지만, 실제로 이 실험의 수행자들 역시 일반 성인 랫트 등을 대상으로 한 스트렙토조토신 유발모델은 제1형 당뇨 유발 모델인 것에 반해, 신생아 상태의 랫트를 대상으로 한 n-스트렙토조토신 유발 당뇨 모델은 제2형 당뇨 모델라고 분명히 구분하고 있다[B. M. Kim 등, Diabetol., 44, 2192, 2001; V. M. F. Rastelli 등, Inflamm. Res., 54, 173, 2005; R. K. Cuman 등, Inflamm. Res. 50, 460, 2001; U. A. Shinde 등, J. Cell Mol. Med., 7, 322, 2003; U. A. Shindea 등, J. Trace Elem. Med. Biol., 18, 23, 2004].

결론적으로, N. Nakashima 등[N. Nakashima 등, J. Nat. Prod., 56, 345, 1994]이 보고한 티모사포닌의 혈당 강하 활성은 제1형 당뇨모델에서의 활성을 검증해본 것으로서, 본 연구자들이 제시하고자 하는 제2형 당뇨에 대한 혈당 강하효과와는 무관한 것으로 사료된다. 또한, N. Nakashima 등이 제시한 문헌에서는 상대적 혈당 강하효과만을 언급하였을 뿐, 혈당 강하 효과에 대한 절대치, 즉 효력에 대한 언급이 불분명하며 티모사포닌 A-Ⅲ가 프로토티모사포닌 A-Ⅲ나 슈도티모사포닌 A-Ⅲ에 비해 약한 활성을 갖는다는 점을 바탕으로 티모사포닌 A-Ⅲ의 제2형 당뇨모델에서의 혈당 강하에 대한 우수성을 유추하기에는 부족함이 있다.

지모는 백합과(liliaceae)에 속하는 다년생 초본으로서, 이 식물의 뿌리줄기를 항균, 해열, 당뇨, 이뇨, 진해, 거담 등의 치료제로 사용하고 있다. 이 식물의 뿌리줄기에 함유되어 있는 성분으로는 아네마레나사포닌(anemarrhenasaponin)[S. Saito 등, Chem. Pharm. Bull., 42, 2342, 1994]계열, 티모사포닌(timosaponin A-III)[S. Nagumo 등, Yakugaku Zasshi, 111, 6, 306, 1991] 계열, 아네마사포닌(Anemarsaponin)[JX. Dong 등, Yao Hsueh Hsueh Pao, 27, 26, 1992]계열, 크산톤(xanthone)[M. Fujita, Tetrahedron Lett., 4503, 1977; M. Fujita 등, Chem. Pharm. Bull.,30, 7, 2342, 1982] 계열 등의 성분들이 함유되어 있다.

최근 5'AMP 활성화 단백질 인산화 효소(5'AMP-activated protein kinase, 이하, "AMPK"라 함)가 탄수화물 및 지질대사 그리고 포도당 흡수를 조절하는 역할이 밝혀지면서 이의 활성물질이 제2형 당뇨병 치료제로서의 개발 가능성이 제시되고 있다[B. R. Barnes 등, Curr. Mol. Med., 5, 341, 2005; A. E. Halseth 등, Biochem. Biophys. Res. Commun., 21, 798, 2002]. AMPK 활성이 증가하면 근육세포에서 인슐린 신호 전달 체계와 독립적으로 포도당의 흡수를 증가되며, 지방세포에서 아세틸 CoA 카르복시라제(ACC)의 활성을 저해하여 지방의 산화를 증가시키거나 혹은 지방 합성을 감소시킴으로써 비만 조절에도 중요한 역할을 한다[D. S. Rubink 등, J. Appl. Physiol., 98, 1221, 2005; W. W. Winder 등, Biochem Soc Trans., 31, 182, 2003; D. G. Hardie 등, Biochem. Soc. Trans., 30, 1064, 2002]. 결론적으로, AMPK는 에너지 불균형으로 인하여 초래되는 당뇨 및 비만 등 대사성 질환 치료를 위한 새로운 목표 물질로 인식되고 있으며, 인슐린 신호 전달 체계와 독립적으로 일어나고 있는 기전상의 차별성으로 인해 제2형 당뇨 치료에 있어 새로운 목표 물질로서 주목받고 있다.

당뇨가 15 ~ 20년 이상 장기적으로 지속되면 체내 여러 기관이 손상을 받아 당뇨병성 백내장, 신장병, 말초신경장애, 고지혈증 등의 만성 합병증이 나타나게 되는데 대표적으로 백내장(cataract), 당뇨병성 신증(nephropathy), 당뇨병성 망막증(retinopathy), 당뇨병성 신경증(neuropathy) 등이 있으며 종국에는 사망에까지 이르는 치명적인 질병이다[S. Yamagishi, Curr. Pharm. Des., 11, 2279, 2005; A. M. Aring 등, Am. Fam. Physician., 71, 21238, 2005; A. H. Barnett, Acta. Diabetol., 42, 42, 2005; H. Vlassara 등, Diabetes Care, 13, 1180, 1990; R. G. Judzewitsch 등, N. Engl. J. Med., 308, 119, 1983].

당뇨병으로 인한 합병증 발생은 그 원인이 아직까지 확실히 밝혀지지 않았으나 크게 폴리올 경로내의 알도스 환원효소에 의한 솔비톨 침착으로 인한 세포 손상, 단백질 당화에 의한 최종 당산화물(AGE's; advanced glycation end product) 형성에 의한 DNA, 단백질, 조직 등의 손상과 자유 라디칼에 의한 산화적 스트레스 등이 그 원인으로 알려져 있다[S. S. Chung 등, Curr. Drug Targets, 6, 475, 2005; K. H. Gabbay, Curr, Diab, Rep., 4, 405, 2004; N. Vasavada 등, Adv. Chronic Kidney Dis., 12, 146, 2005; D. Bonnefont-Rousselot, Treat. Endocrinol., 3, 41, 2004; R. Da Ros 등, Curr. Vasc. Pharmacol., 2, 335, 2004 ;N. Ahmed 등, Diabetes Res. Clin. Pract., 67,3, 2005; A. Pojas 등, Life Sci., 76, 715, 2004.]

현재까지 개발된 당뇨 합병증 치료제로는 최초의 알도스 환원효소 저해제인 톨레스태트(tolrestat, AlrestinR: Wyeth-Ayerst)가 있으나, 1988년 개발되었으나 간독성 등으로 인해 1996년 철수되었고(WHO, 1999), 일본 오노제약이 개발한 에팔레스태트(epalrestat, Kinedak) 역시 알도스 환원효소 저해제로서 당뇨병성 신경병 증 치료제로 승인을 받았으나, 현재까지 일본내에서만 판매되고 있는 실정[E. Kubo 등, J. Ocul. Pharmacol. Ther., 14, 181, 1998; ONO Product review 2000]으로서 당뇨 합병증 치료제의 개발이 요구되어지고 있다.

이에, 본 발명자들은 새로운 혈당강하제를 탐색하는 과정에서 유효성분으로서 티모사포닌 A-Ⅲ를 35 ~ 65% 함유하는 생약 조성물이 제2형 당뇨 모델에서 매우 우수한 혈당강하 효과를 나타내고, AMPK 활성화 효과, 알도스 환원효소 저해 효과, 최종 당산화물 생성 억제 효과가 있음를 밝힘과 동시에 AMPK 관련 대사성 질환 그리고 당뇨 합병증에도 탁월한 효능을 밝힘으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 지모로부터 티모사포닌 A-Ⅲ이 35 ~ 65%(w/w) 함유된 조성물을 제조하고, 이 조성물의 용도를 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 지모로부터 티모사포닌 A-Ⅲ가 35 ~ 65%(w/w) 함유된 조성물을 제조하는 방법 및 상기 조성물의 용도를 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 지모(Anemarrhena asphodeloides Bunge)로부터 바람직하게는 티모사포닌 A-Ⅲ가 35 ~ 65%(w/w) 함유된 조성물을 제조하였고, 상기의 조성물이 우수한 혈당강하 효과를 통한 제2형 당뇨병을 예방 및 치료하기 위한 용도, 5'AMP 활성 화 단백질 인산화 효소(5'AMP-activated protein kinase, AMPK) 활성화를 통한 당뇨 및 비만 등을 포함한 대사성 질환의 예방 및 치료를 위한 용도, 알도스 환원효소 저해 및 최종 당산화물 생성 저해 기전을 통한 당뇨 합병증 예방 및 치료 용도에 관한 것이다.

본 발명은 지모로부터 티모사포닌 A-Ⅲ(timosaponin A-Ⅲ, 3-O-β-D-글루코피라노실-(1→2)-β-D-갈락토피라노실 살사사포제닌, 화학식 I)이 35 ~ 65%(w/w) 함유하는 조성물을 얻고, 이 조성물이 우수한 혈당강하 효과, AMPK 활성화 효과, 알도스 환원효소 저해 및 최종 당산화물 생성 억제효과가 있음을 확인하였다.

본 발명은

1) 지모를 저급 알콜 수용액으로 추출하여 얻은 추출물을 3차 증류수로 회수하는 단계;

2) 상기 회수된 추출물을 동량의 부탄올로 분획하는 단계;

3) 수득한 부탄올 분획에 동량의 메탄올을 넣고 균질화 시킨 후, 방치하여 침천물을 얻는 단계; 및

4) 상기 용매를 사용하여 얻어진 침전물을 역상 오픈 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 티모사포닌 A-Ⅲ가 함유된 조성물을 수득하는 단계로 이루어진, 바람직하게는 티모사포닌 A-Ⅲ가 35 ~ 65%(w/w) 함유된 조성물을 제조하는 방법을 포함한다.

단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.

지모를 추출 용매(저급 알콜)를 사용하여 교반 침지시킨 후, 고형분이 가라앉도록 방치하고, 최종 부유물을 제거 후, 감압 농축하여 추출물을 3차 증류수로 회수하는 1단계

회수한 추출물을 동량의 부탄올과 혼합하여 분리장치(separation funnel)에 넣고, 반복 추출하고 감압 농축하여 목적하는 부탄올 분획을 얻는 2단계

부탄올 분획에 동량의 메탄올을 넣고 균질화 시킨 후, 방치한 다음, 필터링하여 침전물을 얻는 3단계

수득된 침전물을 다이옥산(dioxane) 수용액에 희석시켜 역상 오픈 칼럼 크로마토그래피을 이용하여 극성 물질을 제거 후 목적하는 티모사포닌 A-Ⅲ 함유 조성물(티모사포닌 A-Ⅲ가 35 ~ 65%(w/w) 함유된 조성물)을 얻는 4단계로 구성된다.

상기의 방법으로 제조한 분획내의 티모사포닌 A-Ⅲ의 함량은 지모의 산지, 채취시기, 보관상태 등의 변수로 인해 약 37.6 ~ 62.4%(w/w) 정도의 함량차이를 보임[표 2 참조]을 확인하였고, 이러한 사실에 근거하여 바람직하게는 티모사포닌 A-Ⅲ를 35%(w/w) 내지는 65%(w/w) 함유한 지모 유래의 생약 조성물을 제조하는 방법 을 제공한다.

상기와 같이, 본 발명은 티모사포닌 A-Ⅲ가 35 ~ 65%(w/w) 함유된 조성물로서, 함량이 35% 미만일 경우에는 제2형 당뇨병 및 당뇨 합병증에 우수한 효과를 가지기 어렵고, 65%를 초과하면 추출수율과 생산 단가를 고려 시 높은 생산비가 발생되어 비효율적이라는 문제점이 있다.

본 발명에 따른 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여, 예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용할 수 있으며, 일반적인 의약품 및 건강식품의 형태로 사용될 수 있다.

상기 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면 정제, 환제, 유제, 액제, 에어로졸, 트로키제(troches), 로진지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캅셀, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캅셀 등의 제형으로 제제화하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캅셀제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다. 또한, 본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액으로 제조하고 이 를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다.

본 발명의 조성물에 사용되는 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 알루미늄염, 페녹시에틸에탄올, 물, 생리식염수, 락토즈, 덱스트로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 화학식 1의 화합물의 제형은 충진제, 항응집제, 윤활유제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 유효성분에 대한 인체 내로의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로는 성인 1일 0.1 ~ 15 mg/kg으로 투여토록 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 식품 또는 의약품으로 제조하여 상기 1일 복용량에 맞추어 1일 1회 내지 2회 정도로 분할하여 복용할 수 있다.

또한, 건강식품이란, 상기 유효성분을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캅셀화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

참고예 1: 지모로부터 활성분획 지모 EA 분획의 제조

지모 3 kg을 20 L의 50% 에탄올에 4시간 동안 2회 침지하였다. 효과적인 추출을 위해서 80 ℃에서 실행하며, 교반기를 이용하여 휘저어 주었다. 4 시간 후에 고형분이 가라앉도록 방치하고, 최종 부유물을 제거하기 위해서 깔대기에 탈지면을 넣어 걸러내었다. 증류기(rotary evaporator)로 여과액을 증발시키고, 획득한 추출물의 양을 측정하여 추출물 100 g당 500 mL의 3차 증류수로 회수하였다. 회수한 추출물을 동량의 헥산(n-Hexane, Jin chemicals pharmaceutical Co. Ltd., Korea)과 혼합하여 분리장치(separation funnel)에 넣고, 교반 후 24시간 동안 방치하여 상층의 헥산층을 제거하였다. 동일한 방법으로 2 ~ 3회 더 세척하였다.

남은 물층은 동량의 메틸렌 클로라이드(methylene chloride, Jin chemicals pharmaceutical Co. Ltd., Korea, 이하 MC)를 사용하여, 상기와 동일한 방법으로 3 ~ 4회 세척하였다.

남은 물층을 동량의 에틸 아세테이트(ethyl acetate, Jin chemicals pharmaceutical Co. Ltd., Korea, 이하 EA)와 혼합하여 분리장치에 넣고, 교반 후 24 시간 동안 방치하여 상층의 EA 층만을 분리하였다. EA로 2 ~ 3회 추가 분획하여 감압 농축하고 목적하는 지모 EA 분획(AA~EA)을 얻었고, 분말화하여 -20 ℃에 서 보관하여 사용하였다.

참고예 2: 지모 EA 분획으로부터 세부 분획 제조

지모 EA 분획 290 g을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(170 ~ 230 mesh, 3 kg)를 이용하여 순차 분획하였다. 용매 조건은 EA(15 L), EA:MeOH=20:1(20 L), EA:MeOH:Water = 20:2:0.1(20 L), EA:MeOH:Water = 10:2:0.2(20 L) 순으로 15 L씩 5개의 분획을 얻었고, 각각을 EA-I, EA-Ⅱ, EA-Ⅲ, EA-Ⅳ 및 EA-V라 명명하였다. 각각의 분획을 감압 농축하고, 분말화하여 -20 ℃에서 보관하여 사용하였다.

참고예 3: 활성성분 분리 및 구조 규명

지모 EA-V 분획 1 g에 40 ml의 70% 다이옥산(dioxane) 수용액을 첨가 후, 50 ℃ 물중탕 및 초음파 분해(sonication)를 통하여 완전 용해시켰다. 용해된 상태의 지모 EA-V 분획을 상온에서 24시간 방치하여 얻어진 백색 침상의 물질을 필터링하여 얻은 물질을 화합물 I(Rf 0.38, 90% MeOH, 황산 발색, RP-18 F254s, 머크)라 명명하였다.

분리된 화합물 I를 H¹-NMR, C¹³-NMR, ESI-MS를 이용하여 구조 분석하여 티모사포닌 A-Ⅲ[S. Saito 등, Chem. Pharm. Bull., 2342. 1994]임을 규명하였고, 문헌에 보고된 바와 일치함을 확인하였다. 또한, 표준품(SKF 7862, WAKO pure chemical industries. LTD.)을 구입하여 고압액체크로마토그래피(HPLC)로 동일물질 임을 확인하였다.

실시예 1: 추출 용매 조건에 따른 티모사포닌 A-Ⅲ의 추출수율 비교

지모 20 g을 140 ml의 추출 용매(50% 메탄올, 70% 메탄올, 100% 메탄올, 50% 에탄올, 70% 에탄올)를 사용하여 4시간 동안 2회 침지하였다. 효과적인 추출을 위하여 80 ℃에서 실행하며, 교반하였다. 4 시간 후에 고형분이 가라앉도록 방치하고, 최종 부유물을 제거하기 위해서 깔대기에 탈지면을 넣어 걸러내었다. 증류기(rotary evaporator)로 여과액을 증발시키고, 획득한 추출물의 양을 측정하여 추출물 10 g당 100 mL의 3차 증류수로 회수하였다. 회수한 추출물을 동량의 부탄올(n-Buthanol, Jin chemicals pharmaceutical Co. Ltd., Korea)과 혼합하여 분리장치(separation funnel)에 넣고, 24시간 동안 2 ~ 3회 반복 추출하여 목적하는 부탄올 분획(시료 1, 시료 3, 시료 5, 시료 7, 시료 9)과 나머지 물 분획(시료 2, 시료 4, 시료 6, 시료 8, 시료 10)을 얻었다. 얻어진 시료(시료 1 ~ 시료 10)는 감압 농축 후, 분말화하여 -20 ℃에서 보관하여 사용하였고, 고압액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 각 시료내의 티모사포닌 A-Ⅲ를 정량하였다[표 1 참조].

추출 및 분획 조건에 따른 티모사포닌 A-Ⅲ의 함량 및 수율

시료명	추출 용매	추출량 (g)	분획 용매	분획별 건조 중량 (g)	분획 내 TA1) 함량 (%)	지모(20g) 대비 TA1) 추출량 (mg)	지모 대비 TA1) 추출수율 (%)
시료 1	50% 메탄올	11.5	부탄올	2.17	4.3	93.3	0.47
시료 2			물	8.56	-	-	-
시료 3	70% 메탄올	10.09	부탄올	2.20	5.3	116.6	0.58
시료 4			물	7.93	-	-	-
시료 5	100% 메탄올	7.12	부탄올	2.07	5.6	115.9	0.58
시료 6			물	3.45	-	-	-
시료 7	50% 에탄올	11.2	부탄올	2.07	5.4	111.8	0.56
시료 8			물	7.36	-	-	-
시료 9	70% 에탄올	11.04	부탄올	2.49	4.7	117.0	0.59
시료 10			물	7.57	-	-	-
1) TA : 티모사포닌 A-Ⅲ

상기 표 1에서와 같이, 티모사포닌 A-Ⅲ는 모두 부탄올 층으로 이행되었다. 지모(20 g)대비 티모사포닌 A-Ⅲ의 추출 수율을 비교해보면 시료 1(50% 메탄올 추출, 부탄올 분획)이 0.47%(93.3 mg)로 가장 적었고, 나머지 시료(시료 3, 시료 5, 시료 7, 시료 9)간에는 추출 수율에 있어 큰 차이가 없음을 알 수 있다. 추출수율과 생산단가를 고려한 생산 공정상에서는 시료 3(70% 메탄올 추출, 부탄올 분획)을 얻는 공정이 효율적 측면에서 티모사포닌 A-Ⅲ를 얻을 수 있는 최적의 생산 공정임을 확인하였고, 이후 생약 조성물 제조에 이용하였다.

실시예 2: 국내 유통되는 지모 부탄올 칼럼 분획내의 티모사포닌 A-Ⅲ의 함량 비교

원생약에 함유된 유효 생리 활성물질의 함량은 산지, 채취시기, 보관기관 및 상태 등에 따라 크게 달라질 수 있기에, 국내 유통되는 중국산 지모(지모 A ~ 지모 E)를 대상으로 티모사포닌 A-Ⅲ 함량을 비교하였다. 지모는 경동시장, 대효를 통하여 구입하였으며, A, B, C, D, E 구분은 구입처 및 구입 시기 등의 차이에 따라 임의로 구분하였다.

지모 샘플 5종(지모 A ~ 지모 E)에 대하여 실시예 1과 동일한 방법으로 5종의 부탄올 분획(부탄올 A ~ 부탄올 E)을 제조하였다. 각각의 부탄올 분획(부탄올 A ~ 부탄올 E) 500 g에 500 ml의 메탄올(Methanol, Jin chemicals pharmaceutical Co. Ltd., Korea, 이하 MeOH)을 넣고 균질화시킨 후, 24시간 동안 0 ℃에서 방치하였다. 방치 후 필터링하여 얻어진 침전물(200 g)을 40% 다이옥산(dioxane) 수용액에 희석시켜 역상(YMC-gel ODS-A, S-50um, YMC Co. LTD.) 오픈 칼럼을 이용하여 순차 분획하였다. 용매조건은 80% 메탄올 4L, 90% 메탄올 4L, 100% 메탄올 4L 순으로 각 부탄올 분획(시료 A ~ 시료 E)에 대하여 각각 3개씩의 칼럼 세부분획을 얻었다. 얻어진 15개의 칼럼 분획(칼럼 A-1 ~ 칼럼 E-3)에 대하여 HPLC로 티모사포닌 A-Ⅲ를 정량하여 함량비를 비교하였다[표 2 참조].

부탄올 칼럼 분획내의 티모사포닌 A-Ⅲ 함량

생약구분	분획명	칼럼분획명	부탄올 분획 내 티모사포닌 A-Ⅲ 함량 (%)	분획수율 (%. w/w)
지모 A	부탄올 A	칼럼 A-1	3.2	9.6
		칼럼 A-2	57.6	8.9
		칼럼 A-3	-	1.1
지모 B	부탄올 B	칼럼 B-1	2.7	10.1
		칼럼 B-2	53.1	8.2
		칼럼 B-3	-	0.8
지모 C	부탄올 C	칼럼 C-1	1.4	9.6
		칼럼 C-2	37.6	8.7
		칼럼 C-3	-	0.7
지모 D	부탄올 D	칼럼 D-1	1.6	9.2
		칼럼 D-2	38.2	8.7
		칼럼 D-3	-	1.2
지모 E	부탄올 E	칼럼 E-1	3.7	9.2
		칼럼 E-2	62.4	8.9
		칼럼 E-3	-	0.9

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 90% 메탄올 분획(칼럼 A-2, 칼럼 B-2, 칼럼 C-2, 칼럼 D-2, 칼럼 E-2)에서 대부분의 티모사포닌 A-Ⅲ가 용출됨을 확인할 수 있었고, 그 함량은 약 37.6 ~ 62.4%(w/w)로서 지모의 산지, 채취시기, 보관상태 등의 변수가 티모사포닌 A-Ⅲ의 함량에 영향을 미친다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기에서 언급된 제조방법을 통한 지모 분획내의 티모사포닌 A-Ⅲ의 함량 차이와 수율 및 생산단가 등을 고려하여 볼 때, 유효성분으로서 티모사포닌 A-Ⅲ를 35%(w/w) 내지는 65%(w/w) 함유하는 조성물이 향후 대량 생산공정을 통해 얻을 수 있는 최적화된 조성물임을 확인하였다.

실험예 1: db /db 마우스에서 혈당강하 효과.

8 ~ 9주된 db/db 계통의 수컷 마우스(C57BL/Ks-db/db)를 실험에 사용하였다. C57BL/Ks-db/db 마우스(미국 잭슨 연구소에서 개발, 시상하부의 렙틴 수용체가 결여되어 렙틴에 의한 신호 전달 체계의 이상으로 비만을 통한 당뇨 유발)는 생후 4 ~ 5 주령 경부터 비만이 시작되고, 혈당이 상승한다. 이러한 특징을 바탕으로, 비만, 당뇨 및 당뇨합병증의 발병 기구의 해석, 규명이나 혈당강하제의 약효 스크리닝에 사용되어지고 있는 대표적인 제2형 당뇨 동물 모델이다[D. A. Rees 등, Diabetic Medicine, 22, 359, 2005; G. H. Lee 등, Nature, 379, 632, 1996; S. C. Chua 등, Science, 271, 994, 1996; J. K. Naggert 등, Mamm. Genome., 6, 131, 1995]

0.5% 카르복시메틸셀룰로스(CMC) 용액의 음성대조군, 0.5% 카르복시메틸셀룰로스(CMC)용액에 녹인 양성대조군(rosiglitazone) 및 시험약물은 매일 오후에 복강 또는 경구 투여하며, 혈당 측정은 꼬리정맥을 절개하여 3 ~ 4일 간격으로 오후에 일정 시간에 투여 직전에 혈당 측정기로 측정하였다. 동물의 체중과 사료 양은 2일 간격으로 약물 투여 직전에 측정하였다. 8 ~ 10일 동안 투여 및 혈당측정과 체중측정이 끝난 후, 혈액을 채취하여 혈청을 분리하여 간기능, 신장기능 및 지질검사를 위한 생화학 매개변수(Biochemical parameter) 등을 측정하였다.

도 1은 상기 참고예 1에 의하여 제조된 지모 EA 분획(AA-EA) 및 참고예 2에 의해 얻어진 세부분획(EA-I, EA-Ⅱ, EA-Ⅲ, EA-Ⅳ, EA-V)을 각각 300 mg/kg로 경구 투여한 후, 혈당 강하효과를 측정한 것이다. 그 결과, EA-V가 지모 EA 분획보다 우수한 활성을 나타냄을 확인하였고, 양성 대조군과 동등한 혈당강하 효과를 나타내었기에 이 분획을 바탕으로 활성 성분을 탐색하였다.

도 2는 상기 참고예 3에 의하여 얻어진 티모사포닌 A-Ⅲ을 농도별(100 mg/kg, 200 mg/kg, 300 mg/kg)로 경구 투여한 후, 혈당 강하효과를 나타낸 것이다. 200 mg/kg의 농도에서 양성대조군인 로지글리타존(rosiglitazone) 대비 동등 이상 효과, 300 mg/kg 농도에서는 그 이상의 강력한 혈당강하 효과를 나타냄으로써, 티모사포닌 A-Ⅲ가 EA-V 분획의 주요 활성 지표성분임을 확인하였다.

실험예 2: 티모사모닌 A-Ⅲ의 KK-Ay 마우스에 대한 혈당 강하 효과

9 ~ 10주된 KK-Ay 계통의 수컷 마우스(C57BL/Ks)를 실험에 사용하였다. KK-Ay 마우스는 KK 마우스(일본 사이타마현 카스카베를 기원으로, 유전 연구 목적으로 다케다 약품 공업 주식회사에 도입되어 개발됨.)에 비만 유전자 Ay가 도입되어 조기에 비만, 고혈당이 발현되어 고인슐린혈증(hyperinsulinemia)을 특징으로 하는 제2형 당뇨병 모델로 이용되어지고 있다[M. Okazaki 등, Exp Anim., 51, 191, 2002; J. Suto 등, Eur J Endocrinol., 139, 654, 1998].

0.5% 카르복시메틸셀룰로로스(CMC) 용액의 음성대조군, 0.5% 카르복시메틸셀룰로로스(CMC)에 녹인 시험약물은 매일 오후에 경구 투여하며, 혈당 측정은 꼬리정맥을 절개하여 3 ~ 4일 간격으로 오후에 일정 시간에 투여 직전에 혈당 측정기로 측정하였다. 동물의 체중과 사료 양은 2일 간격으로 약물 투여 직전에 측정하였다. 8일 동안 투여 및 혈당측정과 체중측정이 끝난 후, 혈액을 채취하여 혈청을 분리하여 간 기능, 신장기능 및 지질검사를 위한 생화학 매개변수(Biochemical parameter) 등을 측정하였다.

도 3은 참고예 3에 의하여 얻어진 티모사포닌 A-Ⅲ을 농도별(100 mg/kg, 200 mg/kg)로 경구 투여한 후, 혈당 변화를 나타낸 것으로 200 mg/kg의 농도에서 강력한 혈당강하 효과를 확인할 수 있었다.

실험예 3: 티모사포닌 A-Ⅲ 함유 생약 조성물의 db/db 마우스에서 혈당강하 효과

8 ~ 9주 된 db/db 계통의 수컷 마우스(C57BL/Ks-db/db)를 대상으로 실험예 1 과 동일한 방법으로 실험을 실시하였다.

표 2에서 알 수 있듯이, 본 발명에서 규격화한 제조공정(실시예 2)을 통하여 얻을 수 있는 조성물 내의 티모사포닌 A-Ⅲ 함량은 약 37.6 ~ 62.4%(w/w)의 차이를 보였기에 그 중 가장 함량이 낮았던 칼럼분획(칼럼 C-2: 티모사포닌 A-Ⅲ 약 37.6% 함유)과 가장 함량이 높았던 분획(칼럼 E-2: 티모사포닌 A-Ⅲ 약 62.4% 함유)을 선정하여 항당뇨 활성을 재 검정하였다.

도 4는 상기 실시예 2로부터 제조된 티모사포닌 A-Ⅲ 함유 조성물(칼럼 C-2, 칼럼 E-2)을 300 mg/kg씩 경구 투여한 후, 혈당 강하효과를 측정한 것이다. 티모사포닌 A-Ⅲ가 약 60%(w/w) 함유된 조성물(칼럼 E-2)이 양성 대조군인 로지글리타존에 상응하는 혈당강하 효과를 나타냄을 확인하였다.

도 5는 티모사포닌 A-Ⅲ 함유 조성물(칼럼 C-2, 칼럼 E-2)을 300 mg/kg씩 경구 투여한 후, 체중 변화를 측정한 것이다. 양성대조군인 로지글리타존에서 보이는 심각한 체중 증가현상(약 16% 이상, 로지글리타존의 부작용 중 하나로 알려짐)은 보이지 않았다[표 3 참조].

티모사포닌 A-Ⅲ 함유 생약 조성물에 의한 db/db 마우스 체중 변화율

구분	대조군	로지글리타존	칼럼 C-2	칼럼 E-2
체중변화율(%)	4.73	16.69	6.93	3.64

실험예 4: 알도스 환원효소 저해효과

일반적으로 포도당이 세포내로 들어오면 헥소키나제에 의하여 6-인산포도당으로 전환된 다음 해당경로(glycolysis)를 거쳐 분해되었다. 하지만, 당뇨환자처럼 고혈당 상태에서는 해당경로내의 헥소키나제가 포화되어 여분의 포도당은 폴리올경로(polyol pathway)를 거쳐 솔비톨로 대사됨으로써 세포내에는 솔비톨이 축적된다[J. H. Kinoshita, Exp. Eye Res., 50, 567, 1990; Y. N. Chihiro, Pharmacol. Rev., 50, 21, 1998; C. N. Carder 등, Folia. Histochem. Cytochem., 17, 137, 1979]. 이러한 환원과정을 일으키는 효소가 알도스 환원효소로서 망막, 렌즈, 신장, 적혈구, 및 말초신경 등에 존재하며 축적된 솔비톨은 미오이노시톨의 유입을 저하시켜 축색 손상 및 신경전도 감소를 초래하거나 이러한 과정에서 일어나는 대사적 변화를 일을켜 당뇨 합병증을 일으킨다[C. E. Grimsaw 등, Biochemistry, 29, 9947, 1990; K. H. Gabbay, N. Engl. J. Med., 288, 831, 1973].

알도스 환원효소원은 헤이만 등(S. Hayman 등, J Biol. Chem., 240, 877, 1965)이 사용한 방법을 일부 수정하여 준비하였다. 랫트의 수정체를 적출하고, 인산완충액을 가하여 균질화하였다. 균질액은 4 ℃에서 원심분리하고, 상등액을 취하였다. 상등액에 암모늄 설페이트를 40%로 가하고 다시 원심분리하여 상등액을 수거한 다음 여기에 암모늄 설페이트를 70%로 가하여 1시간 정도 혼합하였다. 이를 원심분리하여 침전물을 수득하고, PBS 완충액에 현탁시킨 후 1일 투석하여 알도스 환원효소원을 준비하였다. 이후 준비한 알도스 환원효소원에 각각의 시료(지모 부탄올 분획: 참고예 1에 의해 제조된 시료 3, 티모사포닌 A-Ⅲ함유 조성물: 칼럼 C-2, 칼럼 E-2)를 가하고, DL-글리세르알데하이드를 기질로 반응시켜 340 nm에서의 NADPH 흡광도 감소율을 측정하였다. 양성 대조군으로는 일본에서 당뇨병성 신경병증 치료제로 시판되는 에팔레스태트(epalrestat)와 알도스 환원효소 억제 활성물질로 알려진 쿼세틴(quercetin)을 양성 대조물질로 사용하였다.

도 6는 티모사포닌 A-Ⅲ 함유 생약 조성물(칼럼 C-2, 칼럼 E-2)의 알도스 환원효소 저해능을 나타낸 것으로, 티모사포닌을 함유한 조성물의 우수한 알도스 환원효소 저해능을 확인할 수 있었고 양성 대조군인 쿼세틴 보다 약 3배의 활성을 나타냄을 확인하였다.

실험예 5: 최종당화산물(AGE's) 생성 억제 효과

최종 당산화물은 유입된 포도당이나 자동산화(autoxidation)에 의해 활성화된 형태로 효소의 도움 없이 당화반응(glycation)을 통하여 조직(기저막, 혈장알부민, 수정체 단백질, 피브린, 콜라겐 등)내의 단백질 등과 결합하여, 쉬프 염기(schiff base)를 형성하고 이후 아마도리 전위 등을 거쳐 생성되며, 당뇨 합병증 발병의 주요 기전으로 알려져 있다[M. Takeuchi 등, Int. J. Clin. Pharmacol. Res., 24, 95, 2004; N. Ahmed, Diabetes Res. Clin. Pract., 67, 3, 2005; A. Pojas 등, Life Sci., 76, 715, 2004].

단백질원으로 소혈청알부민(bovine serum albumin)을 50 mM 포스페이트 완충용액(pH 7.4)에 가하여 제조하였다. 당원으로는 0.1 M 프럭토오스와 0.1 M 글루코오스의 혼합된 액에 시료(지모 부탄올 분획: 참고예 1에 의해 제조된 시료 3, 티모사포닌 A-Ⅲ 함유 조성물: 칼럼 C-2, 칼럼 E-2)를 첨가하고 37 ℃에서 30일간 배양하였다. 한편, 효능의 우수함을 비교할 수 있는 지표인 양성 대조군으로서 아미노구아니딘(aminoguanidine HCl)을 사용하였다. 30일 후 배양액에서 생성된 최종당화산물의 함량을 분광형광계(spectrofluorometer)[Excitation: 350 nm, Emission: 450 nm]로 그 생성 억제 정도를 분석한다.

도 7은 티모사포닌 A-Ⅲ 함유 생약 조성물(칼럼 C-2, 칼럼 E-2)의 최종 당산화물 생성 억제능을 나타낸 것으로, 두 조성물 모두 유의적으로 최종 당산화물 생성을 저해함을 확인하였다.

실험예 6: 웨스턴 블롯(Western blot)을 이용한 AMPK 효소의 활성 측정

C2C12 세포 배양 및 분화는 상기 실험예 1과 동일한 조건에서 수행하며 후보 물질의 처리 조건도 동일하게 실행하였다(50분 동안 10 μM 처리). 이후, 배양액을 제거하고 세포를 PBS 용액으로 두 번 세척한 후 라이시스(lysis) 완충액(50 mM 트리스 HCl, pH 7.4, 1 % NP-40, 0.25 % 소듐 데옥시콜레이트, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM 소듐 오르쏘바나데이트, 1 mM NaF, 1 ㎍/mL 아프로티닌, 1 ㎍/mL 로이펩틴, 1 ㎍/mL 펩스타틴)를 사용하여 단백질 추출물을 얻었다. AMPK의 활성도는 AMPK의 기질인 아세틸 CoA 카르복시라제의 세린79 잔기의 인산화 정도와 AMPK 활성화 시 필수적으로 동반되는 알파 서브유닛(alpha subunit)의 트레오닌172 잔기의 인산화 정도를 웨스턴 블롯(Western blot) 분석을 통하여 간접적으로 측정하였다. 단백질의 일정한 정량을 확인하기 위해서 ERK(Extracellular signal regulated protein kinase)의 양을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 확인하였다.

도 8은 티모사포닌 A-Ⅲ 및 이것을 함유하는 조성물(칼럼 C-2, 칼럼 E-2) 의 AMPK에 대한 인산화(활성화) 정도를 웨스턴 블롯 결과 및 대조군의 활성을 1.0으로 보았을 때의 상대적 인산화 유도 정도(fold induction)를 나타내었다. 티모사포닌 A-Ⅲ을 함유한 생약 조성물(칼럼 C-2, 칼럼 E-2)이 모두 우수한 활성을 나타냄을 확인하였고, 특히 티모사포닌 A-Ⅲ가 대조군 대비 약 2배 이상의 활성을 나타냄으로써 상기 조성물의 AMPK 활성화 효과에 대한 유효성분임을 확인하였다.

실험예 7: 티모사포닌 A-Ⅲ 함유 생약 조성물의 ob/ob 마우스에서 체중 감소 효과

티모사포닌 A-Ⅲ 함유 조성물 (칼럼 C-2, 칼럼 E-2)은 로지글리타존에서 보이는 심각한 체중증가 현상이 나타나지 않았고, 비만, 당뇨 등의 대사성 질환과 관련된 것으로 알려진 AMPK를 활성화 시킴을 확인하였다[표 3, 도 5, 도 8 참조]. 특히, AMPK 활성화 효과에 있어 티모사포닌 A-Ⅲ가 유효성분인 것을 확인한 바[도 8 참조], 비만 연구의 대표적 모델중 하나인 C57BL/6J-ob/ob 마우스 모델을 이용하여 티모사포닌 A-Ⅲ의 체중감소에 대한 효과를 측정하였다.

8 ~ 9주 된 ob/ob 계통의 수컷 마우스(C57BL/6J-ob/ob)를 실험에 사용하였다. C57BL/6J-ob/ob 마우스 (시상하부의 렙틴 결여로 인한 비만유발)는 식욕 증가로 인한 비만이 발생하며 인슐린 저항성과 혈당 상승, 및 고지혈증을 동반한다. 비만 및 당뇨의 해석, 규명이나 혈당강하제의 약효 스크리닝에 사용되어지고 있는 대표적인 제 2형 비만형 당뇨 동물 모델이다[D. A. Rees 등, Diabetic Medicine; M. Haluzik 등, Endocrinology, 145, 3258, 2004; C.P. O'Donnell 등, Respir. Physiol., 119, 173. 2000]. 0.5% 카르복시메틸셀룰로스(CMC) 용액의 음성대조군, 0.5% 카르복시메틸셀룰로스(CMC) 용액에 녹인 양성대조군(rosiglitazone) 및 시험약물은 매일 오후에 경구 투여하며, 2 ~ 3일 간격으로 약물 투여 직전에 체중변화를 측정하였다. 10일 동안 투여 및 체중측정이 끝난 후, 혈액을 채취하여 혈청을 분리하여 간 기능, 신장 기능 및 지질검사를 위한 생화학 매개변수(Biochemical parameter) 등을 측정하였다.

도 9는 참고예 3에 의하여 얻어진 티모사포닌 A-Ⅲ(180 mg/kg)를 ob/ob 마우스에 경구 투여한 후, 체중 변화를 측정한 것이다. 대조군과 로지글리타존군 모두 체중이 약 7.8% 이상 증가한데 반하여, 티모사포닌 A-Ⅲ의 체중 감소효과(-9.12%)를 확인할 수 있었다[표 4 참조]. 이 결과를 통해 티모사포닌 A-Ⅲ의 체중감소 효과를 확인할 수 있었고, 그 활성은 도 8의 결과와 같이 AMPK 활성화 작용에 기인한 것으로 사료된다.

구분	대조군	로지글리타존	티모사포닌 A-Ⅲ
체중변화율(%)	7.86	7.87	-9.12

상기의 실험(실험예 1 ~ 7)을 바탕으로, 본 발명자들은 티모사포닌 A-Ⅲ 함유 조성물(칼럼 C-2: 티모사포닌 A-Ⅲ 함량 37.6%(w/w), 칼럼 E-2: 티모사포닌 A-III 함량 62.4%(w/w))이 제2형 당뇨 모델에서 강력한 혈당강하 효과, AMPK 활성화 및 이와 연계된 체중 감소 효과, 알도스 환원효소 억제효과, 최종 당산화물 생성 억제 효과를 갖고 있음을 확인하였다.

제제예 1: 분말 및 캅셀제의 제조

티모사포닌 A-Ⅲ 100 ㎎을 락토오스 14.8 ㎎, 결정성 셀룰로오스 3 ㎎, 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎과 함께 섞었다. 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 No.5 젤라틴 캅셀에 채웠다.

제제예 2: 연고제의 제조

티모사포닌 A-Ⅲ를 이용하여 다음과 같은 조성으로 연고제를 제조하였다.

[조성]

유효성분 5 g, 세틸팔미테이트 20 g, 세탄올 40 g, 스테아릴알코올 40 g, 미리스탄이소프로필 80 g, 모노스테아린산 소르비탄 20 g, 폴리솔베이트 60 g, 파라옥시안식향산 프로필 1 g, 파라옥시안식향산 메틸 1 g, 인산 및 정제수 적량

제제예 3: 주사제의 제조

티모사포닌 A-Ⅲ를 이용하여 다음과 같은 조성으로 주사제를 제조하였다.

[조성]

유효성분 100 mg, 만니톨 180 mg, 인산일수소나트륨 25 mg, 주사용 정제수 2974 mg

제제예 4: 건강식품의 제조

1일 복용 기준으로 티모사포닌 A-Ⅲ 0.3 g, 분말비타민 E, 젖산철, 산화아연, 니코틴산 아미드, 비타민 A, 비타민 B1 및 비타민 B2를 혼합하여 제조하였다.

상기 건강식품의 구성성분은 다음과 같다(사람 1일복용량 기준).

유효성분 300 mg

인삼 추출물 100 mg

녹차 추출물 100 mg

비타민 C 100 mg

분말비타민 E 120 mg

젖산철 2 mg

산화아연 2 mg

니코틴산아미드 20 mg

비타민 A 5 mg

비타민 B1 2 mg

비타민 B2 2 mg

옥수수전분 200 mg

스테아린산 마그네슘 20 mg

이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 티모사포닌 A-Ⅲ가 바람직하게는 35 ~ 65%(w/w) 함유된 지모 유래의 생약 조성물은 강력한 혈당강하 효과를 바탕으로 제2형 당뇨병 예방 및 치료에 효과적으로 사용할 수 있고, AMPK 활성화 기작을 통하여 이와 관련된 당뇨와 비만 등을 포함한 대사성 질환에도 사용할 수 있으며, 더 나아가 알도스 환원효소 억제 및 최종 당산화물 생성을 저해함으로써 당뇨 합병증 예방 및 치료에 사용될 수 있다.

Claims (5)

1. 삭제
2. 삭제
3. 1) 지모를 탄소수 1~4개의 저급 알콜 수용액으로 추출하여 얻은 추출물을 3차 증류수로 회수하는 단계;

   2) 상기 회수된 추출물을 동량의 부탄올로 분획하는 단계;

   3) 수득한 부탄올 분획에 동량의 메탄올을 넣고 균질화 시킨 후, 방치하여 침전물을 얻는 단계; 및

   4) 상기 얻어진 침전물을 다이옥산 수용액에 희석시켜 역상 오픈 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 물/메탄올(2:8 ~ 10:1)의 농도구배를 달리한 혼합용매를 용출제로 사용하여 티모사포닌 A-Ⅲ가 35 ~ 65%(w/w) 함유된 조성물을 수득하는 단계

   를 포함하는 방법으로 제조된 티모사포닌 A-Ⅲ가 35 ~ 65%(w/w) 함유된 조성물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 당뇨 합병증 예방 및 치료용 조성물.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 조성물은 경구용 또는 비경구용으로 제형화된 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 삭제

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