CN114085883B - 知母皂苷aⅲ的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及知母皂苷AⅢ的制备方法，属于天然提取物制备领域。知母皂苷AⅢ的制备方法，将破碎后的知母与水混合，在40～60℃下保温至少12h，即将知母中的知母皂苷BⅡ转化为知母皂苷AⅢ；或将知母皂苷BⅡ、破碎后的知母和水在40～60℃下保温至少12h，即将知母皂苷BⅡ转化为知母皂苷AⅢ。本发明方法简单、成本低。

Description

知母皂苷AⅢ的制备方法
技术领域
本发明涉及知母皂苷AⅢ的制备方法，属于天然提取物制备领域。
背景技术
知母为百合科植物知母的根茎，知母Anemarrhena asphodeloides Bunge，为多年生草本。全株无毛。根茎横生，粗壮，密被许多黄褐色纤维状残叶基，下面生有多数肉质须根。叶基生，丛出，线形，长20-70cm，宽3-7mm，上面绿色，下面深绿色，无毛，质稍硬，叶基部扩大包着根茎。花葶直立，不分枝，高50-120cm，下部具披针形退化叶，上部疏生鳞片状小苞片；花2-6朵成一簇，散生在花葶上部呈总状花序，长20-40cm；花黄白色，干后略带比色，多于夜间开放，具短梗；花被片6，基部稍连合，2轮排列，长圆形，长5-8mm，宽1-1.5mm，先端稍内折，边缘较薄，具3条淡绿色纵脉纹；发育雄蕊3，着生于内轮花被片近中部，花药黄色，退化雄蕊3，着生于外轮花被片近基部，不具花药；雌蕊1，子房长卵形，3室，花柱短，柱头1。蒴果卵圆形，长10-15mm，直径5-7mm，成熟时沿腹缝线上方开裂为3裂片，每裂片内能常具1颗种子。种子长卵形，具3棱，一端尖，长8-12mm，黑色。花期5-8月。果期7-9月。主产于河北、山西、陕西、内蒙古等地。具清热泻火，滋阴润燥之功效，为中国药典历版所收载品种。
知母药材化学成分主含皂苷。含总皂苷约6％，从中检出6种皂甙苷，分别称为知母皂苷A-Ⅰ，A-Ⅱ，A-Ⅲ、A-Ⅳ、B-Ⅰ和B-Ⅱ，其中知母皂苷B-Ⅱ即是原知母皂苷A-Ⅲ(prototimosaponinA-Ⅲ)，知母皂苷A-Ⅲ即是知母皂苷(zhimrsaponin)A，又是知母皂苷(anemarsaponin)A1，是萨尔萨皂苷元与知母双糖结合而成的双糖苷，知母皂苷A-Ⅰ是萨尔萨皂苷元β-D-吡喃半乳糖苷。此外还有马尔考皂苷元、新芰脱皂苷元。尚含多量的还原糖和粘液质、鞣酸、脂肪油等。另含芒果苷约0.5％。
知母所含皂苷中知母皂苷BⅡ的含量最高，《中国药典》2020版规定知母药材含知母皂苷BⅡ不少于3.0％；文献报道(不同产地知母药材中芒果苷和知母皂苷BⅡ的含量测定，中国实验方剂学杂志，2010年第16期49-51页)药材中含知母皂苷BⅡ多在5％左右，最高测得含量达10.25％。
知母皂苷BⅡ为呋甾皂苷元；知母皂苷AⅢ为螺甾皂苷元，是知母皂苷BⅡC-22位脱羟基、C-26糖链脱葡萄糖基而成。用传统的酸水解方法将知母皂苷BⅡ水解为知母皂苷AⅢ，反应强烈，条件不容易控制，且C-3糖链容易脱糖而水解为菝葜皂苷元。
随着提取、分离、纯化等技术的发展和应用，目前，国内外对知母各种皂苷及其苷元的研究日渐广泛深入。如授权发明专利ZL201210234803.4公开了一种知母皂苷AⅢ的制备方法。该方法将市售的中药知母饮片或者新鲜采集的知母根茎或须根为原料，采用醇提、酶解、萃取、树脂及硅胶柱层析、结晶组合工艺制得知母皂苷AⅢ。文献报道知母皂苷AⅢ具有抗血小板聚集、改善学习能力和记忆力、降血糖和抗肿瘤等作用，对肝癌、乳腺癌、宫颈癌等肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，如授权发明专利ZL201610637699.1提供了一种用于抑制肝癌、黑色素瘤和乳腺癌等多种恶性肿瘤的TAⅢ脂质体。
发明内容
本发明解决的第一个问题是提供一种不外加任何试剂试药，工艺简单的将知母皂苷BⅡ转化为知母皂苷AⅢ的方法。
知母皂苷AⅢ的制备方法，将破碎后的知母与水混合，在40～60℃下保温至少12h，即将知母中的知母皂苷BⅡ转化为知母皂苷AⅢ；或，将知母皂苷BⅡ、破碎后的知母和水在40～60℃下保温至少12h，即将知母皂苷BⅡ转化为知母皂苷AⅢ。
在一种实施方式中，保温温度为40～55℃；在另一种实施方式中，保温温度为45～55℃；在一种具体的实施方式中，保温温度为50℃。
在一种实施方式中，知母与水的重量比为1:4～12；在另一种实施方式中，知母和水的重量比为1:6～10；在一种具体的实施方式中，知母和水的重量比为1:8。
在一种实施方式中，保温时间为至少18h；在另一种实施方式中，保温时间为18～36h；在一种具体的实施方式中，保温时间为24h。
在一种实施方式中，知母皂苷AⅢ的制备方法，按以下步骤进行：
a、将破碎后的知母药材与水混合，在40～60℃下保温至少12h；然后过滤，得到滤渣和滤液；
b、将滤液浓缩成浸膏A；将滤渣用有机溶剂回流提取，再将提取液浓缩成浸膏B；
c、将浸膏A和浸膏B合并，用水稀释后，加入浸膏总重量3％～8％的活性炭，静置8小时以上，过滤，得到知母皂苷AⅢ提取物滤饼；优选稀释用水的水温为50～100℃；更优选水温为80～95℃；
d、将知母皂苷AⅢ提取物滤饼用有机溶剂加热溶解澄清后，过滤出活性炭，再静置12h以上，过滤，所得滤饼为知母皂苷AⅢ粗品；
e、将知母皂苷AⅢ粗品重结晶，收集结晶，干燥，即为高纯度知母皂苷AⅢ。
在一种实施方式中，步骤a中，破碎后的知母药材粒径在1cm以下。
在一种实施方式中，步骤b中，浸膏A、浸膏B的相对密度均为1.05～1.25，优选相对密度为1.11～1.12。
在一种实施方式中，步骤b和步骤d中的有机溶剂为醇；优选的，醇的浓度为60～80％；进一步优选醇的浓度为70％；更进一步优选为有机溶剂为甲醇或乙醇；再更进一步优选有机溶剂为甲醇。
在一种实施方式中，步骤b中，回流提取时，滤渣与有机溶剂的重量比为1:4～8，优选重量比为1:6；每次提取1～2h，回流提取至少3次；优选回流提取方法为：第1次提取2小时，第2、3次每次提取1小时。
在一种实施方式中，步骤c中，浸膏总重量与水重量的比为1:4～8，优选重量比为1:5；优选过滤采用板框过滤；优选活性炭加入量为5％；优选静置时间为8～36h；更优选静置时间为24h。
在一种实施方式中，步骤d中，知母皂苷AⅢ提取物滤饼与有机溶剂的比为1:8～1:16；优选知母皂苷AⅢ提取物滤饼与有机溶剂的比为1:12，静置时间为30小时。
在一种实施方式中，步骤e中，结晶剂为甲醇或者甲醇/二氯甲烷配伍溶剂，重结晶次数为至少1次；优选结晶剂为甲醇；重结晶次数为2次。
本发明的有益效果：
(1)本发明利用知母自身所带的生物酶，酶解知母皂苷BⅡ为知母皂苷AⅢ，为首次报道，其带来的有益效果是：只需适合的温度和湿度，就可以使知母皂苷BⅡ酶解为知母皂苷AⅢ。药材加工质量高、成本低，环境污染小。
(2)本发明制得知母皂苷AⅢ纯度高，可达98.3％以上。
(3)本发明工艺简单，可操作性强，适宜于工业化生产。
(4)本发明的工艺新颖性、简便性、快捷性、环保性，成本低廉性，生产安全性，药材资源利用率高，是目前其他任何一条工艺都不能比拟的。
附图说明
图1为酶解率随温度的变化曲线图。
图2为酶解率随加水量的变化曲线图。
图3为酶解率随酶解时间的变化曲线图。
图4为知母皂苷AⅢ的结构图。
图5为知母皂苷BⅡ的结构图。
图6为实施例2所得知母皂苷AⅢ的碳谱图。
图7为实施例2所得知母皂苷AⅢ的碳谱图的局部放大图。
图8为实施例2所得知母皂苷AⅢ的碳谱图的局部放大图。
图9为实施例2所得知母皂苷AⅢ的氢谱图。
图10为实施例2所得知母皂苷AⅢ的氢谱图的局部放大图。
图11为实施例2所得知母皂苷AⅢ的液相色谱图。
图12为实施例3所得知母皂苷AⅢ的液相色谱图。
图13为实施例4所得知母皂苷AⅢ的液相色谱图。
具体实施方式
知母皂苷AⅢ的制备方法，将破碎后的知母与水混合，在40～60℃下保温至少12h，即将知母中的知母皂苷BⅡ转化为知母皂苷AⅢ；或，将知母皂苷BⅡ、破碎后的知母和水在40～60℃下保温至少12h，即将知母皂苷BⅡ转化为知母皂苷AⅢ。
本发明发现知母本身带有可以酶解苷键的生物酶，该酶在适宜的温度和湿度下，活性增强，直接作用于知母皂苷BⅡ的C-22位羟基和C-26糖链葡萄糖基，从而自身酶解将知母皂苷BⅡ转化为一种螺甾皂苷——知母皂苷AⅢ。
为了提高酶解率，在一种实施方式中，保温温度为40～55℃；优选保温温度为45～55℃；更优选保温温度为50℃。
为了提高酶解率，在一种实施方式中，知母与水的重量比为1:4～12；优选的，知母和水的重量比为1:6～10；更有选的，知母和水的重量比为1:8。
为了提高酶解率，在一种实施方式中，保温时间为至少18h；优选的，保温时间为18～36h；更优选的，保温时间为24h。
在一种实施方式中，保温可以采用带盖的保温容器。带盖的保温容器为带温度控制器的提取罐或反应釜、带温度控制器的不锈钢缸罐或桶、带温度控制器的保温池。
为了得到高纯度的知母皂苷AⅢ，在上述方案的基础上，继续通过醇提水淀、活性炭吸附，醇结晶，甲醇或甲醇/二氯甲烷配伍溶剂重结晶，制得高纯度知母皂苷AⅢ，知母皂苷AⅢ纯度达98.3％以上。
在一种实施方式中，知母皂苷AⅢ的制备方法，按以下步骤进行：
a、将破碎后的知母药材与水混合，在40～60℃下保温至少12h；然后过滤，得到滤渣和滤液；
b、将滤液浓缩成浸膏A；将滤渣用有机溶剂回流提取，再将提取液浓缩成浸膏B；
c、将浸膏A和浸膏B合并，用水稀释后，加入浸膏总重量3％～8％的活性炭，静置8小时以上，过滤，得到知母皂苷AⅢ提取物滤饼；
d、将知母皂苷AⅢ提取物滤饼用有机溶剂加热溶解澄清后，过滤出活性炭，再静置12h以上，过滤，所得滤饼为知母皂苷AⅢ粗品；
e、将知母皂苷AⅢ粗品重结晶，收集结晶，干燥，即为高纯度知母皂苷AⅢ。
在一种实施方式中，步骤a中，破碎后的知母药材粒径在1cm以下。
为了提高知母皂苷AⅢ的纯度，在一种实施方式中，步骤b中，浸膏A、浸膏B的相对密度均为1.05～1.25，优选相对密度为1.11～1.12。
在一种实施方式中，步骤b和步骤d中的有机溶剂为醇；优选的，醇的浓度为60～80％；进一步优选醇的浓度为70％；更进一步优选为有机溶剂为甲醇或乙醇；再更进一步优选有机溶剂为甲醇。
在一种实施方式中，步骤b中，回流提取时，滤渣与有机溶剂的重量比为1:4～8，优选重量比为1:6；每次提取1～2h，回流提取至少3次；优选回流提取方法为：第1次提取2小时，第2、3次每次提取1小时。
在一种实施方式中，步骤c中，稀释用水的水温为50～100℃；优选水温为80～95℃。采用温度较高的水，可以提高除杂效果。
步骤c中，活性炭的加入量为3～8％。如果活性炭加入量少，除杂效果和助滤不好，活性炭加入量过多会造成皂苷过多损耗。活性炭的主要作用的吸附部分色素成分及助滤。
在一种实施方式中，步骤c中，浸膏总重量与水重量的比为1:4～8，优选重量比为1:5；优选过滤采用板框过滤；优选活性炭加入量为5％；优选静置时间为8～36h；更优选静置时间为24h。
在一种实施方式中，步骤d中，知母皂苷AⅢ提取物滤饼与有机溶剂的比为1:8～1:16；优选知母皂苷AⅢ提取物滤饼与有机溶剂的比为1:12，静置时间为30小时。
在一种实施方式中，步骤e中，结晶剂为甲醇或者甲醇/二氯甲烷配伍溶剂，重结晶次数为至少1次；优选结晶剂为甲醇；重结晶次数为2次。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
本发明实施例所使用原料、辅料或化学试剂，均通过常规商业途径获得。
实施例1
1、知母药材中知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ的含量测定
1.1色谱条件
知母皂苷BⅡ色谱条件：仪器为waters2695-2996 DAD配alltech 2000es ELSD；色谱柱为Thermo HyPURITY C18(4.6*150mm,3.0um)色谱柱；乙腈-水(25：75)为流动相。
知母皂苷AⅢ色谱条件：仪器为waters2695-2996 DAD配alltech 2000es ELSD；色谱柱为Thermo HyPURITY C18(4.6*150mm,3.0um)色谱柱；乙腈-水(25：75)为流动相。
1.2供试品的制备
1.2.1知母药材中知母皂苷AIII的供试品的制备。
取知母药材粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，称定重量，超声提取30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀。滤过，取续滤液，即得。
1.2.2.知母药材中知母皂苷BII的供试品的制备。
取知母药材粉末(过三号筛)约0.15g，精密称定，置塞锥形瓶中，精密加入30％丙酮25ml，称定重量，超声提取30分钟，取出，放冷，再称定重量，用30％丙酮补足减失的重量，摇匀。滤过，取续滤液，即得。
1.3测定
分别精密吸取对照品溶液5μ1,10μ1,供试品溶液5-10μ1,注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。
1.4测定
知母药材中知母皂苷BII、知母皂苷AIII含量测定结果见下表1。
表1
批次 知母皂苷BII含量(％) 知母皂苷AIII含量(％)
210301 4.32 0.12
2、单因素筛选知母药材自身酶酶解知母皂苷BⅡ条件
2.1温度单因素筛选
取批次为210301的净选知母药材，破碎为1cm以下的碎块，堆放于带盖的保温容器中；按药材重量比，加入8倍量40～60℃温水，搅拌均匀，盖上保温容器的盖；在40～60℃保温，不定时翻动物料的情况下，保温时间24小时；从保温容器中取出物料，测定酶解后知母药材及浸出液中知母皂苷BⅡ的量，结合酶解前知母皂苷BⅡ的量，计算知母皂苷BⅡ酶解率，以酶解率为指标筛选酶解温度。温度50℃时酶解效果最佳，见下表2和图1。
表2
温度/℃ 40 45 50 55 60
酶解率/％ 75.12 85.22 98.25 88.35 65.12
2.2加水量(湿度)单因素筛选
取批次为210301的净选知母药材，破碎为1cm以下的碎块，堆放于带盖的保温容器中；按药材重量比，加入4～12倍量50℃温水，搅拌均匀，盖上保温容器的盖；在50℃保温，不定时翻动物料的情况下，保温时间24小时；从保温容器中取出物料，测定酶解后知母药材及浸出液中知母皂苷BⅡ的量，结合酶解前知母皂苷BⅡ的量，计算知母皂苷BⅡ酶解率，以酶解率为指标筛选加水量。加水量8倍时为最佳加水量，见下表3和图2。
表3
加水量(倍数) 4 6 8 10 12
酶解率/％ 86.56 92.35 98.16 93.11 88.12
2.3酶解时间单因素筛选
取批次为210301的净选知母药材，破碎为1cm以下的碎块，堆放于带盖的保温容器中；按药材重量比，加入8倍量50℃温水，搅拌均匀，盖上保温容器的盖；在50℃保温，不定时翻动物料的情况下，保温时间12～36小时；从保温容器中取出物料，测定酶解后知母药材及浸出液中知母皂苷BⅡ的量，结合酶解前知母皂苷BⅡ的量，计算知母皂苷BⅡ酶解率，以酶解率为指标筛选加酶解时间。酶解24小时即达最佳时间，见下表4、图3。
表4
酶解时间/h 12 18 24 30 36
酶解率/％ 65.88 80.16 98.36 98.59 98.99
实施例2
净选批次为210301的知母药材50KG，破碎为1cm以下的碎块，堆放于带盖的保温容器中；按药材重量比，加入8倍量50℃温水，搅拌均匀，盖上保温容器的盖；在50℃保温，不定时翻动物料的情况下，保温时间24小时；过滤，
浸泡液浓缩成相对密度1.05的浸膏，药渣回流提取3次，每次用4倍量60％甲醇，每次提取1小时，合并提取液回收甲醇后，浓缩成相对密度1.05的浸膏；
合并浸泡液和提取液浸膏用4倍量沸水稀释，加入浸膏量3％的活性炭，静置8小时，板框过滤，得到知母皂苷AⅢ提取物滤饼；
知母皂苷AⅢ提取物滤饼用料液比为1:8的60％甲醇加热溶解澄清后，过滤出活性炭后静置12小时，过滤得到知母皂苷AⅢ粗品；知母皂苷AⅢ粗品用甲醇重结晶3次，收集结晶，干燥，得到知母皂苷AⅢ0.95Kg，知母皂苷AⅢ纯度99.36％。
本实施例产品的碳谱图见图6～8，氢谱图见图9、图10，液相色谱图见图11。
实施例3
净选批次为210301的知母药材50KG，破碎为1cm以下的碎块，堆放于带盖的保温容器中；按药材重量比，加入8倍量50℃温水，搅拌均匀，盖上保温容器的盖；在50℃保温，不定时翻动物料的情况下，保温时间24小时；过滤，
浸泡液浓缩成相对密度1.11的浸膏，药渣回流提取3次，每次用6倍量70％甲醇，提取时间为第1次提取2小时，第2、3次每次提取1小时，合并提取液回收甲醇后，浓缩成相对密度1.12的浸膏；
合并浸泡液和提取液浸膏用5倍量沸水稀释，加入浸膏量5％的活性炭，静置24小时，板框过滤，得到知母皂苷AⅢ提取物滤饼；
知母皂苷AⅢ提取物滤饼用料液比为1:12的70％甲醇加热溶解澄清后，过滤出活性炭后静置30小时，过滤得到知母皂苷AⅢ粗品；知母皂苷AⅢ粗品用甲醇重结晶2次，收集结晶，干燥，得到知母皂苷AⅢ1.22Kg，知母皂苷AⅢ纯度99.53％。
本实施例产品的液相色谱图见图12。
实施例4
净选批次为210301的知母药材50KG，破碎为1cm以下的碎块，堆放于带盖的保温容器中；按药材重量比，加入8倍量50℃温水，搅拌均匀，盖上保温容器的盖；在50℃保温，不定时翻动物料的情况下，保温时间24小时；过滤，
浸泡液浓缩成相对密度1.25的浸膏，药渣回流提取3次，每次用8倍量80％甲醇，每次提取2小时，合并提取液回收甲醇后，浓缩成相对密度1.25的浸膏；
合并浸泡液和提取液浸膏用8倍量沸水稀释，加入浸膏量8％的活性炭，静置36小时，板框过滤，得到知母皂苷AⅢ提取物滤饼；
知母皂苷AⅢ提取物滤饼用料液比为1:16的80％甲醇加热溶解澄清后，过滤出活性炭后静置48小时，过滤得到知母皂苷AⅢ粗品；知母皂苷AⅢ粗品用甲醇/二氯甲烷配伍溶剂重结晶2次，收集结晶，干燥，得到知母皂苷AⅢ1.05Kg，知母皂苷AⅢ纯度98.39％。
本实施例产品的液相色谱图见图13。

Claims (28)

1.知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，按以下步骤进行：
a、将破碎后的知母药材与水混合，在40~60℃下保温至少12 h；然后过滤，得到滤渣和滤液；
或将知母皂苷BⅡ、破碎后的知母药材与水混合，在40~60℃下保温至少12 h；然后过滤，得到滤渣和滤液；
其中，知母与水的重量比为1:4~12；
b、将滤液浓缩成浸膏A；将滤渣用有机溶剂回流提取，再将提取液浓缩成浸膏B；
c、将浸膏A和浸膏B合并，用水稀释后，加入浸膏总重量3%～8%的活性炭，静置8小时以上，过滤，得到知母皂苷AⅢ提取物滤饼；
d、将知母皂苷AⅢ提取物滤饼用有机溶剂加热溶解澄清后，过滤出活性炭，再静置12h以上，过滤，所得滤饼为知母皂苷AⅢ粗品；
e、将知母皂苷AⅢ粗品重结晶，收集结晶，干燥，即为高纯度知母皂苷AⅢ。
2.根据权利要求1所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，a步骤中，破碎后的知母药材粒径在1cm以下。
3.根据权利要求1所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，a步骤中，保温温度为40~55℃。
4.根据权利要求1所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，a步骤中，保温温度为45~55℃。
5.根据权利要求1所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，a步骤中，保温温度为50℃。
6.根据权利要求1所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，a步骤中，知母与水的重量比为1:6~10 。
7.根据权利要求1所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，a步骤中，知母与水的重量比为1:8 。
8.根据权利要求1所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，a步骤中，保温时间为至少18h。
9.根据权利要求1所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，a步骤中，保温时间为18~36h。
10.根据权利要求1所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，a步骤中，保温时间为24h。
11.根据权利要求1所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，b步骤中，浸膏A、浸膏B的相对密度为1.05～1.25 。
12.根据权利要求1所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，b步骤中，浸膏A、浸膏B的相对密度为1.11~1.12 。
13.根据权利要求1所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，c步骤中，稀释用水的水温为50~100℃ 。
14.根据权利要求1所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于， c步骤中，稀释用水的水温为80~95℃ 。
15.根据权利要求1所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，步骤b和步骤d中的有机溶剂为醇，醇的浓度为60%~80%。
16.根据权利要求15所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，醇的浓度为70%。
17.根据权利要求15或16所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇或乙醇。
18.根据权利要求15或16所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇。
19.根据权利要求1所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，步骤b中，回流提取时，滤渣与有机溶剂的重量比为1:4~8；每次提取1~2h，回流提取至少3次。
20.根据权利要求18所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，步骤b中，回流提取时，滤渣与有机溶剂的重量比为1:6；回流提取方法为：第1次提取2小时，第2、3次每次提取1小时。
21.根据权利要求1所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，步骤c中，浸膏总重量与水重量的比为1:4~8。
22.根据权利要求20所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，步骤c中，浸膏总重量与水重量的比为1:5。
23.根据权利要求20或21所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，步骤c中，过滤采用板框过滤，活性炭加入量为5%，静置时间为8~36h。
24.根据权利要求22所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，静置时间为24h。
25.根据权利要求1所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，步骤d中，知母皂苷AⅢ提取物滤饼与有机溶剂的比为1:8～1:16。
26.根据权利要求24所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，步骤d中，知母皂苷AⅢ提取物滤饼与有机溶剂的比为 1:12，静置时间为30小时。
27.根据权利要求1所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，步骤e中，结晶剂为甲醇或者甲醇/二氯甲烷配伍溶剂，重结晶次数为至少1次。
28.根据权利要求26所述的知母皂苷AⅢ的制备方法，其特征在于，步骤e中，结晶剂为甲醇，重结晶次数为2次。
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