CN107163059B

CN107163059B - 一种芒果核鞣花酸的制备方法

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Publication number: CN107163059B
Application number: CN201710391212.0A
Authority: CN
Inventors: 康超; 段振华; 罗杨合; 李燕; 伍淑婕; 莫福旺; 邓年方; 谢微; 苏辉兰; 帅良
Original assignee: Hezhou University
Current assignee: Hezhou University
Priority date: 2017-05-27
Filing date: 2017-05-27
Publication date: 2019-08-20
Anticipated expiration: 2037-05-27
Also published as: CN107163059A

Abstract

本发明公开了一种芒果核鞣花酸的制备方法，属于食品技术及生物技术领域。本发明的芒果核鞣花酸提取物以芒果核为原料，经过醇提取及大孔树脂、硅胶柱层析纯化方法制备得到。本发明制备的芒果核鞣花酸提取物具有显著的抑菌、抗氧化、抗衰老等作用，可作为抗氧化保健品或药物而进一步研究开发。

Description

一种芒果核鞣花酸的制备方法

技术领域

本发明涉及一种芒果核鞣花酸的制备方法，属于食品技术及生物技术领域。

背景技术

鞣花酸(ellagic acid)是没食子酸的二聚衍生物，属于鞣花酸类化合物，存在于多种植物的果实中。近几年，鞣花酸因其具有显著的抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、增强免疫生理活性、美白等而受到人们的关注。

目前，鞣花酸的制备方法主要有以下几种方法：

(1)植物提取方法：从植物中提取鞣花酸。自然界中，红木莓、草莓、石榴以及蕨类等植物中含有少量鞣花酸((1％)。目前，国际上有公司以草莓、石榴为原料，可生产出含量为5-40％左右的天然鞣花酸提取物，用于食品添加剂，但难以生产高纯度的鞣花酸，由于受原料成本较高，且原料中鞣花酸含量的限制而意义不大。虽然欧洲专利(EP0390107A2Kiyoshi M.，Yasuhiko I.，Katsumi Y.，etal)公开了另一种方法制备含量为50-60％的鞣花酸，以五倍子为原料，用甲醇提取，但是五倍子是动物的虫瘦，虽属于中药但是仅限于外用，因此，以五倍子为生产原料制备的鞣花酸不能用于食品添加剂。得到的鞣花酸品质较低，外观与颜色较差；再加上述方法步骤繁多，周期长，生产成本高，不易大规模投产。中国专利(200810073982.1)公开了一种高纯度的鞣花酸的制备方法，以塔拉粉为原料经纯净水或50-90％乙醇或甲醇水溶液提取、通过浓硫酸或双氧水水解、使用二乙胺或三乙胺纯化、结晶，可以得到高纯度鞣花酸，但用到强酸等腐蚀性试剂，步骤繁琐。

(2)化学合成方法：由于没食子酸或没食子酸酯通过酶作用下的氧化聚合作用制取鞣花酸，这一鞣花酸的制备方法，产率为20-30％，但所用的没食子酸(酯)本身的制备过程十分繁琐复杂，酶也需要精制纯化，而且产物中还有一种未知的醌类物质，其与鞣花酸的比例为1∶2.4，为产品的分离纯化带来了很大困难，因此目前较少用此法进行鞣花酸的生产。

芒果属于性平味甘、解渴生津的果品，有益胃、止呕、防晕的功效。芒果中含有的芒果苷具有明显的抗过氧化、保护脑神经元和祛痰止咳的功效。

广西作为我国生产芒果为数不多的主要省份之一，更是具有芒果资源丰富，品种繁多等优势，但是目前市场上主要还是以产地鲜销为主，少量加工成果汁、果脯以及果肉为辅外，芒果深加工产业亟待需要进一步发展。在芒果生产加工中的废弃物，在过去常被丢弃或者饲养牲畜。近年来，人们逐渐对芒果废弃物进行研究，包括芒果叶、芒果皮、芒果核、芒果树皮等，尤其是占芒果总重20-60％的芒果核获得大部分研究者和企业家的关注。

据报道，芒果核富含有氨基酸、多肽、蛋白质、酚类、黄酮、多糖、有机酸、皂苷、鞣质、黄酮、蒽醌、生物碱、香豆素与内酯、三萜及甾体、生物碱、挥发油及油脂等多种活性成分。

发明内容

为了充分利用自然资源，尤其是广西特色果蔬资源，课题组研究发现芒果中芒果甙和鞣花酸含量较高，为了得到纯度和含量较高核鞣花酸，本发明提供了一种芒果核鞣花酸制备方法。本发明方法是经过醇提取及大孔树脂、硅胶柱层析纯化方法制备得到了纯度高、含量高的芒果核鞣花酸，且所用试剂安全无毒，得到的产品是食品安全的，具有广泛的应用前景。

本发明的芒果核鞣花酸的制备方法，是先将芒果核干燥粉碎，用乙醇提取后浓缩得到提取液浸膏，再用乙醇溶解并用大孔吸附树脂进行吸附，从大孔吸附树脂上得到醇浓度40-70％(v/v)的乙醇溶液洗脱的含有鞣花酸组分的洗脱液；再利用硅胶柱层析进行分离，得到含有鞣花酸的馏分，馏分经去溶剂、浓缩或干燥得到鞣花酸提取物。

在一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：

(1)将芒果核干燥粉碎；

(2)用醇浓度20-90％(v/v)的乙醇溶液作为溶剂对步骤(1)中得到的芒果核干燥粉末进行提取，然后将得到的提取液减压浓缩或真空冷冻干燥至浸膏；

(3)将步骤(2)中得到的浸膏用水或醇浓度小于50％(v/v)的乙醇溶液溶解，除去不溶物，得到大孔吸附树脂上样溶液；

(4)取非极性或弱极性大孔吸附树脂，将步骤(3)得到的上样溶液上样，先用水洗去杂质，然后用醇浓度40-70％(v/v)的乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液；所述大孔吸附树脂和芒果核干燥粉末重量比为1:0.5-1:20；

(5)将步骤(4)收集的洗脱液减压浓缩或真空冷冻干燥至浸膏，浸膏用水或醇浓度小于50％(v/v)的乙醇溶液溶解，除去不溶物，得到硅胶柱上样溶液；然后进行硅胶柱层析结合薄层色谱分析，得到含有鞣花酸的馏分，并减压浓缩或真空冷冻干燥；得到芒果核鞣花酸提取物。

在一种实施方式中，步骤(2)中提取方法为每千克芒果核粉末加入2-50L醇浓度为30％-80％的乙醇溶液，热回流或浸渍或浸漉提取2-5次，合并提取液；其中热回流提取时每次提取1-3h，浸渍或浸漉提取时每次提取10-15天。

在一种实施方式中，所述步骤(2)的提取，乙醇浓度为40％-60％。

在一种实施方式中，所述步骤(2)的提取，料液比(芒果核粉末质量与乙醇溶液之比，m/v)为1:1-1:40，优选1:5-1:30，更优选地为1:15-1:25。

在一种实施方式中，所述步骤(3)中浸膏的溶解所用的水或乙醇溶液的重量为浸膏重量的3-50倍。

在一种实施方式中，步骤(3)的提取方法如下：将步骤(2)中得到的浸膏用10倍浸膏重量的水或者10％乙醇溶液溶解，除去不溶物后得到上样溶液。

在一种实施方式中，步骤(3)的除去不溶物，是采用过滤或离心的方法。

在一种实施方式中，步骤(4)的大孔吸附树脂的类型选用HPD-722、HPD-826、LX-17、LX-26、LX-28、SP70、SP700、AB-8、DM21或者D101，优选大孔树脂AB-8、DM21、D101，更优选地为AB-8。

在一种实施方式中，步骤(4)中的先用水洗去杂质，是指用2-5BV的水进行洗脱以除去杂质。

在一种实施方式中，所述步骤(4)的洗脱流速为洗脱液流速1BV/h-10BV/h，优选为2BV/h-5Bv/h。

在一种实施方式中，所述步骤(4)中，芒果核粉末质量：树脂质量为1:1-10:1。

在一种实施方式中，所述步骤(5)的硅胶柱层析分离，是将硅胶柱上样溶液加入到硅胶层析柱中，然后向柱子中不同梯度的洗脱剂进行梯度洗脱；其中洗脱剂分别为氯仿：丙酮：甲酸的体积比为95:4:1、94:5:1、93:6:1、92:7:1、90:9:1的氯仿/丙酮/甲酸混合液；每个梯度用1～10倍的柱体积洗脱液进行洗脱。

在一种实施方式中，所述步骤(5)中氯仿/丙酮/甲酸混合液每个梯度用3倍的柱体积洗脱液进行洗脱.

在一种实施方式中，所述步骤(5)的硅胶柱层析的洗脱步骤，控制流速在2mL/min。

在一种实施方式中，所述薄层色谱分析所用的展开剂为氯仿：丙酮：甲酸＝9:0.9:0.1或石油醚：丙酮：甲酸＝7.9:2:0.1或石油醚：乙酸乙酯：甲酸＝6:3.9:0.1或环己烷：乙酸乙酯：甲酸＝6.9:3:0.1或氯仿：甲醇＝6:1。

本发明还要求保护按照所述制备方法或者纯化方法得到的芒果核鞣花酸提取物，及其在制备食品、保健品或药物上的应用。

在一种实施方式中，所述保健品或药物，是具有美白、抑菌抗氧化活性的保健品或药物。

本发明的有益效果：

(1)本发明提出的一种芒果核制备鞣花酸提取物的方法，芒果核原料采用水醇提取，蒸发浓缩、大孔吸附树脂、硅胶柱层析分离方法可得到鞣花酸提取物。得到的提取物中鞣花酸的纯度可达85-88％。

(2)本发明采用的芒果核原料，在我国有丰富的资源；从芒果核中提取、纯化具有生物活性的鞣花酸，变废为宝，提升了芒果的综合利用价值。

(3)本发明方法工艺简单，适合大规模生产。以芒果核为原料生产价格昂贵的鞣花酸，具有非常广阔的经济前景。

附图说明

图1为鞣花酸标准样品及获得的鞣花酸提取物的红外光谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

各实施例中使用的仪器设备、化学试剂以及检测方法如下：

仪器与设备：FW100高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；UPC-Ⅱ-20T优普系列超纯水器，四川优普超纯科技有限公司；SQP电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；ZWYR-D2403振荡培养箱，上海智诚分析仪器制造有限公司；SHZ-DⅢ予华牌循环水真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；HHS-6S电子恒温不锈钢水浴锅，上海宜昌仪器纱筛厂；UV1901PC紫外可见分光光度计，上海奥析科学仪器有限公司；

化学试剂：无水碳酸钠、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、福林酚试剂、没食子酸标准品、鞣花酸标准品、各种类型大孔树脂、硅胶板等均由柳州苏利有限责任公司提供。

鞣花酸提取物中鞣花酸纯度的测定：

分别吸取标准溶液1，5，10，15和20mL于200mL容量瓶中，加水稀释定容至刻度线，配成质量浓度依次为0.5，2.5，5，7.5和10μg/mL的对照品稀释液。以纯水为参比，在标准溶液紫外光谱测定的最大吸收波长下，测定不同浓度对照品溶液的吸光度，重复测定3次，取其平均值。以鞣花酸标准品溶液质量浓度(ρ)为横坐标，相应的吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线。将分离纯化获得的样品分别配制5.0μg/mL的石榴皮鞣花酸供试品检测溶液，分别稀释1000倍后测定其吸光度，根据标准曲线回归方程计算鞣花酸质量浓度，再推算出鞣花酸质量，计算鞣花酸提取液中鞣花酸的纯度，即鞣花酸纯度＝(提取液中鞣花酸质量浓度×稀释倍数×提取液体积)/鞣花酸提取液干质量*100％。

抗氧化活性的测定：

清除羟基自由基能力测定：分别取不同质量浓度的待测样液于5只试管中，各加入硫酸亚铁、双氧水，静置，10min后加入水杨酸，静置后在510nm处测定吸光度A₁，用蒸馏水替代水杨酸按照上述方法测定吸光度值A₂，用蒸馏水代替待测液按上述方法测定吸光度值A₀，V_C做对照，按照下列公式求鞣花酸物质对羟自由基的清除率：羟自由基(％)＝[A₀-(A₁-A₂)]/(A₀)*100(％)。

DPPH清除能力测定：分别取2.0mL不同质量浓度(1.0、5.0、10.0、15.0、芒果核活性成分样液于5只试管中，各加入2mLDPPH(0.04mg/ml)，静置20min在517nm检测吸光度A₁；以无水乙醇代替DPPH，按照上述方法测定吸光度A₂；做空白组按上述方法测定吸光度A₀，以V_C做对照，样品对DPPH自由基的清除率：DPPH清除率(％)＝[1-(A₁-A₂)/A₀]*100(％)。

鞣花酸对弹性蛋白酶抑制率的测定：采用分光光度法测定鞣花酸对弹性蛋白酶的抑制率。以刚果红-弹性蛋白为底物，弹性蛋白被酶分解后，刚果红会脱落，测定溶液中刚果红的含量以表征酶活性。以pH 8.8硼酸盐缓冲溶液分别配制不同浓度的鞣花酸、芒果核粗提物溶液。具塞三角烧瓶中依次加入刚果红-弹性蛋白及硼酸缓冲溶液，置于37℃水浴中预热10min，然后加入不同浓度的样品溶液及0.2mg/mL弹性蛋白酶溶液。将上述反应体系置于37℃恒温水浴振荡器中振摇20min，立即加入5.0mLpH 6.0磷酸缓冲溶液混合终止反应，于5000r/min下离心15min。准确吸取上清液2.0mL，加入pH 8.8硼酸缓冲液和pH 6.0磷酸缓冲液等量混合液2.0mL，充分摇匀并于495nm测定其吸光度，

抑制率计算公式如下：

抑制率＝(1-(A₁-A₂)/(B₁-B₂))×100％

表1反应液组成与体积

实施例1：本发明的芒果核鞣花酸的粗提取

粗提取：芒果核干燥粉碎，秤取芒果核粉末1kg加入20L浓度为50％的乙醇，热回流提取三次，热回流提取每次1h，合并提取液，提取液减压浓缩汁浸膏，浸膏用浸膏重量10倍的水溶解，过滤出去不溶物，得到上样溶液，即为芒果核鞣花酸的粗提物。

实施例2：大孔吸附树脂、硅胶柱层析纯化工艺

(1)大孔吸附树脂上柱：将实施例1得到的上样溶液进行大孔吸附树脂AB-8的上柱，控制流出液流速为0.5BV/h，上样量与树脂AB-8体积比为2:1，至提取液全部进入树脂床。

(2)大孔吸附树脂的乙醇洗脱：处理好的AB-8树脂20ml于柱内，加芒果核鞣花酸提取液于柱顶，以0.5BV/h的流速进行吸附后，再用5BV的70％乙醇以2BV/h流速进行单独洗脱，按照树脂体积流出收集洗脱液。

(3)硅胶柱层析：

上样：称取从大孔吸附树脂中经70％体积浓度乙醇洗脱流出液真空干燥后的样品，将样品用尽可能少量的乙醇溶解，并加入少量100-200目的硅胶拌拌匀，然后进行旋转蒸发直至乙醇挥发后，将混有样品的硅胶倒入装好的硅胶层析柱中，使样品表面平整，并在样品表面再覆盖上一层石英砂，以防在添加洗脱剂时样品被冲散。其中真空干燥后的样品与硅胶总质量比为1:100～1:130。

过柱及洗脱收集：当上样结束后，就向柱子中不同梯度的洗脱剂进行梯度洗脱(氯仿：丙酮：甲酸＝95:4:1、94:5:1、93:6:1、92:7:1、90:9:1)，每个梯度用3倍的柱体积洗脱液进行洗脱，控制流速在2mL/min，每15-20mL左右接一个馏分。在低于40℃真空旋转蒸发器回收洗脱溶剂，样品备用。

硅胶层析柱分离组分的定性鉴定：将收集好的分离组分，通过硅胶薄层层析板检测收集的组分是否为同一组分，同一组分则合并，合并完成后，采用10％的硫酸-乙醇溶液以及碘进行显色反应来初步定性判定各洗脱组分。

结果显示，将经硅胶层析柱分离的含有鞣花酸馏分干燥，得到的鞣花酸提取物中鞣花酸的纯度为85-88％。

如图1所示，为鞣花酸标准样品及获得的鞣花酸提取物的红外光谱图。从红外图谱中可以看出主要吸收峰[IR(KBr)]/cm^-1：2955，2925，1699，1618，1583，1512，1451，1397，1340，1259，1196，1112，1056，924，883，756。其中2955和2925cm^-1是由于C-H伸缩振动引起，1699cm^-1附近的吸收峰是为C＝O的伸缩振动引起的；1618，1583，1512，1451cm^-1是苯环上的C＝C伸缩振动峰，924、883及756cm^-1出现的吸收峰是C-H面外弯曲振动引起的，且756cm^-1是判断为苯环邻二取代的重要峰值。所获得的鞣花酸提取物与鞣花酸标准品的红外图谱峰重合性较好，各个峰波数大致相同。

实施例3：不同大孔吸附树脂洗脱液经硅胶层析柱分离得到的鞣花酸纯度

(2)取11份处理好的AB-8树脂20ml于柱内，加芒果核鞣花酸提取液于柱顶，以0.5BV/h的流速进行吸附后，再分别用5BV的水、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％乙醇以2BV/h流速进行单独洗脱，按照树脂体积流出收集洗脱液。

(3)硅胶柱层析：

上样：称取从大孔吸附树脂中经水、5％-90％体积浓度乙醇洗脱流出液真空干燥后的样品，将样品用尽可能少量的乙醇溶解，并加入少量100-200目的硅胶拌拌匀，然后进行旋转蒸发直至乙醇挥发后，将混有样品的硅胶倒入装好的硅胶层析柱中，使样品表面平整，并在样品表面再覆盖上一层石英砂，以防在添加洗脱剂时样品被冲散。

过柱及洗脱收集：当上样结束后，就向柱子中不同梯度的洗脱剂进行梯度洗脱(氯仿：丙酮：甲酸＝95:4:1、94:5:1、93:6:1、92:7:1、90:9:1)，每个梯度用3倍的柱体积洗脱液进行洗脱，控制流速在2mL/min，每15-20mL左右接一个馏分。在低于40℃真空旋转蒸发器回收洗脱溶剂，样品备用。经过硅胶柱层析后合并含有鞣花酸的馏分，得到芒果核鞣花酸提取物。

结果显示，芒果核鞣花酸提取物中，由水洗脱液得到的提取物的鞣花酸纯度约为10％，5％乙醇洗脱液得到的提取物的鞣花酸纯度约为15％，10％乙醇洗脱液得到的提取物的鞣花酸纯度约为18％，20％乙醇洗脱液得到的提取物的鞣花酸纯度约为22％，30％乙醇洗脱液得到的提取物的鞣花酸纯度约为28％，40％乙醇洗脱液得到的提取物的鞣花酸纯度约为40％，50％乙醇洗脱液得到的提取物的鞣花酸纯度约为58％，60％乙醇洗脱液得到的提取物的鞣花酸纯度约为70％，70％乙醇洗脱液得到的提取物的鞣花酸纯度约为85％，80％乙醇洗脱液得到的提取物的鞣花酸纯度约为30％，90％乙醇洗脱液得到的提取物的鞣花酸纯度约为20％。

实施例4：本发明方法得到的芒果核鞣花酸的抗菌抗氧化性能

抑菌效果的测定：

将供试菌株于斜面培养基上活化，用接种环挑取环1-2环于50mL无菌生理盐水三角瓶中振荡10min(内有数粒玻璃珠)，要求菌悬液约10⁸CFU/mL左右备用。称取一定量真空冷冻干燥的实施例2得到的芒果核鞣花酸提取物样品，在超净工作台上用无菌的40％乙醇水溶液溶解样品至所需的浓度，备用。新鲜配制的培养基基于121℃条件下灭菌，当培养基冷至50-60℃时，于超净工作台上将培养基倒入灭菌的的培养皿中，每皿15-20mL培养基，待平板冷却后，每皿中加入0.5mL菌悬液，用三角玻璃涂棒均匀涂成薄板备用。将无菌滤纸片浸入配好的药液其中12h，沥干。每一含菌平板上，呈正三角形排布3片带药无菌纸片，细菌于37℃条件下培养24h，啤酒酵母和黑曲霉于30℃条件下培养5d，测其抑菌圈直径。根据抑菌圈大小来确定其抑菌效果。以不加芒果核鞣花酸溶液只加菌悬液为对照。结果显示，本发明得到的芒果核鞣花酸具有强烈的抑菌效果。

芒果核鞣花酸物质抗氧化活性研究：

羟基是活性最强的活性氧化自由基，会诱发机体产生氧化损伤，其清除率常常是反应药物抗氧化作用的重要指标。同样的，超氧阴离子也是生物体主要的活性氧自由基，由其引起的体内脂质过氧化是机体衰老、心血管疾病及肿瘤发生的重要原因。芒果核鞣花酸羟基自由基清除能力随着鞣花酸浓度增加而增加，当芒果核鞣花酸的浓度达到0.05-0.2mg/mL时清除率能达到约90％，说明芒果核鞣花酸具有较强的清除羟基自由基作用，且清除作用比V_C的清除作用强。芒果核鞣花酸提取物DPPH自由基清除能力随着鞣花酸浓度增加而增加，当浓度达到0.06-0.25mg/mL以上时，其对DPPH自由基的清除率能达到88％，说明芒果核鞣花酸具有较强的清除DPPH自由基作用。以上数据说明芒果果核鞣花酸对羟基自由基以及DPPH·自由基均具有较好的清除能力，研究结果将为芒果核资源的综合利用及其相应的功能性食品开发提供参考借鉴。

实施例5：本发明方法得到的芒果核鞣花酸抗衰老作用

鞣花酸、芒果核粗提物对弹性蛋白酶活性均有一定的抑制作用，且随着浓度的增加均逐渐增强。当鞣花酸的质量浓度为3mg/mL时，抑制率高达80.3％。

弹性蛋白酶(Elastase)是一种分解不溶性弹性蛋白为特征的蛋白水解酶，主要通过动物胰脏和微生物发酵获得，是除了DPPH·和·OH等自由基外，对人体皮肤等产生重要影响的生物活性酶。弹性蛋白酶会使皮肤真皮中支撑皮肤结构的弹性蛋白被过度的降解，从而使皮肤产生皱纹、松弛无弹性等衰老症状。鞣花酸作为天然弹性蛋白酶抑制剂，可以有效地抑制弹性蛋白酶的活性，从而起到增强皮肤弹性，减少皱纹及色素沉着，延缓皮肤衰老等作用。

以上通过实施例对本发明的内容进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种芒果核鞣花酸的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将芒果核干燥粉碎；

(3)将步骤(2)中得到的浸膏用醇浓度小于50％(v/v)的乙醇溶液溶解，除去不溶物，得到大孔吸附树脂上样溶液；

(4)取大孔吸附树脂AB-8，将步骤(3)得到的上样溶液上样，先用水洗去杂质，然后用醇浓度40-70％(v/v)的乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液；所述大孔吸附树脂和芒果核干燥粉末重量比为1:0.5-1:20；

(5)将步骤(4)收集的洗脱液减压浓缩或真空冷冻干燥至浸膏，浸膏用水或醇浓度小于50％(v/v)的乙醇溶液溶解，除去不溶物，得到硅胶柱上样溶液；然后进行硅胶柱层析结合薄层色谱分析，得到含有鞣花酸的馏分，并减压浓缩或真空冷冻干燥；得到芒果核鞣花酸提取物；所述步骤(5)的硅胶柱层析分离，是将硅胶柱上样溶液加入到硅胶层析柱中，然后向柱子中不同梯度的洗脱剂进行梯度洗脱；其中洗脱剂分别为氯仿：丙酮：甲酸的体积比为95:4:1、94:5:1、93:6:1、92:7:1、90:9:1的氯仿/丙酮/甲酸混合液；每个梯度用1～10倍的柱体积洗脱液进行洗脱。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中氯仿/丙酮/甲酸混合液每个梯度用3倍的柱体积洗脱液进行洗脱。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)的硅胶柱层析的洗脱步骤，控制流速在2mL/min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述薄层色谱分析所用的展开剂为氯仿：丙酮：甲酸＝9:0.9:0.1或石油醚：丙酮：甲酸＝7.9:2:0.1或石油醚：乙酸乙酯：甲酸＝6:3.9:0.1或环己烷：乙酸乙酯：甲酸＝6.9:3:0.1或氯仿：甲醇＝6:1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中提取方法为每千克芒果核粉末加入2-50L醇浓度为30％-80％的乙醇溶液，热回流或浸渍或浸漉提取2-5次，合并提取液；其中热回流提取时每次提取1-3h，浸渍或浸漉提取时每次提取10-15天。