CN109810965A - 一种源于知母的β-葡萄糖苷酶、其编码基因、表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够特异催化呋甾皂苷转化为螺甾皂苷的蛋白，AaF26G1，为β‑葡萄糖苷酶的一种。通过设计特定的引物，可从中药知母植物中克隆得到该蛋白的编码基因；利用生物工程的方法，可进一步制备得到含有该蛋白表达基因的表达载体、重组细胞系。通过将上述重组细胞进行扩大培养及诱导表达，可裂解得到该蛋白的粗酶，进一步纯化可得到精酶，所得到的酶可在体外将具有一定结构特征的呋甾皂苷转化为螺甾皂苷。本发明提供的方法能在体外高效转化呋甾皂苷为螺甾皂苷，相比传统的转化方法可控性更好，效率更高，对制备改善老年痴呆症状、抗衰老、抗抑郁、抗肿瘤等多种含螺甾皂苷的药物具有重要的应用价值。

Description

一种源于知母的β-葡萄糖苷酶、其编码基因、表达载体及其 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种蛋白，具体涉及一种能够转化呋甾皂苷为螺甾皂苷的β-葡萄糖苷酶。

背景技术

甾体皂苷(Steroidal saponins)是一类重要的中药活性成分，是合成甾体激素及其有关药物的重要原料。在植物中有着广泛的分布，主要存在于百合科、薯蓣科、菝葜科、玄参科、龙舌兰科等植物中，迄今发现此类化合物已达万种以上。甾体皂苷具有抗癌、治疗心血管疾病、调节免疫等多方面的生理活性。至今为止，全球生产的甾体药物高达400多种，其包括甾体激素类、甾体生物碱、强心苷类、甾体皂苷类等。近年来，随着甾体生物转化技术的不断发展，甾体药物被广泛应用于治疗风湿、心血管、胶原性疾病、淋巴性白血病、人体器官移植、抗肿瘤、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调等疾病。据统计，2011年甾体激素药物销售额就已高于280亿美元，约占全球医药总销售额的6％，成为产量第二大类药物，仅次于抗生素。

螺甾皂苷具有较好的药效活性。甾体皂苷依据F环的环合状态分为呋甾皂苷(Furostanol saponin)和螺甾皂苷(Spirostanol saponin)两种类型。螺甾皂苷甾体皂苷元的结构特征之一就在于E/F的螺环，此螺环半开环可以得到呋甾烷型化合物，全开环则可以得到胆甾烷型化合物。螺甾烷醇苷类具有典型的皂苷性质，如抗真菌、溶血活性，被认为是许多中药的有效成分，一直受到国内外科研工作者的普遍重视；而呋甾皂苷类活性较弱，俄国学者曾进行了甾体皂苷类化合物降胆固醇作用的筛选工作，发现螺甾皂苷类的活性远远高于呋甾皂苷类的活性，后者几乎无降胆固醇作用。螺甾烷型甾体皂苷元是天然产物中一类非常重要的生物活性物质，比如薯蓣皂苷元，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗高血脂、抗病毒等作用；知母皂苷及其苷元在改善老年痴呆症状、抗衰老、抗抑郁、抗肿瘤等方面有着显著作用。

F26G(Furostanol glycoside 26-O-β-glucosidase)存在于植物体内，为一种β-葡萄糖苷酶，由于它能特异的切开呋甾烷型皂苷C26位的葡萄糖，所以称这个酶为F26G。植物的根茎通常贮存呋甾皂苷，当植物受到损伤或者虫咬时，会释放F26G，生成活性更高的螺甾皂苷，螺甾皂苷的抗虫活性强于呋甾皂苷。因此，呋甾皂苷和螺甾皂苷之间的转化反应是由F26G所催化的，该酶一直被认为是甾体皂苷生物合成途径中的一个关键酶，该酶不同于普通的β-葡萄糖苷酶，有很强的专一性。目前从植物中克隆的F26G基因较少，仅从甘薯和闭鞘姜植物中克隆了F26G。

知母(Anemarrhena asphodeloides Bge.)是重要的常用中药，甾体皂苷在知母根茎中的总含量非常高，约为6％，近50多种不同的呋甾皂苷和螺甾皂苷。近年来，发现知母甾体皂苷具有治疗老年痴呆的作用，知母皂苷BⅡ作为国家I类新药研发。目前虽然存在酶转化法，主要从猪肝脏、微生物中分离纯化出关键的糖苷酶，或者利用基因重组技术获得高活性的重组酶。知母皂苷BⅡ是呋甾皂苷，在知母根茎中含量最高。因此，从知母原植物中克隆合适F26G，将呋甾皂苷转化为活性更强的螺甾皂苷，具有重要的应用价值。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是，提供一种可在体外将呋甾皂苷转化为螺甾皂苷的蛋白。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种蛋白，为β-葡萄糖苷酶的一种，命名为AaF26G1，源于中药知母(Anemarrhenaasphodeloides Bge.)，能够将呋甾皂苷转化为螺甾皂苷。

所述蛋白的氨基酸序列为a)或b)：

a)如序列表SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

b)序列表SEQ ID NO：1中的氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且编码与所述蛋白相关的衍生蛋白的氨基酸序列。

序列表中的序列1由633个氨基酸残基组成。取代和/或缺失和/或添加具体可为1至10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述(b)中的AaF26G1可以人工合成，也可以是重组蛋白、天然蛋白，也可以先合成其编码基因，在进行生物表达得到。上述(b)中的AaF26G1的编码基因可通过将序列表序列1，自5’端第一至1650位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在5’端和/或在3’端连上纯化标签得到。

所述蛋白的编码基因的核苷酸序列为1)或2)或3)：

1)如序列SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

2)与1)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白的核苷酸序列；

3)与1)或2)限定的序列具有90％以上同源性，且编码具有相同功能的蛋白的核苷酸序列。

根据所述蛋白的编码基因，可通过设计特定的引物对在知母的基因组中扩增得到。

经过生物工程的方法，可将扩增得到的基因插入到特定的载体/细胞，构建含有所述蛋白基因组的重组表达载体、表达盒。

优选地，所述重组表达载体为pCold I-AaF26G1：将所述基因AaF26G1连接到pCold I载体上。

将所述基因AaF26G1连接到pCold I或pCold TF载体，研究发现pCold TF载体表达TF蛋白与目的蛋白结合，后期对酶活有影响，并且相比于该pCold I载体，pCold TF载体没有明显促进可溶性目的蛋白的表达；由于pCold I载体克隆位点处有His标签与目的蛋白连接，可利用TAKARA公司的His60Ni Gravity Columns对表达的带His标签的AaF26G1进行纯化，因此优选pCold I为重组表达出发载体。

将含有所述蛋白的编码基因的重组表达载体转入生物细胞中，即可得到转基因细胞系或重组菌，可用于表达所述蛋白。重组时用到的生物细胞包括原核或真核宿主(例如：细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)。

一般选用大肠杆菌(E.Coli)进行重组蛋白的原核表达。

优选地，使用大肠杆菌BL21(pGro7)为原核表达菌。

通过在http://www.biotech.ou.edu/网站计算，当在大肠杆菌中过表达时，该AaF26G1蛋白溶解率为0。前期选用不同菌种(包括E.Coli DH5α、BL21、BL21(pGro7))做过表达时，仅E.Coli BL21(pGro7)菌种表达可溶性蛋白。pGro7可表达分子伴侣，可促进可溶性目的基因蛋白的表达。

本发明还提供生产所述蛋白的方法：将含有所述蛋白编码基因的转基因细胞系或重组菌扩大培养，并诱导表达所述蛋白，破碎(裂解)细胞(菌)体可得到含有所述蛋白粗酶，或对粗酶经进一步纯化后可得到精酶(即纯酶)。所得到的酶可用于在体外将呋甾皂苷为螺甾皂苷。

具体地，所述蛋白将呋甾皂苷转化为螺甾皂苷的具体表现为：对C3、C26位连有双糖链的，且呋甾皂苷C22有易于游离的羟基或甲氧基等基团，或C22位存在双键的呋甾体皂苷有效。

本发明提供的蛋白能够利用生物工程的方法在体外将呋甾皂苷为螺甾皂苷，相比传统的转化方法可控性更好，效率更高，对制备改善老年痴呆症状、抗衰老、抗抑郁、抗肿瘤等含有螺甾皂苷的药物具有重要的应用价值。

附图说明

图1为AaF26G1基因扩增产物的电泳图。

图2为pCold I-AaF26G1的重组质粒结构图谱。

图3为pCold I-AaF26G1在大肠杆菌中表达的聚丙烯酰胺电泳图及纯化后的AaF26G1蛋白。

图4为LC-MS检测AaF26G1体外催化原薯蓣皂苷(Protodioscin)的反应色谱图。

图5为LC-MS检测AaF26G1体外催化甲基原薯蓣皂苷(Methylprotodioscin)的反应色谱图。

图6为LC-MS检测AaF26G1体外催化原纤细薯蓣皂苷(Protogracillin)的反应色谱图。

图7为LC-MS检测AaF26G1体外催化知母皂苷BⅡ(Timosaponin BⅡ)的反应色谱图。

图8为LC-MS检测AaF26G1体外催化知母皂苷N(Timosaponin N)的反应色谱图。

图9为AaF26G1催化反应的底物和产物的结构式。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1.AaF26G1的基因克隆

选择在知母根茎中高表达的一个Unigene的核苷酸序列CL481.Contig5_All，寻找该序列的CDS序列。以知母(Anemarrhena asphodeloides Bge.)根茎总RNA为模板，用上述引物对进行PCR扩增，扩增设计如下引物：

(SEQ ID NO：3)5’-端引物：

5’-catatcgaaggtaggcatatggagctcATGGCATTACCCCTTAGCTTC-3’

(SEQ ID NO：4)3’-端引物：

3’-gactgcaggtcgacaagcttgaattcCTAAGATTCAAGGAAGTGTTT-5’

该引物包括该候选基因的一段序列，以及pCold I载体上的一段同源臂序列，小写字母标识载体同源序列，大写字母表示基因的序列。

具体步骤如下：

1、总RNA的提取

用Trizol法(所有试剂购自Takara公司，货号：9752Q)提取成熟期知母根茎的总RNA：

收集100mg洗净的知母根茎材料，立即置于液氮中研磨，加入1mL Trizol试剂，充分混匀后，室温放置5分钟；加入0.2mL的氯仿，剧烈振摇15秒，室温孵育3分钟；4℃，12000g离心15min；将上清液转移到一个新的1.5mL离心管中，加入0.5mL异丙醇沉淀RNA；最后将RNA沉淀用1mL 75％乙醇洗涤后溶入适量经DEPC处理过的双蒸水中，-70℃保存备用。

2、cDNA的合成

应用Takara公司的PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(货号：6210A)并按试剂盒说明书进行操作：

在冰上配制反应液，取1-5μg步骤1种提取的知母根茎总RNA放入灭活的无RNase的PCR管中，加入1.6μL OligodTPrimer(50μM)和0.4μL Random6mers(50μM)，2μL dNTP混合物(10mM)，用DEPC处理后的双蒸水补至20μL，混匀后在65℃下加热5分钟，然后迅速置于冰上1分钟。短暂离心后再加入48μL 5×第一链合成缓冲液、2μL PrimeScript II RTase(200U/μL)和1μL RNase Inhibitor(40U/μL)，用DEPC处理后的双蒸水补至40μL，轻轻混匀后，42℃温育1小时，70℃加热15分钟使酶失活，得到第一链cDNA，于-20℃保存备用。

3、基因克隆

应用Vazyme公司的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(货号：P505-d3)并按试剂盒说明书进行操作：取1μL步骤2所得反转录产物，在5’-端引物和3’-端引物的引导下，进行PCR。PCR反应体系如下：

PCR反应条件为：

反应产物用用1％琼脂糖凝胶检测，结果如图1所示。

如图1，可见一条分子量约为1.6kb的条带，与预期结果相符，说明已成功扩增AaF26G1基因。

用琼脂糖凝胶回收试剂盒(北京天根)回收该片段，然后将该回收片段与pCold I双酶切产物(NEB公司，Sac I，EcoR I)进行同源连接。应用Vazyme公司的ClonExpress IIOne Step Cloning Kit试剂盒(货号：C112-01)并按试剂盒说明书进行操作，按如下连接体系加入各材料并轻弹混匀，最后37℃，反应30分钟：

按照常规转化法，将同源连接产物转化至E.Coli DH5α感受态细胞，根据pCold I载体上的氨苄青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该质粒载体上的pCold-F和pCold-R序列为引物对其进行核苷酸序列测定。测序结果表明扩增到的序列由1650个碱基组成，其开放阅读框(ORF)为序列表中序列1的自5′末端第1-1650位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质。将序列1所示的DNA序列命名为AaF26G1，将序列2所示的氨基酸序列命名为AaF26G1，将在pCold I中插入序列1所示的核苷酸序列得到的重组载体命名为pCold I-AaF26G1。

实施例2.AaF26G1原核表达细胞系的获得及表达

一、原核表达载体pCold I-AaF26G1的构建

1)用限制性内切酶Sac I和EcoR I(NEB公司)对pCold I进行双酶切。酶切体系为按如下进行，并轻弹混匀，37℃反应80分钟；然后65℃反应20分钟进行限制性内切酶灭活，便得到线性化空载体。

2)用琼脂糖凝胶回收试剂盒(北京天根)回收1.6kb PCR片段，溶解于35μL ddH2O中。

3)连接体系为为如下，混匀并37℃反应30分钟：

4)按照常规转化法，将同源连接产物转化至E.Coli DH5α感受态细胞，用含有羧苄青霉素(浓度为100μg/mL)的平板进行筛选。

5)将阳性克隆进行PCR鉴定，引物如下：

(SEQ ID NO：5)pCold-F:5'-ACGCCATATCGCCGAAAGG-3'。

(SEQ ID NO：6)pCold-R:5'-GGCAGGGATCTTAGATTCTG-3'。

验证得到正确插入AaF26G1基因的重组质粒，命名为pCold I-AaF26G1，其质粒结构图谱如图2所示，此时对所得正确序列可预测蛋白大小为60KDa。

二、AaF26G1原核表达细胞系的获得

1)按照常规转化法，将质粒pCold I-AaF26G1转化至E.Coli BL21(pGro7)感受态细胞，用含有氯霉素(浓度为20μg/mL)和羧苄青霉素(浓度为100μg/mL)的平板进行筛选。

2)将阳性克隆用基因特异性引物对进行PCR鉴定，引物如下：

5’-端引物：(SEQ ID NO：3)

5’-catatcgaaggtaggcatatggagctcATGGCATTACCCCTTAGCTTC-3’

3’-端引物：(SEQ ID NO：4)

3’-gactgcaggtcgacaagcttgaattcCTAAGATTCAAGGAAGTGTTT-5’

具体步骤：

挑取阳性克隆于装有1mL LB液体培养基中，小摇4小时取菌液进行PCR验证，PCR体系(10μL)如下：

反应条件为：

PCR产物通过1％电泳结果验证。验证结果表明，pCold I-AaF26G1成功地转入了表达载体大肠杆菌BL21(pGro7)，获得AaF26G1原核表达细胞系。

三、AaF26G1原核表达细胞系的表达结果

1)将通过验证的单克隆菌菌液(或含有空载pCold I的菌液)进一步接种于装有750μL的LB液体培养基(含抗生素羧苄青霉素钠100μg/mL和氯霉素20μg/mL)的EP管中，置于摇床中，37℃摇4-5小时至菌液浑浊，以1：100的比例接种于新的100mL LB液体培养基中(含抗生素)，37℃摇1-2小时至菌液OD值达到0.4-0.6。

2)15℃放置30分钟，加入终浓度为0.5mM的IPTG和0.5mg/mL阿拉伯糖的诱导。

3)15℃，200rpm，摇24小时。

4)4℃，4000rpm离心10分钟收集菌体，弃上清。

5)在菌体中加入适量裂解溶液(20mM咪唑，300mM氯化钠，50mM磷酸钠，pH7.4)及酶抑制剂PMSF(异丙醇溶解，终浓度1mM)，超声破碎。超声条件为：间隙时间5秒，超声时间3秒，全程时间15分钟，温度保护4℃，功率约200W。

6)4℃，12000rpm，离心30分钟。收集上清及沉淀，各取40μL制备聚丙烯酰胺电泳蛋白样。

7)聚丙烯酰胺电泳检验，结果如图3所示。

如图3，vector的1、2号泳道分别为未插入AaF26G1基因的空载pCold I在BL21(pGro7)细胞过表达后得到的沉淀溶液和上清溶液；pCold I-AaF26G1的泳道1、2为插入了AaF26G1基因的pCold I-AaF26G1转入BL21(pGro7)细胞过表达后得到的的沉淀溶液和上清溶液。

由图3可得，pCold I-AaF26G1的泳道1、2相比vector的1、2号泳道，在50～75KD之间有明显的，与预测的AaF26G1蛋白大小(约60KDa)一致的蛋白条带。说明AaF26G1蛋白已成功在BL21(pGro7)细胞中表达，且在上清和沉淀中都有该蛋白，但在上清中的含量比沉淀中的含量要高。因此，选取上清溶液进行AaF26G1可溶性蛋白纯化。

实施例3.AaF26G1纯酶的获得

1)按照TAKARA公司的His60Ni Gravity Columns(货号：635657)提供的用户操作说明书操作，对BL21(pGro7)+pCold I-AaF26G1过表达的可溶性蛋白进行纯化。

2)用超滤管将按照实施例3项下1)步骤得到的纯化蛋白进行浓缩，浓缩条件为4000rpm，4℃，10min/次，直至将蛋白洗脱液浓缩至超滤管刻度250μL左右。此时，往超滤管中加入500μL PBS开始替换蛋白洗脱液，4000rpm，4℃，10min/次，浓缩至超滤管刻度250μL左右，如此重复共计加3次500μL PBS并最终浓缩至250μL左右，即得蛋白浓缩PBS溶液。应用生工公司提供的Bradford法蛋白质定量检测试剂盒(货号：C503031-1000)，得到蛋白浓缩PBS溶液浓度为277μg/mL。取部分进行聚丙烯酰胺电泳检验，考察纯化效果，结果如图3所示。检测原薯蓣皂苷米氏常数时将蛋白浓缩PBS溶液稀释50倍，浓度为5.54μg/mL。

如图3，pCold I-AaF26G1的3号条带所示，经纯化后在50～75KD之间有明显的蛋白条带，箭头所示条带为目的蛋白条带。纯化后的蛋白条带下面还带有少量的菌体蛋白(空载中也含有)，可能为蛋白纯化柱非特异吸附的杂蛋白。

实施例4.AaF26G1酶的功能鉴定

1)取135μL含有20μM底物(分别为以下的一种：原薯蓣皂苷、甲基原薯蓣皂苷、原纤细薯蓣皂苷、知母皂苷BII、知母皂苷N)的缓冲液(磷酸盐溶液pH 7.0)于1.5mL离心管中，30℃，孵育5分钟；

2)按1)每种底物设置3组，分别在每组中加入如下表不同成分的反应液15μL。各组反应液的成分如下表：

将加入反应液后的混合液置于30℃，200rpm，反应1小时；加入等体积150μL正丁醇终止反应，涡旋10秒，10000rpm，离心30秒，取上层正丁醇溶液于另一1.5mL离心管中；重复萃取三次，合并正丁醇萃取液，14000rpm，离心10分钟，取上清，LC-MS分析(分析上样时，分别同时对原反应底物以及该底物所对应转化螺甾皂苷进行分析，以考察各反应液的转化效果)。不同底物的反应结果如图4～8所示。

由图4～8可得，加入含有PBS或空载pCold I的反应液对底物无催化作用，而加入含有AaF26G1纯酶的反应液，能将反应底物催化为对应的螺甾皂苷(分别对应产物为：薯蓣皂苷、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、知母皂苷AIII、知母皂苷AII)。

实施例5.AaF26G1酶的米氏常数测定

1)用单因素法依次考察反应pH值(柠檬酸盐缓冲液pH3.0、4.0、5.0，磷酸盐溶液pH6.0、7.0、8.0)，温度(10-60℃)，加酶量等因素找寻最适条件测定米氏常数，考察pH值及温度时底物浓度为20μM。最后确定于50℃，pH 7.0，加15μL上述纯酶(浓度为：5.54μg/μL)，测定米氏常数，反应时间为10min。

2)取135μL分别含有0.5、1、2、5、10、20、40μM原薯蓣皂苷的缓冲液(磷酸盐溶液pH7.0)于1.5mL离心管中，30℃，孵育5分钟；各组三个重复。

3)在1)中加入15μL酶，于30℃，200rpm，反应10分钟；加入等体积150μL正丁醇终止反应，涡旋10秒，10000rpm，离心30秒，取上层正丁醇溶液于另一1.5mL离心管中；重复萃取三次，合并正丁醇萃取液，14000rpm，离心10分钟，取上清，LC-MS分析。AaF26G1酶对原薯蓣皂苷的Km值为4.75μM，相应的Kcat/Km值为0.507M^-1S^-1。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州中医药大学

<120> 一种源于知母的β-葡萄糖苷酶、其编码基因、表达载体及其应用

<130> 无

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 549

<212> PRT

<213> 知母属知母（Anermarrhena asphodeloides Bge.）

<400> 1

Met Ala Leu Pro Leu Ser Phe Pro Leu Gln Thr Lys Ala Gln Ile Ser

1 5 10 15

Leu Lys Gly Ser Gly Phe Ser Lys Ala Arg Leu Pro Ser Val Gly Val

20 25 30

Lys Ala Ser Arg Lys Ile Ser Glu Arg Ala Asn Asn Leu Pro Val Leu

35 40 45

Cys Ser Val Arg Arg Asp Gly Thr Thr Thr Thr Thr Val Lys Glu Ser

50 55 60

Glu Ala Val Pro Ala Trp Val Val Leu Arg Lys Ser Ser Phe Pro Pro

65 70 75 80

Gly Phe Thr Phe Gly Thr Ala Ser Ser Ala Tyr Gln Val Glu Ser Ala

85 90 95

Thr Asp Glu Gly Gly Arg Gly Pro Cys Ile Trp Asp Thr Phe Ala Ala

100 105 110

Glu Gln Pro Asp Lys Ile Thr Asp Gly Lys Ser Gly Lys Asp Gly Pro

115 120 125

Asn Thr Tyr His Lys Tyr Lys Glu Asp Ile Gln Leu Met Lys Gln Met

130 135 140

Gly Val Asp Thr Tyr Arg Phe Ser Ile Ser Trp Ser Arg Ile Leu Pro

145 150 155 160

Asp Gly Thr Gly Asp Val Asn Pro Glu Gly Ile Lys Tyr Tyr Asn Asn

165 170 175

Leu Ile Asn Glu Leu Ile Asp Asn Gly Ile Thr Pro Phe Val Thr Ile

180 185 190

Phe His Trp Asp Thr Pro Gln Ala Leu Glu Asn Arg Tyr Gly Gly Phe

195 200 205

Arg Ser Arg Asp Ile Val Lys Asp Phe Val Asn Tyr Val Asp Ile Cys

210 215 220

Phe Lys Asn Phe Gly Asp Arg Val Lys Asn Trp Ile Thr Ile Asn Glu

225 230 235 240

Pro Trp Ser Tyr Ser Thr Met Gly His Cys Leu Gly Trp His Ala Pro

245 250 255

Gly Arg Cys Ser Ser Tyr Met Gly Cys Pro Val Gly Asp Ser Thr Arg

260 265 270

Glu Pro Tyr Ile Val Ala His Asn Leu Ile Leu Ala His Ala Tyr Ala

275 280 285

Val Lys His Tyr Arg His Asn Tyr Gln Ala Leu Gln Arg Gly Lys Val

290 295 300

Gly Ile Thr Ile Asn Ser Thr Trp Tyr Lys Pro Leu Thr Glu Ser Leu

305 310 315 320

Gln Asp Lys Gln Ala Ala Asp Arg Cys His Glu Phe Phe Val Gly Trp

325 330 335

Phe Met Asp Pro Leu Phe Ala Gly Asp Tyr Pro Phe Ser Met Arg Ala

340 345 350

Val Val Arg Asp Arg Leu Pro Val Phe Asp Glu Lys Asp Lys Ala Val

355 360 365

Leu Arg Gly Ser Tyr Asp Phe Ile Gly Val Asn Tyr Tyr Ser Ser Arg

370 375 380

Tyr Ala Thr Glu Asn Leu Asp Pro Ile Ser Pro Gly His Val Pro Asp

385 390 395 400

Met Ser Ile Asn Asp Arg Cys Ala Tyr Glu Leu Glu Lys Ser Lys Asp

405 410 415

Gly Glu Leu Ile Gly Glu Leu His Gly Asp Trp Val Tyr Val Val Pro

420 425 430

Asp Gly Leu Arg Glu Leu Leu Leu Tyr Ile Lys Asp Arg Tyr Asn Asn

435 440 445

Pro Thr Ile Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Thr Val Glu Thr Asp Asn Pro

450 455 460

Asp Val Pro Ile Glu Glu Ala Ile Gln Asp Pro His Arg Ser Asp Tyr

465 470 475 480

Leu Lys Leu His Leu Ala Glu Leu Leu Gln Ala Ile Asn Ala Gly Ala

485 490 495

Asn Val Lys Gly Tyr Phe Ala Trp Ser Ile Met Asp Asn Tyr Glu Trp

500 505 510

His Lys Gly Tyr Thr Glu Arg Phe Gly Leu Tyr Tyr Ile Asp Tyr Asn

515 520 525

Glu Ala Asp Lys Thr Arg Tyr Ala Lys Ser Ser Val Asp Ala Tyr Lys

530 535 540

His Phe Leu Glu Ser

545

<210> 2

<211> 1650

<212> DNA

<213> 知母属知母（Anermarrhena asphodeloides Bge.）

<400> 2

atggcattac cccttagctt cccacttcaa accaaagccc agatttcact gaaaggctcg 60

ggcttcagca aggctagact gccttcagtt ggtgtgaagg cgagtagaaa gatctcagag 120

agggctaata atcttcctgt actttgctca gtcaggagag atggaaccac tacaactact 180

gtgaaagaat ctgaagctgt cccggcttgg gttgttctga ggaagtccag cttccctcca 240

ggtttcacct tcggtaccgc ctcttctgcc taccaggttg aatcagcaac cgacgaagga 300

gggagaggac catgcatctg ggacactttc gctgcggaac agccggacaa aattactgat 360

ggaaaaagtg gaaaagatgg acctaacact tatcataaat acaaggaaga catacaactc 420

atgaaacaga tgggtgttga tacttaccgt ttctccatct cttggtcaag aatattgcca 480

gatggtacag gtgacgtaaa tccggaggga ataaaatatt acaacaatct tattaatgaa 540

ttgattgata atggcataac accctttgta actattttcc attgggatac cccacaagct 600

ctagaaaata gatatggagg gtttcgaagt cgtgatatcg tgaaggactt cgtaaattat 660

gttgacattt gtttcaagaa cttcggagat agagttaaga attggatcac aataaacgag 720

ccatggtcct acagtaccat gggtcattgc cttggatggc atgcacctgg aagatgctca 780

tcttacatgg gttgtcctgt tggagactct actagagagc catacattgt tgctcacaat 840

cttatacttg ctcatgcata tgctgtaaaa cattatagac acaattatca ggctttgcag 900

agaggcaaag tgggaattac catcaacagt acatggtata agccacttac agaatcactt 960

caagacaaac aagcagcaga tagatgtcat gaatttttcg ttggatggtt tatggatcca 1020

ttatttgctg gggactaccc attcagcatg agggccgtgg tgagagatag acttccagta 1080

tttgatgaga aggacaaggc agtgcttaga ggatcttacg atttcattgg agttaattat 1140

tatagttcca gatatgctac tgaaaatttg gatccgatct ctcctggcca tgtgcctgac 1200

atgagcataa atgaccggtg tgcttatgaa ctagaaaaat caaaagatgg agagctgatt 1260

ggagagttgc atggtgattg ggtctatgtg gttccagatg gcttgagaga gttactacta 1320

tacatcaagg atagatacaa caatccaact atctacataa ctgaaaatgg aacggttgag 1380

actgataatc cagatgtacc aattgaagag gcaatccagg atccacatag gagcgactac 1440

ttgaagcttc atcttgccga acttctacaa gcaataaacg ctggagccaa tgtgaaagga 1500

tattttgcat ggtctatcat ggacaattac gagtggcata aaggatatac agaacgattt 1560

ggactatatt atatcgacta caatgaagct gataagacgc gatatgcaaa atcatcagtc 1620

gatgcataca aacacttcct tgaatcttag 1650

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catatcgaag gtaggcatat ggagctcatg gcattacccc ttagcttc 48

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tttgtgaagg aacttagaat ccttaagttc gaacagctgg acgtcag 47

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acgccatatc gccgaaagg 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggcagggatc ttagattctg 20

Claims (10)

1.一种蛋白，名为AaF26G1，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列为a)或b)：

a)如序列SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

b)序列SEQ ID NO：1中的氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，编码与所述蛋白相关的衍生蛋白的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述蛋白的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列为1)或2)或3)：

1)如序列SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

2)与1)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白的核苷酸序列；

3)与1)或2)限定的序列具有90％以上同源性，且编码具有相同功能的蛋白的核苷酸序列。

3.用于扩增权利要求2所述编码基因的引物对，序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4。

4.含有如权利要求2所述编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pCold I-AaF26G1；所述重组表达载体pCold I-AaF26G1为将所述蛋白的编码基因插入质粒载体pCold I得到。

6.如权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为大肠杆菌。

7.如权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为大肠杆菌为BL21(pGro7)。

8.根据权利要求4所述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，用于生产所述蛋白。

9.根据权利要求8所述转基因细胞系或重组菌的应用，其特征在于，所述蛋白的生产方法为：将含有所述蛋白编码序列的转基因细胞系或重组菌扩大培养后破碎，得到粗蛋白，或经纯化后可得到精蛋白。

10.根据权利要求1所述蛋白的应用，其特征在于，所述蛋白为β-葡萄糖苷酶，能够特异催化呋甾皂苷C26位上的苷键水解并环化，转化为螺甾皂苷。