KR102338008B1 - 당사슬 연장에 촉매 작용하기 위한 한 그룹의 udp-글리코실트랜스퍼라제 및 이의 응용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 한 그룹의 글리코실트랜스퍼라제 및 이의 응용에 관한 것이다. 구체적으로, 글리코실트랜스퍼라제 GT29-32, GT29-33, GT29-34 , GT29-4, GT29-5, GT29-7, GT29-9, GT29-11, GT29-13, GT29-17, GT29-18, GT29-19, GT29-20, GT29-21, GT29-22, GT29-23, GT29-24, GT29-25, GT29-36, GT29-37, GT29-42, GT29-43, GT29-45, GT29-46, PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-5, PNUGT29-6, PNUGT29-7, PNUGT29-8, PNUGT29-9, PNUGT29-14와 PNUGT29-15 및 이의 유도 폴리펩티드가 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물 기질 C-20 부위의 첫 번째 글리코실기, C-6 부위의 첫 번째 글리코실기 및 C-3 부위의 첫 번째 글리코실기에 촉매 작용을 하여 당사슬을 연장시킴으로써, 진세노사이드(ginsenoside)Rg3, 진세노사이드Rd, 진세노사이드Rb1, 진세노사이드Rb3, 사포닌(saponin)DMGG, 사포닌DMGX, 지페노사이드(Stevenleaf)LXXV, 지페노사이드XVII, 지페노사이드XIII, 지페노사이드IX, 노토진세노사이드(notoginsenoside)U 및, 노토진세노사이드R1, 노토진세노사이드R2, 노토진세노사이드R3, 3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-PPD; 3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-CK, 20-O-Glucosylginsenoside Rf 및 Ginsenoside F3 등 진세노사이드 산물을 얻는 촉매 반응을 제공하였다. 본 발명의 글리코실트랜스퍼라제는 인공 합성 진세노사이드 및 다양한 신규 진세노사이드 및 이의 유도체를 구축하는데 적용될 수도 있다.

Description

당사슬 연장에 촉매 작용하기 위한 한 그룹의 UDP-글리코실트랜스퍼라제 및 이의 응용
본 발명은 생물 기술 및 직물 생물학 분야에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명은 한 그룹의 글리코실트랜스퍼라제(Glycosyltransferase) 및 이의 응용에 관한 것이다.
진세노사이드(ginsenoside)는 인삼속 식물(예를 들어, 인삼, 삼칠 및 서양삼 등)과 돌외에서 분리된 사포닌의 총칭으로, 트리테르페노이드(triterpenoid) 화합물이다. 진세노사이드는 또한 분리된 근원에 따라 진세노사이드, 노토진세노사이드(notoginsenoside) 및 지페노사이드(gypenoside)로 지칭될 수 있다. 진세노사이드는 이러한 약물용 식물에서의 주요한 활성 성분이다. 현재, 약 150 종의 사포닌(saponin)을 분리하였다. 구조적으로 보면, 진세노사이드는 주로 사포게닌(sapogenin)이 글리코실화되어 형성된 생물 활성 소분자이다. 진세노사이드의 사포게닌은 제한적인 몇 가지 유형만이 존재하고, 주로 다마렌(Dammarane)형 테트라시클릭트리터페노이드(tetracyclic triterpenoid)의 프로토파낙사디올(protopanoxadiol)과 프로토파낙사트리올(Protopanaxatriol), 및 올레아놀산(Oleanolic acid)이다. 사포게닌은 글리코실화된 후, 수용성이 향상시키고, 이의 세포 이하의 위치를 변화시키며, 상이한 생물 활성을 생성할 수 있다. 대부분의 프로토파낙사디올형 사포닌은 C3 및/또는 C20 부위 히드록실기에서 글리코실화 변형되는 반면, 프로토파낙사트리올형 사포닌은 C6 및/또는 C20의 히드록실기에서 글리코실화 변형된다. 상이한 유형의 글리코실기 및 상이한 정도의 글리코실화 변형에 의해 다양한 분자 구조를 가진 진세노사이드를 생성하였다.
상이한 글리코실화 변형 방식을 갖는 진세노사이드는 상이한 생물 활정을 갖는다. 예를 들어, Rb1, Rb2 및 Rb3은 각각 Rd의 C20-O-Glc에서 일 분자의 글루코스(glucos), 아라비노스(arabinose) 및 자일로스(xylose)를 연장시킨다. 실험에 따르면 풍부한 사포닌Rb1은 신경 세포 보호 및 항염증 및 항산화 효능이 있고; Rb2는 종양 혈관 신생 및 종양 전이를 억제하고 당뇨병 마우스의 혈당 및 혈중 지질을 감소시키는 효능이 있으며; Rb3은 심근 허혈을 완화시키고 항우울 효능이 있는 것을 확인하였다.
진세노사이드는 인삼 또는 삼칠의 사포닌 또는 풍부한 사포닌을 원료로, 화학, 효소 및 생물 발효의 가수분해 방법에 의조하여 제조된다. 야생 인삼 자원이 기본적으로 고갈됨에 따라, 진세노사이드 자원은 현재 인삼 또는 삼칠의 인공 재배에서 유래되나, 인공 재배의 생장 주기가 길고(일반적으로 5 ~ 7년 이상 수요됨), 지리적 제한이 있으며, 또한 질병과 해충의 영향을 많이 받으며 많은 양의 살충제를 적용해야 하므로, 인삼 또는 삼칠의 인공 재배는 심각한 연작 장애를 가지고 있으므로(인삼 또는 삼칠 재배지는 5 ~ 15년 이상 휴경되어야만 연작 장애를 극복할 수 있음), 진세노사이드의 산량, 질량 및 안전성은 도전에 직면하고 있다.
합성 생물학의 발전은 식물 유래의 천연 산물의 이종 합성을 위한 새로운 기회를 제공하였다. 효모를 섀시(chassis)로 사용하여 대사 경로의 조립 및 최적화를 통해 저렴한 단당으로 아테미신닌산(artemisinic acid) 또는 디히드로아테미신닌산(Dihydroartemisinic acid)을 발효 및 합성한 다음, 1 단계 화학 전환하는 방법을 통해 아테미신닌(artemisinin)을 생산하였으며, 이는 합성 생물학이 천연 사물의 약물 합성에서의 큰 잠재력이 있는 것을 시사한다. 효모 섀시 세포를 사용하는 합성 생물학 방법에 의한 진세노사이드 단량체의 이종 합성에서, 원료는 저렴한 단당이고, 제조 과정은 안전성을 조정할 수 있는 발효 과정으로, 임의의 외부 오염을 방지하므로(예를 들어, 원료 식물 인공 재배 시 사용되는 농약), 합성 생물학 기술에 의한 진세노사이드 단량체의 제조는 비용상의 이점 뿐만 아니라 완제품의 질량과 안전성을 보장할 수 있다. 합성 생물학 기술에 의해 충분한 양의 다양한 고순도 천연 및 비천연적인 진세노사이드 단량체를 제조하여, 활성 측정 및 임상 실험에 사용되고, 희귀 진세노사이드의 혁신적인 약물 연구 개발을 촉진하기 위해 사용된다.
최근, 인삼, 삼칠 및 서양삼의 전사체 및 기능성 게놈 연구를 통해, 진세노사이드사포게닌 합성 경로의 분석이 큰 진전을 이루었다. 2006년, 일본과 한국 과학자들은 에폭시스쿠알렌(epoxy squalene)을 다마렌디올(dammarenediol)로 전환시키는 테르펜시클라제(terpene cyclase) 요소(다마렌디올신타제(Dammarenediol synthase), PgDDS)를 각각 검증하였다. 2011년부터 2012년까지 한국 과학자들은 또한 다마렌디올을 프로토파낙사디올로 산화시키고, 프로토파낙사디올을 프로토파낙사트리올로 추가적으로 산화시키는 시토크롬(cytochrome)P450 요소 CYP716A4 및 CYP716A53v2를 검증하였다.
합성 생물학 방법으로 이러한 약용 활성이 있는 진세노사이드를 합성하려면, 사포게닌을 합성하는 대사 경로를 구축해야 할 뿐만 아니라 진세노사이드의 글리코실화에 촉매 작용을 하는 UDP-글리코실트랜스퍼라제도 검증하여야 한다. UDP-글리코실트랜스퍼라제의 기능은 글리코실기 공여체(뉴클레오시드디포스페이트당(Nucleoside diphosphate sugar), 예를 들어, UDP-글루코스, UDP-람노스(UDP-Rhamnose), UDP-자일로스(UDP-xylose) 및 UDP-아라비노스(UDP-arabinose))의 글리코실기를 상이한 글리코실기 수용체에 전이시킨다. 현재 시퀀싱된 식물 게놈의 분석으로부터, 식물 게놈은 종종 100 가지 이상의 상이한 글리코실트랜스퍼라제를 코딩하였다. UDP-글리코실트랜스퍼라제가 촉매 작용하 할 수 있는 기질(글리코실기 공여체 및 글리코실기 수용체를 포함함)이 매우 다양하므로, 이러한 UDP-글리코실트랜스퍼라제의 기능적 검증에 큰 어려움을 가져왔다. 2014년까지는 진세노사이드 글리코실화에 참여하는 최초의 UDP-글리코실트랜스퍼라제(UGTPg1)가 중국 학자들에 의해 검증되었고, 이는 프로토파낙사디올형 진세노사이드의 C20 히드록실기에 하나의 글루코실기를 전입시킬 수 있다. 이후, 한국 과학자들은 또한 인삼에서 2개의 UDP-글리코실트랜스퍼라제 요소(PgUGT74AE2 및 PgUGT94Q2)를 클로닝하였으며, 이들은 각각 프로토파낙사디올형 사포닌의 C3 부위에 하나의 글루코실기를 전입시키고 하나의 글루코실기를 연장할 수 있다. 거의 동시에, 중국 학자들도 독립적으로 인삼에서 PgUGT74AE2 및 PgUGT94Q2와 동일한 기능을 갖는 2개의 글리코실트랜스퍼라제 요소 UGTPg45 및 UGTPg29를 클로닝하였다. 2015년에 중국 학자들은 프로토파낙사트리올 C6 부위에 하나의 글루코실기를 전입시킬 수 있는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 요소(UGTPg100)를 추가적으로 검증하였다. 2015년 한국 학자들은 돌외에서 프로토파낙사디올형 및 프로토파낙사트리올형 사포닌의 C20에서 하나의 글루코실기가 연장될 수 있는 하나의 글리코실트랜스퍼라제 GpUGT23을 발견하였다. 그러나 지금까지, C3 부위에서 하나의 글리코실기를 연장하는 글리코실트랜스퍼라제 식물 외에, 인삼에서 당사슬의 연장에 촉매 작용을 할 수 있는 다른 글리코실트랜스퍼라제는 보도되지 않았다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 인삼에서 프로토파낙사디올형 및 프로토파낙사트리올형 사포닌의 C20에서 하나의 글루코실기 또는 자일로스글리코실기를 연장시킬 수 있는 글리코실트랜스퍼라제 및 프로토파낙사트리올형 사포닌의 C6에서 하나의 자일로스글리코실기를 연장시킬 수 있는 글리코실트랜스퍼라제를 클로닝하고 검증하였다. 상기 글리코실트랜스퍼라제는 진세노사이드Rb1, 진세노사이드Rb3, 지페노사이드LXXV, 지페노사이드XVII, 노토진세노사이드U, 노토진세노사이드R1, 노토진세노사이드R2 및 노토진세노사이드R3 등을 포함하는 진세노사이드의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명은 한 그룹의 신규 글리코실트랜스퍼라제 및 이를 이용하여 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물 글리코실화 반응에 촉매 작용하는 방법을 제공하였다.
본 발명은 한 그룹의 신규 글리코실트랜스퍼라제 및 이를 이용하여 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물 글리코실화 반응에 촉매 작용하는 방법을 제공하였다.
본 발명의 제1 양태에 있어서, 체외 글리코실화 방법을 제공하였고,
글리코실트랜스퍼라제 존재 하에서, 글리코실기 공여체의 글리코실기를 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물의 C20 부위 및/또는 C3 부위의 첫 번째 글리코실기에 전이시켜, 글리코실기화된 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물을 형성하는 단계를 포함하며,
여기서, 상기 글리코실트랜스퍼라제는 SEQ ID NO.: 4, 6, 8, 8, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 98, 또는 100으로 표시된느 글리코실트랜스퍼라제 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, C20 부위에서 글리코실기화된 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물로 진세노사이드Rd, CK, F1 및 F2를 포함한다.
본 발명의 제2 양태에 있어서, 체외 글리코실화 방법을 제공하였고,
글리코실트랜스퍼라제 존재 하에서, 글리코실기 공여체의 글리코실기를 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물의 C6 부위의 첫 번째 글리코실기에 전이시켜, 글리코실기화된 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물을 얻는 단계를 포함하며;
여거서, 상기 글리코실트랜스퍼라제는 SEQ ID NO.:12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 및 30으로 표시되는 글리코실트랜스퍼라제 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, C6 부위에서 글리코실기화된 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물로 Rg1 또는 Rh1을 포함한다.
본 발명은 체외 글리코실화 하는 방법을 제공하였고,
글리코실트랜스퍼라제 존재 하에서, 글리코실기 공여체의 글리코실기를 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물의 C3 부위의 첫 번째 글리코실기에 전이시켜, 글리코실기화된 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물을 형성하는 단계를 포함하며;
여기서, 상기 글리코실트랜스퍼라제는 SEQ ID NO.: 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124로 표시되는 글리코실트랜스퍼라제 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, C3 부위에서 글리코실기화된 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물로 F2, 또는 Rh2를 포함한다. 또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 유도 폴리펩티드는 각각,
(a) SEQ ID NOs.: 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124 중 하나 또는 여러개로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;
(b) SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124에 태그 서열, 신호 서열 또는 분비 신호 서열을 부가하여 형성된, 글리코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 유도 폴리펩티드;
(c) 아미노산 서열과 SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124 중 하나 또는 여러개로 표시되는 아미노산 서열의 상동성이 ≥ 95 %이며, 글리코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 유도 폴리펩티드로부터 선택된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, (c)는 SEQ ID NOs.: 4, 6, 8, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124 중 하나 또는 여러개로 표시되는 아미노산 서열의 폴리펩티드를 하나 또는 여러 개의 아미노산 잔기로 치환, 결실 또는 부가하여 형성된, 글리코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 유도 폴리펩티드를 더 포함한다.
본 발명의 제3 양태에 있어서, 분리된 폴리펩티드를 제공하였고, 상기 분리된 폴리펩티드는,
SEQ ID NOs.: 4, 6, 8, 28, 30, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124 중 하나 또는 여러 개로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 유도 폴리펩티드이며; 여기서, 상기 유도 폴리펩티드는,
(a) SEQ ID NOs.: 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124 중 하나 또는 여러 개로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;
(b) SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 28, 30, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124에 태그 서열, 신호 서열 또는 분비 신호 서열을 부가하여 형성된, 글리코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 유도 폴리펩티드;
(c) 아미노산 서열과 SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 28, 30, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124 중 하나 또는 여러 개로 표시되는 아미노산 서열의 상동성이 ≥ 95 %이고, 글리코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 유도 폴리펩티드로부터 선택된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, (c)는 SEQ ID NOs.: 4, 6, 8, 28, 30, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124 중 하나로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 하나 또는 여러 개의 아미노산 잔기로 치환, 결실, 또는 부가하여 형성된, 글리코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 유도 폴리펩티드를 더 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 분리된 폴리펩티드는 체외 글리코실화에 사용된다.
본 발명의 제4 양태에 있어서, 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공하였고, 상기 폴리뉴클레오티드는,
(A) 제4 양태에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(B) SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 28, 30, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124로 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(C) SEQ ID NO.: 3, 5, 7, 27, 29, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 115, 117, 119, 121, 또는 123으로 표시되는 뉴클레오티드 서열;
(D) SEQ ID NO.: 3, 5, 7, 27, 29, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 115, 117, 119, 121, 또는 123으로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 표시되는 서열과의 상동성이 ≥ 95 %(바람직하게는 ≥ 98 %)인 뉴클레오티드 서열;
(E) (A) ~ (D) 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열과 상보적(바람직하게는 완전 상보적)인 뉴클레오티드 서열로부터 선택된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 (D)는 SEQ ID NO.: 3, 5, 7, 27, 29, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 115, 117, 119, 121, 또는 123으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 5’말단 및/또는 3’ 말단에서 1 ~ 60개(바람직하게는 1 ~ 30개, 더욱 바람직하게는 1 ~ 10개)의 뉴클레오티드를 절단 또는 부가함으로써 형성된 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 서열 SEQ ID NO.: 3, 5, 7, 27, 29, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 115, 117, 119, 121, 또는 123으로 표시되는 뉴클레오티드 서열은 각각 SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 28, 30, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124로 표시되는 폴리펩티드를 코딩한다.
본 발명의 제5 양태에 있어서, 전달체를 제공하였고, 상기 전달체는 본 발명의 제4 양태에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 분리된 폴리펩티드를 발현한다.
본 발명의 제3 양태에 따른 분리된 폴리펩티드의 용도에 있어서, 글리코실기 공여체로부터의 글리코실기를 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물의 (i) C-6 부위의 첫 번째 글리코실기; 또는 (ii) C-20 부위의 첫 번째 글리코실기; 및/또는 (iii)C3 부위의 첫 번째 글리코실기에 전이시켜 당사슬을 연장하는 반응과 같은 하나 또는 다양한 반응에 촉매 작용을 하거나, 또는 상기와 같은 하나 또는 다양한 반응에 촉매 작용을 하는 촉매제의 제조에 사용된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 글리코실기 전이는 특정 부위의 라디칼에서 글리코실기의 부가 또는 치환을 포함한다.
또 다른 바람직한 예에서, 폴리펩티드 또는 이의 유도 폴리펩티드의 용도를 더 제공하였고,
글리코실트랜스퍼라제 존재 하에서, 글리코실기 공여체의 글리코실기를 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물의 C-6 부위의 첫 번째 글리코실기; 또는 C-20 부위의 첫 번째 글리코실기; 및/또는 C-3 부위의 첫 번째 글리코실기에 전이시켜, 글리코실기화된 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물을 형성하는 반응에 촉매 작용을 하거나, 또는 상기 반응에 촉매 작요을 하는 촉매제의 제조에 사용되며;
여기서, 상기 글리코실트랜스퍼라제는 SEQ ID NO.: 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124로 표시되는 글리코실트랜스퍼라제 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또 다른 바람직한 예에서, 폴리펩티드 또는 이의 유도 폴리펩티드의 용도를 더 제공하였고,
글리코실트랜스퍼라제 존재 하에서, 글리코실기 공여체의 글리코실기를 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물의 C20 부위 및/또는 C3 부위의 첫 번째 글리코실기에 전이시켜, 글리코실기화된 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물을 형성하는 반응에 촉매 작용을 하거나, 또는 상기 반응에 촉매 작용을 하는 촉매제의 제조에 사용되며;
여기서, 상기 글리코실트랜스퍼라제는 SEQ ID NO.: 4, 6, 8, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 98, 또는 100으로 표시되는 글리코실트랜스퍼라제 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또 다른 바람직한 예에서, 폴리펩티드 또는 이의 유도 폴리펩티드의 용도를 더 제공하였고,
글리코실트랜스퍼라제 존재 하에서, 글리코실기 공여체의 글리코실기를 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물의 C6 부위의 첫 번째 글리코실기에 전이시켜, 글리코실기화된 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물을 형성하는 반응에 촉매 작용을 하거나, 또는 상기 반응에 촉매 작용을 하는 촉매제의 제조에 사용되며;
여기서, 상기 글리코실트랜스퍼라제는 SEQ ID NO.: 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 또는 30으로 표시되는 글리코실트랜스퍼라제 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또 다른 바람직한 예에서, 폴리펩티드 또는 이의 유도 폴리펩티드의 용도를 더 제공하였고,
글리코실트랜스퍼라제 존재 하에서, 글리코실기 공여체의 글리코실기를 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물의 C-3 부위의 첫 번째 글리코실기에 전이시켜, 글리코실기화된 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물을 형성하는 반응에 촉매 작용을 하거나, 또는 상기 반응에 촉매 작용을 하는 촉매제의 제조에 사용되며;
여기서, 상기 글리코실트랜스퍼라제는 SEQ ID NO.: 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124로 표시되는 글리코실트랜스퍼라제 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 유도 폴리펩티드는 각각,
(a) SEQ ID NOs.: 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124 중 하나로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;
(b) SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124에 태그 서열, 신호 서열 또는 분비 신호 서열을 부가하여 형성된, 글리코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 유도 폴리펩티드;
(c) 아미노산 서열과 SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124 중 하나로 표시되는 아미노산 서열의 상동성이 ≥ 95 %이고, 글리코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 유도 폴리펩티드로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 글리코실기 공여체는 UDP-글루코스, ADP-글루코스, TDP-글루코스, CDP-글루코스, GDP-글루코스, UDP-아세틸글루코스, ADP-아세틸글루코스, TDP-아세틸글루코스, CDP-아세틸글루코스, GDP-아세틸글루코스, UDP-자일로스, ADP-자일로스, TDP-자일로스, CDP-자일로스, GDP-자일로스, UDP-갈락투론산, ADP-갈락투론산, TDP-갈락투론산, CDP-갈락투론산, GDP-갈락투론산, UDP-갈락토스, ADP-갈락토스, TDP-갈락토스, CDP-갈락토스, GDP-갈락토스, UDP-아라비노스, ADP-아라비노스, TDP-아라비노스, CDP-아라비노스, GDP-아라비노스, UDP-람노스, ADP-람노스, TDP-람노스, CDP-람노스, GDP-람노스, UDP-자일로스, ADP-자일로스, TDP-자일로스, CDP-자일로스, GDP-자일로스, 또는 기타 뉴클레오시드디포스페이트헥소스(Nucleoside diphosphate hexose) 또는 뉴클레오시드디포스페이트펜토스(Nucleoside diphosphate pentose), 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 뉴클레오시드디포스페이트당을 포함한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 글리코실기 공여체는 UDP-글루코스, UDP-갈락투론산, UDP-갈락토스, UDP-아라비노스, UDP-람노스, UDP-자일로스, 또는 其他우리딘디포스페이트헥소스(uridine diphosphate hexose) 또는 우리딘디포스페이트펜토스(uridine diphosphate pentose), 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 우리딘디포스페이트(UDP)당을 포함한다. 또 다른 바람직한 예에서, 상기 분리된 폴리펩티드 하기 하나 또는 여러 개의 반응에 촉매 작용을 하거나, 또는 하기 하나 또는 여러 개의 반응에 촉매 작용을 하는 촉매제의 제조에 사용되고,
(A)
Figure 112019131566297-pct00001
식(I) 화합물 식(Ⅱ) 화합물
여기서, R1은 H, 단당 글리코실기 또는 다당 글리코실기이며; R2는 H 또는 OH이고; R3은 단당 글리코실기이며; R4는 단당 글리코실기이고, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4, 6, 8, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택된다. 또 다른 바람직한 예에서, 상기 단당은 글루코스(Glc), 람노스(Rha), 아세틸글루코스(Glc(6)Ac), 아라비노푸라노스(Araf), 아라비노피라노스(Arap), 또는 자일로스(Xyl) 등을 포함한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 다당은 Glc(2-1)Glc, Glc(6-1)Glc, Glc(6)Ac, Glc(2-1)Rha, Glc(6-1)Arap, Glc(6-1)Xyl, Glc(6-1)Araf, Glc(3-1)Glc(3-1), Glc(2-1) Glu(6)Ac, Glc(6-1)Arap(4-1)Xyl, Glc(6-1)Arap(2-1)Xyl, 또는 Glc(6-1)Arap(3-1)Xyl 등 2 ~ 4개의 단당으로 이루어진 다당을 포함한다.
또 다른 바람직한 예에서, R1-R4가 치환된 후의 화합물은 하기 표에 나타낸 바와 같다.
Figure 112019131566297-pct00002
즉, 상기 R1이 H이고, R2가 OH이며, R3이 글루코실기일 경우, 상기 식(I) 화합물은 진세노사이드CK (CK)이고;상기 R1이 H이며, R2가 OH이고, R3 및 R4가 글루코실기일 경우, 상기 식(Ⅱ) 화합물은 지페노사이드LXXV이며;
상기 R1이 H이고, R2가 OH이며, R3이 글루코실기이고, R4가 자일로실기일 경우, 상기 식(Ⅱ) 화합물은 지페노사이드XIII이며;
R1 및 R2가 모두 H이고, R3이 글루코실기일 경우, 상기 식(I) 화합물은 진세노사이드DMG이며;
R1 및 R2가 모두 H이고, R3 및 R4가 글루코실기일 경우, 상기 식(Ⅱ) 화합물은 사포닌DMGG (20-O-β-(D-글루코피라노실)-β-(D-글루코피라노실)-다마렌디올) (20-O-β-(D-glucopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)- dammarenediol)이며;
R1 및 R2가 모두 H이고, R3이 글루코실기이며, R4가 자일로실기일 경우, 상기 식(Ⅱ) 화합물은 사포닌DMGX (20-O-β-(D-자일로피라노실)-β-(D-글루코피라노실)-다마렌디올) (20-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)- dammarenediol)이고;
R1이 글루코실기이며, R2가 OH이고, R3이 글루코실기일 경우, 상기 식(I) 화합물은 진세노사이드F2(F2)이며;
R1이 글루코실기이고, R2가 OH이며, R3 및 R4가 글루코실기일 경우, 상기 식(Ⅱ) 화합물은 지페노사이드XVII이고;
R1이 글루코실기이고, R2가 OH이며, R3이 글루코실기이고, R4가 자일로실기일 경우, 상기 식(Ⅱ) 화합물은 지페노사이드IX이며;
R1이 2개의 글루코실기(Glc(2-1)Glc)이고, R2가 OH이며, R3이 글루코실기일 경우, 상기 식(I) 화합물은 진세노사이드Rd이고;
R1이 2개의 글루코실기(Glc(2-1)Glc)이며, R2가 OH이고, R3 및 R4가 글루코실기일 경우, 상기 식(Ⅱ) 화합물은 진세노사이드Rb1이거나; 또는
R1이 2개의 글루코실기(Glc(2-1)Glc)이며, R2가 OH이고, R3이 글루코실기이며, R4가 자일로실기일 경우, 상기 식(Ⅱ) 화합물은 진세노사이드Rb3이고;
상기 R1이 H이며, R2가 OH이고, R3이 글루코실기이며, R4가 아라비노실기(Arabinosyl group)일 경우, 상기 식(Ⅱ) 화합물은 진세노사이드F3이;
(B)
Figure 112019131566297-pct00003
식(Ⅲ) 화합물 식(Ⅳ) 화합물
여기서, R1이 H, 글리코실기 또는 다당 글리코실기이고, R2가 글리코실기이며, R3이 글리코실기이고, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 4 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 예에서, R1-R3이 치환된 후의 화합물은 하기 표에 나타낸 바와 같다:
Figure 112019131566297-pct00004
즉, R1이 H이고, R2가 글루코실기일 경우, 상기 식(Ⅲ) 화합물은 진세노사이드F1 (F1)이며;R1이 H이고, R2 및 R3이 글루코실기일 경우, 상기 식(Ⅳ) 화합물은 노토진세노사이드U이며; R1 및 R2가 글루코실기일 경우, 상기 식(Ⅲ) 화합물은 진세노사이드Rg1 (Rg1)이거나; 또는
R1, R2 및 R3이 글루코실기일 경우, 상기 식(Ⅳ) 화합물은 노토진세노사이드R3(R3)이고;
(C)
Figure 112019131566297-pct00005
식(V) 화합물 식(VI) 화합물;
여기서, R1 및 R2는 H 또는 글리코실기이고, R3 및 R4는 글리코실기이며; 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 예에서, R1-R4가 치환된 후의 화합물은 하기 표에 나타낸 바와 같다:
Figure 112019131566297-pct00006
즉, R1이 H이고, R2 및 R3이 글루코실기일 경우, 상기 식(V) 화합물은 진세노사이드Rg1이며;R1이 H이고, R2 및 R3이 글루코실기이며, R4가 자일로실기일 경우, 상기 식(VI) 화합물은 노토진세노사이드R1이고;
R1이 H이며, R2 및 R3이 글루코실기이고, R4가 글루코실기일 경우, 상기 식(VI) 화합물은 사포닌20-O-Glucosylginsenoside Rf이며;
R1 및 R2가 H이고, R3이 글루코실기일 경우, 상기 식(V) 화합물은 진세노사이드Rh1이고;
R1 및 R2가 H이며, R3이 글루코실기이고, R4가 자일로실기일 경우, 상기 식(VI) 화합물은 노토진세노사이드R2이며; R1 및 R2가 H이고, R3 및 R4가 글루코실기일 경우, 상기 식(VI) 화합물은 진세노사이드Rf이다.
(D)
Figure 112019131566297-pct00007
식(Ⅶ) 화합물 식(Ⅷ) 화합물
여기서, R1은 글리코실기이고; R2 및 R3은 OH 또는 H이며; R4는 글리코실기 또는 H이고; R5는 글리코실기이며, R5-R1-O는 C3첫 번째 글리코실기로부터 유도된 글리코실기이고; 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택되며;
R1-R4가 치환된 후의 화합물은 하기 표에 나타낸 바와 같다:
Figure 112019131566297-pct00008
즉, R1이 글루코실기이고; R2가 H이며, R3이 OH이고, R4가 H일 경우, 식(Ⅶ) 화합물은 Rh2이며;R1이 글루코실기이고; R2가 H이며, R3이 OH이고, R4가 글루코실기일 경우, 식(Ⅶ) 화합물은 F2이며;
R1이 글루코실기이고; R2가 H이며, R3이 OH이고, R4가 2개의 글루코실기일 경우, 식(Ⅶ) 화합물은 지페노사이드(Gypenoside) XVII이며;
R1이 글루코실기이고; R2가 H이며, R3이 OH이고, R4가 하나의 글루코실기로부터 연장된 하나의 자일로실기일 경우, 식(Ⅶ) 화합물은 지페노사이드 IX이며;
기질 (Ⅶ) 화합물이 Rh2이면, 산물 식(Ⅷ) 화합물은 Rg3이고; 기질 (Ⅶ) 화합물이 F2이면, 산물 식(Ⅷ) 화합물은 Rd이며; 기질 (Ⅶ) 화합물이 Gypenoside XVII이면, 산물 식(Ⅷ) 화합물은 Rb1이고; 기질 (Ⅶ) 화합물이 Gypenoside IX이면, 산물 식(Ⅷ) 화합물은 Rb3이다.
(E)
Figure 112019131566297-pct00009
식(IX) 화합물 식(X) 화합물
식(IX) 화합물 식(X) 화합물
여기서, R1은 글리코실기이고; R2 및 R3은 OH 또는 H이며; R4는 글리코실기 또는 H이고; R5는 글리코실기이며, R6-R1-O는 C3첫 번째 글리코실기로부터 유도된 글리코실기이고; R6은 글리코실기이며, R6-R1-O는 C3 첫 번째 글리코실기로부터 유도된 글리코실기이고, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 41, 45, 90, 92, 94 또는 96 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택되며;
R1가 2개의 글루코실기이고, R2가 H이며, R3이 OH이고, R4가 H일 경우, 식(IX) 화합물은 Rg3이다.
R1이 2개의 글루코실기이고, R2가 H이며, R3이 OH이고, R4가 글루코실기일 경우, 식(IX) 화합물은 Rd이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 글리코실기는 글루코실기, 자일로스, 갈락투론산기, 갈락토실기(galactosyl group), 아라비노실기, 람노실기(Rhamnosyl group), 및 기타 헥소실기(Hexosyl group) 또는 펜토실기(Pentosyl group)로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 식에서 (I), (Ⅲ), (V), (Ⅶ), (IX) 화합물은 S배열 또는 R배열의 다마렌형 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물, 라노스테인(Lanostane)형 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물, apotirucallane형 테트라시클릭트리터페노이드, 티루칼라네스(Tirucallanes)형 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물, 시클로아탄(시클로알탄)(cycloartane)형 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물, 쿠커비탄(Cucurbitane)형 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물, 또는 멜리아칸(Decane)형 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물을 포함한다(하지만 이에 한정되지 않음).
또 다른 바람직한 예에서, 상기 반응식에서 (Ⅱ), (Ⅳ), (VI), (Ⅷ), 또는 (X) 화합물은 진세노사이드Rg3, 진세노사이드Rd, 진세노사이드Rb1, 진세노사이드Rb3, 사포닌DMGG, 사포닌DMGX, 지페노사이드LXXV, 지페노사이드XVII, 지페노사이드XIII, 지페노사이드IX, 노토진세노사이드U, 노토진세노사이드R1, 노토진세노사이드R2, 노토진세노사이드R3, 3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-PPD; 3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-CK, 20-O-Glucosylginsenoside Rf및Ginsenoside F3을 포함한다.
본 발명의 제6 양태에 있어서, 글리코실기 전이 촉매반응을 수행하는 방법을 제공하였고, 본 발명의 제3 양태에 따른 폴리펩티드 또는 이의 유도 폴리펩티드 존재 하에서, 글리코실기 전이 촉매 반응을 수행하는 단계를 포함한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 방법은,
글리코실기 공여체 및 본 발명의 제3 양태에 따른 폴리펩티드 및 이의 유도 폴리펩티드 존재 하에서, 상기 식(I) 화합물을 상기 식(Ⅱ) 화합물로 전이시키거나, 또는 식(Ⅲ) 화합물을 상기 식(Ⅳ) 화합물로 전이시키거나, 또는 식(V) 화합물을 상기 식(VI) 화합물로 전이시키거나; 또는 상기 식(Ⅶ) 화합물을 상기 식(Ⅷ) 화합물로 전이시키거나, 또는 식(IX) 화합물을 상기 식(IX) 화합물로 전이시키는 단계를 더 포함한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 방법은 상기 폴리펩티드 및 이의 유도 폴리펩티드를 촉매 반응에 각각 넣는 단계; 및/또는
상기 폴리펩티드 및 이의 유도 폴리펩티드를 촉매 반응에 동시에 넣는 단계를 더 포함한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 방법은 글리코실트랜스퍼라제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 다마렌디올 및/또는 프로토파낙사디올 및/또는 프로토파낙사트리올 합성 대사 경로에서의 관건적인 유전자와 숙주 세포에서 공동 발현되어, 상기 식(Ⅱ), (Ⅳ), (VI), (Ⅷ), 또는 (X) 화합물을 얻는 단계를 더 포함한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 효모균 또는 대장균이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124로 표시되는아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 이의 유도 폴리펩티드이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NOs.: 3, 5, 7, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 115, 117, 119, 121, 또는 123으로 표시된다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 방법은 반응 체계에 효소 활성 조절용 첨가물을 제공하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 효소 활성 조절용 첨가물은 효소 활성을 향상시키거나 효소 활성을 억제시키는 첨가물이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 효소 활성 조절용 첨가물은 Ca2 +, Co2 +, Mn2 +, Ba2+, Al3+, Ni2+, Zn2+ 또는 Fe2+로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 효소 활성 조절용 첨가물은 Ca2 +, Co2 +, Mn2 +, Ba2+, Al3+, Ni2+, Zn2+ 또는 Fe2+를 생성할 수 있는 물질이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 글리코실기 공여체는 뉴클레오시드디포스페이트당이고, UDP-글루코스, ADP-글루코스, TDP-글루코스, CDP-글루코스, GDP-글루코스, UDP-자일로스, ADP-자일로스, TDP-자일로스, CDP-자일로스, GDP-자일로스, UDP-갈락투론산, UDP-아세틸글루코스, ADP-아세틸글루코스, TDP-아세틸글루코스, CDP-아세틸글루코스, GDP-아세틸글루코스, ADP-갈락투론산, TDP-갈락투론산, CDP-갈락투론산, GDP-갈락투론산, UDP-갈락토스, ADP-갈락토스, TDP-갈락토스, CDP-갈락토스, GDP-갈락토스, UDP-아라비노스, ADP-아라비노스, TDP-아라비노스, CDP-아라비노스, GDP-아라비노스, UDP-람노스, ADP-람노스, TDP-람노스, CDP-람노스, GDP-람노스, 또는 기타 뉴클레오시드디포스페이트헥소스 또는 뉴클레오시드디포스페이트펜토스, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 글리코실기 공여체는 우리딘디포스페이트당이고, UDP-글루코스, UDP-자일로스, UDP-갈락투론산, UDP-갈락토스, UDP-아라비노스, UDP-람노스, 또는 기타 우리딘디포스페이트헥소스 또는 우리딘디포스페이트펜토스, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 예에서, 반응체계의 pH는 pH4.0 ~ 10.0이고, 바람직하게 pH는 5.5 ~ 9.0이다.
또 다른 바람직한 예에서, 반응 체계의 온도는 10 ~ 105 ℃이고, 바람직하게 온도는 20 ~ 50 ℃이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 다마렌디올 합성 대사 경로에서의 관건적인 유전자는 다마렌디올 합성 효소 유전자를 포함한다(하지만 이에 한정되지 않음).
또 다른 바람직한 예에서, 상기 진세노사이드CK 합성 대사 경로에서의 관건적인 유전자는 다마렌디올 합성 효소 유전자, 시토크롬P450 CYP716A47 유전자 및 P450 CYP716A47의 환원 효소 유전자 및 테트라시클릭트리터페노이드C20 부위의 글리코실트랜스퍼라제UGTPg1(Genbank accession number KF377585.1), 또는 이들의 조합을 포함한다(하지만 이에 한정되지 않음).
또 다른 바람직한 예에서, 상기 진세노사이드진세노사이드F1 합성 대사 경로에서의 관건적인 유전자는 다마렌디올 합성 효소 유전자, 시토크롬P450 CYP716A47 유전자, P450 CYP716A47의 환원 효소 유전자, 시토크롬P450 CYP716A53V2 유전자 및 이의 환원 효소 유전자와 테트라시클릭트리터페노이드C20 부위의 글리코실트랜스퍼라제UGTPg1, 또는 이들의 조합을 포함한다(하지만 이에 한정되지 않음).
또 다른 바람직한 예에서, 상기 진세노사이드Rg1 합성 대사 경로에서의 관건적인 유전자는 다마렌디올 합성 효소 유전자, 시토크롬P450 CYP716A47 유전자와 P450 CYP716A47의 환원 효소 유전자 및 테트라시클릭트리터페노이드C20 부위 및 C6의 글리코실트랜스퍼라제UGTPg1와 UGTPg100(Genbank accession number AKQ76388.1), 또는 이들의 조합을 포함한다(하지만 이에 한정되지 않음).
또 다른 바람직한 예에서, 상기 글리코실기 촉매 반응의 기질은 식(I), (Ⅲ), (V), (Ⅶ), (IX) 화합물이고, 상기 산물은 각각 (Ⅱ), (Ⅳ), (VI), (Ⅷ), (X) 화합물이며;
또 다른 바람직한 예에서, 상기 식(I) 화합물은 진세노사이드CK이고, 식(Ⅱ) 화합물은 지페노사이드LXXV (20-O-β-(D-글루코피라노실)-β-(D-글루코피라노실)-프로토파낙사디올) (20-O-β-(D-glucopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxadiol)이며;
또는, 상기 식(I) 화합물은 진세노사이드DMG이고, 식(Ⅱ) 화합물은 신규 진세노사이드DMGG (20-O-β-(D-글루코피라노실)-β-(D-글루코피라노실)-다마렌디올) (20-O-β-(D-glucopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)- dammarenediol)이며;
상기 식(I) 화합물은 진세노사이드F2이고, 식(Ⅱ) 화합물은 지페노사이드XVII(3-O-β-(D-글루코피라노실)-20-O-β-(D-글루코피라노실)-β-(D-글루코피라노실)-프로토파낙사디올)(3-O-β-(D-glucopyranosyl)-20-O-β-(D-glucopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl) -protopanaxadiol)이며;
또는, 상기 식(I) 화합물은 진세노사이드Rd이고, 식(Ⅱ) 화합물은 진세노사이드Rb1(3-O-β-(D-글루코피라노실)-β-(D-글루코피라노실)-20-O-β-(D-글루코피라노실)-β-(D-글루코피라노실)-프로토파낙사디올)(3-O-β-(D-glucopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-20-O-β-(D-glucopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxadiol)이며;
또는, 상기 식(I) 화합물은 진세노사이드Rd이고, 식(Ⅱ) 화합물은 진세노사이드Rb3(3-O-β-(D-글루코피라노실)-β-(D-글루코피라노실)-20-O-β- (D-자일로피라노실)-β-(D-글루코피라노실)-프로토파낙사디올)(3-O-β-(D-glucopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-20-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxadiol)이며;
상기 식(I) 화합물은 진세노사이드CK이고, 식(Ⅱ) 화합물은 지페노사이드XIII이며;
상기 식(I) 화합물은 진세노사이드DMG이고, 식(Ⅱ) 화합물은 진세노사이드DMGX (20-O-β-(D-자일로피라노실)-β-(D-글루코피라노실)-다마렌디올) (20-O-β-(D-glucopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)- dammarenediol)이며;
상기 식(I) 화합물은 진세노사이드F2이고, 식(Ⅱ) 화합물은 지페노사이드IX이며;
상기 식(I) 화합물은 진세노사이드CK이고, 식(Ⅱ) 화합물은 진세노사이드F3이며; 또 다른 바람직한 예에서, 상기 식(Ⅲ) 화합물은 진세노사이드F1이고, 식(Ⅳ) 화합물은 노토진세노사이드U(20-O-β-(D-글루코피라노실)-β-(D-글루코피라노실)-프로토파낙사트리올) (20-O-β-(D-glucopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxatriol)이며;
또 다른 바람직한 예에서, 상기 식(Ⅲ) 화합물은 진세노사이드Rg1이고, 식(Ⅳ) 화합물은 노토진세노사이드R3이며;
또 다른 바람직한 예에서, 상기 식(V) 화합물은 진세노사이드Rg1이고, 식(VI) 화합물은 노토진세노사이드R1(6-O-β-(D-자일로피라노실)-β-(D-글루코피라노실)-20-O-β-(D-글루코피라노실)-프로토파낙사트리올)(6-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-20-O-β-(D-glucopyranosyl) -protopanaxatriol)이며;
상기 식(V) 화합물은 진세노사이드Rg1이고, 식(VI) 화합물은 20-O-Glucosylginsenoside Rf이며;
상기 식(V) 화합물은 진세노사이드Rh1이고, 식(VI) 화합물은 노토진세노사이드R2(6-O-β-(D-자일로피라노실)-β-(D-글루코피라노실)-프로토파낙사트리올)(6-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxatriol)이다.
또는, 상기 식(V) 화합물은 진세노사이드Rh1이고, 식(VI) 화합물은 진세노사이드Rf이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 식(III) 화합물은 진세노사이드Rg1이고, 식(Ⅳ) 화합물은 노토진세노사이드R3이며;
또 다른 바람직한 예에서, 상기 식(Ⅶ) 화합물이 Rh2이면, 산물 식(Ⅷ) 화합물은 Rg3이고;
상기 식(Ⅶ) 화합물이 F2이면, 산물 식(Ⅷ) 화합물은 Rd이며;
상기 식(Ⅶ) 화합물이 Gypenoside XVII이면, 산물 (Ⅷ) 화합물은 Rb1이고;
상기 식 (Ⅶ) 화합물이 Gypenoside IX이면, 산물(Ⅷ) 화합물은 Rb3이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 식 (IX) 화합물이 Rg3이면, 산물 식(X) 화합물은 3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-PPD이고;
상기 식(IX) 화합물이 Rd이면, 산물 식(X) 화합물은 3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-CK이다.
본 발명의 제7 양태에 있어서, 유전자 조작된 숙주 세포를 제공하였고, 상기 숙주 세포는 본 발명의 제5 양태에 따른 전달체를 포함하거나, 또는 유전자를 본 발명의 제4 양태에 따른 폴리뉴클레오티드에 통합시켰다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 효모 세포 또는 식물 세포와 같은 진핵 세포이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 출아형 효모 세포이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 대장균과 같은 원핵 세포이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 인삼 세포이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 (II), (Ⅳ), (VI), (Ⅶ), (X) 화합물을 자연적으로 생성하는 세포가 아니다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 진세노사이드Rg3, 진세노사이드Rd, 진세노사이드Rb1, 진세노사이드Rb3, 사포닌DMGG, 사포닌DMGX, 지페노사이드LXXV, 지페노사이드XVII, 지페노사이드XIII, 지페노사이드IX, 노토진세노사이드U, 노토진세노사이드R1, 노토진세노사이드R2, 노토진세노사이드R3, 3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-PPD; 3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-CK, 20-O-Glucosylginsenoside Rf 및 Ginsenoside F3을 자연적으로 생성하는 세포가 아니다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 다마렌디올 합성 대사 경로에서의 관건적인 유전자는 다마렌디올 합성 효소 유전자를 포함한다(하지만 이에 한정되지 않음).
또 다른 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 다마렌디올 합성 효소 유전자, 시토크롬P450 CYP716A47 유전자, P450 CYP716A47의 환원 효소 유전자 및 테트라시클릭트리터페노이드C20 부위의 글리코실트랜스퍼라제UGTPg1, 또는 이들의 조합을 포함하는(하지만 이에 한정되지 않음) 진세노사이드CK 합성 대사 경로에서의 관건적인 유전자를 함유한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 다마렌디올 합성 효소 유전자, 시토크롬P450 CYP716A47 유전자, P450 CYP716A47의 환원 효소 유전자, 시토크롬P450 CYP716A53V2 유전자 및 테트라시클릭트리터페노이드C20 부위의 글리코실트랜스퍼라제UGTPg1, 또는 이들의 조합을 포함하는(하지만 이에 한정되지 않음) 진세노사이드F1 합성 대사 경로에서의 관건적인 유전자를 함유한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 진세노사이드Rg1 합성 대사 경로에서의 관건적인 유전자는 다마렌디올 합성 효소 유전자, 시토크롬P450 CYP716A47 유전자 및 P450 CYP716A47의 환원 효소 유전자 및 테트라시클릭트리터페노이드C20 부위 및 C6의 글리코실트랜스퍼라제UGTPg1 및 UGTPg100(Genbank accession number AKQ76388.1), 또는 이들의 조합을 포함한다(하지만 이에 한정되지 않음).
본 발명의 제8 양태에 있어서, 본 발명의 제7 양태에 따른 숙주 세포의 용도를 제공하였고, 효소 효소 촉매 작용 시약을 제조하거나, 글리코실트랜스퍼라제를 생성하거나, 촉매 작용 세포로 사용되거나, 또는 식(Ⅱ), (Ⅳ), (VI), (Ⅷ) 또는 (X) 화합물의 생성에 사용된다.
본 발명의 제9 양태에 있어서, 유전자 변형 식물을 생성하는 방법을 제공하였고, 제8양태에 따른 유전자 조작된 숙주 세포를 식물로 재생시키는 단계를 포함하고, 상기 유전자 조작된 숙주 세포는 식물 세포이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 유전자 조작된 숙주 세포는 인삼 세포이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 유전자 조작된 숙주 세포는 삼칠 세포이다.
본 발명의 범위 내에서, 본 발명이 상기 각 기술적 특징 및 이하(예를 들어 실시예)에서 구체적으로 기술되는 각 기술적 특징은 서로 조합되어 새롭거나 바람직한 기술적 해결 수단을 구성할 수 있음을 이해하여야 한다. 편폭의 제한으로 인해 여기서 일일이 설명하지 않을 것이다.
(1) 본 발명의 글리코실트랜스퍼라제는 테트라시클릭트리터페노이드 화합물 기질의 C-20 부위의 첫 번째 글리코실기/또는 C-6 또는 C-3 부위의 첫 번째 글리코실기에 글리코실기를 특이적 및 효율적으로 전입시키거나 글리코실기를 치환하여 당사슬을 연장할 수 있고;
(2) 본 발명의 글리코실트랜스퍼라제는 특히 CK, DMG, F2, Rd, F1, Rh1 및 Rg1을 활성을 갖는 진세노사이드Rg3, 진세노사이드Rd, 진세노사이드Rb1, 진세노사이드Rb3, 사포닌DMGG, 사포닌DMGX, 지페노사이드LXXV, 지페노사이드XVII, 지페노사이드XIII, 지페노사이드IX, 노토진세노사이드U, 노토진세노사이드R1, 노토진세노사이드R2, 노토진세노사이드R3, 3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-PPD; 3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-CK, 20-O-Glucosylginsenoside Rf 및 Ginsenoside F3으로 각각 전환시킬 수 있으며;
(3) 진세노사이드Rb1은 신경 세포 및 항염증 및 항산화 효능이 있고; 진세노사이드Rb3은 심근 허혈을 완화시키며 항우울 효능이 있다. 노토진세노사이드R1은 노토진세노사이드의 주요 성분으로, 항염증 효능이 있다. 노토진세노사이드R2는 신경 보호 효능이 있다.
도 1의 (A)은 대장균에서 SDS-PAGE글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-32, GT29-33 및 GT29-34의 발현을 나타내고; 레인 대조군(control), pet28a 빈 전달체 재조합체의 용해물 총 단백질 또는 용해된 상청액; 레인GT29-32, 재조합 대장균 BL21-GT29-32의 용해물 총 단백질 또는 용해된 상청액; 레인GT29-33, 재조합 대장균 BL21-GT29-33의 용해물 총 단백질 또는 용해된 상청액; 레인GT29-34, 재조합 대장균 BL21-GT29-34의 용해물 총 단백질 또는 용해된 상청액; (B)는 웨스턴 블롯(Western Blot)에 의한 대장균에서 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-32, GT29-33 및 GT29-34의 발현을 검출하는 것을 나타내고; 레인 대조군, pet28a 빈 전달체 재조합체의 용해물 총 단백질 또는 용해된 상청액; 레인GT29-32, 재조합 대장균 BL21-GT29-32의 용해물 총 단백질 또는 용해된 상청액; 레인GT29-33, 재조합 대장균 BL21-GT29-33의 용해물 총 단백질 또는 용해된 상청액; 레인GT29-34, 재조합 대장균 BL21-GT29-34의 용해물 총 단백질 또는 용해된 상청액이다.
도 2는 글리코실트랜스퍼라제 GT29-32, GT29-33 및 GT29-34에 의해 촉매되고 진세노사이드CK 또는 Rd를 글리코실기 수용체로, UDP-글루코스 또는 UDP-자일로스를 글리코실기 공여체로 사용하는 글리코실 전이 반응의 TLC패턴을 나타낸다. 대조군은 pet28a 빈 전달체 재조합체의 용해물 상청액을 효소 용액으로 하는 것을 대표하고; GT29-32, GT29-33 및 GT29-34는 각각 재조합 대장균 BL21-GT29-32, BL21-GT29-33 및 BL21-GT29-34의 용해물 상청액을 각각 효소 용액으로 하는 것을 대표한다.
도 3은 글리코실트랜스퍼라제 GT29-32, GT29-33 및 GT29-34에 의해 촉매되고 진세노사이드CK 또는 Rd를 글리코실기 수용체로, UDP-글루코스를 글리코실기 공여체로 사용하는 글리코실 전이 반응의 HPLC 패턴을 나타낸다. 대조군은 pet28a 빈 전달체 재조합체의 용해물 상청액을 효소 용액으로 하는 것을 대표하고; GT29-32, GT29-33 및 GT29-34는 재조합 대장균 BL21-GT29-32, BL21-GT29-33 및 BL21-GT29-34의 용해물 상청액을 각각 효소 용액으로 하는 것을 대표한다.
도 4는 글리코실트랜스퍼라제 GT29-32, GT29-33 및 GT29-34에 의해 촉매되고 진세노사이드Rd를 글리코실기 수용체로, UDP-자일로스를 글리코실기 공여체로 사용하는 글리코실 전이 반응의 HPLC 패턴을 나타낸다. 대조군은 pet28a 빈 전달체 재조합체의 용해물 상청액을 효소 용액으로 하는 것을 대표하고; GT29-32, GT29-33 및 GT29-34는 재조합 대장균 BL21-GT29-32, BL21-GT29-33 및 BL21-GT29-34의 용해물 상청액을 각각 효소 용액으로 하는 것을 대표한다.
도 5는 글리코실트랜스퍼라제 GT29-32, GT29-33 및 GT29-34에 의해 촉매되고 진세노사이드F1을 글리코실기 수용체로, UDP-글루코스를 글리코실기 공여체로 사용하는 글리코실 전이 반응의 TLC 패턴을 나타낸다. 대조군은 pet28a 빈 전달체 재조합체의 용해물 상청액을 효소 용액으로 하는 것을 대표하고; GT29-32, GT29-33 및 GT29-34는 재조합 대장균 BL21-GT29-32, BL21-GT29-33 및 BL21-GT29-34의 용해물 상청액을 각각 효소 용액으로 하는 것을 대표한다.
도 6은 글리코실트랜스퍼라제 GT29-32, GT29-33 및 GT29-34에 의해 촉매되고 진세노사이드F1을 글리코실기 수용체로, UDP-글루코스를 글리코실기 공여체로 사용하는 글리코실 전이 반응의 HPL 패턴을 나타낸다. 대조군은 pet28a 빈 전달체 재조합체의 용해물 상청액을 효소 용액으로 하는 것을 대표하고; GT29-32, GT29-33 및 GT29-34는 재조합 대장균 BL21-GT29-32, BL21-GT29-33 및 BL21-GT29-34의 용해물 상청액을 각각 효소 용액으로 하는 것을 대표한다.
도 7은 글리코실트랜스퍼라제 GT29-4, GT29-5, GT29-7, GT29-9, GT29-11, GT29-13, GT29-17, GT29-18, GT29-24 및 GT29-25에 의해 촉매되고 진세노사이드Rg1을 글리코실기 수용체로, UDP-자일로스를 글리코실기 공여체로 사용하는 글리코실 전이 반응의TLC 패턴을 나타낸다. 대조군은 pet28a 빈 전달체 재조합체의 용해물 상청액을 효소 용액으로 하는 것을 대표하고; GT29-4, GT29-5, GT29-7, GT29-9, GT29-11, GT29-13, GT29-17, GT29-18, GT29-24 및 GT29-25는 재조합 대장균 BL21-GT29-4, BL21-GT29-5, BL21-GT29-7, BL21-GT29-9, BL21-GT29-11, BL21-GT29-13, BL21-GT29-17, BL21-GT29-18, BL21-GT29-24 및 BL21-GT29-25의 용해물 상청액을 각각 효소 용액으로 하는 것을 대표한다.
도 8은 글리코실트랜스퍼라제 GT29-4, GT29-5, GT29-7 및 GT29-9에 의해 촉매되고 진세노사이드Rg1을 글리코실기 수용체로, UDP-자일로스를 글리코실기 공여체로 사용하는 글리코실 전이 반응의 HPLC 패턴을 나타낸다. 대조군은 pet28a 빈 전달체 재조합체의 용해물 상청액을 효소 용액으로 하는 것을 대표하고; GT29-4, GT29-5, GT29-7 및 GT29-9는 재조합 대장균 BL21-GT29-4, BL21-GT29-5, BL21-GT29-7 및 BL21-GT29-9의 용해물 상청액을 각각 효소 용액으로 하는 것을 대표한다.
도 9는 글리코실트랜스퍼라제 GT29-11, GT29-13, GT29-17, GT29-18, GT29-24 및 GT29-2에 의해 촉매되고 진세노사이드Rg1을 글리코실기 수용체로, UDP-자일로스를 글리코실기 공여체로 사용하는 글리코실 전이 반응의 HPLC 패턴을 나타낸다. 대조군은 pet28a 빈 전달체 재조합체의 용해물 상청액을 효소 용액으로 하는 것을 대표하고; GT29-11, GT29-13, GT29-17, GT29-18, GT29-24 및 GT29-25는 재조합 대장균 BL21-GT29-11, BL21-GT29-13, BL21-GT29-17, BL21-GT29-18, BL21-GT29-24 및 BL21-GT29-25의 용해물 상청액을 각각 효소 용액으로 하는 것을 대표한다.
도 10은 웨스턴 블롯에 의한 글리코실트랜스퍼라제 PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-5, PNUGT29-6, PNUGT29-7, PNUGT29-8, PNUGT29-9, PNUGT29-14, PNUGT29-15 단백질 발현 검출 정황을 나타낸다. 대조군은 pet28a 빈 전달체 재조합체의 용해물 상청액을 효소 용액으로 하는 것을 대표하고; PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-5, PNUGT29-6, PNUGT29-7, PNUGT29-8, PNUGT29-9, PNUGT29-14, PNUGT29-15는 재조합 대장균 BL21- PNUGT29-1, BL21- PNUGT29-2, BL21- PNUGT29-3, BL21- PNUGT29-4, BL21- PNUGT29-5, BL21- PNUGT29-6, BL21- PNUGT29-7, BL21- PNUGT29-8, BL21- PNUGT29-9, BL21- PNUGT29-14, BL21- PNUGT29-15의 용해물 상청액을 각각 효소 용액으로 하는 것을 대표한다.
도 11은 글리코실트랜스퍼라제 PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-5, PNUGT29-6, PNUGT29-7, PNUGT29-8, PNUGT29-9, PNUGT29-14, PNUGT29-15에 의해 촉매되고 인삼 사포닌Rd을 글리코실기 수용체로, UDP-글루코스를 글리코실기 공여체로 사용하는 글리코실 전이 반응의 TLC 패턴을 나타낸다. 대조군은 pet28a 빈 전달체 재조합체의 용해물 상청액을 효소 용액으로 하는 것을 대표하고; PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-5, PNUGT29-6, PNUGT29-7, PNUGT29-8, PNUGT29-9, PNUGT29-14, PNUGT29-15는 재조합 대장균 BL21- PNUGT29-1, BL21- PNUGT29-2, BL21- PNUGT29-3, BL21- PNUGT29-4, BL21- PNUGT29-5, BL21- PNUGT29-6, BL21- PNUGT29-7, BL21- PNUGT29-8, BL21- PNUGT29-9, BL21- PNUGT29-14, BL21- PNUGT29-15의 용해물 상청액을 각각 효소 용액으로 하는 것을 대표한다.
도 12는 글리코실트랜스퍼라제 PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-5, PNUGT29-6, PNUGT29-7, PNUGT29-8, PNUGT29-9, PNUGT29-14, PNUGT29-15에 의해 촉매되고 인삼 사포닌CK를 글리코실기 수용체로, UDP-글루코스를 글리코실기 공여체로 사용하는 글리코실 전이 반응의 TLC 패턴을 나타낸다. 대조군은 pet28a 빈 전달체 재조합체의 용해물 상청액을 효소 용액으로 하는 것을 대표하고; PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-5, PNUGT29-6, PNUGT29-7, PNUGT29-8, PNUGT29-9, PNUGT29-14, PNUGT29-15는 재조합 대장균 BL21- PNUGT29-1, BL21- PNUGT29-2, BL21- PNUGT29-3, BL21- PNUGT29-4, BL21- PNUGT29-5, BL21- PNUGT29-6, BL21- PNUGT29-7, BL21- PNUGT29-8, BL21- PNUGT29-9, BL21- PNUGT29-14, BL21- PNUGT29-15의 용해물 상청액을 각각 효소 용액으로 하는 것을 대표한다.
도 13은 글리코실트랜스퍼라제 PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-5, PNUGT29-6, PNUGT29-7, PNUGT29-8, PNUGT29-9, PNUGT29-14, PNUGT29-15에 의해 촉매되고 인삼 사포닌Rh2를 글리코실기 수용체로, UDP-글루코스를 글리코실기 공여체로 사용하는 글리코실 전이 반응의 TLC 패턴을 나타낸다. 대조군은 pet28a 빈 전달체 재조합체의 용해물 상청액을 효소 용액으로 하는 것을 대표하고; PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-5, PNUGT29-6, PNUGT29-7, PNUGT29-8, PNUGT29-9, PNUGT29-14, PNUGT29-15는 재조합 대장균 BL21- PNUGT29-1, BL21- PNUGT29-2, BL21- PNUGT29-3, BL21- PNUGT29-4, BL21- PNUGT29-5, BL21- PNUGT29-6, BL21- PNUGT29-7, BL21- PNUGT29-8, BL21- PNUGT29-9, BL21- PNUGT29-14, BL21- PNUGT29-15의 용해물 상청액을 각각 효소 용액으로 하는 것을 대표한다.
도 14는 글리코실트랜스퍼라제 GT29-36, GT29-36, GT29-42 및 GT29-43에 의해 촉매되고 진세노사이드Rd를 글리코실기 수용체로, UDP-자일로스를 글리코실기 공여체로 사용하는 글리코실 전이 반응의 TLC 패턴을 나타낸다. GT29-36, GT29-36, GT29-42 및 GT29-43은 재조합 대장균 BL21-GT29-36, BL21-GT29-36, BL21-GT29-42 및 BL21-GT29-43의 용해물 상청액을 각각 효소 용액으로 하는 것을 대표한다.
도 15는 글리코실트랜스퍼라제 GT29-45 및 GT29-46에 의해 촉매되고 진세노사이드Rh2를 글리코실기 수용체로, UDP-글루코스를 글리코실기 공여체로 사용하는 글리코실 전이 반응의 TLC 패턴을 나타낸다. 대조군은 pet28a 빈 전달체 재조합체의 용해물 상청액을 효소 용액으로 하는 것을 대표하고; GT29-45 및 GT29-46은 재조합 대장균 BL21-GT29-45 및 BL21-GT29-46의 용해물 상청액을 각각 효소 용액으로 하는 것을 대표한다.
도 16은 글리코실트랜스퍼라제 GT29-45 및 GT29-46에 의해 촉매되고 진세노사이드CK를 글리코실기 수용체로, UDP-글루코스를 글리코실기 공여체로 사용하는 글리코실 전이 반응의 TLC 패턴을 나타낸다. 대조군은 pet28a 빈 전달체 재조합체의 용해물 상청액을 효소 용액으로 하는 것을 대표하고; GT29-45 및 GT29-46은 재조합 대장균 BL21-GT29-45 및 BL21-GT29-46의 용해물 상청액을 각각 효소 용액으로 하는 것을 대표한다.
도 17은 글리코실트랜스퍼라제 GT29-32에 의해 촉매되고 진세노사이드CK를 글리코실기 수용체로, UDP-아라비노스를 글리코실기 공여체로 사용하는 글리코실 전이 반응의 TLC 패턴을 나타낸다. 대조군은 pet28a 빈 전달체 재조합체의 용해물 상청액을 효소 용액으로 하는 것을 대표하고; GT29-32는 재조합 대장균 BL21-GT29-32의 용해물 상청액을 효소 용액으로 하는 것을 대표한다.
본 발명자는 광범위하고 심층적인 연구를 걸쳐, 처음으로 글리코실트랜스퍼라제, 이의 대응되는 글리코실 전이 촉매 부위를 제공하였다. 구체적으로, 본 발명의 글리코실트랜스퍼라제 GT29-32 (SEQ ID NO.: 4), GT29-33 (SEQ ID NO.: 6), GT29-34 (SEQ ID NO.: 8), GT29-4(SEQ ID NO.: 12), GT29-5(SEQ ID NO.: 14), GT29-7(SEQ ID NO.: 16), GT29-9(SEQ ID NO.: 18), GT29-11(SEQ ID NO.: 20), GT29-13(SEQ ID NO.:22), GT29-17(SEQ ID NO.: 24), GT29-18(SEQ ID NO.: 26), GT29-19(SEQ ID NO.:116), GT29-20(SEQ ID NO.:118), GT29-21(SEQ ID NO.:120), GT29-22(SEQ ID NO.:122), GT29-23(SEQ ID NO.:124), GT29-24(SEQ ID NO.: 28), GT29-25(SEQ ID NO.: 30), GT29-36(SEQ ID NO.: 90), GT29-37(SEQ ID NO.: 92), GT29-42(SEQ ID NO.: 94), GT29-43(SEQ ID NO.: 96), GT29-45(SEQ ID NO.: 98), GT29-46(SEQ ID NO.: 100), PNUGT29-1(SEQ ID NO.: 39), PNUGT29-2(SEQ ID NO.: 41), PNUGT29-3(SEQ ID NO.: 43), PNUGT29-4(SEQ ID NO.: 45), PNUGT29-5(SEQ ID NO.: 47), PNUGT29-6(SEQ ID NO.: 49), PNUGT29-7(SEQ ID NO.: 51), PNUGT29-8(SEQ ID NO.: 53), PNUGT29-9(SEQ ID NO.: 55), PNUGT29-14(SEQ ID NO.: 57), PNUGT29-15(SEQ ID NO.: 59)는 테트라시클릭트리터페노이드 화합물 기질의 C-20 부위, C-6 부위 또는 C3 부위의 첫 번째 글리코실기의 히드록실글리코실화에 특이적이 효율적으로 촉매 작용하거나 원래의 글리코실기를 글리코실 치환하여, 당사슬을 연장할 수 있다.
본 발명의 글리코실트랜스퍼라제 특히 진세노사이드CK, DMG, F2, Rd, F1, Rh1 및 Rg1을 다른 활성이 있는 진세노사이드Rg3, 진세노사이드Rd, 진세노사이드Rb1, 진세노사이드Rb3, 사포닌DMGG, 사포닌DMGX, 지페노사이드LXXV, 지페노사이드XVII, 지페노사이드XIII, 지페노사이드IX, 노토진세노사이드U, 노토진세노사이드R1, 노토진세노사이드R2, 노토진세노사이드R3, 3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-PPD; 3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-CK, 20-O-Glucosylginsenoside Rf 및 Ginsenoside F3으로 각각 전이시킬 수 있다.
정의
본 명세서에 사용된 바오 같이, 용어 “활성 폴리펩티드”, “본 발명의 폴리펩티드 및 이의 유도 폴리펩티드”, “본 발명의 효소”, “글리코실트랜스퍼라제”는 호환 사용이 가능하고, 모두 GT29-32 (SEQ ID NO.: 4), GT29-33 (SEQ ID NO.: 6), GT29-34 (SEQ ID NO.: 8), GT29-4(SEQ ID NO.: 12), GT29-5(SEQ ID NO.: 14), GT29-7(SEQ ID NO.: 16), GT29-9(SEQ ID NO.: 18), GT29-11(SEQ ID NO.: 20), GT29-13(SEQ ID NO.:22), GT29-17(SEQ ID NO.: 24), GT29-18(SEQ ID NO.: 26), GT29-19(SEQ ID NO.:116), GT29-20(SEQ ID NO.:118), GT29-21(SEQ ID NO.:120), GT29-22(SEQ ID NO.:122), GT29-23(SEQ ID NO.:124), GT29-24(SEQ ID NO.: 28), GT29-25(SEQ ID NO.: 30), GT29-36(SEQ ID NO.: 90), GT29-37(SEQ ID NO.: 92), GT29-42(SEQ ID NO.:94), GT29-43(SEQ ID NO.: 96), GT29-45(SEQ ID NO.: 98), GT29-46(SEQ ID NO.: 100), PNUGT29-1(SEQ ID NO.: 39), PNUGT29-2(SEQ ID NO.: 41), PNUGT29-3(SEQ ID NO.: 43), PNUGT29-4(SEQ ID NO.: 45), PNUGT29-5(SEQ ID NO.: 47), PNUGT29-6(SEQ ID NO.: 49), PNUGT29-7(SEQ ID NO.: 51), PNUGT29-8(SEQ ID NO.: 53), PNUGT29-9(SEQ ID NO.: 55), PNUGT29-14(SEQ ID NO.: 57), PNUGT29-15(SEQ ID NO.: 59)폴리펩티드 및 이의 유도 폴리펩티드를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, “분리된 폴리펩티드” 또는 “활성 폴리펩티드”는 상기 폴리펩티드에 자연적으로 과련된 다른 단백질, 지질류 또는 다른 물질이 실질적으로 함유되지 않은 것을 의미한다. 당업자는 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 상기 폴리펩티드를 정제할 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 비 환원성 폴리 아크릴 아미드 겔에 단일 주 밴드를 생성할 수 있다. 상기 폴리펩티드의 순도는 아미노산 서열에 의해 추가로 분석될 수 있다.
본 발명의 활성 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 자연적으로 정제된 산물, 또는 화학 합성된 산물, 또는 재조합 기술을 사용하여 원핵 또는 진핵 숙주(예를 들어, 박테리아, 효모, 식물)에 생성된 것일 수 있다. 재조합 생산 수단에 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 글리코실화거나, 또는 비글리코실화된 것일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 출발 메오닌 잔기를 포함하거나 포함하지 않을 수도 있다.
본 발명은 상기 폴리펩티드의 단편, 유도체 및 유사체를 더 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “단편”, “유도체” 및 “유사체”는 상기 폴리펩티드와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 대체로 부유하는 폴리펩티드를 지칭한다.
본 발명의 폴리펩티드단편, 유도체 또는 유사체는 (i) 하나 또는 복수 개의 보존적 또는 비보존적인 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적인 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드가 있고, 이렇게 치환된 아미노산 잔기는 윤전자 코드에 의해 코딩된 것일 수있거나 아닐 수도 있으며, 또는 (ii) 하나 또는 복수 개의 아미노산 잔기에 치환기가 있는 폴리펩티드, 또는 (iii) 성숙된 폴리펩티드가 다른 하나의 화합물(폴리에틸렌 글리콜과 같은 예를 들어 폴리펩티드의 반감기를 연장시키는 화합물)과 융합시켜 형성된 폴리펩티드, 또는 (iv) 추가 아미노산 서열을 이 폴리펩티드 서열에 융합하여 형성된 폴리펩티드(예를 들어, 리더 서열 또는 분비 서열 또는 이 폴리펩티드를 정제하기 위한 서열, 또는 단백질원 서열, 또는 항원 IgG 단편과 형성된 융합 단백질)일 수 있다. 본 명세서의 교시에 따르면, 이러한 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에게 공지된 범위 내에 속한다.
본 발명의 활성 폴리펩티드는 글리코실트랜스퍼라제 활성을 가지며 하기와 같은 하나 또는 복수의 반응을 촉진할 수 있다.
(A)
Figure 112019131566297-pct00010
식(I) 화합물 식(Ⅱ) 화합물
여기서, R1은 H, 단당 글리코실기 또는 다당 글리코실기이고; R2는 H 또는 OH이며; R3은 단당 글리코실기이고; R4는 단당 글리코실기이며, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4, 6, 8, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 단당은 글루코스(Glc), 람노스(Rha), 아세틸글루코스(Glc(6)Ac), 아라비노푸라노스(Araf), 아라비노피라노스(Arap), 또는 자일로스(Xyl) 등을 포함한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 다당은 Glc(2-1)Glc, Glc(6-1)Glc, Glc(6)Ac, Glc(2-1)Rha, Glc(6-1)Arap, Glc(6-1)Xyl, Glc(6-1)Araf, Glc(3-1)Glc(3-1), Glc(2-1) Glu(6)Ac, Glc(6-1)Arap(4-1)Xyl, Glc(6-1)Arap(2-1)Xyl, 또는 Glc(6-1)Arap(3-1)Xyl 등 2 ~ 4개의 단당으로 이루어진 다당을 포함한다.
R1-R4가 치환된 후의 화합물은 하기 표에 나타낸 바와 같다:
Figure 112019131566297-pct00011
즉, 상기 R1이 H이고, R2가 OH이며, R3이 글루코실기일 경우, 상기 식(I) 화합물은 진세노사이드CK (CK)이고;
R1 및 R2가 모두 H이며, R3이 글루코실기일 경우, 상기 식(I) 화합물은 진세노사이드DMG이고;
R1이 글루코실기이며, R2가 OH이고, R3이 글루코실기일 경우, 상기 식(I) 화합물은 진세노사이드F2 (F2)이거나; 또는
R1이 2개의 글루코실기(Glc(2-1)Glc)이며, R2가 OH이고, R3이 글루코실기일 경우, 상기 식(I) 화합물은 진세노사이드Rd이고;
(B)
Figure 112019131566297-pct00012
식(Ⅲ) 화합물 식(Ⅳ) 화합물
여기서, R1은 H, 글리코실기 또는 다당 글리코실기이며, R2는 글리코실기이고, R3은 글리코실기이며, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 4 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택되고;
R1-R3이 치환된 후의 화합물은 하기 표에 나타낸 바와 같다:
Figure 112019131566297-pct00013
즉, R1이 H이고, R2가 글루코실기일 경우, 상기 식(Ⅲ) 화합물은 진세노사이드F1 (F1)이거나; 또는 R1 및 R2가 글루코실기일 경우, 상기 식(Ⅲ) 화합물은 진세노사이드Rg1 (Rg1)이며;
(C)
Figure 112019131566297-pct00014
식(V) 화합물 식(VI) 화합물;
여기서, R1 및 R2는 H 또는 글리코실기이고, R3 및 R4는 글리코실기이다. 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택되고;
R1-R4가 치환된 후의 화합물은 하기 표에 나타낸 바와 같다:
Figure 112019131566297-pct00015
즉, R1이 H이고, R2 및 R3이 글루코실기일 경우, 상기 식(V) 화합물은 진세노사이드Rg1이고;
R1 및 R2가 H이며, R3이 글루코실기일 경우, 상기 식(V) 화합물은 진세노사이드Rh1이다.
(D)
Figure 112019131566297-pct00016
식(Ⅶ) 화합물 식(Ⅷ) 화합물
여기서, R1은 글리코실기이고; R2 및 R3은 OH 또는 H이며; R4는 글리코실기 또는 H이고; R5는 글리코실기이며, R5-R1-O는 C3의 첫 번째 글리코실기로부터 유도된 글리코실기이고; 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 26, 28, 30, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택되며;
Figure 112019131566297-pct00017
즉, R1이 글루코실기이고; R2가 H이며, R3이 OH이고, R4가 H일 경우, 식(Ⅶ) 화합물은 Rh2이며; R1이 글루코실기이고; R2가 H이며, R3이 OH이고, R4가 글루코실기일 경우, 식(Ⅶ) 화합물은 F2이며;
R1이 글루코실기이고; R2가 H이며, R3이 OH이고, R4가 2개의 글루코실기일 경우, 식(Ⅶ) 화합물은 지페노사이드 XVII이며;
R1이 글루코실기이고; R2가 H이며, R3이 OH이고, R4가 하나의 글루코실기로부터 연장된 하나의 자일로실기일 경우, 식(Ⅶ) 화합물은 지페노사이드 IX이며;
(E)
Figure 112019131566297-pct00018
식(IX) 화합물 식(X) 화합물
여기서, R1은 글리코실기이고; R2 및 R3은 OH 또는 H이며; R4는 글리코실기 또는 H이고; R5는 글리코실기이며, R5-R1-O는 C3의 첫 번째 글리코실기로부터 유도된 글리코실기이고; R6은 글리코실기이며, R6-R1-O은 C3의 첫 번째 글리코실기로부터 유도된 글리코실기이고, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 41, 45, 90, 92, 94 또는 96 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택되며;
R1이 2개의 글루코실기이고, R2가 H이며, R3이 OH이고, R4가 H일 경우, 식(IX) 화합물은 Rg3이다.
R1이 2개의 글루코실기이고, R2가 H이며, R3이 OH이고, R4가 글루코실기일 경우, 식(IX) 화합물은 Rd이다.
상기 폴리펩티드의 바람직한 서열은 SEQ ID NO.: 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124로 표시되는 폴리펩티드이고, 상기 용어는 상기 폴리펩티드와 동일한 기능을 갖는, SEQ ID NO.: 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124 서열의 돌연변이 형태 및 유도 폴리펩티드를 더 포함한다. 이러한 돌연변이 형태는 하나 또는 복수 개(통상적으로 1 ~ 50개, 바람직하게는 1 ~ 30개, 더욱 바람직하게는 1 ~ 20개, 가장 바람직하게는 1 ~ 10개)의 아미노산의 결실, 삽입 및/또는 치환, 및 C 말단 및/또는 N 말단에 하나 또는 복수 개(통상적으로 20개 이내, 바람직하게는 10개 이내, 더욱 바람직하게는 5개 이내)의 아미노산을 첨가하는 것을 포함한다(하지만 이에 한정되지 않음). 예를 들어, 당 업계에서, 성능이 비슷하거나 유사한 아미노산에 의해 치환될 때, 단백질의 기능은 일반적으로 변하지 않는다. 또한 예를 들어, C 말단 및/또는 N 말단에 하나 또는 복수 개의 아미노산의 첨가는 일반적으로 단백질의 기능을 변화시키지 않는다. 상기 용어 본 발명의 단백질의 활성 단편 및 활성 유도체를 더 포함한다. 본 발명은 상기 폴리펩티드의 유사체를 더 제공하였다. 이러한 유사체와 천연 폴리펩티드의 차이는 아미노산 서열의 차이일 수 있고, 서열에 영향을 미치지 않는 돌연변이 형태의 차이일 수도 있거나, 또는 둘 다일 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 천연 또는 유도된 유전자 변이체를 포함한다. 유도된 변이체는 다양한 기술에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 복사 또는 유도제에 노출되어 생성된 무작위 돌연변이를 통해 얻을 수 있고, 부위 특이적 돌연변이법 또는 기타 분자 생물학에 공지된 기술에 의해 얻을 수도 있다. 유사체는 천연 L-아미노산의 잔기(예를 들어 D-아미노산)를 갖는 유사체, 및 비천연적으로 존재하거나 합성된 아미노산(예를 들어 β, γ-아미노산)을 갖는 유사체를 더 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 상기에서 예를 든 대표적인 폴리펩티드에 제한되지 않는 것을 이해해야 한다.
변형(통상적으로 1차 구조를 변경하지 않음) 형태로 체내 또는 체외의 폴리펩티드의 아세틸화 또는 카르복실화와 같은 화학적으로 유도된 형태를 포함한다. 변형은 글리코실화를 더 포함하고, 예를 들어, 폴리펩티드는 그러한 폴리펩티드의 합성 및 가공 또는 추가 가공 단계에서 글리코실화 변형에 의해 생성된다. 이러한 변형은 폴리펩티드를 글리코실화를 수행하는 효소(예를 들어, 포유 동물의 글리코실라제 또는 탈글리코실라제)에 노출시킴으로써 완성된다. 변형 형태는 인산화 아미노산 잔기(예를 들어, 포스포티로신, 포스포세린, 포스포레오닌)를 갖는 서열을 더 포함한다. 단백질 분해 효소 가수 분해에 대한 내성을 향상 시키거나 용해성을 최적화하도록 변형된 폴리펩티드를 더 포함한다.
본 발명의 GT29-32, GT29-33, GT29-34, GT29-4, GT29-5, GT29-7, GT29-9, GT29-11, GT29-13, GT29-17, GT29-18, GT29-19, GT29-20, GT29-21, GT29-22, GT29-23, GT29-24, GT29-25, GT29-32, GT29-33, GT29-34, GT29-36, GT29-37, GT29-42, GT29-43, GT29-45, GT29-46, PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-5, PNUGT29-6, PNUGT29-7, PNUGT29-8, PNUGT29-9, PNUGT29-14 또는 PNUGT29-15 단백질의 아미노기 말단 또는 카르복실기 말단은 단백질 태그로서 하나 또는 복수 개의 폴리펩티드 단편을 더 포함할 수 있다. 임의의 적합한 태그는 제한없이 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 태그는 FLAG, HA, HA1, c-Myc, Poly -His, Poly-Arg, Strep-TagII, AU1, EE, T7, 4A6, ε, B, gE 및 Ty1일 수 있다. 이러한 태그는 단백질의 정제에 사용될 수 있다. 표에 이 중의 일부 시판되는 태그를 열거하였다.
Figure 112019131566297-pct00019
번역된 단백질이 분비되어 발현하도록 하기 위해(예를 들어 세포 외에 분비됨), 상기 GT29-32, GT29-33, GT29-34, GT29-4, GT29-5, GT29-7, GT29-9, GT29-11, GT29-13, GT29-17, GT29-18, GT29-19, GT29-20, GT29-21, GT29-22, GT29-23, GT29-24, GT29-25, GT29-32, GT29-33, GT29-34, GT29-36, GT29-37, GT29-42, GT29-43, GT29-45, GT29-46, PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-9, PNUGT29-14 또는 PNUGT29-15의 아미노산 아미노기 말단에 pelB 신호 펩티드 등과 같은 신호 펩티드 서열을 추가할 수도 있다. 신호 펩티드는 폴리펩티드에서 세포 내로부터 분비되어 나오는 과정에서 절단될 수 있다.본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 형태 또는 RNA 형태일 수 있다. DNA 형태는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인공 합성된 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩 가닥 또는 비코딩 가닥일 수 있다. 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역 서열은 SEQ ID NO.: 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 115, 117, 119, 121, 또는 123으로 표시되는 코딩 영역 서열과 동일하거나 축퇴 변이체일 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, “축퇴 변이체”는 본 발명에서 SEQ ID NO.: 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124로 표시되는 서열을 갖는 단백질을 지칭하나, SEQ ID NO.: 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 115, 117, 119, 121, 또는 123로 각각 표시되는 코딩 영역 서열과 차별되는 핵산 서열이다.
SEQ ID NO.: 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124를 갖는 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 성숙 폴리펩티드만을 코딩하는 코딩 서열; 성숙 폴리펩티드의 코딩 서열 및 다양한 추가 코딩 서열; 성숙 폴리펩티드의 코딩 서열(및 임의의 추가 코딩 서열) 및 비코딩 서열을 포함한다.
용어 “폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드”는 폴리펩티드를 코딩하는 것을 포함하는 폴리 뉴클레오티드일 수 있고, 추가적인 코딩 및/또는 비코딩 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수도 있다.
또한 본 발명은 상기 폴리 뉴클레오티드의 변이체, 본 발명과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 이의 단편, 유사체 및 유도체에 관한 것이다. 이 폴리 뉴클레오티드의 변이체는 천연적으로 발생되는 대립 변이체 또는 비천연적으로 발생되는 변이체일 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 변이체는 치환 변이체, 결실 변이체 및 삽입 변이체를 포함한다. 당 업계에 공지된 바와 같이, 대립 변이체는 하나의 폴리 뉴클레오티드의 대체 형태이고, 이는 하나 또는 복수 개의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있지만, 실질적으로 이의 코딩된 폴리펩티드의 기능을 변화시키지 않는다.
또한 본 발명은 상기의 서열 혼성화되고 2개의 서열 사이에 적어도 50 %, 바람직하게는 적어도 70 %, 더욱 바람직하게 적어도 80 %, 85 %, 90 %, 95 %의 동일성을 갖는 폴리 뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히 엄격한 조건(또는 엄한 조건) 하에서 본 발명에 따른 폴리 뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 폴리 뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명에서, “엄격한 조건”은, (1) 비교적 낮은 이온 강도와 비교적 높은 온도 하에서의 혼성화 및 용리, 예를 들어 0.2 × SSC, 0.1 %의 SDS, 60 ℃; 또는 (2) 혼성화시 변성제 첨가, 예를 들어, 50 %(v/v)의 포름아미드, 0.1 %의 소태아 혈청/0.1 %의 Ficoll, 42 ℃ 등; 또는 (3) 두 가닥의 서열 사이의 동일성이 적어도 90 % 이상이고, 바람직하게는 95 % 이상일 때만 혼성화된다. 또한, 혼성화 가능한 폴리 뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드는 SEQ ID NO.: 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 116, 118, 120, 122, 또는 124로 표시되는 성숙 폴리펩티드와 동일한 생물학적 기능과 활성을 갖는다.
또한 본 발명은 상기의 서열과 혼성화된 핵산 단편에 관한 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, “핵산 단편”의 길이는 적어도 15개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 30개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 50개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 100개의 뉴클레오티드를 포함한다. 핵산 단편은 GT29-32, GT29-33, GT29-34, GT29-4, GT29-5, GT29-7, GT29-9, GT29-11, GT29-13, GT29-17, GT29-18, GT29-19, GT29-20, GT29-21, GT29-22, GT29-23, GT29-24, GT29-25, GT29-32, GT29-33, GT29-34, GT29-36, GT29-37, GT29-42, GT29-43, GT29-45, GT29-46, PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-5, PNUGT29-6, PNUGT29-7, PNUGT29-8, PNUGT29-9, PNUGT29-14 또는 PNUGT29-15 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 결정 및/또는 분리하기 위한 핵산 증폭 기술(예를 들어 PCR)에 적용될 수 있다.
본 발명에서의 폴리펩티드와 폴리 뉴클레오티드는 바람직하게 분리된 형식으로 제공되고, 더욱 바람직하게는 정제 또는 균질화 형식으로 제공된다.
본 발명의 GT29-32, GT29-33, GT29-34, GT29-4, GT29-5, GT29-7, GT29-9, GT29-11, GT29-13, GT29-17, GT29-18, GT29-19, GT29-20, GT29-21, GT29-22, GT29-23, GT29-24, GT29-25, GT29-32, GT29-33, GT29-34, GT29-36, GT29-37, GT29-42, GT29-43, GT29-45, GT29-46, PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-5, PNUGT29-6, PNUGT29-7, PNUGT29-8, PNUGT29-9, PNUGT29-14 또는 PNUGT29-15뉴클레오티드 전장 서열 또는 이의 단편은 통상적으로 PCR 증폭법, 재조합법 또는 인공 합성의 방법에 의해 얻는다. PCR 증폭법에 관하여, 본 발명에 개시된 관련 뉴클레오티드 서열, 특히 개방 판독 프레임 서열에 따라 프라이머를 설계할 수 있고, 시판되는 cDNA 라이브러리 또는 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 제조된 cDNA 라이브러리를 주형으로 증폭하여 관련 서열을 얻을 수 있다. 서열이 비교적 길 경우, 2회 또는 여러 회 PCR 증폭을 수행할 필요가 있고, 다음 각각의 증폭된 단편을 정확한 순서에 따라 함께 스플라이싱한다.
관련 서열을 얻으면, 재조합법에 따라 관련 서열을 대량으로 얻을 수 있다. 이는 일반적으로 전달체에 클로닝되고 다시 세포로 전달된 후, 통상적인 방법에 의해 증식된 숙주 세포로부터 분리하여 얻은 관련 서열이다.
이 외에, 특히 단편 길이가 짧을 경우 인공 합성 방법 관련 서열을 합성할 수도 있다. 통상적으로, 먼저 복수 개의 작은 단편을 합성한 후, 다시 연결하여 긴 단편을 얻을 수 있다.
현재, 본 발명의 단백질(또는 이의 단편, 또는 이의 유도체)을 코딩하는 DNA 서열은 화학적 합성에 의해 완전히 얻을 수 있다. 이후, 이 DNA 서열은 당 업계에 공지된 다양한 기존 DNA 분자 (또는 예를 들어 전달체) 및 세포에 도입될 수 있다. 이 외에, 화학 합성에 의해 돌연변이를 본 발명의 단백질 서열에 도입할 수도 있다.
PCR 기술에 의해 DNA/RNA를 증폭시키는 방법은 바람직하게는 본 발명의 유전자를 얻기 위해 사용된다. 특히, 라이브러리로부터 전장의 cDNA를 얻는 것이 어려운 경우, 바람직하게 RACE법(RACE-cDNA 말단 고속 증폭법)을 사용할 수 있고, PCR에 사용된 프라이머는 본 명세서에 개시된 본 발명의 서열 정보에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 합성될 수도 있다. 증폭된 DNA/RNA는 전기 영동과 같은 통상적인 방법에 의해 분리 및 정제될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 전달체, 본 발명의 전달체 또는 GT29-32, GT29-33, GT29-34, GT29-4, GT29-5, GT29-7, GT29-9, GT29-11, GT29-13, GT29-17, GT29-18, GT29-19, GT29-20, GT29-21, GT29-22, GT29-23, GT29-24, GT29-25, GT29-32, GT29-33, GT29-34, GT29-36, GT29-37, GT29-42, GT29-43, GT29-45, GT29-46, PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-5, PNUGT29-6, PNUGT29-7, PNUGT29-8, PNUGT29-9, PNUGT29-14 또는 PNUGT29-15 단백질 코딩 서열로 유전자 조작에 의해 생성된 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의해 본 발명에 따른 폴리펩티드를 생성하는 방법에 관한 것이다.
통상적인 재조합 DNA 기술에 의해, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 이용하여 재조합된 GT29-32, GT29-33, GT29-34, GT29-4, GT29-5, GT29-7, GT29-9, GT29-11, GT29-13, GT29-17, GT29-18, GT29-19, GT29-20, GT29-21, GT29-22, GT29-23, GT29-24, GT29-25, GT29-32, GT29-33, GT29-34, GT29-36, GT29-37, GT29-42, GT29-43, GT29-45, GT29-46, PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-5, PNUGT29-6, PNUGT29-7, PNUGT29-8, PNUGT29-9, PNUGT29-14 또는 PNUGT29-15폴리펩티드를 발현하거나 생산할 수 있다. 일반적으로,
(1). 본 발명의 GT29-32, GT29-33, GT29-34, GT29-4, GT29-5, GT29-7, GT29-9, GT29-11, GT29-13, GT29-17, GT29-18, GT29-19, GT29-20, GT29-21, GT29-22, GT29-23, GT29-24, GT29-25, GT29-32, GT29-33, GT29-34, GT29-36, GT29-37, GT29-42, GT29-43, GT29-45, GT29-46, PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-5, PNUGT29-6, PNUGT29-7, PNUGT29-8, PNUGT29-9, PNUGT29-14 또는 PNUGT29-15 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(또는 변이체), 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 함유한 재조합 발현 전달체를 적합한 숙주 세포에 형질 전화시키거나 형질도입시키는 단계;
(2). 적합한 배지에서 숙주 세포를 배양하는 단계;
(3). 배지 또는 세포에서 단백질을 분리, 정제하는 단계를 포함한다.
본 발명에서, GT29-32, GT29-33, GT29-34, GT29-4, GT29-5, GT29-7, GT29-9, GT29-11, GT29-13, GT29-17, GT29-18, GT29-19, GT29-20, GT29-21, GT29-22, GT29-23, GT29-24, GT29-25, GT29-32, GT29-33, GT29-34, GT29-36, GT29-37, GT29-42, GT29-43, GT29-45, GT29-46, PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-9, PNUGT29-14 또는 PNUGT29-15 폴리뉴클레오티드 서열은 재조합 발현 전달체에 삽입될 수 있다. 용어 “재조합 발현 전달체”는 당 업계에 공지된 박테리아 플라스미드, 파지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 아데노바이러스와 같은 포유 동물 세포 바이러스, 레트로바이러스 또는 기타 전달체를 지칭한다. 숙주 체내에서 복제 및 안정화될 수 있는 플라스미드 및 전달체라면 임의의 것을 사용할 수 있다. 발현 전달체의 하나의 중요한 특징은 통상적으로 복제 기점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 제어 요소를 함유한다는 것이다.
당업자에게 공지된 방법은 GT29-32, GT29-33, GT29-34, GT29-4, GT29-5, GT29-7, GT29-9, GT29-11, GT29-13, GT29-17, GT29-18, GT29-19, GT29-20, GT29-21, GT29-22, GT29-23, GT29-24, GT29-25, GT29-32, GT29-33, GT29-34, GT29-36, GT29-37, GT29-42, GT29-43, GT29-45, GT29-46, PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-9, PNUGT29-14 또는 PNUGT29-15코딩 DNA 서열 및 적합한 전사/번역 제어 신호를 함유하는 발현 전달체를 구축하는데 사용된다. 이러한 방법은 체외 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술, 체내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 발현 전달체 중의 적합한 프로모터에 효과적으로 연결되어 mRNA 합성을 지시할 수 있다. 이러한 프로모터의 대표적인 예로, 대장균의 lac 또는 trp 프로모터; λ파지 PL 프로모터; CMV 즉시 초기 프로모터, HSV 티미딘키나제 프로모터, 초기 및 말기 SV40프로모터, 역전사 바이러스의 LTRs 및 기타 일부 공지된 제어 가능한 유전자가 원핵 또는 진핵 세포 또는 이의 바이러스에서 발현되는 프로모터를 비롯한 진핵 프로모터가 있다. 발현 전달체는 번역 개시용의 리보솜 결합 부위 및 전사 종결자를 더 포함한다.
이 외에, 바람직하게 발현 전달체는 진핵 세포 배양을 위한 디히드로폴레이트리덕타제(dihydrofolate reductase), 네오마이신(neomycin) 내성 및 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 형질 전환 된 숙주 세포 선택하기 위한 표현형 특성을 제공하거나, 대장균의 테트라사이클린(tetracycline) 또는 암피실린 내성을 제공하기 위한 하나 또는 복수 개의 선별 마커 유전자를 포함한다.
상기의 적합한 DNA 서열 및 적합한 프로모터 또는 제어 서열을 전달체를 단백질의 발현을 가능하게 하는 적절한 숙주 세포에 형질 전환시킬 수 있다.
숙주 세포는 박테리아 세포와 같은 원핵 세포; 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포; 또는 포유 동물 세포와 같은 고등 진핵 세포일 수 있다. 대표적인 예로 대장균, 스트렙토마이세스 속; 살모넬라티피무리움의 박테리아 세포; 효모와 같은 진균 세포; 식물 세포; 초파리 S2 또는 Sf9의 곤충 세포; CHO, COS, 293세포, 또는 Bowes 흑색종 세포의 동물 세포 등이 있다.
본 발명의 폴리 뉴클레오티드가 고등 진핵 세포에서 발현될 때, 인핸서 서열이 전달체에 삽입되면 전사가 향상된다. 인핸서는 DNA의 시스 작용 인자로, 통상적으로 약 10개 내지 300개의 염기쌍이 있으며, 프로모터에 작용하여 유전자의 전사를 증가시킨다. 복제 개시점 말기 일측의 100개 내지 270개의 염시쌍의 SV40인핸서, 복제 개시점 말기 일측의 폴리마 인핸서 및 아데노 바이러스 인핸서 등을 포함하는 것을 예로 들 수 있다.
적절한 전달체, 프로모터, 인핸서 및 숙주 세포를 선택하는 방법은 당업자에게 명백할 것이다.
재조합 DNA에 의한 숙주 세포의 형질 전환은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 숙주가 대장균과 같은 원핵 생물일 때, DNA를 흡수할 수 있는 컴피턴트 세포는 지수 생장기 이후에 획득할 수 있고, CaCl2법에 의해 처리되며, 사용된 단계는 당 업계에 잘 알려져 있다. 다른 방법은 MgCl2를 사용하는 것이다. 필요하면, 형질 전환은 전기 천공에 의해 수행될 수도 있다. 숙주가 진핵 생물일 경우, 인산칼슘 공침법, 미세 주사법, 전기 천공법, 리포좀 패키징 등과 같은 통상적인 기계적 방법과 같은 DNA 형질 감염 방법을 선택하여 사용할 수 있다.
얻은 형질 전환체는 통상의 방법에 따라 배양하여 본 발명의 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 사용된 숙주 세포에 따라, 배양에 사용된 배지는 다양한 통상적인 배지로부터 선택될 수 있다. 숙주 세포 성장에 적합한 조건 하에서 배양하였다. 숙주 세포가 적절한 세포 밀도까지 성장한 후, 선택된 프로모터는 적합한 방법(예를 들어 온조 전환 또는 화학적 유도)에 의해 유도되고, 세포를 일정 시간 동안 더 배양하였다.
상기 방법에서의 재조합 폴리펩티드는 세포 내 또는 세포 막 상에서 발현되거나 세포 외로 분비될 수 있다. 필요하면, 재조합 단백질은 이의 물리적, 화학적 및 기타 특성을 이용하여 다양한 분리 방법에 의해 분리 및 정제할 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 방법의 예로 통상적인 재생 처리, 단백질 침전제 처리(염석 방법), 원심 분리, 침투 파균, 울트라 처리, 울트라 원심 분리, 분자체 크로마토그래피(겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 기타 다양한 액상 크로마토그래피 기술 및 이러한 방법의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
응용
본 발명에 관한 활성 폴리펩티드 또는 글리코실트랜스퍼라제는 공지된 진세노사이드 및 신규 진세노사이드 및 이의 유도체의 인공 합성에 사용될 수 있고, CK, DMG, F2, Rd, F1, Rh1 및 Rg1 등을 각각 진세노사이드Rg3, 진세노사이드Rd, 진세노사이드Rb1, 진세노사이드Rb3, 사포닌DMGG, 사포닌DMGX, 지페노사이드LXXV, 지페노사이드XVII, 지페노사이드XIII, 지페노사이드IX, 노토진세노사이드U和, 노토진세노사이드R1, 和노토진세노사이드R2, 노토진세노사이드R3, 3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-PPD; 3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-CK, 20-O-Glucosylginsenoside Rf 및 Ginsenoside F3으로 전환할 수 있다.
본 발명의 장점:
(1) 본 발명의 글리코실트랜스퍼라제는 테트라시클릭트리터페노이드 화합물 기질의 C-20 부위의 첫 번째 글리코실기/또는 C-6 또는 C-3 부위의 첫 번째 글리코실기에 글리코실기를 특이적 및 효율적으로 전입시키거나 글리코실기를 치환하여 당사슬을 연장할 수 있고;
(2) 본 발명의 글리코실트랜스퍼라제는 특히 CK, DMG, F2, Rd, F1, Rh1 및 Rg1을 활성을 갖는 진세노사이드Rg3, 진세노사이드Rd, 진세노사이드Rb1, 진세노사이드Rb3, 사포닌DMGG, 사포닌DMGX, 지페노사이드LXXV, 지페노사이드XVII, 지페노사이드XIII, 지페노사이드IX, 노토진세노사이드U, 노토진세노사이드R1, 노토진세노사이드R2, 노토진세노사이드R3, 3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-PPD; 3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-CK, 20-O-Glucosylginsenoside Rf 및 Ginsenoside F3으로 각각 전환시킬 수 있으며;
(3) 진세노사이드Rb1은 신경 세포 및 항염증 및 항산화 효능이 있고; 진세노사이드Rb3은 심근 허혈을 완화시키며 항우울 효능이 있다. 노토진세노사이드R1은 노토진세노사이드의 주요 성분으로, 항염증 효능이 있다. 노토진세노사이드R2는 신경 보호 효능이 있다.
실시예 1. 인삼글리코실트랜스퍼라제 및 코딩 유전자의 분리
인삼 RNA를 추출하고 연전사하여 인삼의 cDNA를 얻었다. 상기 cDNA를 주형으로 프라이머 쌍 1(SEQ ID NO.: 1 및 SEQ ID NO.: 2) 또는 프라이머 쌍 2(SEQ ID NO.: 9 및 SEQ ID NO.: 10) 또는 프라이머 쌍 3(SEQ ID NO.: 113 및 SEQ ID NO.: 114)에 의해 PCR 증폭을 수행하여, 1.4 ~ 1.5 kb인 증폭 산물을 얻었다. DNA 폴리머라제는 TaKaRa Bio Group 유한 회사의 고충실도 KOD DNA폴리머라제를 선택하여 사용하였다. PCR 산물은 아가로스 겔 전기 영동에 의해 검출되었다.
자외선 조사 하에서, 표적 DNA 밴드를 절단하였다. 다음 Axygen Gel Extraction Kit(AEYGEN회사)를 사용하여 아가로스 겔로부터 DNA, 즉 증폭된 DNA단편을 회수하였다. 이 DNA단편에 TaKaRa Bio Group 유한 회사의 rTaq DNA 폴리머라제를 사용하여 말단에 A를 첨거한 후 시판되는 클로닝 전달체 pMD18-T Vector와 연결되었다. 연결 산물을 시판되는 대장균 EPI300 적격 세포에 형질 전환시킨 후, 형질 전환된 대장균 박테리아 용액을 50ug/mL의 AMP, 0.5mM의 IPTG, 25 μg/mL의 X-Gal을 함유한 LB 플레이트에 도포하고, PCR 및 효소 절단에 의해 재조합 클론을 추가로 확인하였다. 몇 개의 클로을 취하여 재조합 플라스미드를 추출한 후 시퀀싱하여, 29개의 상이한 핵산 서열을 얻었으며, 각각 GT29-32 (SEQ ID NO.: 3), GT29-33 (SEQ ID NO.: 5), GT29-34 (SEQ ID NO.: 7), GT29-4(SEQ ID NO.: 11), GT29-5(SEQ ID NO.: 13), GT29-7(SEQ ID NO.: 15), GT29-9(SEQ ID NO.: 17),GT29-11(SEQ ID NO.: 19), GT29-13(SEQ ID NO.:21), GT29-17(SEQ ID NO.: 23), GT29-18(SEQ ID NO.: 25), GT29-19(SEQ ID NO.: 116), GT29-20(SEQ ID NO.: 118), GT29-21(SEQ ID NO.: 120), GT29-22(SEQ ID NO.: 122), GT29-23(SEQ ID NO.: 124), GT29-24(SEQ ID NO.: 27), GT29-25(SEQ ID NO.: 29), GT29-36(SEQ ID NO.:89), GT29-37(SEQ ID NO.: 91), GT29-42(SEQ ID NO.: 93), GT29-42(SEQ ID NO.: 95), GT29-45(SEQ ID NO.: 97)和GT29-46(SEQ ID NO.: 99)으로 명명하였다. BESTORF 소프트웨어로 ORF를 찾았다. 서열 대비에 의해, 확장된 산물이 모두 글리코실트랜스퍼라제 제1 패밀리 보존적 기능 도메인을 가지며, 이는 글리코실트랜스퍼라제 유전자인 것을 나타낸다.
GT29-32: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-32는 442개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-32를 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 4로 포시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.2 kDa이고, 등전점 pI는 6.09인 것으로 예측되었다. 상기 글리코실트랜스퍼라제는 기능적으로 검증된 글리코실트랜스퍼라제 UGTPg29(Genbank accession AKA44579.1)의 아미노산 서열과의 동일성은 92 %로 나타났다.
GT29-33: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-33는 448개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-33을 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 50.0 kDa이고, 등전점 pI는 6.77인 것으로 예측되었다. 상기 글리코실트랜스퍼라제는 기능적으로 검증된 글리코실트랜스퍼라제 UGTPg29의 아미노산 서열과의 동일성은 90 %로 나타났다.
GT29-34: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-34는 446개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-34를 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.7 kDa이고, 등전점 pI는 6.23으로 나타났다. 상기 글리코실트랜스퍼라제는 기능적으로 검증된 글리코실트랜스퍼라제 UGTPg29의 아미노산 서열과의 동일성은 90 %로 나타났다.
GT29-4: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-4는 446개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-4를 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.8 kDa인 것으로 예측되었고, 등전점은 5.63으로 나타났다. 상기 글리코실트랜스퍼라제는 기능적으로 검증된 글리코실트랜스퍼라제 UGTPg29의 아미노산 서열과의 동일성은 92 %로 나타났다.
GT29-5: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-5는 446개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-5를 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 14로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.7 kDa이고, 등전점 pI는 5.93인 것으로 예측되었다. 상기 글리코실트랜스퍼라제는 기능적으로 검증된 글리코실트랜스퍼라제 UGTPg29의 아미노산 서열과의 동일성은 93 %로 나타났다.
GT29-7: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-7은 446개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-7을 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 16으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.8 kDa이고, 등전점 pI는 5.8인 것으로 예측되었다. 상기 글리코실트랜스퍼라제는 기능적으로 검증된 글리코실트랜스퍼라제 UGTPg29의 아미노산 서열과의 동일성은 92 %로 나타났다.
GT29-9: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-9는 446개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-9를 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.8 kDa이고, 등전점 pI는 5.93인 것으로 예측되었다. 상기 글리코실트랜스퍼라제는 기능적으로 검증된 글리코실트랜스퍼라제 UGTPg29의 아미노산 서열과의 동일성은 92 %로 나타났다.
GT29-11: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-11은 446개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-11을 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 20으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.9 kDa이고, 등전점 pI는 5.90인 것으로 예측되었다. 상기 글리코실트랜스퍼라제는 기능적으로 검증된 글리코실트랜스퍼라제 UGTPg29의 아미노산 서열과의 동일성은 91 %로 나타났다.
GT29-13: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-13은 446개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-13을 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 22로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.9 kDa이고, 등전점 pI는 5.93인 것으로 예측되었다. 상기 글리코실트랜스퍼라제는 기능적으로 검증된 글리코실트랜스퍼라제 UGTPg29의 아미노산 서열과의 동일성은 91 %로 나타났다.
GT29-17: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-17은 442개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-17을 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 24로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.3 kDa이고, 등전점 pI는 5.35인 것으로 예측되었다. 상기 글리코실트랜스퍼라제는 기능적으로 검증된 글리코실트랜스퍼라제 UGTPg29의 아미노산 서열과의 동일성은 93 %로 나타났다.
GT29-18: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-18은 446개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-18을 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 26으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.9 kDa이고, 등전점 pI는 5.93인 것으로 예측되었다. 상기 글리코실트랜스퍼라제는 기능적으로 검증된 글리코실트랜스퍼라제 UGTPg29의 아미노산 서열과의 동일성은 91 %로 나타났다.
GT29-24: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-24는 446개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-24를 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 28로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.9 kDa이고, 등전점 pI는 5.93인 것으로 예측되었다. 상기 글리코실트랜스퍼라제는 기능적으로 검증된 글리코실트랜스퍼라제 UGTPg29의 아미노산 서열과의 동일성은 91 %로 나타났다.
GT29-25: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-25는 446개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-25를 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 30으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.9 kDa이고, 등전점 pI는 5.93인 것으로 예측되었다. 상기 글리코실트랜스퍼라제는 기능적으로 검증된 글리코실트랜스퍼라제 UGTPg29의 아미노산 서열과의 동일성은 91 %로 나타났다.
GT29-19: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-19는 442개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-19를 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 116으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.1 kDa이고, 등전점 pI는 5.47인 것으로 예측되었다.
GT29-20: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-20은 442개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-20을 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 118로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.1 kDa이고, 등전점 pI는 5.93인 것으로 예측되었다.
GT29-21: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-21은 442개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-21을 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 120으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.1 kDa이고, 등전점 pI는 5.80인 것으로 예측되었다.
GT29-22: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-22는 442개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-22를 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 122로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.1 kDa이고, 등전점 pI는 5.93인 것으로 예측되었다.
GT29-23: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-23은 442개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-23을 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 124로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.0 kDa이고, 등전점 pI는 5.61인 것으로 예측되었다.
GT29-36: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-36은 442개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-36을 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO:102로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.1 kDa이고, 등전점 pI는 5.93인 것으로 예측되었다.
GT29-37:글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-37은 442개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-37을 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO:104로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.1 kDa이고, 등전점 pI는 5.62인 것으로 예측되었다.
GT29-42:글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-42는 444개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-42를 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO:106으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.4 kDa이고, 등전점 pI는 6.16인 것으로 예측되었다.
GT29-43: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-43은 442개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-43을 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO:108로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.1 kDa이고, 등전점 pI는 5.78인 것으로 예측되었다.
GT29-45: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-45는 448개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-45를 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 110으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 50.0 kDa이고, 등전점 pI는 7.25인 것으로 예측되었다.
GT29-46: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-46은 442개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 GT29-46을 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 112로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.1 kDa이고, 등전점 pI는 5.48인 것으로 예측되었다.
실시예 2. 대장균에서 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-32, GT29-33 및 GT29-34의 발현
실시예 1에 따라 구축된 GT29-32, GT29-33 및 GT29-34 유전자를 함유하는 플라스미드 GT29-32-pMD18T, GT29-33-pMD18T 및 GT29-34-pMD18T를 주형으로, 표 1에 나타낸 프라이머로 목표 유전자 GT29-32, GT29-33 및 GT29-34를 증폭하였다.
발현 전달체 pET28a(Merck 회사에서 구입)를 NcoI/SalI 효소로 절단한 후, GT29-32, GT29-33 및 GT29-34를 pET28a(Vazyme서 구입 한 1 단계 클로닝 키트)에 클로닝하여, 대장균 발현 전달체 GT29-32-pET28a, GT29-33-pET28a 및 GT29-34-pET28a를 구축하였다. 재조합 단백질 GT29-32, GT29-33 및 GT29-34의 C말단이 6×His tag 태그를 갖도록 pET28a의 6×His tag 서열을 사용하였다. 플라스미드를 시판되는 E. coli BL21에 각각 형질 전화시켜, 재조합 균주 BL21-GT29-32, BL21-GT29-33 및 BL21-GT29-34를 구축하였다. 하나의 재조합체를 LB 배지에 접종하고, 37 ℃의 온도 하에서 200 rpm으로 OD60이 약 0.6 ~ 0.8이 될 때까지 배양하며, 박테리아 용액을 4 ℃로 냉각시키고, 최종 농도가 100 μM인 IPTG를 넣어, 18 ℃의 온도 하에서 120 rpm으로 16시간 동안 발현을 유도하였다. 4 ℃의 온도 하에서 원심 분리하여 균체를 수집하고, 초음파에 의해 세포를 파쇠한 후, 4 ℃의 온도 하에서 12000 g으로 10분 동안 원심 분리하여 세포 용해물 상청액을 수집하며, 샘플을 취하여 SDS-PAGE 전기 영동 및 웨스턴 블롯을 수행하였다. SDS-PAGE에 따르면 GT29-32-pET28a, GT29-33-pET28a 및 GT29-34-pET28a의 재조합 형질 전환체는 빈 전달체 pET28a 재조합 형질 전환체 세포 용해물과 명확한 차이가 없었으며, 가용성 발현량이 유의하지 않았다(도 1A). 항 6×His tag 웨스턴 블롯(도 1의 (B))에 따르면, 45 ~ 55 kD 사이에는 명확한 밴드가 있으며, 글리코실트랜스퍼라제 GT29-32, GT29-33 및 GT29-34는 대장균에서 소량의 가용성 발현을 갖는다.
유전자 프라이머 SEQ ID NO.
UGT29-4 UGT29-4-F 31
UGT29-4-R 34
UGT29-5 UGT29-5-F 33
UGT29-5-R 32
UGT29-7 UGT29-7-F 35
UGT29-7-R 32
UGT29-9 UGT29-9-F 33
UGT29-9-R 32
UGT29-11 UGT29-11-F 33
UGT29-11-R 32
UGT29-13 UGT29-13-F 33
UGT29-13-R 32
UGT29-17 UGT29-17-F 31
UGT29-17-R 32
UGT29-18 UGT29-18-F 33
UGT29-18-R 34
UGT29-24 UGT29-24-F 33
UGT29-24-R 34
UGT29-25 UGT29-25-F 33
UGT29-25-R 32
UGT29-32 UGT29-32-F 31
UGT29-32-R 32
UGT29-33 UGT29-33-F 36
UGT29-33-R 37
UGT29-34 UGT29-34-F 36
UGT29-34-R 34
UGT29-19 UGT29-19-F 125
UGT29-19-R 126
UGT29-20 UGT29-20-F 127
UGT29-20-R 128
UGT29-21 UGT29-21-F 129
UGT29-21-R 130
UGT29-22 UGT29-22-F 131
UGT29-22-R 132
UGT29-23 UGT29-23-F 133
UGT29-23-R 134
UGT29-36 UGT29-36-F 101
UGT29-36-R 102
UGT29-37 UGT29-37-F 103
UGT29-37-R 104
UGT29-42 UGT29-42-F 105
UGT29-42-R 106
UGT29-43 UGT29-43-F 107
UGT29-43-R 108
UGT29-45 UGT29-36-F 109
UGT29-36-R 110
UGT29-46 UGT29-36-F 111
UGT29-36-R 112
표 1. 유전자 즉폭에 사용된 프라이머
실시예 3. GT29-32, GT29-33 및 GT29-34의 체외 글리코실 전이 활성 및 산물 검증
실시예 2에서 재조합 대장균 BL21-GT29-32, BL21-GT29-33 및 BL21-GT29-34의 세포 용해물 상청액을 조효소 용액으로 글리코실 전이 반응을 수행하고, 빈 전달체 pET28a재조합 대장균을 전이하는 세포 용해물을 대조로 하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, GT29-32 및 GT29-34는 프로토파낙사디올형 진세노사이드CK를 글리코실기 수용체로, UDP-글루코스(UDP-glucose)를 글리코실기 공여체로 하여, 이에 촉매 작용하여 새로운 산물을 생성할 수 있고;
도 3에 도시된 바와 같이:GT29-32, GT29-33 및 GT29-34는 진세노사이드Rd를 글리코실기 수용체로, UDP-글루코스를 글리코실기 공여체로 하여, 이에 촉매 작용하여 Rb1을 생성할 수 있다. HPLC의 결과는 TLC의 결과와 일치하였다.
따라서, GT29-32 및 GT29-34는 CK의 C20-O-Glc에 촉매 작용하여 일 분자의 글루코스를 연장하여 진세노사이드Gypenoside LXXV를 생성할 수 있다. UDP-자일로스(UDP-xylose)가 글리코실기 공여체일 경우, GT29-32는 Rd에 촉매 작용하여 3가지 산물을 생성할 수 있다. 여기서, 하나의 산물의 TLC에서의 이동율이 Rb3와 일치하였고, 즉 GT29-32는 C20-O-Glc에 일 분자의 자일로스를 연장하여 Rb3을 생성할 수 있다(도 2). HPLC의 결과는 TLC와 일치하였고, GT29-32는 Rd 및 UDP-자일로스에 촉매 작용하여 3가지 산물을 생성할 수 있다(도 4).
GT29-32는 프로토파낙사트리올형 진세노사이드F1을 글리코실기 수용체로, UDP-글루코스를 글리코실기 공여체로 하여, 촉매 작용하여 새로운 산물을 생성할 수 있고, F1의 C20-O-Glc에서 일 분자의 글루코스가 연장된 것으로 예측되며, 산물은 노토진세노사이드R3(Notoginsenoside R3)이다(도 5 및 도 6).
GT29-32, GT29-33 및 GT29-34는 프로토파낙사디올형 진세노사이드CK를 글리코실기 수용체로, UDP-아라비노스를 글리코실기 공여체로 하여, CK의 C-20 첫번재 글리코실기에 연장된 하나의 아라비노실기에 촉매 작용하여 진세노사이드F3(Ginsenoside F3)을 생성할 수 있고, 여기서 GT29-32의 활성이 가장 강하다(도 17).
실시예 4. 대장균에서 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-4, GT29-5, GT29-7, GT29-9, GT29-11, GT29-13, GT29-17, GT29-18, GT29-24 및 GT29-25의 발현
실시예 1에서 구축된 GT29-4, GT29-5, GT29-7, GT29-9, GT29-11, GT29-13, GT29-17, GT29-18, GT29-24 및 GT29-25 유전자를 함유한 플라스미드GT29-4-pMD18T, GT29-5-pMD18T, GT29-7-pMD18T, GT29-9-pMD18T, GT29-11-pMD18T, GT29-13-pMD18T, GT29-17-pMD18T, GT29-18-pMD18T, GT29-24-pMD18T 및 GT29-25-pMD18T를 주형으로, 표 1에 나타낸 프라이머로 목표 유전자 GT29-4, GT29-5, GT29-7, GT29-9, GT29-11, GT29-13, GT29-17, GT29-18, GT29-24 및 GT29-25를 증폭하였다. 발현 전달체pET28a Merck에서 구입)를 NcoI/SalI 효소로 절단한 후, GT29-11, GT29-13, GT29-17, GT29-18, GT29-24 및 GT29-25를 pET28a(Vazyme서 구입 한 1 단계 클로닝 키트)에 클로닝하여, 대장균 발현 전달체GT29-4-pET28a, GT29-5-pET28a, GT29-7-pET28a, GT29-9-pET28a, GT29-11-pET28a, GT29-13-pET28a, GT29-17-pET28a, GT29-18-pET28a, GT29-24-pET28a 및 GT29-25-pET28a를 구축하였다.
재조합 단백질 GT29-4-pET28a, GT29-5-pET28a, GT29-7-pET28a, GT29-9-pET28a, GT29-11-pET28a, GT29-13-pET28a, GT29-17-pET28a, GT29-18-pET28a, GT29-24 및 GT29-25의 C이 6×His tag 태그를 갖도록 pET28a의 6×His tag 서열을 사용하였다. 플라스미드를 시판되는 E. coli BL211에 각각 형질 전화시켜, 재조합 균주 BL21-GT29-4, BL21-GT29-5, BL21-GT29-7, BL21-GT29-9, BL21-GT29-11, BL21-GT29-13, BL21-GT29-17, BL21-GT29-18, BL21-GT29-24 및 BL21-GT29-25를 구축하였다. 하나의 재조합체를 LB 배지에 접종하고, 37 ℃의 온도 하에서 200 rpm으로 OD60이 약 0.6 ~ 0.8이 될 때까지 배양하며, 박테리아 용액을 4 ℃로 냉각시키고, 최종 농도가 100 μM인 IPTG를 넣어, 18 ℃의 온도 하에서 120 rpm으로 16시간 동안 발현을 유도하였다. 4 ℃의 온도 하에서 원심 분리하여 균체를 수집하고, 초음파에 의해 세포를 파쇠한 후, 4 ℃의 온도 하에서 12000 g으로 10분 동안 원심 분리하여 세포 용해물 상청액을 수집하며, 샘플을 취하여 SDS-PAGE 전기 영동 및 웨스턴 블롯을 수행하였다.
SDS-PAGE에 따르면 GT29-4-pET28a, GT29-5-pET28a, GT29-7-pET28a, GT29-9-pET28a, GT29-11-pET28a, GT29-13-pET28a, GT29-17-pET28a, GT29-18-pET28a, GT29-24-pET28a 및 GT29-25-pET28a 재조합 형질 전환체는 빈 전달체 pET28a 재조합 형질 전환체 세포 용해물과 명확한 차이가 없었으며, 가용성 발현량이 유의하지 않았다. 항 6×His tag 웨스턴 블롯에 따르면, 45 ~ 55 kD 사이에는 명확한 밴드가 있으며, 글리코실트랜스퍼라제 GT29-4, GT29-5, GT29-7, GT29-9, GT29-11, GT29-13, GT29-17, GT29-18, GT29-24 및 GT29-25는 대장균에서 소량의 가용성 발현을 갖는다.
실시예 5. GT29-4, GT29-5, GT29-7, GT29-9, GT29-11, GT29-13, GT29-17, GT29-18, GT29-24 및 GT29-25의 체외 글리코실 전이 활성 및 산물 검증
실시예 2에서 재조합 대장균 BL21-GT29-4, BL21-GT29-5, BL21-GT29-7, BL21-GT29-9, BL21-GT29-11, BL21-GT29-13, BL21-GT29-17, BL21-GT29-18, BL21-GT29-24 및 BL21-GT29-25의 세포 용해물 상청액을 조효소 용액으로 글리코실 전이 반응을 수행하고, 빈 전달체 pET28a재조합 대장균을 전이하는 세포 용해물을 대조로 하였다.
도 7에 도시된 바와 같이, GT29-4, GT29-5, GT29-7, GT29-9, GT29-11, GT29-13, GT29-17, GT29-18, GT29-24 및 GT29-25는 프로토파낙사디올형 진세노사이드Rg1을 글리코실기 수용체로, UDP-자일로스를 글리코실기 공여체로 하여, 이에 촉매 작용하여 노토진세노사이드R1을 생성할 수 있다. HPLC의 결과는 TLC의 결과와 일치하였다(도 8 및 도 9). 따라서, GT29-4, GT29-5, GT29-7, GT29-9, GT29-11, GT29-13, GT29-17, GT29-18, GT29-24 및 GT29-25는 Rg1의 C6-O-Glc에 촉매 작용하여 일 분자 자일로스를 연장시켜 노토진세노사이드R1을 생성할 수 있다.
도 10에 도시된 바와 같이, GT29-24 및 GT29-25는 프로토파낙사디올형 진세노사이드Rh2를 글리코실기 수용체로, UDP-글루코스를 글리코실기 공여체로 하여, Rh2의 C-3 부위글리코실기에 촉매 작용하여 하나의 글루코실기를 연장시켜 진세노사이드Rg3을 생성할 수 있다. 기질을 F2로 대체할 경우, GT29-24 및 GT29-25는 F2의 C-3 부위글리코실기에 추가로 촉매 작용하여 하나의 글루코실기를 연장시켜 진세노사이드Rd를 생성할 수 있다.
실시예 6. 삼칠글리코실트랜스퍼라제 및 이의 코딩 유전자의 분리
삼칠 RNA을 추출하고 역전사하여, 삼칠의 cDNA를 얻었다. 상기 cDNA를 주형으로 프라이머 쌍 1 (SEQ ID NO.: 82 및 SEQ ID NO.: 83),프라이머 쌍 2 (SEQ ID NO.:84 및 SEQ ID NO.: 85)프라이머 쌍 3(SEQ ID NO.:84 및 SEQ ID NO.:86)프라이머 쌍 4(SEQ ID NO.:87和SEQ ID NO.: 88, )에 의해 PCR을 수행하여, 1.4 ~ 1.5 kb인 증폭 산물을 얻었다. DNA 폴리머라제는 TaKaRa Bio Group 유한 회사의 고충실도 KOD DNA폴리머라제를 선택하여 사용하였다. PCR 산물은 아가로스 겔 전기 영동에 의해 검출되었다.
실시예 1을 참조하여 몇 개의 클로을 취하여 재조합 플라스미드를 추출한 후 시퀀싱하여, 14개의 상이한 핵산 서열을 얻었으며, 각각 PNUGT29-1 (SEQ ID NO.: 38), PNUGT29-2 (SEQ ID NO.:40), PNUGT29-3 (SEQ ID NO.: 42), PNUGT29-4(SEQ ID NO.: 44), PNUGT29-5(SEQ ID NO.: 46), PNUGT29-6(SEQ ID NO.: 48), PNUGT29-7(SEQ ID NO.: 50), PNUGT29-8(SEQ ID NO.: 52), PNUGT29-9(SEQ ID NO.:54)PNUGT29-14(SEQ ID NO.: 56) 및 PNUGT29-15(SEQ ID NO.: 58)로 명명하였다. 소프트웨어로 ORF를 찾았다. 서열 대비에 의해, 확장된 산물이 모두 글리코실트랜스퍼라제 제1 패밀리 보존적 기능 도메인을 가지며, 이는 글리코실트랜스퍼라제 유전자인 것을 나타낸다.
PNUGT29-1: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 PNUGT29-1은 447개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 PNUGT29-1을 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 39로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.688 kDa이고, 등전점 pI는 6.58인 것으로 예측되었다.
PNUGT29-2: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 PNUGT29-2는 442개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 PNUGT29-2를 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 41로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.118 kDa이고, 등전점 pI는 6.20인 것으로 예측되었다.
PNUGT29-3: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 PNUGT29-3은 447개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 PNUGT29-3을 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 43으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.729 kDa이고, 등전점 pI는 6.58인 것으로 예측되었다.
PNUGT29-4: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 PNUGT29-4는 447개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 PNUGT29-4를 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 45로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.715 kDa이고, 등전점 pI는 6.58인 것으로 예측되었다.
PNUGT29-5: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 PNUGT29-5는 447개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 PNUGT29-5를 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 47로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.718 kDa이고, 등전점 pI는 6.45인 것으로 예측되었다.
PNUGT29-6: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 PNUGT29-6은 447개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 PNUGT29-6을 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 49로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.657 kDa이고, 등전점 pI는 6.70인 것으로 예측되었다.
PNUGT29-7: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 PNUGT29-7은 447개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 PNUGT29-7을 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 51로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.749 kDa이고, 등전점 pI는 6.58인 것으로 예측되었다.
PNUGT29-8: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 PNUGT29-8은 447개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 PNUGT29-8을 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 53으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.657 kDa이고, 등전점 pI는 6.70인 것으로 예측되었다.
PNUGT29-9: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 PNUGT29-9는 447개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 PNUGT29-9를 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 55로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.695kDa이고, 등전점 pI는 6.58인 것으로 예측되었다.
PNUGT29-14: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 PNUGT29-14는 447개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 PNUGT29-14를 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 57로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.778 kDa이고, 등전점 pI는 6.70인 것으로 예측되었다.
PNUGT29-15: 글리코실트랜스퍼라제 유전자 PNUGT29-15는 447개의 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 PNUGT29-15를 코딩하고, 서열 표 중 SEQ ID NO: 59로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 소프트웨어에 의해 상기 단백질의 이론적 분자량은 49.755 kDa이고, 등전점 pI는 6.63인 것으로 예측되었다.
실시예 7. 대장균에서 삼칠글리코실트랜스퍼라제 유전자 PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-5, PNUGT29-6, PNUGT29-7, PNUGT29-8, PNUGT29-9, PNUGT29-14 및 PNUGT29-15의 발현
실시예 6에 따라 구축된PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-5, PNUGT29-6, PNUGT29-7, PNUGT29-8, PNUGT29-9, PNUGT29-14 및 PNUGT29-15 유전자를 함유하는 플라스미드 PNUGT29-1-pMD18T, PNUGT29-2-pMD18T, PNUGT29-3-pMD18T, PNUGT29-4-pMD18T, PNUGT29-5-pMD18T, PNUGT29-6-pMD18T, PNUGT29-7-pMD18T, PNUGT29-8-pMD18T, PNUGT29-9-pMD18T, PNUGT29-14-pMD18T和PNUGT29-15-pMD18T를 주형으로, 표 1에 나타낸 프라이머로 목표 유전자 PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-5, PNUGT29-6, PNUGT29-7, PNUGT29-8, PNUGT29-9, PNUGT29-14 및 PNUGT29-15를 증폭하였다. 실시예 2의 방법을 참조하여, 재조합 균주 BL21- PNUGT29-1, BL21- PNUGT29-2, BL21- PNUGT29-3, BL21- PNUGT29-4, BL21- PNUGT29-5, BL21- PNUGT29-6, BL21- PNUGT29-7, BL21- PNUGT29-8, BL21- PNUGT29-9, BL21- PNUGT29-14 및 BL21- PNUGT29-15를 구축하고 샘플을 취하여 SDS-PAGE 전기 영동 및 웨스턴 블롯을 수행하였다. 항 6×His tag 웨스턴 블롯(도 10)에 따르면, 45 ~ 65 kD사이에는 명확한 밴드가 있으며, 글리코실트랜스퍼라제 PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-5, PNUGT29-6, PNUGT29-7, PNUGT29-8, PNUGT29-9, PNUGT29-14 및 PNUGT29-15는 대장균에서 소량의 가용성 발현을 갖는다.
유전자 프라이머 SEQ ID NO.
PNUGT29-1 PNUGT29-1-F 60
PNUGT29-1-R 61
PNUGT29-2 PNUGT29-2-F 62
PNUGT29-2-R 63
PNUGT29-3 PNUGT29-3-F 64
PNUGT29-3-R 65
PNUGT29-4 PNUGT29-4-F 66
PNUGT29-4-R 67
PNUGT29-5 PNUGT29-5-F 68
PNUGT29-5-R 69
PNUGT29-6 PNUGT29-6-F 70
PNUGT29-6-R 71
PNUGT29-7 PNUGT29-7-F 72
PNUGT29-7-R 73
PNUGT29-8 PNUGT29-8-F 74
PNUGT29-8-R 75
PNUGT29-9 PNUGT29-9-F 76
PNUGT29-9-R 77
PNUGT29-14 PNUGT29-14-F 78
PNUGT29-14-R 79
PNUGT29-15 PNUGT29-15-F 80
PNUGT29-15-R 81
표 2. 유전자 증폭에 사용된 프라이머
실시예 8. 삼칠 글리코실트랜스퍼라제 PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-5, PNUGT29-6, PNUGT29-7, PNUGT29-8, PNUGT29-9, PNUGT29-14 및 PNUGT29-15의 체외 글리코실 전이 활성 및 산물 검증
실시예 7에서 재조합 대장균 BL21- PNUGT29-1, BL21- PNUGT29-2, BL21- PNUGT29-3, BL21- PNUGT29-4, BL21- PNUGT29-5, BL21- PNUGT29-6, BL21- PNUGT29-7, BL21- PNUGT29-8, BL21- PNUGT29-9, BL21- PNUGT29-14 및 BL21- PNUGT29-15의 세포 용해물 상청액을 조효소 용액으로 글리코실 전이 반응을 수행하고, 빈 전달체 pET28a재조합 대장균을 전이하는 세포 용해물을 대조로 하였다.
도 11에 도시된 바와 같이: PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-5, PNUGT29-6, PNUGT29-7, PNUGT29-8, PNUGT29-9, PNUGT29-14, PNUGT29-15는 프로토파낙사디올형 진세노사이드Rd를 글리코실기 수용체로, UDP-글루코스를 글리코실기 공여체로 하여, Rd의 C-20 부위의 글리코실기에 촉매 작용하여 하나의 글루코실기를 연장시켜 Rb1을 생성할 수 있다.
도 12에 도시된 바와 같이: PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-5, PNUGT29-6, PNUGT29-7, PNUGT29-8, PNUGT29-9, PNUGT29-14, PNUGT29-15는 프로토파낙사디올형 진세노사이드CK를 글리코실기 수용체로, UDP-글루코스를 글리코실기 공여체로 하여, C-20 부위의 글리코실기에 촉매 작용하여 하나의 글루코실기를 연장시켜 지페노사이드 LXXV를 생성할 수 있다.
도 13에 도시된 바와 같이: PNUGT29-1, PNUGT29-2, PNUGT29-3, PNUGT29-4, PNUGT29-5, PNUGT29-6, PNUGT29-7, PNUGT29-8, PNUGT29-9, PNUGT29-14, PNUGT29-15는 프로토파낙사디올형 진세노사이드Rh2를 글리코실기 수용체로, UDP-글루코스를 글리코실기 공여체로 하여, Rh2의 C-3 부위의 글리코실기에 촉매 작용하여 하나의 글루코실기를 연장시켜 Rg3을 생성할 수 있다.
실시예 9. 대장균에서 글리코실트랜스퍼라제 유전자 GT29-19, GT29-20, GT29-21, GT29-22, GT29-23, GT29-36, GT29-37, GT29-42, GT29-43, GT29-45 및 GT29-46의 발현
실시예 1에 따라 구축된 GT29-19, GT29-20, GT29-21, GT29-22, GT29-23, GT29-36, GT29-37, GT29-42, GT29-43, GT29-45 및 GT29-46 유전자을 함유하는 플라스미드GT29-19-pMD18T, GT29-20-pMD18T, GT29-21-pMD18T, GT29-22-pMD18T, GT29-23-pMD18T, GT29-36-pMD18T, GT29-37-pMD18T, GT29-42-pMD18T, GT29-43-pMD18T, GT29-45-pMD18T 및 GT29-46-pMD18T를 주형으로, 표 1에 나타낸 프라이머에 의해 목표 유전자 GT29-36, GT29-37, GT29-42, GT29-43, GT29-45 및 GT29-46을 증폭하였다.
실시예 2를 참조하여, 재조합 균주 BL21-GT29-19, BL21-GT29-20, BL21-GT29-21, BL21-GT29-22, BL21-GT29-23, BL21-GT29-36, BL21-GT29-37, BL21-GT29-42, BL21-GT29-43, BL21-GT29-45 및 BL21-GT29-46을 구축하고, 샘플을 취하여 SDS-PAGE 전기 영동 및 웨스턴 블롯을 수행하였다.
상기 글리코실트랜스퍼라제 GT29-19, GT29-20, GT29-21, GT29-22, GT29-23, GT29-36, GT29-37, GT29-42, GT29-43, GT29-45 및 GT29-46은 프로토파낙사디올형 진세노사이드Rh2를 글리코실기 수용체로, UDP-글루코스를 글리코실기 공여체로 하여, Rh2의 C-3 부위의 글리코실기에 모두 촉매 작용하여 하나의 글루코실기를 연장시켜 진세노사이드Rg3을 생성할 수 있고, 도 15는 GT29-45 및 GT29-46는 Rh2에 촉매 작용하여 Rg3을 생성할 수 있는 것을 나타낸다.
상기 글리코실트랜스퍼라제 GT29-19, GT29-20, GT29-21, GT29-22, GT29-23, GT29-36, GT29-37, GT29-42, GT29-43은 프로토파낙사디올형 진세노사이드Rd를 글리코실기 수용체로, UDP-자일로스를 글리코실기 공여체로 하여, Rd C-3 부위의 두 번째 글루코스를 자일로스로 치환하여 새로운 트리테르페노이드사포닌 (3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl), 20-O-β- (D-glucopyranosyl)-PPD)을 생성할 수 있고, 여기서 GT29-36, GT29-37, GT29-42 및 GT29-43의 활성이 가장 강하다(도 14).
도 16에 도시된 바와 같이, GT29-45 및 GT29-46은 프로토파낙사디올형 진세노사이드CK를 글리코실기 수용체로, UDP-글루코스를 글리코실기 공여체로 하여, CK의 C-20 부위의 글리코실기에 추가로 촉매 작용하여 하나의 글루코실기를 연장시켜 지페노사이드 LXXV를 생성할 수 있고, 여기서 GT29-45의 활성이 비교적 강하다.
실시예 10. 글리코실트랜스퍼라제 활성의 추가적 확인
상기 실시예 3, 실시예 5, 실시예 8를 반복 수행하되, 차이점은 다른 글리코실기 공여체와 기질로 대체되는 것이며, 실험 결과 표 3 내지 표 5에 나타낸 바와 같다.
C-3
UDP-자일로스 UDP-G
SEQ ID NO.: Rd F2 Rh2
116 GT29-19 ++ ++ +++
118 GT29-20 ++ ++ +++
120 GT29-21 + ++ +++
122 GT29-22 + ++ ++
124 GT29-23 + ++ ++
90 GT29-36 +++ ++ ++
92 GT29-37 +++ ++ ++
94 GT29-42 +++ ++ ++
96 GT29-43 +++ ++ ++
98 GT29-45 NS ++ ++
100 GT29-46 NS ++ ++
39 PNUGT29-1 NS ++ +++
41 PNUGT29-2 NS +++ +++
43 PNUGT29-3 NS +++ +++
45 PNUGT29-4 NS +++ +++
47 PNUGT29-5 NS ++ ++
49 PNUGT29-6 NS ++ ++
51 PNUGT29-7 NS ++ ++
53 PNUGT29-8 NS ++ ++
55 PNUGT29-9 NS +++ +++
57 PNUGT29-14 NS ++ ++
59 PNUGT29-15 NS ++ ++
C-6
UDP-자일로스 UDP-G
SEQ ID NO.: 명칭 Rg1 Rh1 Rg1 Rh1
12 GT29-4 ++ ++ + +
14 GT29-5 ++ ++ + +
16 GT29-7 +++ ++ ++ ++
18 GT29-9 ++ ++ + +
20 GT29-11 +++ +++ ++ ++
22 GT29-13 ++ ++ ++ ++
24 GT29-17 ++ ++ + +
26 GT29-18 +++ +++ ++ ++
28 GT29-24 +++ +++ ++ ++
30 GT29-25 +++ +++ + +
C-20
UDP-자일로스 UDP-G UDP-아라비노스
SEQ ID NO.: 명칭 Rd CK F1 Rd CK
4 GT29-32 +++ +++ ++ + ++
6 GT29-33 + ++ + ++ ++
8 GT29-34 + ++ + ++ ++
98 GT29-45 + ++ + + NS
100 GT29-46 + + + + NS
39 PNUGT29-1 + +++ + + NS
41 PNUGT29-2 + + + + NS
43 PNUGT29-3 + +++ ++ + NS
45 PNUGT29-4 + +++ ++ ++ NS
47 PNUGT29-5 + +++ + ++ NS
49 PNUGT29-6 + +++ ++ ++ NS
51 PNUGT29-7 + +++ + + NS
53 PNUGT29-8 + +++ + + NS
55 PNUGT29-9 + +++ + + NS
57 PNUGT29-14 + +++ + + NS
59 PNUGT29-15 + +++ + + NS
*NS는 표시되지 않음을 나타낸다.
표 3 내지 표 5로부터, 본 발명의 글리코실트랜스퍼라제는 통상적인 글리코실기 공여체 및 기질을 사용할 수 있고, 테트라시클릭트리터페노이드계 물질의 상이한 부위에서 글리코실기를 연장시키거나 글리코실기를 치환하는 활성을 갖는 것을 알 수 있다.
본 발명에서 언급되는 모든 문헌은 본원 발명에서 각각의 문헌이 단독으로 참조로 인용되는 것처럼 참조로 인용된다. 이 외에 본 발명의 상기 내용을 열독한 후, 당업자는 본 발명에 대하여 다양한 변경 또는 수정을 할 수 있으며, 이런한 등가 형식도 본원에 첨부된 특허청구범위에 의해 한정된 범위에 속하는 것을 이해하여야 한다.
<110> SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES <120> GROUP OF UPD-GLYCOSYLTRANSFERASE FOR CATALYZING CARBOHYDRATE CHAIN ELONGATION, AND APPLICATION THEREOF <130> PIPB194371CN <150> CN 201710359069.7 <151> 2017-05-19 <160> 134 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cagagttcat catggata 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctagcataca aagaaagag 19 <210> 3 <211> 1455 <212> DNA <213> Panax ginseng <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1455) <223> GT29-32 <400> 3 ggggatcctc tagagatatc cagagttcat catggataac caagaaggta gaatcagtat 60 agcgttgcta ccatttttag cccatggtca catatctccc ttctttgagc tagccaaaca 120 actcgcaaaa agaaattgca atgttttcct ctgttctacc ccaatcaatc ttagctccat 180 caagaataag gattcctctg cttctataaa actagtagag cttcatcttc cctcttcccc 240 tgatcttccc cctcactacc acaccacaaa tggcctccct tcccatctca tggtcccact 300 cagaaacgcc tttgaaacag cagcccccac cttctctgaa atccttaaaa ccttaaaccc 360 tgatttgctt atttatgatt tcaatccctc atgggcaccg gaaatcgctt cgtctcacaa 420 tattccggca gtttatttcc taacctcggc agcagccacc tcttccatgg gcctacatgc 480 tttcaaaaac tcaggtgaaa aatacccatt tccagatttt tatgataaca gtaatattac 540 ccctgaacca ccttctgcag ataaaatgaa gttatttcat gattttgtcg cttgtttcaa 600 acgatcttgc gacattattt tgattaagag ttttagagaa ctggaaggga aatatattga 660 ttttctttcc actttatcta agaaaacttt ggttcctgtt ggtccactcg ttcaagatcc 720 tatgggacat gatgaagatc caaaaacagg gcatcttata aactggcttg acaagagggc 780 tgaatctaca gtggtgtttg tctgctttgg aagtgagtat tttccctcca atgaggaatt 840 ggaagaatta gcaattgggc tagagattag catggttagt ttcatattgg ctgtgagatt 900 tcctgaagga gagaaaaaag ggattttacc agaggggttt gttcaaaggg taggagacag 960 aggattggtt gtggaggggt gggctccaca ggcaagaatt ttaggacatt caagcaccgg 1020 tgggtttgtg agccattgtg ggtggagttc tattatggag agtgtgaagt ttggggttcc 1080 agtaattgcc atggccaggc atcttgatca gcctttgaat gctaagctgg cggcggaggt 1140 tggtgtgggc atggaggtta tgagagatga aaatgggaag tataagagag aagcgattgc 1200 agaggtaata agaaaagtcg tgatggagaa aaatggggag gttatgagga ggaaagcaag 1260 ggaattgagt gagaaaatga aagagatagg agagcaattg attgataggg cagtggagga 1320 gctagtacaa atttgtaaga agaagaaaga tgaacaatag tagtaataga ctaatttttt 1380 tccctttaaa atcattttga atgcgcttag gttgggcttt gaactctttc tttgtatgct 1440 aggatatcgt cgacc 1455 <210> 4 <211> 442 <212> PRT <213> Panax ginseng <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(442) <223> GT29-32 <400> 4 Met Asp Asn Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Ala Leu Leu Pro Phe Leu 1 5 10 15 Ala His Gly His Ile Ser Pro Phe Phe Glu Leu Ala Lys Gln Leu Ala 20 25 30 Lys Arg Asn Cys Asn Val Phe Leu Cys Ser Thr Pro Ile Asn Leu Ser 35 40 45 Ser Ile Lys Asn Lys Asp Ser Ser Ala Ser Ile Lys Leu Val Glu Leu 50 55 60 His Leu Pro Ser Ser Pro Asp Leu Pro Pro His Tyr His Thr Thr Asn 65 70 75 80 Gly Leu Pro Ser His Leu Met Val Pro Leu Arg Asn Ala Phe Glu Thr 85 90 95 Ala Ala Pro Thr Phe Ser Glu Ile Leu Lys Thr Leu Asn Pro Asp Leu 100 105 110 Leu Ile Tyr Asp Phe Asn Pro Ser Trp Ala Pro Glu Ile Ala Ser Ser 115 120 125 His Asn Ile Pro Ala Val Tyr Phe Leu Thr Ser Ala Ala Ala Thr Ser 130 135 140 Ser Met Gly Leu His Ala Phe Lys Asn Ser Gly Glu Lys Tyr Pro Phe 145 150 155 160 Pro Asp Phe Tyr Asp Asn Ser Asn Ile Thr Pro Glu Pro Pro Ser Ala 165 170 175 Asp Lys Met Lys Leu Phe His Asp Phe Val Ala Cys Phe Lys Arg Ser 180 185 190 Cys Asp Ile Ile Leu Ile Lys Ser Phe Arg Glu Leu Glu Gly Lys Tyr 195 200 205 Ile Asp Phe Leu Ser Thr Leu Ser Lys Lys Thr Leu Val Pro Val Gly 210 215 220 Pro Leu Val Gln Asp Pro Met Gly His Asp Glu Asp Pro Lys Thr Gly 225 230 235 240 His Leu Ile Asn Trp Leu Asp Lys Arg Ala Glu Ser Thr Val Val Phe 245 250 255 Val Cys Phe Gly Ser Glu Tyr Phe Pro Ser Asn Glu Glu Leu Glu Glu 260 265 270 Leu Ala Ile Gly Leu Glu Ile Ser Met Val Ser Phe Ile Leu Ala Val 275 280 285 Arg Phe Pro Glu Gly Glu Lys Lys Gly Ile Leu Pro Glu Gly Phe Val 290 295 300 Gln Arg Val Gly Asp Arg Gly Leu Val Val Glu Gly Trp Ala Pro Gln 305 310 315 320 Ala Arg Ile Leu Gly His Ser Ser Thr Gly Gly Phe Val Ser His Cys 325 330 335 Gly Trp Ser Ser Ile Met Glu Ser Val Lys Phe Gly Val Pro Val Ile 340 345 350 Ala Met Ala Arg His Leu Asp Gln Pro Leu Asn Ala Lys Leu Ala Ala 355 360 365 Glu Val Gly Val Gly Met Glu Val Met Arg Asp Glu Asn Gly Lys Tyr 370 375 380 Lys Arg Glu Ala Ile Ala Glu Val Ile Arg Lys Val Val Met Glu Lys 385 390 395 400 Asn Gly Glu Val Met Arg Arg Lys Ala Arg Glu Leu Ser Glu Lys Met 405 410 415 Lys Glu Ile Gly Glu Gln Leu Ile Asp Arg Ala Val Glu Glu Leu Val 420 425 430 Gln Ile Cys Lys Lys Lys Lys Asp Glu Gln 435 440 <210> 5 <211> 1461 <212> DNA <213> Panax ginseng <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1461) <223> GT29-33 <400> 5 ccggggatcc tctagagata tccagagttc atcatggata tcgaaaaagg tagaatcagt 60 atagttatgc tgccattttt agcccatggc cacatttctc cattctttga gctagccaag 120 catctctcaa aaagaaattg taatatattc ctctgttcta ccccaatcaa tcttagctcc 180 atcaagaaca gagtatctga taaggattcc tctgcttcta taaaactagt agagcttcat 240 cttccctctt cccctgatct tccccctcac taccacacca caaatggcct cccttcccat 300 ctcatggtcc cactcagaaa cgcctttgaa acagcagccc ccaccttctc tgaaatcctt 360 aaaaccttaa accctgattt gcttatttat gatttcaatc cctcatgggc accggaaatc 420 gcttcgtctc acaatattcc ggcagtttat ttcctaacct cggcagcagc cacctcttcc 480 atgggcctac atgctttcaa aaactcaggt gaaaaatacc catttccaga tttttatgat 540 aacagtaata ttacccctga accaccttct gcagataaaa tgaagttatt tcatgatttt 600 gtcgcttgtt tcaaacgatc ttgcgacatt attttgatta agagttttag agaactggaa 660 gggaaatata ttgattttct ttccacttta tctaagaaaa ctttggttcc tgttggtcca 720 ctcgttcaag atcctatggg acatgatgaa gatccaaaaa cagggcatct tataaactgg 780 cttgacaaga gggctgaatc tacagtggtg tttgtctgct ttggaagtga gtattttccc 840 tccaatgagg aattggaaga attagcaatt gggctagaga ttagcatggt tagtttcata 900 ttggctgtga gatttcctga aggagagaaa aaagggattt taccagaggg gtttgttcaa 960 agggtaggag acagaggatt ggttgtggag gggtgggctc cacagtcaag aattttagga 1020 cattcaagca ccggtgggtt tgtgagccat tgtgggtgga gttctattat ggagagtgtg 1080 aagtttgggg ttccagtaat tgccatggcc aggcatcttg atcagccttt gaatgctaag 1140 ctggcggcgg aggttggtgt gggcatggag gttatgagag atgaaaatgg gaagtataag 1200 agagaagcga ttgcagaggt aataagaaaa gtcgtgatgg agaaaaatgg ggaggttatg 1260 aggaggaaag caagggaatt gagtgagaaa atgaaagtga aaggagagca agagattggt 1320 agggcggtgg aggagctagt acaaatttgt aagaagaaga agcagcacgc acaatattaa 1380 tagtactttt taacccttta gtcattttta tgagctaagg tcgagttttg aactctttct 1440 ttgtatgcta ggatatcgtc g 1461 <210> 6 <211> 448 <212> PRT <213> Panax ginseng <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(448) <223> GT29-33 <400> 6 Met Asp Ile Glu Lys Gly Arg Ile Ser Ile Val Met Leu Pro Phe Leu 1 5 10 15 Ala His Gly His Ile Ser Pro Phe Phe Glu Leu Ala Lys His Leu Ser 20 25 30 Lys Arg Asn Cys Asn Ile Phe Leu Cys Ser Thr Pro Ile Asn Leu Ser 35 40 45 Ser Ile Lys Asn Arg Val Ser Asp Lys Asp Ser Ser Ala Ser Ile Lys 50 55 60 Leu Val Glu Leu His Leu Pro Ser Ser Pro Asp Leu Pro Pro His Tyr 65 70 75 80 His Thr Thr Asn Gly Leu Pro Ser His Leu Met Val Pro Leu Arg Asn 85 90 95 Ala Phe Glu Thr Ala Ala Pro Thr Phe Ser Glu Ile Leu Lys Thr Leu 100 105 110 Asn Pro Asp Leu Leu Ile Tyr Asp Phe Asn Pro Ser Trp Ala Pro Glu 115 120 125 Ile Ala Ser Ser His Asn Ile Pro Ala Val Tyr Phe Leu Thr Ser Ala 130 135 140 Ala Ala Thr Ser Ser Met Gly Leu His Ala Phe Lys Asn Ser Gly Glu 145 150 155 160 Lys Tyr Pro Phe Pro Asp Phe Tyr Asp Asn Ser Asn Ile Thr Pro Glu 165 170 175 Pro Pro Ser Ala Asp Lys Met Lys Leu Phe His Asp Phe Val Ala Cys 180 185 190 Phe Lys Arg Ser Cys Asp Ile Ile Leu Ile Lys Ser Phe Arg Glu Leu 195 200 205 Glu Gly Lys Tyr Ile Asp Phe Leu Ser Thr Leu Ser Lys Lys Thr Leu 210 215 220 Val Pro Val Gly Pro Leu Val Gln Asp Pro Met Gly His Asp Glu Asp 225 230 235 240 Pro Lys Thr Gly His Leu Ile Asn Trp Leu Asp Lys Arg Ala Glu Ser 245 250 255 Thr Val Val Phe Val Cys Phe Gly Ser Glu Tyr Phe Pro Ser Asn Glu 260 265 270 Glu Leu Glu Glu Leu Ala Ile Gly Leu Glu Ile Ser Met Val Ser Phe 275 280 285 Ile Leu Ala Val Arg Phe Pro Glu Gly Glu Lys Lys Gly Ile Leu Pro 290 295 300 Glu Gly Phe Val Gln Arg Val Gly Asp Arg Gly Leu Val Val Glu Gly 305 310 315 320 Trp Ala Pro Gln Ser Arg Ile Leu Gly His Ser Ser Thr Gly Gly Phe 325 330 335 Val Ser His Cys Gly Trp Ser Ser Ile Met Glu Ser Val Lys Phe Gly 340 345 350 Val Pro Val Ile Ala Met Ala Arg His Leu Asp Gln Pro Leu Asn Ala 355 360 365 Lys Leu Ala Ala Glu Val Gly Val Gly Met Glu Val Met Arg Asp Glu 370 375 380 Asn Gly Lys Tyr Lys Arg Glu Ala Ile Ala Glu Val Ile Arg Lys Val 385 390 395 400 Val Met Glu Lys Asn Gly Glu Val Met Arg Arg Lys Ala Arg Glu Leu 405 410 415 Ser Glu Lys Met Lys Val Lys Gly Glu Gln Glu Ile Gly Arg Ala Val 420 425 430 Glu Glu Leu Val Gln Ile Cys Lys Lys Lys Lys Gln His Ala Gln Tyr 435 440 445 <210> 7 <211> 1447 <212> DNA <213> Panax ginseng <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1447) <223> GT29-34 <400> 7 gggatcctct agagatatcc agagttcatc atggatatcg aaaaaggtag aatcattata 60 gttatgctgc catttttagc ccatggccac atttctccat tctttgagct agccaagcat 120 ctctcaaaaa gaaattgtaa tatattcctc tgttctaccc caatcaatct tagctccatc 180 aagaacagag tatctgataa ggattcctct gcttctataa aactagtaga gcttcatctt 240 ccctcttccc ctgatcttcc ccctcactac cacaccacaa atggcctccc ttcccatctc 300 atggtcccac tcagaaacgc ctttgaaaca gcagccccca ccttctctga aatccttaaa 360 accttaaacc ctgatttgct tatttatgat ttcaatccct catgggcacc ggaaatcgct 420 tcgtctcaca atattccggc agtttatttc ctaacctcgg cagcagccac ctcttccatg 480 ggcctacatg ctttcaaaaa ctcaggtgaa aaatacccat ttccagattt ttatgataac 540 agtaatatta cccctgaacc accttctgca gataaaatga agttatttca tgattttgtc 600 gcttgtttca aacgatcttg cgacattatt ttgattaaga gttttagaga actggaaggg 660 aaatatattg attttctttc cactttatct aagaaaactt tggttcctgt tggtccactc 720 gttcaagatc ctatgggaca tgatgaagat ccaaaaacag ggcatcttat aaactggctt 780 gacaagaggg ctgaatctac agtggtgttt gtctgctttg gaagtgagta ttttccctcc 840 aatgaggaat tggaagaatt agcaattggg ctagagatta gcatggttag tttcatattg 900 gctgtgagat ttcctgaagg agagaaaaaa gggattttac cagaggggtt tgttcaaagg 960 gtaggagaca gaggattggt tgtggagggg tgggctccac aggcaagaat tttaggacat 1020 tcaagcaccg gtgggtttgt gagccattgt gggtggagtt ctattatgga gagtgtgaag 1080 tttggggttc cagtaattgc catggccagg catcttgatc agcctttgaa tgctaagctg 1140 gcggcggagg ttggtgtggg catggaggtt atgagagatg aaaatgggaa gtataagaga 1200 gaagggattg cagaggtaat aagaaaagtc gttgtggaga aaagtgggga ggttatgagg 1260 aggaaagcaa gggaattgag tgagaaaatg aaagagaaag gagaggaaga gattgatagg 1320 gcagtggagg agctagtaca aatttgtaag aagaagaaag atgcacaata gtaatagtag 1380 tagtactaat tttgaatgcg cttaggttgg gttttgaact ctttctttgt atgctaggat 1440 atcgtcg 1447 <210> 8 <211> 446 <212> PRT <213> Panax ginseng <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(446) <223> GT29-34 <400> 8 Met Asp Ile Glu Lys Gly Arg Ile Ile Ile Val Met Leu Pro Phe Leu 1 5 10 15 Ala His Gly His Ile Ser Pro Phe Phe Glu Leu Ala Lys His Leu Ser 20 25 30 Lys Arg Asn Cys Asn Ile Phe Leu Cys Ser Thr Pro Ile Asn Leu Ser 35 40 45 Ser Ile Lys Asn Arg Val Ser Asp Lys Asp Ser Ser Ala Ser Ile Lys 50 55 60 Leu Val Glu Leu His Leu Pro Ser Ser Pro Asp Leu Pro Pro His Tyr 65 70 75 80 His Thr Thr Asn Gly Leu Pro Ser His Leu Met Val Pro Leu Arg Asn 85 90 95 Ala Phe Glu Thr Ala Ala Pro Thr Phe Ser 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ttcaagatcc tatgggccat aatgaagatc caaaaacaga gcagtttata aactggcttg 780 acaaaagggc tgaatctaca gtggtgtttg tctgctttgg aagtgagtat tttctctcca 840 atgaggaatt ggaagaagta gcaattgggc tagagattag catggttaat ttcatatggg 900 ctgtgagatt aattgaagga gagaaaaaag gggttttacc agaggggttt gttcaaaggg 960 taggagacag aggattggtt gtggaggggt gggctccaca ggcaagaatt ttaggacatt 1020 caagcaccgg tgggtttgtg agccattgtg ggtggagttc tattacggag agtatgaagt 1080 ttggggttcc agtaattgcc atggccaggc attttgatca gcctttgaat gctaagctgg 1140 cggcggaggt tggtgtgggc atggaggttg tgagagatga aaatgggaag tataagagag 1200 aagatattgc aggggtaata agaaaagtcg tggtggagaa aagtggggag gttatcagga 1260 ggaaagcaag ggaattgagt gagaaaatga aagagatagg agagcaattg attgataggg 1320 cagtggagga gctagtacaa atttgtaaga agaagaaaga tgaacaatag tagtaataga 1380 ctaatttttt tccctttaaa atcattttga atgcgcttag gttgggcttt gaat 1434 <210> 20 <211> 446 <212> PRT <213> Panax ginseng <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(446) <223> GT29-11 <400> 20 Met Asp Asn Gln Lys Gly Arg Ile Ser Ile Val 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ginseng <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(446) <223> GT29-25 <400> 30 Met Asp Asn Gln Lys Gly Arg Ile Ser Ile Val Met Leu Pro Phe Leu 1 5 10 15 Ala His Gly His Ile Ser Pro Phe Phe Glu Leu Ala Lys His Leu Ser 20 25 30 Lys Arg Asn Cys Asn Ile Phe Leu Cys Ser Thr Pro Ile Asn Leu Ser 35 40 45 Ser Ile Lys Asn Arg Ile Ser Asp Lys Asp Ser Ser Ala Ser Ile Lys 50 55 60 Leu Val Glu Leu His Leu Pro Ser Ser Pro Asp Leu Pro Pro His Tyr 65 70 75 80 His Thr Thr Asn Gly Leu Pro Ser His Leu Met Val Pro Leu Arg Asn 85 90 95 Ala Phe Glu Thr Ala Ala Pro Thr Phe Ser Glu Ile Leu Lys Thr Leu 100 105 110 Asn Pro Asp Leu Leu Ile Tyr Asp Phe Asn Pro Ser Trp Ala Pro Glu 115 120 125 Ile Ala Ser Ser His Asn Ile Pro Ala Val Cys Phe Ile Ile Gly Gly 130 135 140 Ala Ala Ser Phe Ser Met Ser Leu His Ser Phe Lys Asn Pro Gly Glu 145 150 155 160 Lys Tyr Pro Phe Leu Asp Phe Asp Asp Asn Ser Asn Ile Thr Pro Glu 165 170 175 Pro Pro Ser Ala Asp Asn Met Lys Leu Leu Leu Asp Phe Met Thr Cys 180 185 190 Phe Glu Arg Ser Cys Asp 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notoginseng <400> 40 atggataacc aaaaaggtag aatcagtata gcgttgctac catttttagc ccatggtcac 60 atatctccct tctttgagct agccaaacaa ctggcaaaaa gaaattgcaa tgttttcctc 120 tgttctaccc caatcaatct tagctccatc aagaataagg attcctctgc ttctgtaaaa 180 ctagttgagc ttcatcttcc atcttcccct gatcttcctc ctcactatca caccacaaat 240 ggcctccctt cccatctcat ggtcccactc agaaacgcct ttgaaacagt aggccccacc 300 ttctctgaaa tccttaaaac cttaaaccct gatttgctta tttatgattt caatccctca 360 tgggcaccgg agatcgcttc gtctcacaat attccggcag tttatttcct aaccacggca 420 gcagccagct cttccattgg cctacatgct ttcaaaaacc caggtgaaaa atacccattt 480 ccagattttt atgataacag taatattacc cctgaaccac cttctgcaga taacatgaag 540 ctacttcatg attttatcgc ttgtttcgaa cgatcttgcg atattatttt gattaagagt 600 tttagagaac tagaagggaa atatattgat ttgctttcca ctttatctga taaaactttg 660 gttcctgttg gtccactcgt tcaagatcct atgggccata atgaagatcc aaaaacagag 720 cagattataa actggcttga caaaagggct gaatctacag tggtgtttgt ctgctttgga 780 agtgagtatt ttctctccaa tgaggaattg gaagaagtag caattgggct agagattagc 840 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gggtggagtt ctattatgga gagtgtgaag tttggggttc cagtaattgc catggccagg 1080 catcttgatc agcctttgaa tgctaagctg gcggcggagg tcggtgtggg catggaggtt 1140 gtgagagatg aaaatgggaa gtataagaga gaagcgattg cagaggtaat aagaaaagtc 1200 gtgatggaga aaaatgggga ggttatcagg aggaaagcaa gggaattgag tgagaaaatg 1260 aaagagacag gagagcaaga gattggtagg gcagtggagg agctagtaca aatttgtaag 1320 atgaagaaag acgcacaata ttaa 1344 <210> 43 <211> 447 <212> PRT <213> Panax notoginseng <400> 43 Met Asp Ile Glu Lys Gly Arg Ile Ser Ile Val Met Leu Pro Phe Leu 1 5 10 15 Ala His Gly His Ile Ser Pro Phe Phe Glu Leu Ala Lys His Leu Ser 20 25 30 Lys Arg Asn Cys Asn Ile Phe Leu Cys Ser Thr Pro Ile Asn Leu Ser 35 40 45 Ser Ile Lys Asn Arg Val Ser Asp Lys Asp Ser Ser Ala Ser Ile Lys 50 55 60 Leu Val Glu Leu His Leu Pro Ser Ser Pro Asp Leu Pro Pro Gln Tyr 65 70 75 80 His Thr Thr Asn Gly Leu Pro Ser His Leu Met Val Pro Leu Lys Asn 85 90 95 Ala Phe Glu Thr Val Gly Pro Thr Phe Ser Glu Ile Leu Lys Thr Leu 100 105 110 Asp Pro Asp Leu Leu Ile Tyr Asp 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ccttctctga aatccttaaa accttagacc ctgatttgct tatttatgat 360 ttcaatccct catgggcacc ggagatcgct ttgtctcaca atattccggc agtttatttc 420 ctaacctcgg cagcagccac ctcttccgtg gccctacgtg ctttgaaaaa cccaggtgaa 480 aaatacccat ttccagattt ttatgataac agtaatatta cccctgaacc accttctgca 540 gataaaatga agctatttca tgattttgtt gcttgtttca aacgatcttg cgacattatt 600 ttgattaaga gttttagaga actagaaggg aaatatattg atttgctttc cactttatct 660 aagaaaactt tggttcctgt tggtccactc gttcaagatc ctttgggaca tgatgaagat 720 ccaaaaacag ggcatcttat aaactggctt gacaaaaggg ctgaatctac agtggtgttt 780 gtctgctttg gaagtgagta ttttccctcc aatgaggaat tggaagaagt agcaattggg 840 ctagagatta gcatggttaa tttcatattg gctgttagat ttcttgaagg agagaaaaaa 900 ggggttttac cagaagggtt tgttcaaagg gtaggagaca gaggattggt tgtggagggg 960 tgggctccac aggcaagaat tttaggacat tcaagcaccg gtgggtttgt gagccattgt 1020 gggtggagtt ctattatgga gagtgtgaag tttggggttc cagtaattgc catggccagg 1080 catcttgatc agcctttgaa tgctaagctg gcggcggagg ttggtgtggg catggaggtt 1140 gtgagagatg aaaatgggaa 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ggcatcttat aaactggctt gacaaaaggg ctgaatctac agtggtgttt 780 gtctgctttg gaagtgagta ttttccctcc aatgaggaat tggaagaagt agcaattggg 840 ctagagatta gcatggttaa tttcatattg gctgttagat ttcttgaagg agagaaaaaa 900 ggggttttac cagaagggtt tgttcaaagg gtaggagaca gaggattggt tgtggagggg 960 tgggctccac aggcaagaat tttaggacat tcaagcaccg gtgggtttgt gagccattgt 1020 gggtggagtt ctattatgga gagtgtgaag tttggggttc cagtaattgc catggccagg 1080 catcttgatc agcctttgaa tgctaagctg gcggcggagg ttggtgtggg catggaggtt 1140 gtgagagatg aaaatgggaa gtatacgaga gaagcgattg cagaggtaat aagaaaagtt 1200 gtgatggaga aaaatgggga ggttatcagg aggaaagcaa gggaattgag tgataaaatg 1260 aaagagaaag gagagcaaga gattggtagg gcagtggagg agctagtaca aatttgtaag 1320 atgaagaaag acgcacaata ttaa 1344 <210> 51 <211> 447 <212> PRT <213> Panax notoginseng <400> 51 Met Asp Ile Glu Lys Gly Arg Ile Ser Ile Val Met Leu Pro Phe Leu 1 5 10 15 Ala His Gly His Ile Ser Pro Phe Phe Glu Leu Ala Lys His Leu Ser 20 25 30 Lys Arg Asn Cys Asn Ile Phe Leu Cys Ser Thr Pro Ile Asn Leu Ser 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aaggagagaa aaaaggggtt 900 ttaccagagg ggtttgttca aagggtagga gacagaggat tggttgtgga ggggtgggct 960 ccacaggcaa gaattttagg acattcaagc accggtgggt ttgtgagcca ttgtgggtgg 1020 agttctatta tggagagtgt gaagtttggg gttccagtaa ttgccatggc caggcatctt 1080 gatcagcctt tgaatgctaa gctggcggcg ggggtcggtg tgggcatgga ggttgtgaga 1140 gatgaaaatg ggaagtataa gagagaagcg attgcagagg taataagaaa agtcgtgatg 1200 gagaaaaatg gggaggttat caggaggaaa gcaagggaat tgagtgagaa aatgaaagag 1260 acaggagagc aagagattgg tagggcagtg gaggagctag tacaaatttg taagatgaag 1320 aaagacgcac aatattaa 1338 <210> 53 <211> 447 <212> PRT <213> Panax notoginseng <400> 53 Met Asp Ile Glu Lys Gly Arg Ile Ser Ile Val Met Leu Pro Phe Leu 1 5 10 15 Ala His Gly His Ile Ser Pro Phe Phe Glu Leu Ala Lys His Leu Ser 20 25 30 Lys Arg Asn Cys Asn Ile Phe Leu Cys Ser Thr Pro Ile Asn Leu Ser 35 40 45 Ser Ile Lys Asn Arg Val Ser Asp Lys Asp Ser Ser Ala Ser Ile Lys 50 55 60 Leu Val Glu Leu His Leu Pro Ser Ser Pro Asp Leu Pro Pro Gln Tyr 65 70 75 80 His Thr Thr Asn Gly 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tgcggccgca agcttgtcga catattgtgc gtctttcttc a 41 <210> 66 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 taagaaggag atataccatg ggtgatatcg aaaaaggtag aatca 45 <210> 67 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 tgcggccgca agcttgtcga catattgtgc gtctttcttc a 41 <210> 68 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 taagaaggag atataccatg ggtgatatcg aaaaaggtag aatca 45 <210> 69 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 tgcggccgca agcttgtcga catattgtgc gtctttcatc at 42 <210> 70 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 taagaaggag atataccatg ggtgatatcg aaaaaggtag aatcagt 47 <210> 71 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 gtgcggccgc aagcttgtcg acatattgtg cgtctttctt catc 44 <210> 72 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 taagaaggag atataccatg ggtgatatcg aaaaaggtag aatcag 46 <210> 73 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taagaaggag atataccatg gatatcgaaa aaggtagaat 40 <210> 81 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 81 tgcggccgca agcttgtcga catattgtgc gtctttcttc atctt 45 <210> 82 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 82 agagttcatt catggataac ca 22 <210> 83 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 83 ttaagcgcat tcaaaaatat tc 22 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 84 agagttcatc atggatatcg a 21 <210> 85 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 85 catagctcat tcaaaatgac tc 22 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 86 catagctcat tcaaaatgaa t 21 <210> 87 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 87 tatctatcgt atacgccaga gttcatcatg gata 34 <210> 88 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 88 tgcagtcgag atacatctag catacaaaga aagag 35 <210> 89 <211> 1329 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caattgggct agagattagc 840 atggttaatt tcatatgggc tgtgagatta attgaaggag agaaaaaagg ggttttacca 900 gagggatttg ttcaaagggt aggagacaga ggattggttg tggaggggtg ggctccacag 960 gcaagaattt taggacattc aagcaccggt gggtttgtga gccattgtgg gtggagttct 1020 attgcggaga gtatgaagtt tggggttcca gtaattgcca tggccaggca tcttgatcag 1080 cctttgaatg gtaagctggc ggcggaggtt ggtgtgggca tggaggttgt gagagatgaa 1140 aatgggaagt ataagagaga agggattgca gaggtaataa gaaaagtcgt tgtggagaaa 1200 agtggggagg ttatgaggag gaaagcaagg gaattgagtg agaaaatgaa agagaaagga 1260 gaggaagaga ttgatagggc agtggaggag ctagtacaaa tttgtaagaa gaagaaagat 1320 gcacaatag 1329 <210> 90 <211> 442 <212> PRT <213> Panax ginseng <400> 90 Met Asp Asn Gln Lys Gly Arg Ile Ser Ile Ala Leu Leu Pro Phe Leu 1 5 10 15 Ala His Gly His Ile Ser Pro Phe Phe Glu Leu Ala Lys Gln Leu Ala 20 25 30 Lys Arg Asn Cys Asn Val Phe Leu Cys Ser Thr Pro Ile Asn Leu Ser 35 40 45 Ser Ile Lys Asp Lys Asp Ser Ser Ala Ser Ile Lys Leu Val Glu Leu 50 55 60 His Leu Pro Ser Ser Pro Asp Leu Pro Pro 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cccatctcat gctcccactc agaaacgcct ttgaaactgc aggccccacc 300 ttctctgaaa tccttaaaac cttaaacccc gatttgctta tttatgattt caatccctca 360 tgggcaccgg agatcgcttc gtctcacaat attccggcag tttatttcct aaccacggca 420 gcagccagct cttccattgg cctacatgct ttcaaaaacc caggtgaaaa atacccattt 480 ccagattttt atgataacag taatattacc cctgaaccac cttctgcaga taacatgaag 540 ctacttcatg attttatcgc ttgtttcgaa cgatcttgcg acattatttt gattaagagt 600 tttagagaac tagaagggaa atatattgat ttgctttcca ctttatctga taaaactttg 660 gttcctgttg gtccactcgt tcaagatcct atgggccata atgaagatcc aaaaacagag 720 cagattataa actggcttga caaaagggct gaatctacag tggtgtttgt ctgctttgga 780 agtgagtatt ttctctccaa tgaggaattg gaagaagtag caattgggct agagattagc 840 acggttaatt tcatatgggc tgtgagatta attgaaggag agaaaaaagg gattttacca 900 gaggggtttg ttcaaagggc aggagacaga ggattggttg tggaggggtg ggctccacag 960 gcaagaattt taggacattc aagcaccggt gggtttgtga gccattgtgg gtggagttct 1020 attgcggaga gtatgaagtt tggggttcca gtaattgcca tggccaggca tcttgatcag 1080 cctttgaatg gtaagctggc ggcggaggtt ggtgtgggca tggaggttgt gagagatgag 1140 aatgggaagt ataagagaga agggattgca gaggtaataa gaaaagtggt tgtggagaaa 1200 agtggggagg ttatcaggag gaaagcaagg gagttgagtg agaaaatgaa agagaaagga 1260 gagcaagaga ttgatagggc attggaggag ctagtacaaa tttgtaagaa gaagaaagat 1320 gaacaatag 1329 <210> 118 <211> 442 <212> PRT <213> Panax ginseng <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(442) <223> GT29-20 <400> 118 Met Asp Asn Gln Lys Gly Arg Ile Ser Ile Ala Leu Leu Pro Phe Leu 1 5 10 15 Ala His Gly His Ile Ser Pro Phe Phe Glu Leu Ala Lys Gln Leu Ala 20 25 30 Lys Arg Asn Cys Asn Val Phe Leu Cys Ser Thr Pro Ile Asn Leu Ser 35 40 45 Ser Ile Lys Asp Lys Asp Ser Ser Ala Ser Ile Lys Leu Val Glu Leu 50 55 60 His Leu Pro Ser Ser Pro Asp Leu Pro Pro His Tyr His Thr Thr Asn 65 70 75 80 Gly Leu Pro Ser His Leu Met Leu Pro Leu Arg Asn Ala Phe Glu Thr 85 90 95 Ala Gly Pro Thr Phe Ser Glu Ile Leu Lys Thr Leu Asn Pro Asp Leu 100 105 110 Leu Ile Tyr Asp Phe Asn Pro Ser Trp Ala Pro Glu Ile Ala Ser Ser 115 120 125 His Asn Ile Pro Ala Val Tyr Phe Leu Thr Thr Ala Ala Ala Ser Ser 130 135 140 Ser Ile Gly Leu His Ala Phe Lys Asn Pro Gly Glu Lys Tyr Pro Phe 145 150 155 160 Pro Asp Phe Tyr Asp Asn Ser Asn Ile Thr Pro Glu Pro Pro Ser Ala 165 170 175 Asp Asn Met Lys Leu Leu His Asp Phe Ile Ala Cys Phe Glu Arg Ser 180 185 190 Cys Asp Ile Ile Leu Ile Lys Ser Phe Arg Glu Leu Glu Gly Lys Tyr 195 200 205 Ile Asp Leu Leu Ser Thr Leu Ser Asp Lys Thr Leu Val Pro Val Gly 210 215 220 Pro Leu Val Gln Asp Pro Met Gly His Asn Glu Asp Pro Lys Thr Glu 225 230 235 240 Gln Ile Ile Asn Trp Leu Asp Lys Arg Ala Glu Ser Thr Val Val Phe 245 250 255 Val Cys Phe Gly Ser Glu Tyr Phe Leu Ser Asn Glu Glu Leu Glu Glu 260 265 270 Val Ala Ile Gly Leu Glu Ile Ser Thr Val Asn Phe Ile Trp Ala Val 275 280 285 Arg Leu Ile Glu Gly Glu Lys Lys Gly Ile Leu Pro Glu Gly Phe Val 290 295 300 Gln Arg Ala Gly Asp Arg Gly Leu Val Val Glu Gly Trp Ala Pro Gln 305 310 315 320 Ala Arg Ile Leu Gly His Ser Ser Thr Gly Gly Phe Val Ser His Cys 325 330 335 Gly Trp Ser Ser Ile Ala Glu Ser Met Lys Phe Gly Val Pro Val Ile 340 345 350 Ala Met Ala Arg His Leu Asp Gln Pro Leu Asn Gly Lys Leu Ala Ala 355 360 365 Glu Val Gly Val Gly Met Glu Val Val Arg Asp Glu Asn Gly Lys Tyr 370 375 380 Lys Arg Glu Gly Ile Ala Glu Val Ile Arg Lys Val Val Val Glu Lys 385 390 395 400 Ser Gly Glu Val Ile Arg Arg Lys Ala Arg Glu Leu Ser Glu Lys Met 405 410 415 Lys Glu Lys Gly Glu Gln Glu Ile Asp Arg Ala Leu Glu Glu Leu Val 420 425 430 Gln Ile Cys Lys Lys Lys Lys Asp Glu Gln 435 440 <210> 119 <211> 1329 <212> DNA <213> Panax ginseng <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1329) <223> GT29-21 <400> 119 atggataacc aaaaaggtag aatcagtata gcgttgctac catttttagc caatggtcac 60 atatctccct tctttgagct agccaaacaa ctcgcgaaaa gaaattgcaa tgttttcctc 120 tgttctaccc caatcaatct tagctccatc aaggataagg attcctctgc ttctataaaa 180 ctagttgagc ttcatcttcc atcttcccct gatcttcctc ctcactatca caccacaaat 240 ggcctccctt cccatctcat gctcccactc agaaacgcct ttgaaactgc aggccccacc 300 ttctctgaaa tccttaaaac cttaaacccc gatttgctta tttatgattt caatccctca 360 tgggcaccgg agatcgcttc gtctcacaat attccggcag tttatttcct aaccacggca 420 gcagccagct cttccattgg cctacatgct ttcaaaaacc caggtgaaaa atacccattt 480 ccagattttt atgataacag taatattacc cctgaaccac cttctgcaga taacatgaag 540 ctacttcatg attttatcgc ttgtttcgaa cgatcttgcg acattatttt gattaagagt 600 tttagagaac tagaagggaa atatattgat ttgctttcca ctttatctga taaaactttg 660 gttcctgttg gtccactcgt tcaagatcct atgggccata atgaagatcc aaaaacagag 720 cagattataa actggcttga caaaagggct gaatctacag tggtgtttgt ctgctttgga 780 agtgagtatt ttctctccaa tgaggaattg gaagaagtag caattgggct agagattagc 840 acggttaatt tcatatgggc tgtgagatta attgaaggag agaaaaaagg gattttacca 900 gaggggtttg ttcaaagggt aggagacaga ggattggttg tggaggggtg ggctccacag 960 gcaagaattt taggacattc aagcatcggt gggtttgtga gccattgtgg gtggagttct 1020 attgcggaga gtatgaagtt tggggttcca gtaattgcca tggccaggca tcttgatcag 1080 cctttgaatg gtaagctggc ggcggaggtt ggtgtgggca tggaggttgt gagagatgag 1140 aatgggaagt ataagagaga agggattgca gaggtaataa gaaaagtggt tgtggagaaa 1200 agtggggagg ttatcaggag gaaagcaagg gagttgagtg agaaaatgaa agagaaagga 1260 gagcaagaga ttgatagggc attggaggag ctagtacaaa tttgtaagaa gaagaaagat 1320 gaacaatag 1329 <210> 120 <211> 442 <212> PRT <213> Panax ginseng <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(442) <223> GT29-21 <400> 120 Met Asp Asn Gln Lys Gly Arg Ile Ser Ile Ala Leu Leu Pro Phe Leu 1 5 10 15 Ala Asn Gly His Ile Ser Pro Phe Phe Glu Leu Ala Lys Gln Leu Ala 20 25 30 Lys Arg Asn Cys Asn Val Phe Leu Cys Ser Thr Pro Ile Asn Leu Ser 35 40 45 Ser Ile Lys Asp Lys Asp Ser Ser Ala Ser Ile Lys Leu Val Glu Leu 50 55 60 His Leu Pro Ser Ser Pro Asp Leu Pro Pro His Tyr His Thr Thr Asn 65 70 75 80 Gly Leu Pro Ser His Leu Met Leu Pro Leu Arg Asn Ala Phe Glu Thr 85 90 95 Ala Gly Pro Thr Phe Ser Glu Ile Leu Lys Thr Leu Asn Pro Asp Leu 100 105 110 Leu Ile Tyr Asp Phe Asn Pro Ser Trp Ala Pro Glu Ile Ala Ser Ser 115 120 125 His Asn Ile Pro Ala Val Tyr Phe Leu Thr Thr Ala Ala Ala Ser Ser 130 135 140 Ser Ile Gly Leu His Ala Phe Lys Asn Pro Gly Glu Lys Tyr Pro Phe 145 150 155 160 Pro Asp Phe Tyr Asp Asn Ser Asn Ile Thr Pro Glu Pro Pro Ser Ala 165 170 175 Asp Asn Met Lys Leu Leu His Asp Phe Ile Ala Cys Phe Glu Arg Ser 180 185 190 Cys Asp Ile Ile Leu Ile Lys Ser Phe Arg Glu Leu Glu Gly Lys Tyr 195 200 205 Ile Asp Leu Leu Ser Thr Leu Ser Asp Lys Thr Leu Val Pro Val Gly 210 215 220 Pro Leu Val Gln Asp Pro Met Gly His Asn Glu Asp Pro Lys Thr Glu 225 230 235 240 Gln Ile Ile Asn Trp Leu Asp Lys Arg Ala Glu Ser Thr Val Val Phe 245 250 255 Val Cys Phe Gly Ser Glu Tyr Phe Leu Ser Asn Glu Glu Leu Glu Glu 260 265 270 Val Ala Ile Gly Leu Glu Ile Ser Thr Val Asn Phe Ile Trp Ala Val 275 280 285 Arg Leu Ile Glu Gly Glu Lys Lys Gly Ile Leu Pro Glu Gly Phe Val 290 295 300 Gln Arg Val Gly Asp Arg Gly Leu Val Val Glu Gly Trp Ala Pro Gln 305 310 315 320 Ala Arg Ile Leu Gly His Ser Ser Ile Gly Gly Phe Val Ser His Cys 325 330 335 Gly Trp Ser Ser Ile Ala Glu Ser Met Lys Phe Gly Val Pro Val Ile 340 345 350 Ala Met Ala Arg His Leu Asp Gln Pro Leu Asn Gly Lys Leu Ala Ala 355 360 365 Glu Val Gly Val Gly Met Glu Val Val Arg Asp Glu Asn Gly Lys Tyr 370 375 380 Lys Arg Glu Gly Ile Ala Glu Val Ile Arg Lys Val Val Val Glu Lys 385 390 395 400 Ser Gly Glu Val Ile Arg Arg Lys Ala Arg Glu Leu Ser Glu Lys Met 405 410 415 Lys Glu Lys Gly Glu Gln Glu Ile Asp Arg Ala Leu Glu Glu Leu Val 420 425 430 Gln Ile Cys Lys Lys Lys Lys Asp Glu Gln 435 440 <210> 121 <211> 1329 <212> DNA <213> Panax ginseng <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1329) <223> GT29-22 <400> 121 atggataacc aaaaaggtag aatcagtata gcgttgctac catttttagc ccatggtcac 60 atatctccct tctttgagct agccaaacaa ctcgcgaaaa gaaattgcaa tgttttcctc 120 tgttctaccc caatcaatct tagctccatc aaggataagg attcctctgc ttctataaaa 180 ctagttgagc ttcatcttcc atcttcccct gatcttcctc ctcactatca caccacaaat 240 ggcctccctt cccatctcat gctcccactc agaaacgcct ttgaaactgc aggccccacc 300 ttctctgaaa tccttaaaac cttaaacccc gatttgctta tttatgattt caatccctca 360 tgggcaccgg agatcgcttc gtctcacaat attccggcag tttatttcct aaccacggca 420 gcagccagct cttccattgg cctacatgct ttcaaaaacc caggtgaaaa atacccattt 480 ccagattttt atgataacag taatattacc cctgaaccac cttctgcaga taacatgaag 540 ctacttcatg attttatcgc ttgtttcgaa cgatcttgcg acattatttt gattaagagt 600 tttagagaac tagaagggaa atatattgat ttgctttcca ctttatctga taaaactttg 660 gttcctgttg gtccactcgt tcaagatcct atgggccata atgaagatcc aaaaacagag 720 cagattataa actggcttga caaaagggct gaatctacag tggtgtttgt ctgctttgga 780 agtgagtatt ttctctccaa tgaggaattg gaagaagtag caattgggct agagattagc 840 acggttaatt tcatatgggc tgtgagatta attgaaggag agaaaaaagg gattttacca 900 gaggggtttg ttcaaagggt aggagacaga ggattggttg tggaggggtg ggctccacag 960 gcaagaattt taggacattc aagcaccggt gggtttgtga gccattgtgg gtggagttct 1020 attgcggaga ttatgaagtt tggggttcca gtaattgcca tggccaggca tcttgatcag 1080 cctttgaatg gtaagctggc ggcggaggtt ggtgtgggca tggaggttgt gagagatgag 1140 aatgggaagt ataagagaga agggattgca gaggtaataa gaaaagtggt tgtggagaaa 1200 agtggggagg ttatcaggag gaaagcaagg gagttgagtg agaaaatgaa agagaaagga 1260 gagcaagaga ttgatagggc attggaggag ctagtacaaa tttgtaagaa gaagaaagat 1320 gaacaatag 1329 <210> 122 <211> 442 <212> PRT <213> Panax ginseng <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(442) <223> GT29-22 <400> 122 Met Asp Asn Gln Lys Gly Arg Ile Ser Ile Ala Leu Leu Pro Phe Leu 1 5 10 15 Ala His Gly His Ile Ser Pro Phe Phe Glu Leu Ala Lys Gln Leu Ala 20 25 30 Lys Arg Asn Cys Asn Val Phe Leu Cys Ser Thr Pro Ile Asn Leu Ser 35 40 45 Ser Ile Lys Asp Lys Asp Ser Ser Ala Ser Ile Lys Leu Val Glu Leu 50 55 60 His Leu Pro Ser Ser Pro Asp Leu Pro Pro His Tyr His Thr Thr Asn 65 70 75 80 Gly Leu Pro Ser His Leu Met Leu Pro Leu Arg Asn Ala Phe Glu Thr 85 90 95 Ala Gly Pro Thr Phe Ser Glu Ile Leu Lys Thr Leu Asn Pro Asp Leu 100 105 110 Leu Ile Tyr Asp Phe Asn Pro Ser Trp Ala Pro Glu Ile Ala Ser Ser 115 120 125 His Asn Ile Pro Ala Val Tyr Phe Leu Thr Thr Ala Ala Ala Ser Ser 130 135 140 Ser Ile Gly Leu His Ala Phe Lys Asn Pro Gly Glu Lys Tyr Pro Phe 145 150 155 160 Pro Asp Phe Tyr Asp Asn Ser Asn Ile Thr Pro Glu Pro Pro Ser Ala 165 170 175 Asp Asn Met Lys Leu Leu His Asp Phe Ile Ala Cys Phe Glu Arg Ser 180 185 190 Cys Asp Ile Ile Leu Ile Lys Ser Phe Arg Glu Leu Glu Gly Lys Tyr 195 200 205 Ile Asp Leu Leu Ser Thr Leu Ser Asp Lys Thr Leu Val Pro Val Gly 210 215 220 Pro Leu Val Gln Asp Pro Met Gly His Asn Glu Asp Pro Lys Thr Glu 225 230 235 240 Gln Ile Ile Asn Trp Leu Asp Lys Arg Ala Glu Ser Thr Val Val Phe 245 250 255 Val Cys Phe Gly Ser Glu Tyr Phe Leu Ser Asn Glu Glu Leu Glu Glu 260 265 270 Val Ala Ile Gly Leu Glu Ile Ser Thr Val Asn Phe Ile Trp Ala Val 275 280 285 Arg Leu Ile Glu Gly Glu Lys Lys Gly Ile Leu Pro Glu Gly Phe Val 290 295 300 Gln Arg Val Gly Asp Arg Gly Leu Val Val Glu Gly Trp Ala Pro Gln 305 310 315 320 Ala Arg Ile Leu Gly His Ser Ser Thr Gly Gly Phe Val Ser His Cys 325 330 335 Gly Trp Ser Ser Ile Ala Glu Ile Met Lys Phe Gly Val Pro Val Ile 340 345 350 Ala Met Ala Arg His Leu Asp Gln Pro Leu Asn Gly Lys Leu Ala Ala 355 360 365 Glu Val Gly Val Gly Met Glu Val Val Arg Asp Glu Asn Gly Lys Tyr 370 375 380 Lys Arg Glu Gly Ile Ala Glu Val Ile Arg Lys Val Val Val Glu Lys 385 390 395 400 Ser Gly Glu Val Ile Arg Arg Lys Ala Arg Glu Leu Ser Glu Lys Met 405 410 415 Lys Glu Lys Gly Glu Gln Glu Ile Asp Arg Ala Leu Glu Glu Leu Val 420 425 430 Gln Ile Cys Lys Lys Lys Lys Asp Glu Gln 435 440 <210> 123 <211> 1329 <212> DNA <213> Panax ginseng <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1329) <223> GT29-23 <400> 123 atggataacc aagaaggtag aatcagtata gcgttgctac catttttagc ccatggtcac 60 atatctccct tctttgagct agccaaacaa ctcgcaaaaa gaaattgcaa tgttttcctc 120 tgttctaccc caatcaatct tagctccatc aagaataagg attcctctgc ttctataaaa 180 ctagttgagc ttcatcttcc atcttcccct gatcttcctc ctcactatca caccacaaat 240 ggcctccctt cccatctcat ggtcccactc ataaacgcct ttgaaacagc aggccccacc 300 ttctctgaaa tccttaaaac cttaaacccc gatttgctta tttatgattt caatccctca 360 tgggcaccgg agatcgcttc gtctcacaat attccggcag tttatttcct aaccacggca 420 gcagccagct cttccattgg cctacatgct ttcaaaaacc caggtgaaaa atacccattt 480 ccagattttt atgataacag taataatacc cctgaaccac cttctgcaga taacatgaag 540 ctacttcatg attttatcgc ttgtttcgaa cgatcttgcg acattatttt gattaagagt 600 tttatagaac tagaagggaa atatatcgat ttgctttcca ctttatctga taaaactttg 660 gttcctgttg gtccactcgt tcaagatcct atgggccata atgaagatcc aaaaacagag 720 cagattataa actggcttga caaaagggct gaatctacag tggtgtttgt ctgctttgga 780 agtgagtatt ttctctccaa tgaggaattg gaagaagtag caattgggct agagattagc 840 atggttaatt tcatatgggc tgtgagatta attgaaggag agaaaaaagg ggttttacca 900 gagggatttg ttcaaagggt aggagacaga ggattggttg tggaggggtg ggctccacac 960 gcaagaattt taggacattc aagcaccggt gggtttgtga gccattgtgg gtggagttct 1020 attgcggaga gtatgaagtt tggggttcca gtaattgcca tggccaggca tcttgatcag 1080 cctttgaatg gtaagctggc ggcggaggtt ggtgtgggca tggaggttgt gagagatgaa 1140 aatgggaagt ataagagaga agggattgca gaggtaataa gaaaagtcgt tgtggagaaa 1200 agtggggagg ttatgaggag gaaagcaagg gaattgagtg agaaaatgaa agagaaagga 1260 gaggaagaga ttgatagggc agtggaggag ctagtacaaa tttgtaagaa gaagaaagat 1320 gcacaatag 1329 <210> 124 <211> 442 <212> PRT <213> Panax ginseng <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(442) <223> GT29-23 <400> 124 Met Asp Asn Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Ala Leu Leu Pro Phe Leu 1 5 10 15 Ala His Gly His Ile Ser Pro Phe Phe Glu Leu Ala Lys Gln Leu Ala 20 25 30 Lys Arg Asn Cys Asn Val Phe Leu Cys Ser Thr Pro Ile Asn Leu Ser 35 40 45 Ser Ile Lys Asn Lys Asp Ser Ser Ala Ser Ile Lys Leu Val Glu Leu 50 55 60 His Leu Pro Ser Ser Pro Asp Leu Pro Pro His Tyr His Thr Thr Asn 65 70 75 80 Gly Leu Pro Ser His Leu Met Val Pro Leu Ile Asn Ala Phe Glu Thr 85 90 95 Ala Gly Pro Thr Phe Ser Glu Ile Leu Lys Thr Leu Asn Pro Asp Leu 100 105 110 Leu Ile Tyr Asp Phe Asn Pro Ser Trp Ala Pro Glu Ile Ala Ser Ser 115 120 125 His Asn Ile Pro Ala Val Tyr Phe Leu Thr Thr Ala Ala Ala Ser Ser 130 135 140 Ser Ile Gly Leu His Ala Phe Lys Asn Pro Gly Glu Lys Tyr Pro Phe 145 150 155 160 Pro Asp Phe Tyr Asp Asn Ser Asn Asn Thr Pro Glu Pro Pro Ser Ala 165 170 175 Asp Asn Met Lys Leu Leu His Asp Phe Ile Ala Cys Phe Glu Arg Ser 180 185 190 Cys Asp Ile Ile Leu Ile Lys Ser Phe Ile Glu Leu Glu Gly Lys Tyr 195 200 205 Ile Asp Leu Leu Ser Thr Leu Ser Asp Lys Thr Leu Val Pro Val Gly 210 215 220 Pro Leu Val Gln Asp Pro Met Gly His Asn Glu Asp Pro Lys Thr Glu 225 230 235 240 Gln Ile Ile Asn Trp Leu Asp Lys Arg Ala Glu Ser Thr Val Val Phe 245 250 255 Val Cys Phe Gly Ser Glu Tyr Phe Leu Ser Asn Glu Glu Leu Glu Glu 260 265 270 Val Ala Ile Gly Leu Glu Ile Ser Met Val Asn Phe Ile Trp Ala Val 275 280 285 Arg Leu Ile Glu Gly Glu Lys Lys Gly Val Leu Pro Glu Gly Phe Val 290 295 300 Gln Arg Val Gly Asp Arg Gly Leu Val Val Glu Gly Trp Ala Pro His 305 310 315 320 Ala Arg Ile Leu Gly His Ser Ser Thr Gly Gly Phe Val Ser His Cys 325 330 335 Gly Trp Ser Ser Ile Ala Glu Ser Met Lys Phe Gly Val Pro Val Ile 340 345 350 Ala Met Ala Arg His Leu Asp Gln Pro Leu Asn Gly Lys Leu Ala Ala 355 360 365 Glu Val Gly Val Gly Met Glu Val Val Arg Asp Glu Asn Gly Lys Tyr 370 375 380 Lys Arg Glu Gly Ile Ala Glu Val Ile Arg Lys Val Val Val Glu Lys 385 390 395 400 Ser Gly Glu Val Met Arg Arg Lys Ala Arg Glu Leu Ser Glu Lys Met 405 410 415 Lys Glu Lys Gly Glu Glu Glu Ile Asp Arg Ala Val Glu Glu Leu Val 420 425 430 Gln Ile Cys Lys Lys Lys Lys Asp Ala Gln 435 440 <210> 125 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 125 aactttaaga aggagatata ccatgggcat ggataaccaa gaaggtag 48 <210> 126 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 126 tcgagtgcgg ccgcaagctt gtcgacttgt tcatctttct tcttct 46 <210> 127 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 127 aactttaaga aggagatata ccatgggcat ggataaccaa aaaggtag 48 <210> 128 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 128 tcgagtgcgg ccgcaagctt gtcgacttgt tcatctttct tcttct 46 <210> 129 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 129 aactttaaga aggagatata ccatgggcat ggataaccaa aaaggtag 48 <210> 130 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 130 tcgagtgcgg ccgcaagctt gtcgacttgt tcatctttct tcttct 46 <210> 131 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 131 aactttaaga aggagatata ccatgggcat ggataaccaa aaaggtag 48 <210> 132 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 132 tcgagtgcgg ccgcaagctt gtcgacttgt tcatctttct tcttct 46 <210> 133 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 133 aactttaaga aggagatata ccatgggcat ggataaccaa gaaggtag 48 <210> 134 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 134 tcgagtgcgg ccgcaagctt gtcgacttgt gcatctttct tcttct 46

Claims (12)

  1. 체외 글리코실화 방법에 있어서,
    글리코실트랜스퍼라제(Glycosyltransferase) 존재 하에서, 글리코실기 공여체의 글리코실기를 테트라시클릭트리터페노이드(tetracyclic triterpenoid)계 화합물의 C20 부위에 첫 번째 글리코실기에 전이시켜, 글리코실기화된 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물을 형성하는 단계를 포함하고,
    상기 글리코실트랜스퍼라제는 SEQ ID NO.: 4, 6, 8, 39, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 또는 98으로 표시되고, 상기 글리코실트랜스퍼라제는 글리신, 히스티딘 및 류신을 240번 위치 내지 246번 위치에서 공통적으로 가지는 체외 글리코실화 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    글리코실트랜스퍼라제 존재 하에서, 글리코실기 공여체의 글리코실기를 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물의 C3 부위의 첫 번째 글리코실기에 전이시켜, 글리코실기화된 테트라시클릭트리터페노이드계 화합물을 얻는 단계를 포함하는 체외 글리코실화 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    글리코실트랜스퍼라제는 SEQ ID NOs.: 39, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 또는 98 중 하나로 표시되는 아미노산 서열인 체외 글리코실화 방법.
  4. 분리된 폴리펩티드에 있어서,
    상기 분리된 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 4, 6, 8, 39, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 또는 98 중 하나로 표시되고, 상기 폴리펩티드는 글리신, 히스티딘 및 류신을 240번 위치 내지 246번 위치에서 공통적으로 가지는 아미노산 서열인 분리된 폴리펩티드.
  5. 분리된 폴리뉴클레오티드에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는,
    (A) SEQ ID NOs.: 39, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 또는 98 중 하나로 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및
    (B) SEQ ID NO.: 3, 5, 7, 38, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 또는 97 로 표시된 뉴클레오티드 서열이고, 이 뉴클레오티드로 코딩된 글리코실트랜스퍼라제는 글리신, 히스티딘 및 류신을 240번 위치 내지 246번 위치에서 공통적으로 가지는, 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 제4항에 따른 분리된 폴리펩티드를 발현하는 전달체.
  7. 제4항에 따른 분리된 폴리펩티드를 사용하는 방법에 있어서,
    글리코실기 공여체로부터의 글리코실기를 C-20 부위의 첫 번째 글리코실기에 전이시켜 탄수화물 사슬을 연장하는 반응을 촉매하거나, 이를 촉매하는 촉매제의 제조에 사용하는 방법.
  8. 유전자 조작된 숙주 세포에 있어서,
    상기 숙주 세포는 제6항에 따른 전달체를 포함 하는 숙주 세포.
  9. 제8항에 따른 숙주 세포의 사용방법에 있어서,
    효소 촉매 작용 시약을 제조하거나, 글리코실트랜스퍼라제를 생성하거나, 촉매 작용 세포로 사용되거나, 식(Ⅱ) 또는 (Ⅳ) 화합물을 생성하는 방법.
  10. 제8항에 따른 유전자 조작된 숙주 세포를 식물로 재생시키는 단계를 포함하는, 상기 유전자 조작된 숙주 세포는 식물 세포인 유전자 변형 식물을 생성하는 방법.
  11. 제7항에 있어서,
    분리된 폴리펩티드가 글리코실기 공여체로부터의 글리코실기를 C3 부위의 첫 번째 글리코실기에 전이시켜 탄수화물 사슬을 연장하는 반응을 촉매하는데 추가로 사용되거나, 이 반응을 촉매하는 촉매제의 제조에 사용되는 방법.
  12. 유전자 조작된 숙주 세포에 있어서,
    상기 숙주 세포는 제5항에 따른 폴리뉴클레오티드를 통합시킨 숙주 세포.
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