JP2020520656A - 一連の糖鎖伸長を触媒するudp−糖転移酵素およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
ジンセンサポニンはオタネニンジンまたはサンシチニンジンの全サポニンまたは豊富なサポニンを原料とし、化学、酵素および微生物発酵による加水分解方法によって製造される。野生のジンセン資源はほぼなくなり、ジンセン全サポニン資源は現在主にオタネニンジンやサンシチニンジンの人工栽培に依頼するが、その人工栽培の成長周期が長く(一般的に5〜7年以上が必要)、そして地域の制限もあり、また病虫害が多くて大量の農薬の施用が必要であるため、オタネニンジンやサンシチニンジンの人工栽培は深刻な連作障害があり(オタネニンジンやサンシチニンジンの栽培地は連作障害を克服するには5〜15年以上の休耕が必要である)、よってジンセンサポニンの生産量、品質および安全性はいずれもチャレンジに直面している。
本発明の第一の側面では、in vitroでのグリコシル化方法であって、
糖転移酵素の存在下で、糖ドナーのグリコシル基をテトラシクロトリテルペン系化合物の
C20位および/またはC3位の1番目のグリコシル基に転移させ、
グリコシル化されたテトラシクロトリテルペン系化合物を形成する工程を含み、
ここで、前記の糖転移酵素は、
配列番号4、6、8、8、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、98、または100で示される糖転移酵素またはその誘導体ポリペプチドから選ばれる、方法を提供する。
本発明の第二の側面では、in vitroでのグリコシル化方法であって、
糖転移酵素の存在下で、糖ドナーのグリコシル基をテトラシクロトリテルペン系化合物の
C6位の1番目のグリコシル基に転移させ、
グリコシル化されたテトラシクロトリテルペン系化合物を形成する工程を含み、
ここで、前記の糖転移酵素は、
配列番号12、14、16、18、20、22、24、26、28および30で示される糖転移酵素またはその誘導体ポリペプチドから選ばれる、方法を提供する。
本発明は、in vitroでのグリコシル化方法であって、
糖転移酵素の存在下で、糖ドナーのグリコシル基をテトラシクロトリテルペン系化合物の
C3位の1番目のグリコシル基に転移させ、
グリコシル化されたテトラシクロトリテルペン系化合物を形成する工程を含み、
ここで、前記の糖転移酵素は、
配列番号39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、90、92、94、96、98、100、116、118、120、122、または124で示される糖転移酵素またはその誘導体ポリペプチドから選ばれる、方法を提供する。
(a)配列番号4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、90、92、94、96、98、100、116、118、120、122、または124のうちの任意の1本または複数本で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(b)配列番号4、6、8、14、16、18、20、22、24、26、28、30、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、90、92、94、96、98、100、116、118、120、122、または124にタグ配列、シグナル配列または分泌シグナル配列を付加したもので、かつ糖転移酵素活性を有する誘導体ポリペプチド;
(c)アミノ酸配列の配列番号4、6、8、14、16、18、20、22、24、26、28、30、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、90、92、94、96、98、100、116、118、120、122、または124のうちの任意の1本または複数本で示されるアミノ酸配列との相同性が≧95%で、かつ糖転移酵素活性を有する誘導体ポリペプチド。
本発明の第三の側面では、単離されたポリペプチドであって、前記の単離されたポリペプチドは、
配列番号4、6、8、28、30、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、90、92、94、96、98、100、116、118、120、122、または124のうちの任意の1本または複数本で示されるアミノ酸配列のポリペプチドまたはその誘導体ポリペプチドで、ここで、前記誘導体ポリペプチドは、
(a)配列番号4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、90、92、94、96、98、100、116、118、120、122、または124のうちの任意の1本または複数本で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(b)配列番号4、6、8、28、30、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、90、92、94、96、98、100、116、118、120、122、または124にタグ配列、シグナル配列または分泌シグナル配列を付加したもので、かつ糖転移酵素活性を有する誘導体ポリペプチド;
(c)アミノ酸配列の配列番号4、6、8、28、30、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、90、92、94、96、98、100、116、118、120、122、または124のうちの任意の1本または複数本で示されるアミノ酸配列との相同性が≧95%で、かつ糖転移酵素活性を有する誘導体ポリペプチド、から選ばれるポリペプチドを提供する。
もう一つの好適な例において、前記の単離されたポリペプチドは、in vitroでのグリコシル化に使用される。
(A)請求項4に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(B)配列番号4、6、8、28、30、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、90、92、94、96、98、100、116、118、120、122、または124で示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(C)配列番号3、5、7、27、29、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、89、91、93、95、97、99、115、117、119、121、または123で示されるヌクレオチド配列;
(D)配列番号3、5、7、27、29、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、89、91、93、95、97、99、115、117、119、121、または123で示されるヌクレオチド配列との相同性が≧95%(好ましくは≧98%)のヌクレオチド配列;
(E)(A)〜(D)のいずれかに記載のヌクレオチド配列と相補的(好ましくは完全相補的)なヌクレオチド配列。
もう一つの好適な例において、配列が配列番号3、5、7、27、29、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、89、91、93、95、97、99、115、117、119、121、または123で示されるヌクレオチド配列で、それぞれ4、6、8、28、30、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、90、92、94、96、98、100、116、118、120、122、または124で示されるポリペプチドをコードする。
本発明の第三の側面に記載の単離されたポリペプチドの使用は、以下の1種または複数種の反応を触媒するため、あるいは以下の1種または複数種の反応を触媒する触媒製剤の製造のために使用される:
糖ドナーからのグリコシル基をテトラシクロトリテルペン系化合物の
(i)C6位の1番目のグリコシル基、
(ii)C20位の1番目のグリコシル基、および/または
(iii)C3位の1番目のグリコシル基
に転移させ、糖鎖を伸長させる反応。
もう一つの好適な例において、ポリペプチドまたはその誘導体ポリペプチドの使用であって、以下の反応を触媒するため、あるいは以下の反応を触媒する触媒製剤の製造のために使用されることを特徴とする使用も提供する:
糖転移酵素の存在下で、糖ドナーのグリコシル基をテトラシクロトリテルペン系化合物の
C6位の1番目のグリコシル基、またはC20位の1番目のグリコシル基、および/またはC3位の1番目のグリコシル基に転移させ、
グリコシル化されたテトラシクロトリテルペン系化合物を形成し、
ここで、前記の糖転移酵素は、
配列番号4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、90、92、94、96、98、100、116、118、120、122、または124で示される糖転移酵素またはその誘導体ポリペプチドから選ばれる。
糖転移酵素の存在下で、糖ドナーのグリコシル基をテトラシクロトリテルペン系化合物の
C20位および/またはC3位の1番目のグリコシル基に転移させ、
グリコシル化されたテトラシクロトリテルペン系化合物を形成し、
ここで、前記の糖転移酵素は、
配列番号4、6、8、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、98、または100で示される糖転移酵素またはその誘導体ポリペプチドから選ばれる。
糖転移酵素の存在下で、糖ドナーのグリコシル基をテトラシクロトリテルペン系化合物の
C6位の1番目のグリコシル基に転移させ、
グリコシル化されたテトラシクロトリテルペン系化合物を形成し、
ここで、前記の糖転移酵素は、
配列番号12、14、16、18、20、22、24、26、28、または30で示される糖転移酵素またはその誘導体ポリペプチドから選ばれる。
糖転移酵素の存在下で、糖ドナーのグリコシル基をテトラシクロトリテルペン系化合物の
C3位の1番目のグリコシル基に転移させ、
グリコシル化されたテトラシクロトリテルペン系化合物を形成し、
ここで、前記の糖転移酵素は、
配列番号39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、90、92、94、96、98、100、116、118、120、122、または124で示される糖転移酵素またはその誘導体ポリペプチドから選ばれる。
(a)配列番号4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、90、92、94、96、98、100、116、118、120、122、または124のうちの任意の1本で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(b)配列番号4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、90、92、94、96、98、100、116、118、120、122、または124にタグ配列、シグナル配列または分泌シグナル配列を付加したもので、かつ糖転移酵素活性を有する誘導体ポリペプチド;
(c)アミノ酸配列の配列番号4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、90、92、94、96、98、100、116、118、120、122、または124のうちの任意の1本で示されるアミノ酸配列との相同性が≧95%で、かつ糖転移酵素活性を有する誘導体ポリペプチド。もう一つの好適な例において、前記の糖ドナーは、UDP-グルコース、ADP-グルコース、TDP-グルコース、CDP-グルコース、GDP-グルコース、UDP-アセチルグルコース、ADP-アセチルグルコース、TDP-アセチルグルコース、CDP-アセチルグルコース、GDP-アセチルグルコース、UDP-キシロース、ADP-キシロース、TDP-キシロース、CDP-キシロース、GDP-キシロース、UDP-ガラクツロン酸、ADP-ガラクツロン酸、TDP-ガラクツロン酸、CDP-ガラクツロン酸、GDP-ガラクツロン酸、UDP-ガラクトース、ADP-ガラクトース、TDP-ガラクトース、CDP-ガラクトース、GDP-ガラクトース、UDP-アラビノース、ADP-アラビノース、TDP-アラビノース、CDP-アラビノース、GDP-アラビノース、UDP-ラムノース、ADP-ラムノース、TDP-ラムノース、CDP-ラムノース、GDP-ラムノース、UDP-キシロース、ADP-キシロース、TDP-キシロース、CDP-キシロース、GDP-キシロース、あるいはほかのヌクレオシド二リン酸六炭糖またはヌクレオシド二リン酸五炭糖、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるヌクレオシド二リン酸糖を含む。
もう一つの好適な例において、前記の糖ドナーは、UDP-グルコース、UDP-ガラクツロン酸、UDP-ガラクトース、UDP-アラビノース、UDP-ラムノース、UDP-キシロース、あるいはほかのウリジン二リン酸六炭糖またはウリジン二リン酸五炭糖、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるウリジン二リン酸(UDP)糖を含む。もう一つの好適な例において、前記単離されたポリペプチドは、以下の1種または複数種の反応を触媒するため、あるいは下記の1種類または2種類以上の反応を触媒する触媒製剤の製造のために使用される。
(A)
もう一つの好適な例において、R1〜R4が置換された化合物は、下記表に示されるものである。
前記のR1がHで、R2がOHで、R3およびR4がグルコシル基である場合、前記の式(II)化合物はジペノサイドLXXVで、
前記のR1がHで、R2がOHで、R3がグルコシル基で、R4がキシロシル基である場合、前記の式(II)化合物はジペノサイドXIIIで、
R1およびR2が共にHで、R3がグルコシル基である場合、前記の式(I)化合物はジンセノサイドDMGで、
R1およびR2が共にHで、R3およびR4がグルコシル基である場合、前記の式(II)化合物はサポニンDMGG(20-O-β-(D-グルコピラノシル)-β-(D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオール)(20-O-β-(D-glucopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)- dammarenediol)で、
R1およびR2が共にHで、R3がグルコシル基で、R4がキシロシル基である場合、前記の式(II)化合物はサポニンDMGX(20-O-β-(D-キシロピラノシル)-β-(D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオール)(20-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)- dammarenediol)で、
R1がグルコシル基で、R2がOHで、R3がグルコシル基である場合、前記の式(I)化合物はジンセノサイドF2(F2)で、
R1がグルコシル基で、R2がOHで、R3およびR4がグルコシル基である場合、前記の式(II)化合物はジペノサイドXVIIで、
R1がグルコシル基で、R2がOHで、R3がグルコシル基で、R4がキシロシル基である場合、前記の式(II)化合物はジペノサイドIXで、
R1が2つのグルコシル基(Glc(2-1)Glc)で、R2がOHで、R3がグルコシル基である場合、前記の式(I)化合物はジンセノサイドRdで、
R1が2つのグルコシル基(Glc(2-1)Glc)で、R2がOHで、R3およびR4がグルコシル基である場合、前記の式(II)化合物はジンセノサイドRb1で、あるいは
R1が2つのグルコシル基(Glc(2-1)Glc)で、R2がOHで、R3がグルコシル基で、R4がキシロシル基である場合、前記の式(II)化合物はジンセノサイドRb3で、
前記のR1がHで、R2がOHで、R3がグルコシル基で、R4がアラビノシル基である場合、前記の式(II)化合物はジンセノサイドF3で、
(B)
R1がHで、R2およびR3がグルコシル基である場合、前記の式(IV)化合物はノトギンセノシドUで、R1およびR2がグルコシル基である場合、前記の式(III)化合物はジンセノサイドRg1(Rg1)で、あるいは
R1、R2およびR3がグルコシル基である場合、前記の式(IV)化合物はノトギンセノシドR3(R3)で、
(C)
R1がHで、R2およびR3がグルコシル基で、R4がキシロシル基である場合、前記の式(VI)化合物はノトギンセノシドR1で、
R1がHで、R2およびR3がグルコシル基で、R4がグルコシル基である場合、前記の式(VI)化合物はサポニン20-O-グルコシルジンセノサイドRfで、
R1およびR2がHで、R3がグルコシル基である場合、前記の式(V)化合物はジンセノサイドRh1で、
R1およびR2がHで、R3がグルコシル基で、R4がキシロシル基である場合、前記の式(VI)化合物はノトギンセノシドR2で、R1およびR2がHで、R3およびR4がグルコシル基である場合、前記の式(VI)化合物はジンセノサイドRfである。
(D)
R1がグルコシル基で、R2がHで、R3がOHで、R4がグルコシル基である場合、式(VII)化合物はF2で、
R1がグルコシル基で、R2がHで、R3がOHで、R4が2つのグルコシル基である場合、式(VII)化合物はジペノサイドXVIIで、
R1がグルコシル基で、R2がHで、R3がOHで、R4が1つのグルコシル基に1つのキシロシル基で伸長したものである場合、式(VII)化合物はジペノサイドIXで、
基質の(VII)化合物がRh2である場合、産物の式(VIII)化合物はRg3で、基質の(VII)化合物がF2である場合、産物の式(VIII)化合物はRdで、基質の(VII)化合物がジペノサイドXVIIである場合、産物の式(VIII)化合物はRb1で、基質の(VII)化合物がジペノサイドIXである場合、産物の式(VIII)化合物はRb3である。
(E)
R1が2つのグルコシル基で、R2がHで、R3がOHで、R4がグルコシル基である場合、式(IX)化合物はRdである。
もう一つの好適な例において、前記反応式における(I)、(III)、(V)、(VII)、(IX)化合物は、S配置またはR配置のダンマラン型テトラシクロトリテルペン系化合物、ラノスタン型テトラシクロトリテルペン系化合物、アポチルカラン(apotirucallane)型テトラシクロトリテルペン系化合物、チルカラン型テトラシクロトリテルペン系化合物、シクロアルタン型テトラシクロトリテルペン系化合物、ククルビタン型テトラシクロトリテルペン系化合物、またはメリアカン型テトラシクロトリテルペン系化合物を含むが、これらに限定されない。
もう一つの好適な例において、前記方法は、さらに、
糖ドナーおよび本発明の第三の側面に記載のポリペプチドまたはその誘導体ポリペプチドの存在下で、前記の式(I)化合物を前記の式(II)化合物に、あるいは前記の式(III)化合物を前記の式(IV)化合物に、あるいは前記の式(V)化合物を前記の式(VI)化合物に、あるいは前記の式(VII)化合物を前記の式(VIII)化合物に、あるいは前記の式(IX)化合物を前記の式(IX)化合物に転化させる工程を含む。
前記のポリペプチドまたはその誘導体ポリペプチドを同時に触媒反応に入れることを含む。
もう一つの好適な例において、前記の方法は、さらに、糖転移酵素をコードするヌクレオチド配列をダンマレンジオールおよび/またはプロトパナキサジオールおよび/またはプロトパナキサトリオールの合成代謝経路における鍵遺伝子と宿主細胞において共発現させ、前記の式(II)、(IV)、(VI)、(VIII)、または(X)化合物を得ることを含む。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は酵母菌または大腸菌である。
もう一つの好適な例において、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号3、5、7、13、15、17、19、21、23、25、27、29、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、89、91、93、95、97、99、115、117、119、121、または123で示される。
もう一つの好適な例において、前記方法は、さらに、反応系に酵素活性を調節する添加物を提供することを含む。
もう一つの好適な例において、前記の酵素活性を調節するための添加物は、Ca2+、Co2+、Mn2+、Ba2+、Al3+、Ni2+、Zn2+、またはFe2+からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の酵素活性を調節する添加物は、Ca2+、Co2+、Mn2+、Ba2+、Al3+、Ni2+、Zn2+、またはFe2+を生成することができる物質である。
もう一つの好適な例において、反応系のpHは、pH4.0〜10.0で、好ましくはpH5.5〜9.0である。
もう一つの好適な例において、反応系の温度は、10℃〜105℃で、好ましくは20℃〜50℃である。
もう一つの好適な例において、前記のダンマレンジオールの合成代謝経路における鍵遺伝子は、ダンマレンジオール合成酵素遺伝子を含むが、これに限定されない。
もう一つの好適な例において、前記のジンセノサイドの合成代謝経路における鍵遺伝子は、ダンマレンジオール合成酵素遺伝子、シトクロムP450 CYP716A47遺伝子、P450 CYP716A47の還元酵素遺伝子、およびシトクロムP450 CYP716A53V2遺伝子およびその還元酵素ならびにテトラシクロトリテルペンC20位の糖転移酵素UGTPg1、あるいはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
もう一つの好適な例において、前記グリコシル触媒反応の基質は、式(I)、(III)、(V)、(VII)、(IX)化合物で、かつ前記の産物はそれぞれ(II)、(IV)、(VI)、(VIII)、(X)化合物である。
あるいは、前記の式(I)化合物はジンセノサイドDMGで、かつ式(II)化合物は新規なジンセノサイドDMGG(20-O-β-(D-グルコピラノシル)-β-(D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオール)(20-O-β-(D-glucopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-dammarenediol)で、
あるいは、前記の式(I)化合物はジンセノサイドF2で、かつ式(II)化合物はジペノサイドXVII(3-O-β-(D-グルコピラノシル)-20-O-β-(D-グルコピラノシル)-β-(D-グルコピラノシル)-プロトパナキサジオール)(3-O-β-(D-glucopyranosyl)-20-O-β-(D-glucopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl) -protopanaxadiol)で、
あるいは、前記の式(I)化合物はジンセノサイドRdで、かつ式(II)化合物はジンセノサイドRb1(3-O-β-(D-グルコピラノシル)-β-(D-グルコピラノシル)-20-O-β-(D-グルコピラノシル)-β-(D-グルコピラノシル)-プロトパナキサジオール)(3-O-β-(D-glucopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-20-O-β-(D-glucopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl) -protopanaxadiol)で、
あるいは、前記の式(I)化合物はジンセノサイドRdで、かつ式(II)化合物はジンセノサイドRb3(3-O-β-(D-グルコピラノシル)-β-(D-グルコピラノシル)-20-O-β-(D-キシロピラノシル)-β-(D-グルコピラノシル)-プロトパナキサジオール)(3-O-β-(D-glucopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-20-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl) -protopanaxadiol)で、
あるいは、前記の式(I)化合物はジンセノサイドCKで、かつ式(II)化合物はジペノサイドXIIIで、
あるいは、前記の式(I)化合物はジンセノサイドDMGで、かつ式(II)化合物はジンセノサイドDMGX(20-O-β-(D-キシロピラノシル)-β-(D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオール)(20-O-β-(D-glucopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-dammarenediol)で、
あるいは、前記の式(I)化合物はジンセノサイドF2で、かつ式(II)化合物はジペノサイドIXで、
あるいは、前記の式(I)化合物はジンセノサイドCKで、かつ式(II)化合物はジンセノサイドF3である。もう一つの好適な例において、前記の式(III)化合物はジンセノサイドF1で、かつ式(IV)化合物はノトギンセノシドU(20-O-β-(D-グルコピラノシル)-β-(D-グルコピラノシル)-プロトパナキサトリオール)(20-O-β-(D-glucopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxatriol)である。
もう一つの好適な例において、前記の式(V)化合物はジンセノサイドRg1で、かつ式(VI)化合物はノトギンセノシドR1(6-O-β-(D-キシロピラノシル)-β-(D-グルコピラノシル)-20-O-β-(D-グルコピラノシル)-プロトパナキサトリオール)(6-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-20-O-β-(D-glucopyranosyl) -protopanaxatriol)で、
あるいは、前記の式(V)化合物はジンセノサイドRg1で、かつ式(VI)化合物は20-O-グルコシルジンセノサイドRf(20-O-Glucosylginsenoside Rf)で、
あるいは、前記の式(V)化合物はジンセノサイドRh1で、かつ式(VI)化合物はノトギンセノシドR2(6-O-β-(D-キシロピラノシル)-β-(D-グルコピラノシル)-プロトパナキサトリオール)(6-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxatriol)で、
あるいは、前記の式(V)化合物はジンセノサイドRh1で、かつ式(VI)化合物はジンセノサイドRfである。
もう一つの好適な例において、前記の式(VII)化合物はRh2である場合、産物の式(VIII)化合物はRg3で、
前記の式(VII)化合物はF2である場合、産物の式(VIII)化合物はRdで、
前記の式(VII)化合物はジペノサイドXVIIである場合、産物の式(VIII)化合物はRb1で、
前記の式(VII)化合物はジペノサイドIXである場合、産物の式(VIII)化合物はRb3である。
前記の式(IX)化合物はRdである場合、産物の式(X)化合物は3-O-β-(D-キシロピラノシル)-β-(D-グルコピラノシル)-CK(3-O-β-(D-xylopyranosyl)-β-(D-glucopyranosyl)-CK)である。
もう一つの好適な例において、前記の細胞は、原核細胞または真核細胞である。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は真核細胞で、たとえば酵母細胞または植物細胞である。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は原核細胞で、たとえば大腸菌である。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は、オタネニンジン細胞である。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は、自然で式(II) 、(IV)、(VI)、(VII)、(X)化合物を生成する細胞ではない。
もう一つの好適な例において、前記のダンマレンジオールの合成代謝経路における鍵遺伝子は、ダンマレンジオール合成酵素遺伝子を含むが、これに限定されない。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞に含まれるジンセノサイドF1の合成代謝経路における鍵遺伝子は、ダンマレンジオール合成酵素遺伝子、シトクロムP450 CYP716A47遺伝子、P450 CYP716A47の還元酵素遺伝子、シトクロムP450 CYP716A53V2遺伝子およびテトラシクロトリテルペンC20位の糖転移酵素UGTPg1、あるいはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
本発明の第八の側面では、本発明の第七の側面に記載の宿主細胞の使用であって、酵素触媒試薬を製造するため、あるいは糖転移酵素を生成するため、あるいは触媒細胞として式(II)、(IV)、(VI)、(VIII)または(X)化合物を生成するために用いられる使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の遺伝子操作された宿主細胞は、オタネニンジン細胞である。
もう一つの好適な例において、前記の遺伝子操作された宿主細胞は、サンシチニンジン細胞である。
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記(たとえば実施例)の具体的に記述された各技術特徴は互いに組み合わせ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
本発明者は幅広く深く研究したところ、初めて、新規な糖転移酵素、それに相応する糖転移触媒部位を提供した。具体的に、本発明の糖転移酵素GT29-32(配列番号4)、GT29-33(配列番号6)、GT29-34(配列番号8)、GT29-4(配列番号12)、GT29-5(配列番号14)、GT29-7(配列番号16)、GT29-9(配列番号18),GT29-11(配列番号20)、GT29-13(配列番号22)、GT29-17(配列番号24)、GT29-18(配列番号26)、GT29-19(配列番号116)、GT29-20(配列番号118)、GT29-21(配列番号120)、GT29-22(配列番号122)、GT29-23(配列番号124)、GT29-24(配列番号28)、GT29-25(配列番号30)、GT29-36(配列番号90)、GT29-37(配列番号92)、GT29-42(配列番号94)、GT29-43(配列番号96)、GT29-45(配列番号98)、GT29-46(配列番号100)、PNUGT29-1(配列番号39)、PNUGT29-2(配列番号41)、PNUGT29-3(配列番号43)、PNUGT29-4(配列番号45)、PNUGT29-5(配列番号47)、PNUGT29-6(配列番号49)、PNUGT29-7(配列番号51)、PNUGT29-8(配列番号53)、PNUGT29-9(配列番号55)、PNUGT29-14(配列番号57)、PNUGT29-15(配列番号59)は特異的かつ効率的にテトラシクロトリテルペン系化合物である基質のC-20位、C-6位またはC3位の1番目のグリコシル基の水酸基のグリコシル化あるいは元のグリコシル基の置換を触媒し、糖鎖を伸長させることができる。
本明細書で用いられるように、用語「活性ポリペプチド」、「本発明のポリペプチドおよびその誘導体ポリペプチド」、「本発明の酵素」、「糖転移酵素」は、入れ替えて使用することができ、いずれもGT29-32(配列番号4)、GT29-33(配列番号6)、GT29-34(配列番号8)、GT29-4(配列番号12)、GT29-5(配列番号14)、GT29-7(配列番号16)、GT29-9(配列番号18)、GT29-11(配列番号20)、GT29-13(配列番号22)、GT29-17(配列番号24)、GT29-18(配列番号26)、GT29-19(配列番号116)、GT29-20(配列番号118)、GT29-21(配列番号120)、GT29-22(配列番号122)、GT29-23(配列番号124)、GT29-24(配列番号28)、GT29-25(配列番号30)、GT29-36(配列番号90)、GT29-37(配列番号92)、GT29-42(配列番号94)、GT29-43(配列番号96)、GT29-45(配列番号98)、GT29-46(配列番号100)、PNUGT29-1(配列番号39)、PNUGT29-2(配列番号41)、PNUGT29-3(配列番号43)、PNUGT29-4(配列番号45)、PNUGT29-5(配列番号47)、PNUGT29-6(配列番号49)、PNUGT29-7(配列番号51)、PNUGT29-8(配列番号53)、PNUGT29-9(配列番号55)、PNUGT29-14(配列番号57)、PNUGT29-15(配列番号59)のポリペプチドおよびその誘導体ポリペプチドを指す。
本明細書で用いられるように、「単離されたポリペプチド」または「活性ポリペプチド」とは、ポリペプチドに実質的に自然でそれに関連するほかのタンパク質、脂質、糖類またはほかの物質が含まれないことである。当業者は標準のタンパク質精製技術によって前記ポリペプチドを精製することができる。実質的に純粋なポリペプチドは、非還元ポリアクリルアミドゲルでは単一のメインバンドが現れる。前記ポリペプチドの純度は、アミノ酸配列でさらに分析することもできる。
本発明は、さらに、前記ポリペプチドの断片、誘導体および類似体を含む。本明細書で用いられるように、用語の「断片」、「誘導体」および「類似体」とは、実質的に前記ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を維持するポリペプチドである。
(A)
もう一つの好適な例において、前記の多糖は、Glc(2-1)Glc、Glc(6-1)Glc、Glc(6)Ac、Glc(2-1)Rha、Glc(6-1)Arap、Glc(6-1)Xyl、Glc(6-1)Araf、Glc(3-1)Glc(3-1)、Glc(2-1) Glu(6)Ac、Glc(6-1)Arap(4-1)Xyl、Glc(6-1)Arap(2-1)Xyl、またはGlc(6-1)Arap(3-1)Xylなどの2〜4個の単糖からなる多糖を含む。
R1〜R4が置換された化合物は、下記の表に示す。
R1およびR2が共にHで、R3がグルコシル基である場合、前記の式(I)化合物はジンセノサイドDMGで、
R1がグルコシル基で、R2がOHで、R3がグルコシル基である場合、前記の式(I)化合物はジンセノサイドF2(F2)で、あるいは
R1が2つのグルコシル基(Glc(2-1)Glc)で、R2がOHで、R3がグルコシル基である場合、前記の式(I)化合物はジンセノサイドRdで、
(B)
(C)
R1およびR2がHで、R3がグルコシル基である場合、前記の式(V)化合物はジンセノサイドRh1である。(D)
R1がグルコシル基で、R2がHで、R3がOHで、R4がグルコシル基である場合、式(VII)化合物はF2で、
R1がグルコシル基で、R2がHで、R3がOHで、R4が2つのグルコシル基である場合、式(VII)化合物はジペノサイドXVIIで、
R1がグルコシル基で、R2がHで、R3がOHで、R4が1つのグルコシル基に1つのキシロシル基で伸長したものである場合、式(VII)化合物はジペノサイドIXで、
(E)
R1が2つのグルコシル基で、R2がHで、R3がOHで、R4がグルコシル基である場合、式(IX)化合物はRdである。
用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでもよく、さらに付加のコードおよび/または非コード配列を含むポリヌクレオチドでもよい。
本発明のGT29-32、GT29-33、GT29-34 、GT29-4、GT29-5、GT29-7、GT29-9、GT29-11、GT29-13、GT29-17、GT29-18、GT29-19、GT29-20、GT29-21、GT29-22、GT29-23、GT29-24、GT29-25、GT29-32、GT29-33、GT29-34、GT29-36、GT29-37、GT29-42、GT29-43、GT29-45、GT29-46、PNUGT29-1、PNUGT29-2、PNUGT29-3、PNUGT29-4、PNUGT29-5、PNUGT29-6、PNUGT29-7、PNUGT29-8、PNUGT29-9、PNUGT29-14またはPNUGT29-15のヌクレオチド全長配列あるいはその断片は、通常、PCR増幅法、組み換え法または人工合成の方法で得られる。PCR増幅法について、本発明で公開された関連のヌクレオチド配列、特に読み枠によってプライマーを設計し、市販のcDNAライブラリーまたは当業者に既知の通常の方法によって調製されるcDNAライブラリーを鋳型とし、増幅して関連配列を得る。配列が長い場合、通常、2回または2回以上のPCR増幅を行った後、各回の増幅で得られた断片を正確な順でつなげる必要がある。
また、特に断片の長さが短い場合、人工合成の方法で関連配列を合成してもよい。通常、まず多数の小さい断片を合成し、そして連接させることにより、配列の長い断片を得ることができる。
現在、本発明のタンパク質(またはその断片、あるいはその誘導体)をコードするDNA配列は全部化学合成で獲得することがすでに可能である。さらに、このDNA配列を本分野で周知の各種の既知のDNA分子(あるいはベクターなど)や細胞に導入してもよい。また、化学合成で本発明のタンパク質配列に変異を導入することもできる。
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、および本発明のベクターまたはGT29-32、GT29-33、GT29-34 、GT29-4、GT29-5、GT29-7、GT29-9、GT29-11、GT29-13、GT29-17、GT29-18、GT29-19、GT29-20、GT29-21、GT29-22、GT29-23、GT29-24、GT29-25、GT29-32、GT29-33、GT29-34、GT29-36、GT29-37、GT29-42、GT29-43、GT29-45、GT29-46、PNUGT29-1、PNUGT29-2、PNUGT29-3、PNUGT29-4、PNUGT29-5、PNUGT29-6、PNUGT29-7、PNUGT29-8、PNUGT29-9、PNUGT29-14またはPNUGT29-15のタンパク質のコード配列を使用して遺伝子工学によって生成した宿主細胞、ならびに組み換え技術によって本発明に係るポリペプチドを生成する方法にも関する。
(2)適切な培地において宿主細胞を培養する;
本発明において、GT29-32、GT29-33、GT29-34 、GT29-4、GT29-5、GT29-7、GT29-9、GT29-11、GT29-13、GT29-17、GT29-18、GT29-19、GT29-20、GT29-21、GT29-22、GT29-23、GT29-24、GT29-25、GT29-32、GT29-33、GT29-34、GT29-36、GT29-37、GT29-42、GT29-43、GT29-45、GT29-46、PNUGT29-1、PNUGT29-2、PNUGT29-3、PNUGT29-4、PNUGT29-9、PNUGT29-14またはPNUGT29-15ポリヌクレオチド配列は組み換え発現ベクターに挿入してもよい。用語「組み換え発現ベクター」とは、本分野でよく知られている細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物ウイルス、たとえばアデノウイルス、レトロウイルスまたはほかのベクターである。宿主体内で安定して複製することができれば、どんなプラスミドおよびベクターでも使用できる。発現ベクターの重要な特徴の一つは、通常、複製起点、プロモーター、マーカー遺伝子および翻訳制御エレメントを含むことである。
上記の適切なDNA配列及び適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターは、適切な宿主細胞を形質転換し、タンパク質を発現するようにすることができる。
宿主細胞は、原核細胞、たとえば細菌細胞、あるいは、低等真核細胞、たとえば酵母細胞、あるいは、高等真核細胞、たとえば哺乳動物細胞でもよい。代表例として、大腸菌、ストレプトマイセス属、ネズミチフス菌のような細菌細胞、酵母のような真菌細胞、植物細胞、ミバエS2若しくはSf9のような昆虫細胞、CHO、COS、293細胞またはBowesメラノーマ細胞のような動物細胞などがある。
当業者は、どうやって適切なベクター、プロモーター、エンハンサーおよび宿主細胞を選択するか、よくわかる。
DNA組み換えによる宿主細胞の形質転換は当業者に熟知の通常の技術で行ってもよい。宿主が原核細胞、たとえば大腸菌である場合、DNAを吸収できるコンピテントセルは指数成長期後収集でき、CaCl2法で処理し、用いられる工程は本分野では周知のものである。もう一つの方法は、MgCl2を使用する。必要により、形質転換はエレクトロポレーションの方法でもよい。宿主が真核生物の場合、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションのような通常の機械方法、リポフェクションなどのDNAトランスフェクションの方法が用いられる。
上記の方法における組み換えポリペプチドは細胞内または細胞膜で発現し、あるいは細胞外に分泌することができる。必要であれば、その物理・化学的特性およびほかの特性を利用して各種の単離方法で組み換えタンパク質を単離・精製することができる。これらの方法は、本分野の技術者に熟知である。これらの方法の例として、通用の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理(塩析法)、遠心、浸透圧ショック、超音波処理、超遠心、分子篩クロマトグラフィー(ゲルろ過)、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)およびほかの各種の液体クロマトグラフィー技術、ならびにこれらの方法の組合せを含むが、これらに限定されない。
本発明に係る活性ポリペプチドまたは糖転移酵素は、既知のジンセンサポニンならびに新規なジンセンサポニンおよびその誘導体の人工合成に使用可能で、CK、DMG、F2、Rd、F1、Rh1およびRg1などをそれぞれジンセノサイドRg3、ジンセノサイドRd、ジンセノサイドRb1、ジンセノサイドRb3、サポニンDMGG、サポニンDMGX、ジペノサイドLXXV、ジペノサイドXVII、ジペノサイドXIII、ジペノサイドIX、ノトギンセノシドUおよび、ノトギンセノシドR1、およびノトギンセノシドR2、ノトギンセノシドR3、3-O-β-(D-キシロピラノシル)-β-(D-グルコピラノシル)-PPD、3-O-β-(D-キシロピラノシル)-β-(D-グルコピラノシル)-CK、20-O-グルコシルジンセノサイドRfおよびジンセノサイドF3に転化させることができる。
(1)本発明の糖転移酵素は、特異的にかつ効率的にグルコースをテトラシクロトリテルペン系化合物の基質のC-20位の1番目のグリコシル基/あるいはC-6位またはC-3位の1番目のグリコシル基にグリコシル基を転移させるか、グリコシル基を置換させることによって、糖鎖を伸長させることができる。
(3)ジンセノサイドRb1は神経細胞の保護および抗炎症・抗酸化の効果を有し、ジンセノサイドRb3は心筋虚血の緩和および抗うつの効果を有する。ノトギンセノシドR1はサンシチニンジンサポニンの主な活性成分で、抗炎症の効果を有する。ノトギンセノシドR2は神経の保護効果を有する。
オタネニンジンのRNAを抽出して逆転写を行い、オタネニンジンのcDNAを得た。このcDNAを鋳型としてプライマー対1(配列番号1と配列番号2)またはプライマー対2(配列番号9と配列番号10)またはプライマー対3(配列番号113と配列番号114)を使用してPCR増幅を行い、1.4-1.5 kbの増幅産物を得た。DNAポリメラーゼは、タカラバイオ株式会社の高正確性のKOD DNAポリメラーゼを使用した。PCR産物はアガロースゲル電気泳動によって検出された。
GT29-33:糖転移酵素遺伝子GT29-33は、448個のアミノ酸を含むタンパク質GT29-33をコードし、配列表における配列番号6で示されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、50.0kDaで、等電点pIが6.77である。この糖転移酵素はすでに機能が同定された糖転移酵素UGTPg29のアミノ酸配列との一致性が90%である。
GT29-4:糖転移酵素遺伝子GT29-4は、446個のアミノ酸を含むタンパク質GT29-4をコードし、配列表における配列番号12で示されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、49.8kDaで、等電点pIが5.63である。この糖転移酵素はすでに機能が同定された糖転移酵素UGTPg29のアミノ酸配列との一致性が92%である。
GT29-7:糖転移酵素遺伝子GT29-7は、446個のアミノ酸を含むタンパク質GT29-7をコードし、配列表における配列番号16で示されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、49.8kDaで、等電点pIが5.8である。この糖転移酵素はすでに機能が同定された糖転移酵素UGTPg29のアミノ酸配列との一致性が92%である。
GT29-11:糖転移酵素遺伝子GT29-11は、446個のアミノ酸を含むタンパク質GT29-11をコードし、配列表における配列番号20で示されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、49.9kDaで、等電点pIが5.90である。この糖転移酵素はすでに機能が同定された糖転移酵素UGTPg29のアミノ酸配列との一致性が91%である。
GT29-17:糖転移酵素遺伝子GT29-17は、442個のアミノ酸を含むタンパク質GT29-17をコードし、配列表における配列番号24で示されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、49.3kDaで、等電点pIが5.35である。この糖転移酵素はすでに機能が同定された糖転移酵素UGTPg29のアミノ酸配列との一致性が93%である。
GT29-24:糖転移酵素遺伝子GT29-24は、446個のアミノ酸を含むタンパク質GT29-24をコードし、配列表における配列番号28で示されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、49.9kDaで、等電点pIが5.93である。この糖転移酵素はすでに機能が同定された糖転移酵素UGTPg29のアミノ酸配列との一致性が91%である。
GT29-19:糖転移酵素遺伝子GT29-19は、442個のアミノ酸を含むタンパク質GT29-19をコードし、配列表における配列番号116で示されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、49.1kDaで、等電点pIが5.47である。
GT29-21:糖転移酵素遺伝子GT29-21は、442個のアミノ酸を含むタンパク質GT29-21をコードし、配列表における配列番号120で示されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、49.1kDaで、等電点pIが5.80である。
GT29-23:糖転移酵素遺伝子GT29-23は、442個のアミノ酸を含むタンパク質GT29-23をコードし、配列表における配列番号124で示されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、49.0kDaで、等電点pIが5.61である。
GT29-37:糖転移酵素遺伝子GT29-37は、442個のアミノ酸を含むタンパク質GT29-37をコードし、配列表における配列番号104で示されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、49.1kDaで、等電点pIが5.62である。
GT29-43:糖転移酵素遺伝子GT29-43は、442個のアミノ酸を含むタンパク質GT29-43をコードし、配列表における配列番号108で示されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、49.1kDaで、等電点pIが5.78である。
GT29-46:糖転移酵素遺伝子GT29-46は、442個のアミノ酸を含むタンパク質GT29-46をコードし、配列表における配列番号112で示されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、49.1kDaで、等電点pIが5.48である。
実施例1で構築されたGT29-32、GT29-33およびGT29-34遺伝子を含むプラスミドGT29-32-pMD18T、GT29-33-pMD18TおよびGT29-34-pMD18Tを鋳型とし、表1で示されるプライマーで標的遺伝子GT29-32、GT29-33およびGT29-34を増幅した。
実施例2における組み換え大腸菌BL21-GT29-32、BL21-GT29-33およびBL21-GT29-34の細胞分解液の上清を粗製酵素液として糖転移反応を行い、ブランクベクターpET28aで形質転換された組み換え大腸菌の細胞分解液を対照とした。
図2に示すように、プロトパナキサジオール型ジンセノサイドCKを糖アクセプターとし、UDP-グルコースを糖ドナーとする場合、GT29-32およびGT29-34は触媒して新規な産物を生成させることができた。
そのため、GT29-32およびGT29-34はCKのC20-O-Glcにおける1分子のグルコースの伸長を触媒してジンセンサポニンのジペノサイドLXXVを生成させることができる。UDP-キシロースを糖ドナーとする場合、GT29-32はRdからの3つの産物の生成を触媒することができた。ここで、1つの産物はTLCにおける移動度がRb3と一致し、すなわち、GT29-32はC20-O-Glcに1分子のキシロースで伸長してRb3を生成させることができた(図2)。HPLCの結果とTLCの結果は一致し、GT29-32はRdおよびUDP-キシロースから触媒して3つの産物を生成させることができた(図4)。
プロトパナキサジオール型ジンセノサイドCKを糖アクセプターとし、UDP-アラビノースを糖ドナーとする場合、GT29-32、GT29-33およびGT29-34は触媒してCK-C-20の1番目のグリコシル基で1つのアラビノースで伸長してジンセノサイドF3を生成させることができたが、中でも、GT29-32の活性が最も強かった(図17)。
実施例1で構築されたGT29-4、GT29-5、GT29-7、GT29-9、GT29-11、GT29-13、GT29-17、GT29-18、GT29-24およびGT29-25遺伝子を含むプラスミドGT29-4-pMD18T、GT29-5-pMD18T、GT29-7-pMD18T、GT29-9-pMD18T、GT29-11-pMD18T、GT29-13-pMD18T、GT29-17-pMD18T、GT29-18-pMD18T、GT29-24-pMD18TおよびGT29-25-pMD18Tを鋳型とし、表1で示されるプライマーで標的遺伝子GT29-4、GT29-5、GT29-7、GT29-9、GT29-11、GT29-13、GT29-17、GT29-18、GT29-24およびGT29-25を増幅した。発現ベクターpET28a(Merck社から購入)をNcoI/SalIで酵素切断した後、GT29-11、GT29-13、GT29-17、GT29-18、GT29-24およびGT29-25をpET28aにクローニングし(ワンステップクローニングキット、Vazyme Biotech社から購入)、大腸菌発現ベクターGT29-4-pET28a、GT29-5-pET28a、GT29-7-pET28a、GT29-9-pET28a、GT29-11-pET28a、GT29-13-pET28a、GT29-17-pET28a、GT29-18-pET28a、GT29-24-pET28aおよびGT29-25-pET28aを構築した。
実施例2における組み換え大腸菌BL21-GT29-4、BL21-GT29-5、BL21-GT29-7、BL21-GT29-9、BL21-GT29-11、BL21-GT29-13、BL21-GT29-17、BL21-GT29-18、BL21-GT29-24およびBL21-GT29-25の細胞分解液の上清を粗製酵素液として糖転移反応を行い、ブランクベクターpET28aで形質転換された組み換え大腸菌の細胞分解液を対照とした。
図10に示すように、GT29-24およびGT29-25は、プロトパナキサジオール型ジンセノサイドRh2を糖アクセプターとし、UDP-グルコースを糖ドナーとし、触媒してRh2のC-3位のグリコシル基で1つのグルコシル基で伸長してジンセノサイドRg3を生産することができた。基質をF2に変更した場合、GT29-24およびGT29-25はまた触媒してF2のC-3位のグリコシル基で1つのグルコシル基で伸長してジンセノサイドRdを生産することができた。
サンシチニンジンのRNAを抽出して逆転写を行い、サンシチニンジンのcDNAを得た。このcDNAを鋳型としてプライマー対1(配列番号82と配列番号83)、プライマー対2(配列番号84と配列番号85)、プライマー対3(配列番号84と配列番号86)、プライマー対4(配列番号87と配列番号88)を使用してPCR増幅を行い、1.4-1.5 kbの増幅産物を得た。DNAポリメラーゼは、タカラバイオ株式会社の高正確性のKOD DNAポリメラーゼを使用した。PCR産物はアガロースゲル電気泳動によって検出された。
PNUGT29-2:糖転移酵素遺伝子PNUGT29-2は、442個のアミノ酸を含むタンパク質PNUGT29-2をコードし、配列表における配列番号41で示されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、49.118kDaで、等電点pIが6.20である。
PNUGT29-4:糖転移酵素遺伝子PNUGT29-4は、447個のアミノ酸を含むタンパク質PNUGT29-4をコードし、配列表における配列番号45で示されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、49.715kDaで、等電点pIが6.58である。
PNUGT29-6:糖転移酵素遺伝子PNUGT29-6は、447個のアミノ酸を含むタンパク質PNUGT29-6をコードし、配列表における配列番号49で示されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、49.657kDaで、等電点pIが6.70である。
PNUGT29-8:糖転移酵素遺伝子PNUGT29-8は、447個のアミノ酸を含むタンパク質PNUGT29-8をコードし、配列表における配列番号53で示されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、49.657kDaで、等電点pIが6.70である。
PNUGT29-14:糖転移酵素遺伝子PNUGT29-14は、447個のアミノ酸を含むタンパク質PNUGT29-14をコードし、配列表における配列番号57で示されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、49.778kDaで、等電点pIが6.70である。
PNUGT29-15:糖転移酵素遺伝子PNUGT29-15は、447個のアミノ酸を含むタンパク質PNUGT29-15をコードし、配列表における配列番号59で示されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、49.755kDaで、等電点pIが6.63である。
実施例6で構築されたPNUGT29-1、PNUGT29-2、PNUGT29-3、PNUGT29-4、PNUGT29-5、PNUGT29-6、PNUGT29-7、PNUGT29-8、PNUGT29-9、PNUGT29-14およびPNUGT29-15遺伝子を含むプラスミドPNUGT29-1-pMD18T、PNUGT29-2-pMD18T、PNUGT29-3-pMD18T、PNUGT29-4-pMD18T、PNUGT29-5-pMD18T、PNUGT29-6-pMD18T、PNUGT29-7-pMD18T、PNUGT29-8-pMD18T、PNUGT29-9-pMD18T、PNUGT29-14-pMD18TおよびPNUGT29-15-pMD18Tを鋳型とし、表1で示されるプライマーで標的遺伝子PNUGT29-1、PNUGT29-2、PNUGT29-3、PNUGT29-4、PNUGT29-5、PNUGT29-6、PNUGT29-7、PNUGT29-8、PNUGT29-9、PNUGT29-14およびPNUGT29-15を増幅した。実施例2の方法を参照し、組み換え菌株BL21- PNUGT29-1、BL21- PNUGT29-2、BL21- PNUGT29-3、BL21- PNUGT29-4、BL21- PNUGT29-5、BL21- PNUGT29-6、BL21- PNUGT29-7、BL21- PNUGT29-8、BL21- PNUGT29-9、BL21- PNUGT29-14およびBL21- PNUGT29-15を構築してサンプリングしてSDS-PAGE電気泳動およびウエスタンブロットを行った。抗6×Hisタグのウエスタンブロット(図10)では、45-65 kDの間に顕著なバンドがあり、糖転移酵素PNUGT29-1、PNUGT29-2、PNUGT29-3、PNUGT29-4、PNUGT29-5、PNUGT29-6、PNUGT29-7、PNUGT29-8、PNUGT29-9、PNUGT29-14およびPNUGT29-15は大腸菌において少量に可溶性発現したことが示された。
実施例7における組み換え大腸菌BL21- PNUGT29-1、BL21- PNUGT29-2、BL21- PNUGT29-3、BL21- PNUGT29-4、BL21- PNUGT29-5、BL21- PNUGT29-6、BL21- PNUGT29-7、BL21- PNUGT29-8、BL21- PNUGT29-9、BL21- PNUGT29-14およびBL21- PNUGT29-15の細胞分解液の上清を粗製酵素液として糖転移反応を行い、ブランクベクターpET28aで形質転換された組み換え大腸菌の細胞分解液を対照とした。
図12に示すように、プロトパナキサジオール型ジンセノサイドCKを糖アクセプターとし、UDP-グルコースを糖ドナーとする場合、PNUGT29-1、PNUGT29-2、PNUGT29-3、PNUGT29-4、PNUGT29-5、PNUGT29-6、PNUGT29-7、PNUGT29-8、PNUGT29-9、PNUGT29-14、PNUGT29-15は触媒してC-20位のグリコシル基で1つのグルコシル基で伸長してジペノサイドLXXVを生成させることができた。
実施例1で構築されたGT29-19、GT29-20、GT29-21、GT29-22、GT29-23、GT29-36、GT29-37、GT29-42、GT29-43、GT29-45およびGT29-46遺伝子を含むプラスミドGT29-19-pMD18T、GT29-20-pMD18T、GT29-21-pMD18T、GT29-22-pMD18T、GT29-23-pMD18T、GT29-36-pMD18T、GT29-37-pMD18T、GT29-42-pMD18T、GT29-43-pMD18T、GT29-45-pMD18TおよびGT29-46-pMD18Tを鋳型とし、表1で示されるプライマーで標的遺伝子GT29-36、GT29-37、GT29-42、GT29-43、GT29-45およびGT29-46を増幅した。
プロトパナキサジオール型ジンセノサイドRh2を糖アクセプターとし、UDP-グルコースを糖ドナーとする場合、上記糖転移酵素GT29-19、GT29-20、GT29-21、GT29-22、GT29-23、GT29-36、GT29-37、GT29-42、GT29-43、GT29-45およびGT29-46はいずれも触媒してRh2のC-3位のグリコシル基でさらに1つのグルコシル基で伸長してジンセノサイドRg3を生成させることができた。図15では、GT29-45およびGT29-46はRh2から触媒してRg3を生成させることができたことが示された。
図16に示すように、プロトパナキサジオール型ジンセノサイドCKを糖アクセプターとし、UDP-グルコースを糖ドナーとする場合、GT29-45およびGT29-46は触媒してCKのC-20位のグリコシル基でさらに1つのグルコースで伸長してジペノサイドLXXVを生成させることができたが、中でも、GT29-45の活性が最も強かった。
ほかのグリコシルドナーおよび基質を変更した以外、以上の実施例3、5、8を繰り返し、実験結果を表3-表5に示す。
Claims (10)
- in vitroでグリコシル化する方法であって、
糖転移酵素の存在下で、糖ドナーのグリコシル基をテトラシクロトリテルペン系化合物の
C20位および/またはC3位の1番目のグリコシル基に転移させ、
グリコシル化されたテトラシクロトリテルペン系化合物を形成する工程を含み、
ここで、前記糖転移酵素が、配列番号4、6、8、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、98、または100で示される糖転移酵素またはその誘導体ポリペプチドから選ばれる、前記方法。 - in vitroでグリコシル化する方法であって、
糖転移酵素の存在下で、糖ドナーのグリコシル基をテトラシクロトリテルペン系化合物の
C6位の1番目のグリコシル基に転移させ、
グリコシル化されたテトラシクロトリテルペン系化合物を形成する工程を含み、
ここで、前記の糖転移酵素が、
配列番号12、14、16、18、20、22、24、26、28および30で示される糖転移酵素またはその誘導体ポリペプチドから選ばれる、前記方法。 - 前記誘導体ポリペプチドがそれぞれ以下:
(a)配列番号4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、98、または100のうちの任意の1本で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(b)配列番号4、6、8、14、16、18、20、22、24、26、28、30、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、98、または100にタグ配列、シグナル配列または分泌シグナル配列を付加したもので、かつ糖転移酵素活性を有する誘導体ポリペプチド;
(c)アミノ酸配列の配列番号4、6、8、14、16、18、20、22、24、26、28、30、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、98、または100のうちの任意の1本で示されるアミノ酸配列との相同性が≧95%で、かつ糖転移酵素活性を有する誘導体ポリペプチド
からなる群から選ばれる、請求項1または2に記載の方法。 - 単離されたポリペプチドであって、
配列番号4、6、8、28、30、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、98、または100のうちの任意の1本で示されるアミノ酸配列のポリペプチドまたはその誘導体ポリペプチドで、ここで、前記誘導体ポリペプチドは、
(a)配列番号4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、98、または100のうちの任意の1本で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(b)配列番号4、6、8、28、30、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、98、または100にタグ配列、シグナル配列または分泌シグナル配列を付加したもので、かつ糖転移酵素活性を有する誘導体ポリペプチド、
(c)アミノ酸配列の配列番号4、6、8、28、30、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、98、または100のうちの任意の1本で示されるアミノ酸配列との相同性が≧95%で、かつ糖転移酵素活性を有する誘導体ポリペプチド
から選ばれる、前記ポリペプチド。 - 単離されたポリヌクレオチドであって、以下:
(A)請求項4に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(B)配列番号4、6、8、28、30、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、98、または100で表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(C)配列番号3、5、7、27、29、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、97または99で示されるヌクレオチド配列;
(D)配列番号3、5、7、27、29、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、97または99で示されるヌクレオチド配列との相同性が≧95%(好ましくは≧98%)のヌクレオチド配列;
(E)(A)〜(D)のいずれかに記載のヌクレオチド配列と相補的(好ましくは完全相補的)なヌクレオチド配列
からなる群から選ばれる、前記ポリヌクレオチド。 - 請求項5に記載のポリヌクレオチドを含むか、あるいは請求項4に記載の単離されたポリペプチドを発現する、ベクター。
- 請求項4に記載の単離されたポリペプチドの使用であって、以下の1種または複数種の反応を触媒するため、あるいは以下の1種または複数種の反応を触媒する触媒製剤の製造のために使用されることを特徴とする使用:
糖ドナーからのグリコシル基をテトラシクロトリテルペン系化合物の
(i)C6位の1番目のグリコシル基、または
(ii)C20位の1番目のグリコシル基、および/または
(iii)C3位の1番目のグリコシル基
に転移させ、糖鎖を伸長させる反応。 - 請求項6に記載のベクターを含むか、あるいは遺伝子に請求項5に記載のポリヌクレオチドが組み込まれている、遺伝子操作された宿主細胞。
- 酵素触媒試薬を製造するため、あるいは糖転移酵素を生成するため、あるいは触媒細胞として式(II)、(IV)、(VI)、(VIII)または(X)化合物を生成するために用いられる、請求項8に記載の宿主細胞の使用。
- 請求項8に記載の遺伝子操作された宿主細胞を植物に再生させることを含み、前記遺伝子操作された宿主細胞が植物細胞である、遺伝子組換え植物を生成する方法。
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