KR101765369B1 - 돌외 유래의 신규한 당전이효소 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PPD(protopanaxadiol) 계열 또는 PPT(protopanaxatriol) 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 글리코시딕 결합(glycosidic bond)로 연결된 글루코스에 대하여 당전이 활성을 가지는, 신규한 UDP-당전이효소(uridine diphosphate glycosyltransferase) 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

돌외 유래의 신규한 당전이효소 및 이의 용도{A novel glycosyltransferase derived from Dolwoe and use thereof}
본 발명은 PPD(protopanaxadiol) 계열 또는 PPT(protopanaxatriol) 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 글리코시딕 결합(glycosidic bond)로 연결된 글루코스에 대하여 당전이 활성을 가지는, 신규한 UDP-당전이효소(uridine diphosphate glycosyltransferase) 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
진세노사이드는 글리코실화된 다마렌(dammarene) 계열의 4환 구조의 트리테르펜(tetracyclic triterpene)으로서, 진세노사이드는 아글리콘(aglycone)의 구조에 따라 프로토파낙사이다이올계(protopanaxadiol-type, PPD 계열) 진세노사이드, 프로토파낙사트라이올계(protopanaxatriol-type, PPT 계열) 진세노사이드 및 올레아놀린산계(oleanolic acid 계열) 진세노사이드의 세 가지로 분류될 수 있다. 이러한 세 그룹은 다시, 화합물 구조 중 고리의 3번 탄소, 6번 탄소 및 20번 탄소 위치에 글리코시딕 결합(glycosidic bond)에 의해 부착되는 당 모이어티(아글리콘)(sugar moieties(aglycones))의 위치 및 수에 따라 분류된다. 또한, PPD 및 PPT는 다른 수산화 형태(hydroxylation pattern)를 가지고 있다. PPD는 3번, 12번 및 20번 탄소 위치에 -OH 기를 가지고 있는 반면, PPT는 3번, 6번, 12번 및 20번 탄소 위치에 -OH 기를 가지고 있다. 상기 PPD 및 PPT는 글루코스 및 다른 당으로 글리코실화되어 다양한 진세노사이드로 전환될 수 있다. PPD가 글리코실화된 형태의 진세노사이드에는, 진세노사이드 Rb1, Rd, F2, Rg3, Rh2, CK(Compound K), Rb2, Rc, C-MC(Compound MC) 및 C-Y(Compound Y) 등이 있으며, PPT가 글리코실화된 형태의 진세노사이드에는 Rg1, Rh1, F1, Rf, Re 및 Rg2 등이 있다.
한편, 진세노사이드 생합성 경로에 대해서는 부분적으로만 알려져 있다. 상기 생합성 경로는 IPP 이성화효소(IPI), GPP 합성효소(GPS), FPP 합성효소(FPS), 스쿠알렌 합성효소(SS) 및 스쿠알렌 애폭시데이즈(SE)의 작용에 의하여 이소펜테닐 2인산(isopentenyl diphosphate) 및 DMADP(dimethylallyldiphosphate)의 일련의 축합반응이 일어나 옥시도스콸렌(oxidosqualene)이 합성될 때까지는 다른 트리테르펜 경로와 함께 그 경로를 일부 공유하는 것으로 알려져 있다(Ajikumar et al. Science, 330, 70-74. 2010; Ro et al. Nature, 440, 940-943. 2006; Sun et al. BMC genomics, 11, 262, 2010). 옥시도스콸렌은 트리테르펜 고리화효소(triterpenecyclase)인 DS(dammarenediol-II synthase)에 의하여 다마렌다이올-II(dammarenediol-II)으로 고리화된다. 다마렌다이올-II은 3번 및 20번 탄소에 히드록시 그룹을 가지고 있으며, p450 효소인 PPDS(protopanaxadiol synthase)에 의하여 12번 탄소에 히드록시화(hydroxylation)되어 PPD로 전환된다. PPDS는 또 다른 p450 단백질인 PPTS(protopanaxatirol synthase)에 의하여 6번 탄소에 히드록실화를 가져와 PPT로 전환될 수 있다. PPD는 3번 및/또는 20번 탄소에 글리코실화되어 다양한 종류의 PPD 계열의 진세노사이드로 전환될 수 있으며, PPT는 6번 및/또는 20번 탄소에 글리코실화되어 다양한 PPT 계열의 진세노사이드로 전환될 수 있다.
UDP(Uridine diphosphate)-당전이효소(UGT, UDP-glycosyltransferase)는 UDP-당으로부터 호르몬 및 2차 대사물질과 같은 다양한 대사물질로 당을 전달하는 효소이다. UGT는 일반적으로 대사물질의 용해성, 안정성, 저장성, 생체활성 또는 생물학적으로 이용가능성을 높이기 위하여 생합성 경로에서 마지막 단계에서 작용한다. 식물 대사물질의 놀라운 다양성에서 알 수 있듯이, 각 식물의 게놈은 다른 UGT들을 수백 개 가량 보유하고 있다. 예를 들어, 애기장대(Arabidopsis thaliana) 식물 모델에서는 아미노산을 기반으로 분류된 14개 그룹(그룹 A 내지 그룹 N)에 속하는 107개의 UGTs를 포함하고 있다. 그러나, 진세노사이드 생합성 효소로서 DS, PPDS 및 PPTS는 보고된 바 있으나, 진세노사이드 생합성에 관여하는 UGT에 대해서는 거의 알려진 바 없어, 특정 진세노사이드의 생산을 위해 진세노사이드를 기질로 하는 UGT를 규명할 필요가 존재하였다.
또한, 서로 다른 UGT들은 당 공여체(sugar donor) 및 당 수용체(sugar acceptor) 모두에 대하여 기질 특이성을 나타낸다. 예를 들어, UGT78D2는 UDP-글루코스로부터 플라보놀(kaempferol, quercetin) 및 안토시아닌(caynidin)의 3번 탄소로 글루코스를 전달하여, 플라보놀-3-O-글루코사이드(flavonol 3-O-glucosides) 및 시아니딘-3-O-글루코사이드(cyanidin 3-O-glucoside)를 각각 생산한다. 이와 같은 글리코실화는 in vivo에서 안정성 및 저장성에 필수적일 것으로 보여진다. 반대로, UGT89C1는 UDP-람노스(rhanmnose)의 람노스를 플라보놀-3-O-글루코사이드(flavonol-3-O-glucosides)의 7번 탄소로 전달시켜, 플라보놀-3-O-글루코사이드-7-O-람노사이드(flavonol-3-O-glucoside-7-O-rhamnoside)를 생산한다. 상기 UGT89C1의 경우, UDP-포도당 및 안토시아닌-3-O-글루코사이드를 모두 기질로 사용하지 않음으로써, UGT78D2와 다른 UDP-당 및 수용체(acceptor)에 대한 다른 특이성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이와 같이 서로 다른 종류의 UGT의 경우, 기질 특이성 및 위치 특이성이 서로 상이할 수 있어, 각 UGT에 따른 기질 특이성 및 위치특이성이 규명되어야 할 필요성이 있다.
이러한 배경 하에 본 발명자들은, 기질특이성 및 위치특이성을 지녀 특정 진세노사이드의 생합성에 이용할 수 있는 신규한 UDP-당전이효소를 개발하고자 예의 노력한 결과, 돌외(Gynostemma pentaphyllum)로부터 진세노사이드에 당을 전이하는 활성을 가지는 신규한 당전이효소인 GpUGT23을 규명하였고, 상기 GpUGT23이 PPD 계열 및 PPT 계열의 진세노사이드의 20번 탄소와 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스에 대해 당 전이 활성을 가짐을 확인하여, 이를 지페노사이드(Gypenoside) LXXV, 지페노사이드(Gypenoside) XVII, Rb1, 노토진세노사이드(Notoginsenoside) U, 노토진세노사이드(Notoginsenoside) R3 또는 글루코-Re(gluco-Re)와 같은 특정 진세노사이드의 생산에 이용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 PPD(protopanaxadiol) 계열 또는 PPT(protopanaxatriol) 계열의 진세노사이드의 20번 탄소와 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스에 대하여 당전이 활성을 가지는 UDP-당전이효소 단백질; 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 상기 벡터가 도입된 형질전환체; 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하여, 20번 탄소와 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스에 당이 전이된, PPD 또는 PPT 계열의 진세노사이드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 UDP-당전이효소 단백질; 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 상기 벡터가 도입된 형질전환체; 또는 상기 형질전환체의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스를 가지는 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드에 당을 전이하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스에 대하여 선택적인 당전이 활성을 가지는, UDP-당전이효소 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 PPD(protopanaxadiol) 계열 또는 PPT(protopanaxatriol) 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 글리코시딕 결합(glycosidic bond)로 연결된 글루코스에 대하여 당전이 활성을 가지는 UDP-당전이효소 단백질; 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 상기 벡터가 도입된 형질전환체; 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하여, 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스가 글리코실화된, PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "UDP(uridine diphosphate)-당전이효소"는 글리코실 공여자(glycosyl donor)로부터 글리코실 수용체 분자(glycosyl acceptor molecule)로 단당류 모이어티를 전달(transfer)하는 활성을 지닌 효소로서, 구체적으로 UDP-당을 글리코실 공여자로 사용하는 효소를 의미한다. 본 발명에서 상기 UDP-당전이효소는 'UGT'와 혼용될 수 있다. 상기 진세노사이드 UDP-당전이효소에 대해서는 거의 알려진 바가 없으며, UDP-당전이효소 활성을 지닌다고 하여도 그 기질 특이성 및 위치 특이성이 효소의 종류에 따라 상이하므로, 인삼 사포닌인 진세노사이드에 특이적으로 작용하는 UDP-당전이효소인지 여부는 개별적으로 규명될 필요가 있다.
본 발명에서는, PPD 계열의 진세노사이드 및 PPT 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스에 선택적으로 당 모이어티를 전달할 수 있는, 돌외( Gynostemma pentaphyllum ) 유래의 신규한 UDP-당전이효소를 최초로 규명하였다. 본 발명에서 규명한 UDP-당전이효소는 PPD 계열의 진세노사이드 또는 PPT 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스에 UDP-글루코스의 당 모이어티를 선택적으로 전달하는 활성을 지닌다. 따라서, 본 발명에서 규명한 UDP-당전이효소는 특별히 이에 제한되지 않으나, 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스에 당을 전달함으로써, PPD 계열의 진세노사이드인 CK, F2 및 Rd를 각각 지페노사이드(Gypenoside) LXXV(Gyp 75와 혼용), 지페노사이드(Gypenoside) XVII(Gyp 17과 혼용) 및 진세노사이드 Rb1으로 전환시킬 수 있고, 또한, PPT 계열의 진세노사이드인 F1, Rg1 및 Re를 각각 노토진세노사이드(Notoginsenoside) U, 노토진세노사이드(Notoginsenoside) R3 및 글루코-Re(gluco-Re)로 전환시킬 수 있다. 이러한 활성을 지닌 진세노사이드 UDP-당전이효소는 알려진바 없었으며, 본 발명자들에 의하여 최초로 규명되었다.
본 발명에서 규명된 UDP-당전이효소는 돌외 유래의 UDP-당전이효소로서, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 상기 아미노산 서열로 정의될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 UDP-당전이효소를 'GpUGT23'로 명명하였다.
이와 같은 본 발명의 UDP-당전이효소는 서열번호 1로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더욱더 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스에 당을 전이할 수 있는 활성을 갖는 단백질이라면 제한 없이 포함하며, 또한 실질적으로 UDP-당전이효소와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 상기 서열번호 1에 기재한 아미노산 서열에서 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 용어, "유사성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench(CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등일 수 있으나, 상동성을 결정할 수 있는 프로그램이라면 제한 없이 이용할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드를 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 UDP-당전이효소는 PPD 계열 또는 PPT 계열 진세노사이드의 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스에 선택적으로 당을 전이하는 활성을 지니므로, 이를 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스를 가지는 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드에 적용하여 글리코실화된 진세노사이드를 제조할 수 있다.
본 발명에서 용어, "20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스를 가지는 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드"는 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드의 20번 탄소의 -OH기와 당이 공유 결합된 형태의 진세노사이드를 말한다. 상기 당은 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로, 글루코스일 수 있으며, 상기 20번 탄소에 글리코시딕 결합을 가지는 진세노사이드는 20번 탄소에 O-글루코사이드를 가질 수 있다. 상기 20번 탄소의 -OH기와 글루코스가 공유 결합으로 연결된 PPD 계열 또는 PPT 계열 진세노사이드의 예로는 CK(compound K), F2, Rd, F1, Rg1 또는 Re를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "PPD 계열의 진세노사이드"는 담마란(dammarane)계 사포닌으로, 3번, 12번 및 20번 탄소 위치에 -OH기를 가지고 있는 PPD 또는 상기 PPD의 상기 -OH기가 하나 이상 글리코실화된 진세노사이드를 말한다.
본 발명에서 용어, "PPT 계열의 진세노사이드"는 담마란계 사포닌으로, 3번, 6번, 12번 및 20번 탄소 위치에 -OH기를 가지고 있는 PPT 또는 상기 PPT의 상기 -OH기가 글리코실화된 진세노사이드를 말한다.
상기 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드는 분리 및 정제된 형태의 진세노사이드를 이용할 수도 있고, 또는 식물, 예컨대 인삼 또는 홍삼의 분말 또는 추출물에 포함되어 있는 진세노사이드를 이용할 수도 있다. 즉, 사포닌을 포함하는 인삼 또는 홍삼의 분말 또는 추출물을 직접 진세노사이드로 이용하여 본 발명의 방법을 실시할 수도 있다. 또한, 화학적으로 합성된 진세노사이드를 이용할 수도 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 인삼으로는, 공지된 다양한 인삼을 사용할 수 있으며, 고려삼(Panax ginseng), 화기삼(P. quiquefolius), 전칠삼(P. notoginseng), 죽절삼(P. japonicus), 삼엽삼(P. trifolium), 히말라야삼(P. pseudoginseng) 및 베트남삼(P. vietnamensis)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 용어, "20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스가 글리코실화된 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드"는 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스에 당, 바람직하게는 글루코스가 전이되어 글리코실화된 진세노사이드로서, 그 예로 지페노사이드 LXXV, 지페노사이드 XVII, Rb1, 노토진세노사이드 U, 노토진세노사이드 R3 또는 글루코-Re 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "글루코-Re(gluco-Re)"는 진세노사이드 Re의 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스가 글리코실화된 형태의 진세노사이드를 의미한다.
또한, 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스를 가지는 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드를 전환시켜 글리코실화된 진세노사이드를 제조함에 있어, 상기 UDP-당전이효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터; 상기 벡터가 도입된 형질전환체; 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용할 수 있다.
상기 UDP-당전이효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 2로 기재한 뉴클레오티드 서열로 정의되는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 서열번호 2로 기재한 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 가장 구체적으로는 98% 이상의 유사성을 나타내는 뉴클레오티드 서열로서 실질적으로 GpUGT23 단백질의 활성을 갖는 단백질을 코딩할 수 있는 뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함한다. 또한 유전 암호의 축퇴성(genetic code degenerancy)에 기인하여 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열 및 이의 변이체 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 핵산 작제물을 말한다. 상기 제조된 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환(transformation) 또는 형질감염(transfection) 시킴으로써, 목적하는 단백질들을 수득할 수 있게 된다.
본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 및 아그로박테리움 매개 형질전환에 사용할 수 있는 Ti-플라스미드를 포함한다. 파아지 DNA의 구체적인 예로는 λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP)가 있다. 또한, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스(baculovirus)와 같은 곤충 바이러스, 이중 가닥 식물 바이러스(예, CaMV), 단일가닥 바이러스 또는 게미니 바이러스로부터 유래된 바이러스 벡터가 또한 사용될 수 있다.
아울러 본 발명의 벡터로서, 핵산 발현 활성화 단백질(예를 들어, B42같은)이 연결된 융합 플라스미드(fusion plasmid, 예를 들어, pJG4-5)가 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 회수되는 목적 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 플라스미드 벡터는 필요에 따라 다른 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 융합 플라스미드에는 GST, GFP, His-tag, Myc-tag 등을 태그(tag)로 포함할 수 있으나, 상기 예들에 의해 본 발명의 융합 플라스미드가 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 융합 단백질의 제조에 있어, 크로마토그래피 공정을 포함할 수 있으며, 상기 융합 단백질은 특히 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 헥사히스티딘이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼(Novagen, USA)을 이용하여 원하는 목적 단백질을 용이하게 회수할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 벡터로 삽입하기 위해, 정제된 DNA를 적당한 제한효소로 절단하여 적당한 벡터 DNA의 제한 부위 또는 클로닝 부위에 삽입하는 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 UDP-당전이효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 벡터에 작동 가능하게 연결되어 있을 수 있다. 본 발명의 벡터는 프로모터 및 본 발명의 핵산 외에 인핸서(enhancer)와 같은 시스 요소(cis element), 스플라이싱 시그널(splicing signal), 폴리 A 추가 시그널(poly A addition signal), 선택 마커(selection marker), 라이보좀 결합 서열(ribosome binding sequence, SD sequence) 등을 추가로 포함할 수 있다. 선택 마커의 예로, 클로람페니콜 저항 핵산, 암피실린 저항 핵산, 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase), 네오마이신 저항 핵산 등이 사용될 수 있으나, 상기 예들에 의해 작동 가능하도록 연결되는 추가적 구성요소가 제한되는 것은 아니다.본 발명에서 용어, "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.
상기 형질전환으로 본 발명의 UDP-당전이효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터의 일부를 숙주 세포 내에 도입할 수 있는데, 여기서 상기 발현 벡터의 일부란, 숙주 세포 내에 상기 UDP-당전이효소 단백질의 활성을 부여할 수 있도록 UDP-당전이효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분을 포함하는 발현 벡터의 부분을 의미한다. 예컨대, 아그로박테리아 매개 형질전환법에서 숙주 세포 내로 전달되는 Ti 플라스미드의 T-DNA를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다. 본 발명의 UDP-당전이효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 형질전환시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명에서 형질전환체 제조에 사용될 수 있는 숙주 세포의 종류는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)같은 바실러스(Bacillus) 속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균; 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모; 동물세포, 식물세포 및 곤충 세포가 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 대장균 균주의 구체적인 예로는 CL41(DE3), BL21 또는 HB101이, 바실러스 서브틸리스 균주의 구체적인 예로는 WB700 또는 LKS87이 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 도입된 형질전환체는 형질전환세포 또는 생물체의 형태일 수 있다. 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 생물체의 예로는 담배, 애기장대, 감자, 인삼, 참깨, 유자, 데이지 등이 있다.
본 발명의 프로모터는, 본 발명의 핵산을 숙주에서 발현하도록 하는 한 어떠한 프로모터도 사용될 수 있다. 예를 들어, trp 프로모터, lac 프로모터, PL 프로모터 또는 PR 프로모터 같은 대장균 또는 파아지-유래 프로모터; T7 프로모터 같은 대장균 감염 파아지-유래 프로모터, CaMV35S, MAS 또는 히스톤 프로모터가 사용될 수 있다. 또한 tac 프로모터 같은 인공적으로 변형된 프로모터도 사용될 수 있다.
상기의 방법으로 형질전환된 본 발명의 UDP-당전이효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 도입된 형질전환체는 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스에 대하여 선택적인 당전이 활성을 지니며, 그 예로 CK의 지페노사이드 LXXV로의 전환, F2의 지페노사이드 XVII로의 전환, Rd의 Rb1로의 전환, F1의 노토진세노사이드 U로의 전환, Rg1의 노토진세노사이드(Notoginsenoside) R3로의 전환 및 Re의 글루코-Re로의 전환으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 전이 활성을 가지나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 용어, "형질전환체의 배양물"은 상기 형질전환체를 배양한 다음 수득한 산물을 의미한다. 상기 배양물은 형질전환체를 포함하는 형태 및 상기 형질전환체를 포함하는 배양액에서 원심분리 등으로 형질전환체를 제거한 형태도 모두 포함하는 개념이다.
상기 배양물은 본 발명의 UDP-당전이효소 단백질을 포함하므로, 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스를 가지는 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드를 글리코실화된 진세노사이드로 전환할 수 있는 활성을 지니며, 그 예로 CK를 지페노사이드 LXXV로, F2를 지페노사이드 XVII로, Rd를 Rb1으로, F1을 노토진세노사이드 U, Rg1을 노토진세노사이드 R3로, 그리고 Re를 글루코-Re로 전환시킬 수 있다.
이와 같이 본 발명의 UDP-당전이효소 단백질; 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터; 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체; 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하여 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스를 가지는 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드를 글리코실화된 진세노사이드로 전환시킬 수 있어, 이를 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스가 글리코실화된 진세노사이드가 필요한 분야, 특히 지페노사이드 LXXV, 지페노사이드 XVII, Rb1, 노토진세노사이드 U, 노토진세노사이드 R3 및 글루코-Re 등과 같은 진세노사이드가 필요한 분야에 있어, 상기 방법이 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 PPD 계열 및 PPT 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스에 선택적으로 UDP-글루코스의 글루코스 모이어티를 전달하는 활성을 지니며 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 신규한 UDP-당전이효소를 돌외로부터 규명하였고, 이를 GpUGT23으로 명명하였다(실시예 1). 이와 같이 규명한 GpUGT23 단백질의 효소 활성을 규명하기 위하여, 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스를 가지는 대표적인 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드인, CK, F2, Rd 및 F1을 사용하여 본 발명의 GpUGT23과 반응시켜 그 전환 활성을 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 GpUGT23은 CK를 지페노사이드 LXXV로, F2를 지페노사이드 XVII로, Rd를 Rb1으로, 그리고 F1을 노토진세노사이드 U로 전환시키는 결과를 나타내었다(도 2 및 4). 이에 반해 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스가 없고, -OH기만 있는 PPD, Rh2, Rg3, PPT 및 Rh1에는 본 발명의 GpUGT23이 당 전이를 일으키지 않는 것을 확인하였다(도 3). 이는 GpUGT23이 PPD 계열 및 PPT 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스에 글루코스 모이어티를 특이적으로 전달하는 활성을 지님을 시사하는 것이다.
본 발명은 또 하나의 양태로서 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스에 대하여 당전이 활성을 가지는 UDP-당전이효소 단백질; 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 상기 벡터가 도입된 형질전환체; 또는 상기 형질전환체의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스를 가지는 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드를 글리코실화하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 UDP-당전이효소 단백질, 벡터, 형질전환체, PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드 및 글리코실화된 진세노사이드에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명은 또 하나의 양태로서 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스에 대하여 당전이 활성을 가지는 UDP-당전이효소 단백질을 제공한다.
상기 UDP-당전이효소 단백질에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명은 또 하나의 양태로서 상기 UDP-당전이효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환세포, 상기 형질전환세포가 포함된, 인간을 제외한 생물체를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터, 형질전환세포 및 생물체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 UDP-당전이효소는 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스에 선택적으로 당을 전이하는 활성을 지니는 단백질이므로, 지페노사이드(Gypenoside) LXXV, 지페노사이드(Gypenoside) XVII, Rb1 및 노토진세노사이드(Notoginsenoside) U와 같은 20번 탄소에 두개 이상의 당을 가지는 특정 진세노사이드의 대량 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은, 본 발명의 GpUGT23에 의해 당전이 되는 PPD 계열 및 PPT 계열 진세노사이드의 예시를 나타낸 것이다.
도 2는, UDP-당전이효소인 GpUGT23이 PPD 계열 및 PPT 계열 진세노사이드의 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스에 글루코스를 붙여 글리코실화시키는 활성을 지님을 나타내는 TLC(thin-layer chromatography) 결과이다. 구체적으로, GpUGT23이 CK(Compound K)를 지페노사이드(Gypenoside) LXXV로, F2를 지페노사이드(Gypenoside) XVII로, Rd를 Rb1으로, 그리고 F1을 노토진세노사이드(Notoginsenoside) U로 전환시키는 것을 나타낸 것이다.
도 3은, UDP-당전이효소인 GpUGT23이 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스가 없는 PPD 계열 및 PPT 계열 진세노사이드에는 당 전이를 일으키지 않음을 나타내는 HPLC(High performance liquid chromatography) 결과이다. 구체적으로 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스가 없고, -OH기만 있는 PPD(A), Rh2(B), Rg3(C), PPT(D) 및 Rh1(E)에는 GpUGT23이 당 전이를 할 수 없음을 나타낸 것이다.
도 4는, PPD 계열 및 PPT 계열 진세노사이드의 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스에 글루코스를 붙여 글리코실화시키는 활성을 지님을 나타내는 HPLC 결과이다. 구체적으로, GpUGT23이 CK를 지페노사이드 LXXV(A)로, F2를 지페노사이드 XVII(B)로, Rd를 Rb1(C)으로, 그리고 F1을 노토진세노사이드 U(D)로 전환시키는 것을 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 돌외 유래 UDP - 당전이효소 GpUGT23 의 클로닝 및 정제
돌외(Gynostemma pentaphyllum) cDNA로부터 GpUGT23-F(5'-GATCGGATCCATGAAGAAAATTTTGATGTTTCC-3';서열번호 3), GpUGT23-R(5'-GATCCTCGAGTATTTTTGCTTGACAAAGC-3'; 서열번호 4) 프라이머를 이용하여 중합효소를 이용하여 PCR로 유전자를 증폭하였고, 제한효소인 BamHI 및 XhoI를 이용하여 유전자의 각 말단을 잘랐다. 그 뒤 pET50(Oh et al. Plant Cell, 16, 3045-3058. 2004) 벡터에 클로닝하여 발현벡터를 제작하였고, 이를 대장균 BL21(DE3)-RIL 균주에 형질전환하여 GpUGT23 발현 균주를 만들었다. 이 균주를 IPTG로 단백질 발현을 유도한 뒤, 단백질을 얻었고, 이를 Ni-NTA His-결합 레진을 이용하여 GpUGT23 효소를 정제하였다.
실시예 2: In vitro 효소 어세이
정제된 GpUGT23(30㎍), 진세노사이드 화합물(5mM) 및 UDP-글루코스(50mM)를 포함하는 반응 완충용액(10mM PBS 완충액, pH 7)에서 당전이효소 어세이를 실시하였다. 이를 위하여, 4개의 서로 다른 종류의 진세노사이드, 즉 CK(Compound K), F2, Rd 및 F1를 사용하여 본 발명의 효소와 반응시켰다.
반응 혼합물은 12시간 동안 37℃에서 배양하여 반응시킨 후, 이의 생산물을 TLC(thin-layer chromatography) 또는 HPLC(high performance liquid chromatography)로 분석하였다.
TLC 분석은 이동상(아세톤:메탄올:DDW=65:35:10 vol/vol)과 함께 60F254 실리카 겔 플레이트(Merck, Germany)를 사용하여 실시하였다. TLC 플레이트의 용해된 생성물(resolved product)을 10%(vol/vol) 황산(H2SO4)으로 분사하여 검출한 다음, 110℃에서 5분 동안 가열하였다(도 2).
HPLC 분석은 ODS(2) C18 컬럼(Phenomenex, USA)을 사용하여 실시하였다. 물및 아세토나이트릴 구배적용(gradient application) 시간; 및 성분 비율은 다음과 같다: 1분당 1㎖의 유속으로, 0분, 68% 물 및 32% 아세토나이트릴; 8분, 35% 물 및 65% 아세토나이트릴; 12분, 0% 물 및 100% 아세토나이트릴; 20분, 0% 물 및 100% 아세토나이트릴; 20.1분, 68% 물 및 32% 아세토나이트릴; 및 28분, 68% 물 및 32% 아세토나이트릴(도 3 및 도 4).
진세노사이드는 UV-감지기(Agilent,USA)를 이용하여 203nm 파장으로 모니터링하였다.
실험예 1: GpUGT23 의 PPD 계열 및 PPT 계열 진세노사이드의 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스에 특이적인 당 전이 효소 활성의 확인
상기 실시예 2에 기술된 방법으로 GpUGT23의 기질특이성 및 위치특이성(regioselectivity) 여부를 확인하였다.
우선, 실시예 1의 재조합 GpUGT인 GpUGT23를 UDP-글루코스 존재하에서 9종의 진세노사이드(PPD, Rh2, Rg3, CK, F2, Rd, PPT, F1 및 Rh1)를 이용하여 반응을 하였을 시 CK, F2, Rd 및 F1에서 반응이 일어나는 것을 TLC(thin-layer chromatography)를 통하여 확인하였다.
이를 다시 확인하기 위하여, 서로 다른 4가지 종류의 진세노사이드(CK, F2, Rd 및 F1)과 GpUGT23을 함께 배양하여 반응시킨 후, 상기 재조합 GpUGT23에 의하여 전환된 생성물을 TLC를 통하여 분석하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 전환 결과는 이동한 스팟(migrating spot)의 위치와 표준 시료로 사용한 CK, Gyp75(지페노사이드 LXXV), F2, Gyp17(지페노사이드 XVII), Rd, Rb1 및 F1이 이동한 스팟의 위치를 서로 비교하여 확인하였다.
그 결과, GpUGT23은 CK를 지페노사이드(Gypenoside) LXXV로, F2를 지페노사이드(Gypenoside) XVII로, Rd를 Rb1으로, 그리고 F1을 노토진세노사이드(Notoginsenoside) U로 각각 전환시켰음을 알 수 있었다(도 2).
또한, 본 발명자들은 TLC에서 확인한 결과를 다시 HPLC를 통하여 재차 확인하였고, 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.
그 결과, 본 발명의 GpUGT23은, TLC 결과와 동일하게, PPD, Rh2, Rg3, PPT 및 Rh1과는 반응하지 않았고(도 3), CK, F2, Rd 및 F1 만을 지페노사이드 LXXV, 지페노사이드 XVII, Rb1 및 노토진세노사이드 U로 전환시켰다(도 4).
상기의 결과들은 모두 GpUGT23이 PPD 계열 및 PPT 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스에 UDP-글루코스를 전이하는 활성을 가지는 효소임을 나타내는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology Intelligent Synthetic Biology Center <120> A novel glycosyltransferase derived from Dolwoe and use thereof <130> KPA140546-KR <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> Gynostemma pentaphyllum <400> 1 Met Lys Lys Ile Leu Met Phe Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Ile Ser 1 5 10 15 Pro Phe Leu Glu Met Ala Lys Arg Leu Ser Lys Phe Asn Phe His Ile 20 25 30 Tyr Ile Cys Ser Ser Pro Ile Asn Leu Gln Ser Ile Lys Pro Lys Leu 35 40 45 Ser Asp Glu Tyr Ser Ser Ser Ile Glu Leu Ile Glu Ile His Leu Pro 50 55 60 Ser Leu Pro Asp Leu Pro Pro His Leu His Thr Thr Asn Gly Leu Ser 65 70 75 80 Ser His Leu Met Pro Thr Leu Leu Lys Ala Phe Asp Met Ser Ala Pro 85 90 95 Glu Phe Thr Thr Ile Leu His Asn Leu Lys Pro Asp Leu Leu Ile Asn 100 105 110 Asp Ile Leu Gln Pro Trp Ala Thr Gln Ile Ala Ser Ser Leu Asn Ile 115 120 125 Pro Val Thr His Phe Ile Thr Ala Gly Val Ile Thr Leu Gly Phe Ala 130 135 140 Leu Gln Ser His Asn Pro Glu Ile Pro Ile Pro Asp Val Asp Leu Gly 145 150 155 160 Tyr His Trp Phe Phe Lys Lys Met Ile Asn Ser Gly Ala Ser Glu Glu 165 170 175 Pro Asp Ser Asp Ser Asn Leu Asn Arg Leu Trp Lys Thr Leu Val Gly 180 185 190 Leu Gly His Leu Ser Asn Thr Ile Leu Ala Asn Thr Phe Thr Glu Leu 195 200 205 Glu Ser Asp His Ile Asn Tyr Leu Ser Leu Leu Leu Asn Lys Lys Val 210 215 220 Leu Pro Ile Gly Pro Leu Val Gln Lys Leu Thr Ser Ile Pro Asn Pro 225 230 235 240 Asn Asp Glu Glu Lys Lys Pro Glu Pro Leu Glu Trp Leu Asp Lys Lys 245 250 255 Ser Pro Lys Ser Thr Val Tyr Val Ser Phe Gly Ser Glu Cys Tyr Leu 260 265 270 Ser Lys Glu Gly Met Glu Glu Leu Ser His Gly Leu Glu Gln Ser Gly 275 280 285 Ala Asn Phe Ile Trp Val Ile Arg Phe Pro Lys Gly Glu Lys Lys Thr 290 295 300 Met Arg Asp Glu Leu Pro Glu Gly Tyr Leu Glu Arg Val Gly Glu Arg 305 310 315 320 Gly Met Val Ile Glu Gly Trp Ala Pro Gln Met Arg Ile Leu Glu His 325 330 335 Ser Ser Val Gly Gly Phe Val Ser His Cys Gly Trp Asn Ser Met Ala 340 345 350 Glu Ala Ala Val Ile Gly Val Pro Ile Ile Ala Leu Pro Met Gln Leu 355 360 365 Asp Gln Pro Trp Asn Gly Lys Ile Ala Glu Gln Cys Gly Ile Gly Val 370 375 380 Val Ala Lys Arg Gly Glu Glu Gly Glu Ile Met Arg Glu Glu Ile Arg 385 390 395 400 Glu Val Ile Lys Glu Val Val Phe Glu Glu Lys Gly Glu Lys Met Arg 405 410 415 Lys Lys Val Lys Glu Ile Ser Ala Val Leu Lys Glu Lys Glu Gly Glu 420 425 430 Ile Thr Asp Gly Leu Val Asn Glu Leu Asn Leu Leu Cys Gln Ala Lys 435 440 445 Ile <210> 2 <211> 1350 <212> DNA <213> Gynostemma pentaphyllum <400> 2 atgaagaaaa ttttgatgtt tccatggttg gcttttggcc atatctcacc atttctagag 60 atggcaaaga ggctgtctaa gttcaatttt cacatttaca tttgttcttc accaataaac 120 cttcaatcca ttaaaccaaa actctcagat gaatattctt cttccattga attgatagag 180 attcatcttc catctttacc agatcttcct cctcacttgc acactaccaa tggcttatct 240 tctcatttaa tgccaacttt gttgaaagcc tttgacatgt ctgcccctga attcaccacc 300 attttacata atcttaaacc agatttactc atcaatgaca ttttacaacc atgggctact 360 caaatagctt cctccctcaa tatccctgtt actcatttca ttacagctgg tgttattact 420 ctcggttttg ctctccagtc tcacaatcct gaaatcccga taccggacgt ggatctgggt 480 tatcactggt tcttcaagaa gatgataaat tcaggagctt ctgaagaacc agattccgat 540 tctaatttga atcgcttgtg gaaaacctta gttggtttag gacatttatc aaacaccatt 600 cttgcaaaca cttttactga attagaaagt gatcacatca attatctctc tctgttgtta 660 aacaagaagg ttcttccaat tggaccttta gttcagaaac tcacctcaat tccaaatcca 720 aacgacgaag aaaagaaacc agaaccccta gaatggcttg ataagaaaag ccctaaatca 780 acagtttacg tttcgtttgg gagcgaatgt tacctttcaa aagagggcat ggaagagtta 840 tcacatggat tagaacaaag cggggcgaat ttcatatggg taattaggtt tccgaaagga 900 gaaaagaaaa cgatgagaga tgaattaccg gaaggttatt tagaaagagt tggagaaaga 960 gggatggtaa ttgaaggatg ggcaccacag atgagaattc tagagcattc tagcgtcgga 1020 gggttcgtca gtcattgtgg atggaattca atggcggaag cggcggtgat aggagtaccg 1080 atcatcgctt tgccgatgca gcttgatcag ccatggaatg ggaaaattgc agaacaatgc 1140 ggcattggtg tggtggcgaa gagaggggaa gaaggagaaa taatgagaga ggaaataagg 1200 gaagtcatta aagaagtggt atttgaagaa aaaggagaga aaatgagaaa gaaagtgaaa 1260 gagattagtg cagtgttgaa ggagaaagag ggtgaaatca cagatgggtt ggtgaatgag 1320 ttgaatttgc tttgtcaagc aaaaatataa 1350 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GpUGT23-F primer <400> 3 gatcggatcc atgaagaaaa ttttgatgtt tcc 33 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GpUGT23-R primer <400> 4 gatcctcgag tatttttgct tgacaaagc 29

Claims (14)

  1. PPD(protopanaxadiol) 계열 또는 PPT(protopanaxatriol) 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 글리코시딕 결합(glycosidic bond)으로 연결된 글루코스에 대하여 당전이 활성을 가지는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 UDP-당전이효소(uridine diphosphate glycosyltransferase) 단백질; 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 상기 벡터가 도입된 형질전환체; 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하여, 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스가 글리코실화된, PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스를 가지는 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드는, CK(compound K), F2, Rd, F1, Rg1 및 Re로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 글리코실화된 진세노사이드의 제조는, CK의 지페노사이드(Gypenoside) LXXV로의 전환, F2의 지페노사이드(Gypenoside) XVII로의 전환, Rd의 Rb1으로의 전환, F1의 노토진세노사이드(Notoginsenoside) U로의 전환, Rg1의 노토진세노사이드(Notoginsenoside) R3로의 전환 및 Re의 글루코-Re(gluco-Re)로의 전환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전환 과정을 포함하는 것인 방법.
  4. 삭제
  5. PPD(protopanaxadiol) 계열 또는 PPT(protopanaxatriol) 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 글리코시딕 결합(glycosidic bond)으로 연결된 글루코스에 대하여 당전이 활성을 가지는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 UDP-당전이효소(uridine diphosphate glycosyltransferase) 단백질; 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 상기 벡터가 도입된 형질전환체; 또는 상기 형질전환체의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스를 가지는 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드를 글리코실화하기 위한 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 20번 탄소에 글리코시딕 결합으로 연결된 글루코스를 가지는 PPD 계열 또는 PPT 계열의 진세노사이드는, CK(compound K), F2, Rd, F1, Rg1 및 Re로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 글리코실화는 CK의 지페노사이드(Gypenoside) LXXV로의 글리코실화, F2의 지페노사이드(Gypenoside) XVII로의 글리코실화, Rd의 Rb1으로의 글리코실화, F1의 노토진세노사이드(Notoginsenoside) U로의 글리코실화, Rg1의 노토진세노사이드(Notoginsenoside) R3로의 글리코실화 및 Re의 글루코-Re(gluco-Re)로의 글리코실화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 글리코실화인 것인 조성물.
  8. 삭제
  9. 서열번호 1의 아미노산 서열로 정의되는, 분리된 UDP-당전이효소(Uridine diphosphate-glycosyltransferase) 단백질.
  10. 제9항에 있어서, 상기 단백질은 PPD(protopanaxadiol) 계열 또는 PPT(protopanaxatriol) 계열의 진세노사이드의 20번 탄소에 글리코시딕 결합(glycosidic bond)으로 연결된 글루코스에 대하여 당전이 활성을 가지는, UDP-당전이효소(uridine diphosphate glycosyltransferase) 단백질.
  11. 제9항의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  12. 제11항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  13. 제12항의 발현 벡터를 포함하는 형질전환세포.
  14. 제13항의 형질전환세포가 포함된, 인간을 제외한 생물체.
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