CN105441522B - 源自绞股蓝的新型葡萄糖基转移酶及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种对通过糖苷键而连接在PPD(原人参萜二醇)类或PPT(原人参萜三醇)类的人参皂苷的第20位碳上的葡萄糖具有糖转移活性的新颖的UDP‑糖基转移酶(尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶)蛋白质及其用途。

Description

源自绞股蓝的新型葡萄糖基转移酶及其用途
技术领域
本发明涉及一种对利用糖苷键连接在PPD(原人参萜二醇)类或PPT(原人参萜三醇)类的人参皂苷的第20位碳上的葡萄糖具有糖转移活性的新颖的UDP-糖基转移酶(尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶)蛋白质及其用途。
背景技术
人参皂苷作为被糖基化的达玛烷(dammarene)类的四环三萜(tetracyclictriterpene)，可根据糖苷配基(aglycone)的结构而分为原人参二醇类(原人参萜二醇-type，PPD类)人参皂苷、原人参三醇类(原人参萜三醇-type，PPT类)人参皂苷、及齐墩果酸类(oleanolic acid类)人参皂苷三类。这三类再根据通过糖苷键附着到化合物结构中环的第3位碳、第6位碳及第20位碳的位置上的糖部分体(糖苷配基)(sugar moieties(aglycones))的位置及数量而分类。另外，PPD及PPT具有不同的羟基化形态(hydroxylation pattern)。PPD在第3位、第12位及第20位碳的位置上具有-OH基，相反地，PPT在第3位、第6位、第12位及第20位碳的位置上具有-OH基。所述PPD及PPT可利用葡萄糖及其他糖进行糖基化而转化成各种人参皂苷。PPD被糖基化的形态的人参皂苷有人参皂苷Rb1、Rd、F2、Rg3、Rh2、CK(化合物K)、Rb2、Rc、C-MC(化合物MC)及C-Y(化合物Y)等，PPT被糖基化的形态的人参皂苷有人参皂苷Rg1、Rh1、F1、Rf、Re及Rg2等。
另一方面，只知一部分人参皂苷生物合成路径。已知在通过IPP异构酶(IPI)、GPP合成酶(GPS)、FPP合成酶(FPS)、角鲨烯合成酶(SS)及角鲨烯环氧酶(SE)的作用发生异戊烯焦磷酸(isopentenyl diphosphate)及DMADP(dimethylallyldiphosphate，二甲基丙烯基焦磷酸)的一系列的缩合反应而合成氧鲨烯(oxidosqualene)前，所述生物合成路径与其他三萜路径一同共享其路径的一部分(Ajikumar et al.Science,330,70-74.2010；Ro etal.Nature,440,940-943,2006；Sun et al.BMC genomics,11,262,2010)。氧鲨烯由作为三萜环化酶(triterpenecyclase)的DS(dammarenediol-II synthase，达玛烯二醇-II合成酶)环化成达玛烷二醇-II(dammarenediol-II)。达玛烷二醇-II在第3位及第20位碳上具有羟基，通过作为p450酶的PPDS(原人参萜二醇synthase)在第12位碳上羟基化(hydroxylation)而可转化为PPD。PPDS通过另一作为p450蛋白质的PPTS(protopanaxatirol synthase)在第6位碳上实现羟基化而可转化为PPT。PPD可在第3位及/或第20位碳上糖基化而转化成各种PPD类人参皂苷，PPT可在第6位及/或第20位碳上糖基化而转化成各种PPT类人参皂苷。
UDP(Uridine diphosphate，尿苷二磷酸)-糖基转移酶(UGT，UDP-glycosyltransferase)是从UDP-糖向诸如荷尔蒙及2次代谢物质的各种代谢物质转移糖的酶。通常，UGT为了提高代谢物质的溶解性、稳定性、存储性、生物体活性及生物学上的利用可能性，在生物合成路径内在最终阶段发挥作用。从植物代谢物质的惊人的多样性可知，各植物的基因组大致拥有数百个不同的UGT。例如，在拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物模型中，包含属于以氨基酸为基础而分类的14个组(组A至组N)中的107个UGTs。但是，作为人参皂苷生物合成酶，报告有DS、PPDS及PPTS，但对于干预人参皂苷生物合成的UGT却几乎一无所知，因此为了生成特定的人参皂苷，需要查明以人参皂苷为基质的UGT。
另外，不同的UGT对糖供体(sugar donor)及糖受体(sugar acceptor)均显示出基质特异性。例如，UGT78D2从UDP-葡萄糖向黄酮醇(kaempferol、quercetin)及花青苷(caynidin)的第3位碳转移葡萄糖，分别生成黄酮醇-3-O-葡糖苷(flavonol 3-O-glucosides)及花青素-3-O-葡糖苷(cyanidin 3-O-glucoside)。为了在in vivo中保持稳定性及存储性，则必需如上所述的糖基化。相反地，UGT89C1将UDP-鼠李糖(rhanmnose)的鼠李糖转移到黄酮醇-3-O-葡糖苷(flavonol-3-O-glucosides)的第7位碳而生成黄酮醇-3-O-葡糖苷-7-O-鼠李糖苷(flavonol-3-O-glucoside-7-O-rhamnoside)。在所述UGT89C1的情况下，已知未将UDP-葡萄糖及花青素-3-O-葡糖苷均用作基质，由此显示出不同于UGT78D2的对UDP-糖及受体(acceptor)的不同的特异性。如上所述，在不同种类的UGT的情况下，基质特异性及位置特异性会彼此不同，从而需要查明各UGT的基质特异性及位置特异性。
在这种背景下，本发明人等为了开发出具有基质特异性及位置特异性而可利用在特定人参皂苷的生物合成中的新颖的UDP-糖基转移酶进行了锐意努力，结果查明了具有从绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)向人参皂苷转移糖的活性的新颖的糖基转移酶即GpUGT23，确认到所述GpUGT23对通过糖苷键而与PPD类及PPT类人参皂苷的第20位碳连接的葡萄糖具有糖转移活性，且确认到可将所述GpUGT23用于诸如绞股蓝皂甙(Gypeno6side)LXXV、绞股蓝皂甙(Gypenoside)XVII、Rb1、三七皂苷(Notoginsenoside)U、三七皂苷(Notoginsenoside)R3或葡萄糖-Re(gluco-Re)的特定人参皂苷的生产中，从而完成了本发明。
发明内容
[发明要解决的问题]
本发明的一个目的在于提供一种制备在通过糖苷键而与第20位碳连接的葡萄糖上转移有的糖的PPD或PPT类的人参皂苷的方法，其是利用对通过糖苷键而与PPD(原人参萜二醇)类或PPT(原人参萜三醇)类的人参皂苷的第20位碳连接的葡萄糖具有糖转移活性的UDP-糖基转移酶蛋白质、包含对所述蛋白质进行编码的多核苷酸的载体、导入有所述载体的转化体或所述转化体的培养物来进行制备。
本发明的另一目的在于提供一种用于向具有通过糖苷键而连接在第20位碳上的葡萄糖的PPD类或PPT类的人参皂苷转移糖的组合物，其包含所述UDP-糖基转移酶蛋白质、包含对所述蛋白质进行编码的多核苷酸的载体、导入有所述载体的转化体或所述转化体的培养物作为有效成份。
本发明的又一目的在于提供一种UDP-糖基转移酶蛋白质，其对通过糖苷键而连接在所述PPD类或PPT类人参皂苷的第20位碳上的葡萄糖具有选择性糖转移活性。
本发明的又一目的在于提供一种转化体，其包含对所述蛋白质进行编码的多核苷酸、包含所述多核苷酸的表达载体、包含所述表达载体。
[解决问题的技术手段]
为了达成所述目的，作为本发明的一实施方式，提供一种制备通过糖苷键而连接在第20位碳上的葡萄糖被糖基化而成的PPD或PPT类的人参皂苷的方法，其是利用对通过糖苷键而连接在PPD(原人参萜二醇)类或PPT(原人参萜三醇)类人参皂苷的第20位碳上的葡萄糖具有糖转移活性的UDP-糖基转移酶蛋白质、包含对所述蛋白质进行编码的多核苷酸的载体、导入有所述载体的转化体或所述转化体的培养物来进行制备。
在本发明中，术语“UDP(uridine diphosphate)-糖基转移酶”是具有从糖基供体(glycosyl donor)向糖基受体分子(glycosyl acceptor molecule)转移(transfer)单糖基的活性的酶，具体而言，是指将UDP-糖用作糖基供体的酶。在本发明中，所述UDP-糖基转移酶可与“UGT”混合使用。对于所述人参皂苷UDP-糖基转移酶几乎一无所知，即使具有UDP-糖基转移酶活性，其基质特异性及位置特异性也因酶的种类而异，因而需要个别地查明是否为在人参皂苷(ginseng saponin)中特异地发挥作用的UDP-糖基转移酶。
在本发明中，首次查明了可选择性地向通过糖苷键而连接在PPD类人参皂苷及PPT类人参皂苷的第20位碳上的葡萄糖转移糖部分体的、源自绞股蓝(Gynostemmapentaphyllum)的新颖的UDP-糖基转移酶。本发明中查明的UDP-糖基转移酶具有选择性地向通过糖苷键而连接在PPD类人参皂苷或PPT类人参皂苷的第20位碳上的葡萄糖转移UDP-葡萄糖的糖部分体的活性。因此，本发明中查明的UDP-糖基转移酶并非特别限制于此，但通过向利用糖苷键而连接在第20位碳上的葡萄糖转移糖，可将作为PPD类人参皂苷的CK、F2及Rd分别转化为绞股蓝皂甙(Gypenoside)LXXV(与Gyp 75混合使用)、绞股蓝皂甙(Gypenoside)XVII(与Gyp 17混合使用)及人参皂苷Rb1，另外，可将作为PPT类人参皂苷的F1、Rg1及Re分别转化为三七皂苷(Notoginsenoside)U、三七皂苷(Notoginsenoside)R3及葡萄糖-Re(gluco-Re)。未曾发现具有这种活性的人参皂苷UDP-糖基转移酶，而由本发明人等首次查明。
本发明中所查明的UDP-糖基转移酶作为源自绞股蓝的UDP-糖基转移酶，可包含记载为序列1的氨基酸序列，可定义为所述氨基酸序列。在本发明的一实施例中，将所述以记载为序列1的氨基酸序列定义的UDP-糖基转移酶命名为“GpUGT23”。
如上所述的本发明的UDP-糖基转移酶不仅是记载为序列1的氨基酸序列，而且是与所述序列显示出70％以上的类似性、具体为80％以上、更具体为90％以上、进而更具体为95％以上、进而更具体为98％以上，最具体为99％以上类似性的氨基酸序列，只要是实质上具有可向通过糖苷键而连接在PPD类或PPT类人参皂苷的第20位碳上的葡萄糖转移糖的活性的蛋白质，则无限制地包含，另外，不证自明的是，只要是实质上具有与UDP-糖基转移酶相同或相应的生物学活性的氨基酸序列，则具有与记载在所述序列1中的氨基酸序列相比一部分序列缺失、变形、被取代或加成的氨基酸序列的蛋白质变异体也包含在本发明的范围内。
在本发明中，术语“类似性”是指两个多核苷酸或多肽部分之间的相同率。可由已知的相应技术决定从一部分到另一部分为止的序列间的相似性。例如，可通过如下方式决定相似性：排列序列信息，利用可容易地获得的计算机程序直接排列两个多核苷酸分子或两个多肽分子间的序列信息。所述计算机程序可为BLAST(NCBI)、CLC Main Workbench(CLCbio)、MegAlignTM(DNASTAR Inc)等，但只要是可决定相似性的程序，则可无限制地利用。另外，可通过如下方式决定多核苷酸间相似性，但并非限制于此：在构成相似区域间的稳定的双链的条件下将多核苷酸杂化后，分解为单链-特异性核酸酶而决定分解出的片段的大小。
本发明的所述UDP-糖基转移酶具有选择性地向通过糖苷键而连接在PPD类或PPT类人参皂苷的第20位碳上的葡萄糖转移糖的活性，因而可将其应用在具有通过糖苷键而连接在第20位碳上的葡萄糖的PPD类或PPT类人参皂苷来制备被糖基化的人参皂苷。
在本发明中，术语“具有通过糖苷键而连接在第20位碳上的葡萄糖的PPD类或PPT类人参皂苷”，是指PPD类或PPT类的人参皂苷的第20位碳的-OH基与糖共价键结而成的形态的人参皂苷。所述糖并非特别地限制于此，但具体而言，可为葡萄糖，在所述第20位碳上具有糖苷键的人参皂苷可在第20位碳上具有O-葡糖苷。作为所述第20位碳的-OH基与葡萄糖通过共价键连接而成的PPD类或PPT类人参皂苷的示例，可列举CK(化合物K)、F2、Rd、F1、Rg1或Re，但并非限制于此。
在本发明中，术语“PPD类的人参皂苷”作为达玛烷(dammarane)类皂苷，是指在第3位、第12位及第20位碳的位置具有-OH基的PPD或所述PPD的一个以上的所述-OH基被糖基化而成的人参皂苷。
在本发明中，术语“PPT类的人参皂苷”作为达玛烷类皂苷，是指在第3位、第6位、第12位及第20位碳的位置具有-OH基的PPT或所述PPT的所述-OH基被糖基化而成的人参皂苷。
所述PPD类或PPT类人参皂苷可利用分离及纯化形态的人参皂苷，或者也可利用植物、例如人参或红参的粉末或提取物中所包含的人参皂苷。即，也可直接将包含皂苷的人参或红参的粉末或提取物用作人参皂苷而实施本发明的方法。另外，还可利用化学合成的人参皂苷。作为可在本发明中利用的人参，可使用公知的各种人参，包含高丽参(Panaxginseng)、花旗参(P.quiquefolius)、三七参(P.notoginseng)、竹节参(P.japonicus)、三叶参(P.trifolium)、喜玛拉雅参(P.pseudoginseng)及越南参(P.vietnamensis)，但并不限定于此。
在本发明中，术语“通过糖苷键而连接在第20位碳上的葡萄糖被糖基化而成的PPD类或PPT类人参皂苷”是糖、优选为葡萄糖转移到通过糖苷键连接在PPD类或PPT类人参皂苷的第20位碳上的葡萄糖而被糖基化而成的人参皂苷，作为其示例，有绞股蓝皂甙LXXV、绞股蓝皂甙XVII、Rb1、三七皂苷U、三七皂苷R3或葡萄糖-Re等，但并不限制于此。
在本发明中，术语“葡萄糖-Re(gluco-Re)”，是指通过糖苷键而连接在人参皂苷Re的第20位碳上的葡萄糖被糖基化而成的形态的人参皂苷。
另外，在使具有通过糖苷键而连接在第20位碳上的葡萄糖的PPD类或PPT类人参皂苷转化而制备被糖基化的人参皂苷时，可利用包含对所述UDP-糖基转移酶进行编码的多核苷酸的表达载体、导入有所述载体的转化体或所述转化体的培养物。
优选地，对所述UDP-糖基转移酶蛋白质进行编码的多核苷酸可为以记载为序列2的核苷酸序列定义的多核苷酸，且不仅作为记载为序列2的核苷酸序列，而且作为与所述序列显示出70％以上类似性、具体为80％以上、更具体为90％以上、进而更具体为95％以上、最具体为98％以上的类似性的核苷酸序列，只要为可实质上对具有GpUGT23蛋白质活性的蛋白质进行编码的核苷酸序列，则无限制地包含。另外，因遗传密码简并性(genetic codedegenerancy)而对所述序列1的氨基酸序列进行编码的碱基序列及其变异体也包含在本发明中。
本发明的包含多核苷酸的表达载体作为可在适当的宿主细胞中表达靶蛋白的表达载体，是指包含必需的调节要素的核酸构建物，所述调节要素以可使核酸插入物被表达的方式连接。通过使所述制备的重组载体转化(transformation)或转染(transfection)到宿主细胞而可获得靶蛋白。
本发明提供的包含多核苷酸的表达载体并非特别限制于此，包含源自大肠杆菌的质粒(pYG601BR322、pBR325、pUC118及pUC119)、源自枯草芽孢(Bacillus subtilis)的质粒(pUB110及pTP5)、源自酵母的质粒(YEp13、YEp24及YCp50)及可使用在以农杆菌为媒介的转化中的Ti-质粒。作为噬菌体DNA的具体例，有λ-噬菌体(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11及λZAP)。另外，还可使用源自如下病毒的病毒载体：诸如逆转录酶病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)或牛痘病毒(vaccinia virus)的动物病毒；诸如杆状病毒(baculovirus)的昆虫病毒；双链植物病毒(例如CaMV)；单链病毒；或双生病毒。
并且，作为本发明的载体，可使用连接有核酸表达活化蛋白(例如B42)的融合质粒(fusion plasmid，例如pJG4-5)。另外，在本发明中，为了容易地对回收的靶蛋白进行纯化，质粒载体可视需要追加包含其他序列。在这种融合质粒中，可包含GST、GFP、His-tag、Myc-tag等作为标记(tag)，但本发明的融合质粒并不限定于所述示例。
另外，在所述融合蛋白的制备中可包含层析工序，特别是，可利用亲和层析法对所述融合蛋白进行纯化。例如，在融合有谷胱甘肽-S-转移酶的情况下，可利用作为该酶的基质的谷胱甘肽，在利用六聚组氨酸的情况下，可利用Ni-NTA His-结合树脂柱(Novagen，USA)而容易地回收所需的靶蛋白。
为了将本发明的多核苷酸插入到载体，可使用如下方法：将经纯化的DNA切断为适当的限制酶而插入到适当的载体DNA的限制位点或克隆位点。
本发明的对UDP-糖基转移酶蛋白质进行编码的多核苷酸能够以可运作地方式连接到载体。本发明的载体除启动子及本发明的核酸以外，可追加包含诸如增强子(enhancer)的顺式作用元件(cis element)、剪接信号(splicing signal)、多聚A添加信号(poly A addition signal)、筛选标记(selection marker)、核糖体结合序列(ribosomebinding sequence、SD sequence)等。作为筛选标记的示例，可使用抗氯霉素核酸、抗氨比西林核酸、二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase)、抗新霉素核酸等，但以可运作的方式连接的追加性构成要素并不限制所述示例。在本发明中，术语“转化”是指如下现象：将DNA导入到宿主，使DNA作为染色体因子或通过完成染色体整合可被复制者而将外部DNA导入到细胞内，从而人为地引起遗传变化。
通过所述转化，可将本发明的包含对UDP-糖基转移酶蛋白质进行编码的多核苷酸的表达载体或所述表达载体的一部分导入到宿主细胞内，其中，所述表达载体的一部分是指如下表达载体的部分：包含对UDP-糖基转移酶蛋白质进行编码的多核苷酸部分，以便可在宿主细胞内赋予UDP-糖基转移酶蛋白质的活性。例如，可列举哦在农杆菌媒介转化法中转移到宿主细胞内的Ti质粒的T-DNA，但并不限制于此。
本发明的转化方法可使用任一转化方法，可通过本发明技术领域内的通常的方法而容易地执行。通常，在转化方法中，有CaCl2沉淀法、通过在CaCl2方法中使用被称为DMSO(dimethyl sulfoxide，二甲基亚砜)的还原物质而提高效率的Hanahan方法、电穿孔法(electroporation)、磷酸钙沉淀法、原生质融合法、利用碳化硅纤维的搅拌法、以农杆菌为媒介的转化法、利用PEG的转化法、硫酸葡聚糖、脂染胺及利用干燥/抑制媒介的转化方法等。用于使本发明的包含对UDP-糖基转移酶进行编码的多核苷酸的载体转化的方法并不局限于所述示例，可无限制地使用在本技术领域内通常使用的转化或转染方法。
在本发明中，只要可表达本发明的多核苷酸，则可使用在转化体的制备中的宿主细胞的种类并无特别限制。作为可使用在本发明中的宿主的特定示例，有诸如大肠杆菌(E.coli)的埃希氏菌(Escherichia)属细菌；诸如枯草芽孢(Bacillus subtilis)的芽孢杆菌(Bacillus)属细菌；诸如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的假单胞菌(Pseudomonas)属细菌；诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的酵母；动物细胞；植物细胞；及昆虫细胞。作为可使用在本发明中的大肠杆菌菌株的具体例，有CL41(DE3)、BL21或HB101，作为枯草芽孢菌株的具体例，有WB700或LKS87。
本发明的导入有包含多核苷酸的表达载体的转化体可为转化细胞或生物体的形态。并非特别限制于此，但作为所述生物体的示例，有烟草、拟南芥、马铃薯、人参、芝麻、柚子、雏菊等。
作为本发明的启动子，只要在宿主中表达本发明的核酸，则可使用任一启动子。例如，可使用：诸如trp启动子、lac启动子、PL启动子或PR启动子的源自大肠杆菌或噬菌体的启动子；诸如T7启动子的源自大肠杆菌转染噬菌体的启动子、CaMV35S、MAS或组蛋白启动子。另外，也可使用诸如tac启动子的经人工变形的启动子。
通过所述方法转化而成的本发明的导入有包含对UDP-糖基转移酶蛋白质进行编码的多核苷酸的表达载体的转化体对通过糖苷键连接在PPD类或PPT类人参皂苷的第20位碳上的葡萄糖具有选择性糖转移活性，作为其示例，具有选自由CK向绞股蓝皂甙LXXV的转化、F2向绞股蓝皂甙XVII的转化、Rd向Rb1的转化、F1向三七皂苷U的转化、Rg1向三七皂苷(Notoginsenoside)R3的转化及Re向葡萄糖-Re转化所构成的群组中的一种以上的转移活性，但并不限制于此。
另外，在本发明中，术语“转化体的培养物”是指培养所述转化体后获得的产物。所述培养物的含义在于，不仅包括包含转化体的形态，而且还包含通过离心分离等从包含所述转化体的培养液去除转化体的形态。
所述培养物包含本发明的UDP-糖基转移酶蛋白质，因而具有可将具有通过糖苷键而连接在第20位碳上的葡萄糖的PPD类或PPT类人参皂苷转化成被糖基化的人参皂苷的活性，作为其示例，可将CK转化成绞股蓝皂甙LXXV，将F2转化成绞股蓝皂甙XVII，将Rd转化成Rb1，将F1转化成三七皂苷U，将Rg1转化成三七皂苷R3，以及将Re转化成葡萄糖-Re。
如上所述，可利用本发明的UDP-糖基转移酶蛋白质、包含对所述蛋白质进行编码的多核苷酸的表达载体、导入有所述表达载体的转化体或所述转化体的培养物，将具有通过糖苷键而连接在第20位碳上的葡萄糖的PPD类或PPT类人参皂苷转化成被糖基化的人参皂苷，因此可在需要通过糖苷键连接在第20位碳上的葡萄糖被糖基化而成的人参皂苷的领域、特别是在需要诸如绞股蓝皂甙LXXV、绞股蓝皂甙XVII、Rb1、三七皂苷U、三七皂苷R3及葡萄糖-Re等的人参皂苷的领域内有效地使用所述方法。
在本发明的一个实施例中，从绞股蓝研究出新颖的UDP-糖基转移酶，所述新颖的UDP-糖基转移酶具有选择性地向通过糖苷键而连接在PPD类及PPT类人参皂苷的第20位碳上的葡萄糖转移UDP-葡萄糖的葡萄糖部分体的活性，且由序列1的氨基酸序列构成，将其命名为GpUGT23(实施例1)。为了查明以此方式研究出的GpUGT23蛋白质的酶活性，使用作为具有通过糖苷键而连接在第20位碳上的葡萄糖的代表性的PPD类或PPT类人参皂苷的CK、F2、Rd及F1，与本发明的GpUGT23进行反应而确认其转化活性。其结果，本发明的GpUGT23显示出将CK转化成绞股蓝皂甙LXXV、将F2转化成绞股蓝皂甙XVII、将Rd转化成Rb1以及将F1转化成三七皂苷U的结果(图2及图4)。与之相反，确认到在无通过糖苷键连接在第20位碳上的葡萄糖而只有-OH基的PPD、Rh2、Rg3、PPT及Rh1中，本发明的GpUGT23不会引起糖转移(图3)。由此可见，GpUGT23具有向通过糖苷键而连接在PPD类及PPT类人参皂苷的第20位碳上的葡萄糖特异性地转移葡萄糖部分体的活性。
作为本发明的又一实施方式，提供一种用于对具有通过糖苷键而连接在第20位碳上的葡萄糖的PPD类或PPT类人参皂苷进行糖基化的组合物，其包含对通过糖苷键而连接在PPD类或PPT类的人参皂苷的第20位碳上的葡萄糖具有糖转移活性的UDP-糖基转移酶蛋白质、包含对所述蛋白质进行编码的多核苷酸的载体、导入有所述载体的转化体或所述转化体的培养物作为有效成份。
所述UDP-糖基转移酶蛋白质、载体、转化体、PPD类或PPT类的人参皂苷及被糖基化的人参皂苷与以上说明相同。
作为本发明的又一实施方式，提供一种UDP-糖基转移酶蛋白质，其对通过糖苷键而连接在PPD类或PPT类人参皂苷的第20位碳上的葡萄糖具有糖转移活性。
所述UDP-糖基转移酶蛋白质与上述说明相同。
作为本发明的又一种实施方式，提供一种对所述UDP-糖基转移酶蛋白质进行编码的多核苷酸、包含所述多核苷酸的表达载体、包含所述表达载体的转化细胞、包含所述转化细胞的除人类以外的生物体。
所述多核苷酸、表达载体、转化细胞及生物体与上述说明相同。
[发明效果]
本发明的UDP-糖基转移酶是具有选择性地向通过糖苷键而连接在PPD类或PPT类人参皂苷的第20位碳上的葡萄糖转移糖的活性的蛋白质，因而可有效地用于在诸如绞股蓝皂甙(Gypenoside)LXXV、绞股蓝皂甙(Gypenoside)XVII、Rb1及三七皂苷(Notoginsenoside)U的第20位碳上具有两个以上糖的特定的人参皂苷的大量生产中。
附图说明
图1是表示通过本发明的GpUGT23而实现糖转移的PPD类及PPT类人参皂苷的示例的图。
图2是表示作为UDP-糖基转移酶的GpUGT23具有使葡萄糖附着到通过糖苷键而连接在PPD类及PPT类人参皂苷的第20位碳上的葡萄糖而使其糖基化的活性的TLC(thin-layer chromatography，薄层层析法)结果。具体而言，表示GpUGT23使CK(化合物K)转化成绞股蓝皂甙(Gypenoside)LXXV、使F2转化成绞股蓝皂甙(Gypenoside)XVII、使Rd转化成Rb1以及使F1转化成三七皂苷(Notoginsenoside)U。
图3是表示作为UDP-糖基转移酶的GpUGT23不会在无通过糖苷键而连接在第20位碳上的葡萄糖的PPD类及PPT类人参皂苷中引起糖转移的HPLC(High performance liquidchromatography，高效液相层析0法)结果。具体而言，表示GpUGT23在无通过糖苷键而连接在第20位碳上的葡萄糖且只有-OH基的PPD(A)、Rh2(B)、Rg3(C)、PPT(D)及Rh1(E)中无法进行糖转移。
图4是表示具有使葡萄糖附着到通过糖苷键而连接在PPD类及PPT类人参皂苷的第20位碳上的葡萄糖而使其糖基化的活性的HPLC结果。具体而言，表示GpUGT23使CK转化为绞股蓝皂甙LXXV(A)、使F2转化为绞股蓝皂甙XVII(B)、使Rd转化为Rb1(C)以及使F1转化为三七皂苷U(D)。
具体实施方式
以下，根据下述示例，详细地对本发明进行说明。然而，下述示例仅用以例示本发明，本发明并不限定于下述示例。
实施例1：源自绞股蓝的UDP-糖基转移酶GpUGT23的克隆及纯化
利用GpUGT23-F(5'-GATCGGATCCATGAAGAAAATTTTGATGTTTCC-3'；序列3)、GpUGT23-R(5'-GATCCTCGAGTATTTTTGCTTGACAAAGC-3'；序列4)引子，并利用聚合酶而通过PCR从绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)cDNA扩增基因，利用作为限制酶的BamHI及XhoI切断基因的各末端。然后，克隆到pET50(Oh et al.Plant Cell，16，3045-3058.2004)载体而制备表达载体，将所述表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)-RIL菌株而制备GpUGT23表达菌株。利用IPTG对所述菌株诱导蛋白质表达后获得蛋白质，对其利用Ni-NTA His-结合树脂纯化GpUGT23酶。
实施例2：In vitro酶实验
在包含经纯化的GpUGT23(30μg)、人参皂苷化合物(5mM)及UDP-葡萄糖(50mM)的反应缓冲溶液(10mM的PBS缓冲液，pH值为7)中实施糖基转移酶实验。为此，使用4个不同种类的人参皂苷、即使用CK(化合物K)、F2、Rd及F1而与本发明的酶进行反应。
在37℃下对反应混合物进行12小时的培养反应后，利用TLC(thin-layerchromatography)或HPLC(high performance liquid chromatography)对其生成物进行分析。
与流动相(丙酮∶甲醇∶DDW＝65∶35∶10vol/vol)一同使用60F254硅胶板(Merck，Germany)实施TLC分析。利用10％(vol/vol)硫酸(H2SO4)对TLC板的溶解出的生成物(resolved product)进行喷射而进行检测，之后在110℃下加热5分钟(图2)。
使用ODS(2)C18柱(Phenomenex，USA)实施HPLC分析。水、乙腈梯度应用(gradientapplication)时间及成分比率如下：按照每分钟的流速，0分钟，68％水及32％乙腈；8分钟，35％水及65％乙腈；12分钟，0％水及100％乙腈；20分钟，0％水及100％乙腈；20.1分钟，68％水及32％乙腈；及28分钟，68％水及32％乙腈(图3及图4)。
利用UV-紫外探测仪(Agilent,USA)，以203nm的波长对人参皂苷进行监测。
实验例1：GpUGT23对通过糖苷键而连接在PPD类及PPT类人参皂苷的第20位碳上的 葡萄糖的特异性糖基转移酶活性的确认
通过所述实施例2中所记述的方法，确认GpUGT23是否有基质特异性及位置特异性(regioselectivity)。
首先，利用9种人参皂苷(PPD、Rh2、Rg3、CK、F2、Rd、PPT、F1及Rh1)，在存在UDP-葡萄糖的条件下，对作为实施例1的重组GpUGT的GpUGT23进行反应时，通过TLC(thin-layerchromatography，薄层层析法)确认到在CK、F2、Rd及F1中发生反应。
为了再次对所述情况进行确认，一同培养4种不同的人参皂苷(CK、F2、Rd及F1)与GpUGT23并进行反应后，利用TLC分析对通过所述重组GpUGT23而转化的生成物进行分析，将其结果示于图2。对移动点(migrating spot)的位点与用作标准试样的CK、Gyp75(绞股蓝皂甙LXXV)、F2、Gyp17(绞股蓝皂甙XVII)、Rd、Rb1及F1移动的点的位点进行比较而确认转化结果。
其结果，GpUGT23分别使CK转化成绞股蓝皂甙(Gypenoside)LXXV、使F2转化成绞股蓝皂甙(Gypenoside)XVII、使Rd转化成Rb1以及使F1转化成三七皂苷(Notoginsenoside)U(图2)。
另外，本发明人等通过HPLC再次对在TLC中确认的结果进行了确认，将其结果示于图3及图4。
其结果，本发明的GpUGT23与TLC的结果相同地，不与PPD、Rh2、Rg3、PPT及Rh1反应(图3)而仅使CK、F2、Rd及F1转化为绞股蓝皂甙LXXV、绞股蓝皂甙XVII、Rb1及三七皂苷U(图4)。
上述结果均显示出GpUGT23为具有向通过糖苷键而连接在PPD类及PPT类人参皂苷的第20位碳上的葡萄糖转移UDP-葡萄糖的活性的酶。
本发明所属技术领域的技术人员根据以上说明可理解，本发明可不变更其技术思想或必要特征而以其他具体形态实施。与此相关，以上记述的实施例仅应理解为在所有方面均为示例且并非限定性实施例。本发明的范围应解释为从权利要求书的含义、范围及其等效概念导出的所有变更或变形的形态包含在本发明的范围内，而并不限定于上述详细说明。
Figure IDA0000804954640000021
Figure IDA0000804954640000031

Claims (11)

1.一种制备通过糖苷键连接在第20位碳上的葡萄糖被糖基化的PPD类或PPT类的人参皂苷的方法，所述人参皂苷利用由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的UDP-糖基转移酶蛋白质来制备。
2.根据权利要求1所述的方法，其中具有通过糖苷键连接在第20位碳上的葡萄糖的PPD类或PPT类的人参皂苷为选自由CK(化合物K)、F2、Rd、F1、Rg1及Re所构成的群组中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其中被糖基化的所述人参皂苷的制备包含选自下列的一种或多种：CK向绞股蓝皂甙LXXV的转化、F2向绞股蓝皂甙XVII的转化、Rd向Rb1的转化、F1向三七皂苷U的转化、Rg1向三七皂苷R3的转化、以及Re向葡萄糖-Re的转化。
4.一种用于将具有通过糖苷键连接在第20位碳上的葡萄糖的PPD(原人参萜二醇)类或PPT(原人参萜三醇)类的人参皂苷糖基化的组合物，其包含由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的UDP-糖基转移酶蛋白质作为有效成份。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述具有通过糖苷键连接在第20位碳上的葡萄糖的PPD类或PPT类的人参皂苷为选自由CK(化合物K)、F2、Rd、F1、Rg1及Re所构成的群组中的一种或多种。
6.根据权利要求4所述的组合物，其中所述糖基化为选自下列的一种或多种：CK向绞股蓝皂甙LXXV的糖基化、F2向绞股蓝皂甙XVII的糖基化、Rd向Rb1的糖基化、F1向三七皂苷U的糖基化、Rg1向三七皂苷R3的糖基化、及Re向葡萄糖-Re的糖基化。
7.一种分离的UDP-糖基转移酶(尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶)蛋白质，其以SEQ ID NO:1的氨基酸序列定义。
8.根据权利要求7所述的UDP-糖基转移酶(尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶)蛋白质，其中所述蛋白质对通过糖苷键连接在PPD(原人参萜二醇)类或PPT(原人参萜三醇)类的人参皂苷的第20位碳上的葡萄糖具有糖转移活性。
9.一种多核苷酸，其编码根据权利要求7所述的蛋白质。
10.一种表达载体，其包含根据权利要求9所述的多核苷酸。
11.一种转化细胞，其包含根据权利要求10所述的表达载体。
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