JP6072180B2 - アマチャヅル由来の新規な糖転移酵素及びその用途 - Google Patents

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Description

本発明は、ＰＰＤ（protopanaxadiol）系又はＰＰＴ（protopanaxatriol）系ジンセノサイドの２０位の炭素にグリコシド結合（glycosidic bond）で連結されたグルコースに対して糖転移活性を有する、新規なＵＤＰ−糖転移酵素（uridine diphosphate glycosyltransferase）タンパク質及びその用途に関する。
ジンセノサイドはグリコシル化されたダンマラン（dammarane）系の四環トリテルペン（tetracyclic triterpene）であり、ジンセノサイドはアグリコン（aglycone）の構造によってプロトパナキサジオール系（protopanaxadiol-type, ＰＰＤ系）ジンセノサイド、プロトパナキサトリオール系（protopanaxatriol-type, ＰＰＴ系）ジンセノサイド及びオレアノール酸系（oleanolic acid系）ジンセノサイドの３種類に分類される。これら３つのグループは、さらに化合物構造中の環の３位の炭素、６位の炭素及び２０位の炭素位置にグリコシド結合により付着する糖部分（アグリコン）（sugar moieties(aglycones)）の位置及び数によって分類される。また、ＰＰＤとＰＰＴは異なる水酸化パターン（hydroxylation pattern）を有する。ＰＰＤは３位、１２位及び２０位の炭素位置に−ＯＨ基を有するのに対して、ＰＰＴは３位、６位、１２位及び２０位の炭素位置に−ＯＨ基を有する。前記ＰＰＤ及びＰＰＴがグルコースや他の糖にグリコシル化されると様々なジンセノサイドに変換される。ＰＰＤがグリコシル化された形態のジンセノサイドには、ジンセノサイドＲｂ１、Ｒｄ、Ｆ２、Ｒｇ３、Ｒｈ２、ＣＫ（Compound K）、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｃ−ＭＣ（Compound MC）、Ｃ−Ｙ（Compound Y）などがあり、ＰＰＴがグリコシル化された形態のジンセノサイドにはＲｇ１、Ｒｈ１、Ｆ１、Ｒｆ、Ｒｅ及びＲｇ２などがある。
一方、ジンセノサイド生合成経路については部分的にのみ知られている。前記生合成経路は、ＩＰＰ異性化酵素（ＩＰＩ）、ＧＰＰ合成酵素（ＧＰＳ）、ＦＰＰ合成酵素（ＦＰＳ）、スクアレン合成酵素（ＳＳ）及びスクアレンエポキシダーゼ（ＳＥ）の作用によりイソペンテニル二リン酸（isopentenyl diphosphate）及びＤＭＡＤＰ（dimethylallyldiphosphate）の一連の縮合反応が起こり、オキシドスクアレン（oxidosqualene）が合成されるまでは他のトリテルペン経路とその経路を一部共有することが知られている（非特許文献１，２，３）。オキシドスクアレンは、トリテルペン・シクラーゼ（triterpene cyclase）であるＤＳ（dammarenediol-II synthase）によりダンマレンジオール−ＩＩ（dammarenediol-II）に環化される。ダンマレンジオール−ＩＩは、３位及び２０位の炭素にヒドロキシ基を有し、ｐ４５０酵素であるＰＰＤＳ（protopanaxadiol synthase）により１２位の炭素に水酸化（hydroxylation）されてＰＰＤに変換される。ＰＰＤＳは、他のｐ４５０タンパク質であるＰＰＴＳ（protopanaxatirol synthase）により６位の炭素が水酸化されてＰＰＴに変換される。ＰＰＤは３位及び／又は２０位の炭素がグリコシル化されて各種ＰＰＤ系ジンセノサイドに変換され、ＰＰＴは６位及び／又は２０位の炭素がグリコシル化されて各種ＰＰＴ系ジンセノサイドに変換される。
ＵＤＰ（Uridine diphosphate）−糖転移酵素（UGT, UDP-glycosyltransferase）は、ＵＤＰ−糖からホルモンや二次代謝産物などの様々な代謝物質に糖を転移する酵素である。ＵＧＴは、一般に代謝物質の溶解性、安定性、保存性、生体活性又は生物学的利用可能性を高めるために、生合成経路における最後の段階で作用する。植物代謝物質の驚くべき多様性から分かるように、各植物のゲノムは異なるＵＧＴを約数百個保有している。例えば、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）植物モデルにおいては、アミノ酸に基づいて分類された１４のグループ（グループＡ〜グループＮ）に属する１０７個のＵＧＴｓを含む。しかし、ジンセノサイド生合成酵素としてＤＳ、ＰＰＤＳ及びＰＰＴＳは報告されているものの、ジンセノサイド生合成に関与するＵＧＴについてはほとんど明らかにされていないので、特定のジンセノサイドの作製のためにジンセノサイドを基質とするＵＧＴを解明する必要がある。
また、異なるＵＧＴは、糖供与体（sugar donor）及び糖受容体（sugar acceptor）の両方に対して基質特異性を示す。例えば、ＵＧＴ７８Ｄ２は、ＵＤＰ−グルコースからフラボノール（kaempferol, quercetin）及びアントシアニン（caynidin）の３位の炭素にグルコースを転移することにより、フラボノール−３−Ｏ−グルコシド（flavonol 3-O-glucosides）及びシアニジン−３−Ｏ−グルコシド（cyanidin 3-O-glucoside）をそれぞれ作製する。このようなグリコシル化は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて安定性及び保存性に必須であると考えられる。逆に、ＵＧＴ８９Ｃ１は、ＵＤＰ−ラムノース（rhamnose）のラムノースをフラボノール−３−Ｏ−グルコシド（flavonol-3-O-glucosides）の７位の炭素に転移し、フラボノール−３−Ｏ−グルコシド−７−Ｏ−ラムノシド（flavonol-3-O-glucoside-7-O-rhamnoside）を作製する。前記ＵＧＴ８９Ｃ１の場合、ＵＤＰ−ブドウ糖とアントシアニン−３−Ｏ−グルコシドのどちらも基質として用いないため、ＵＧＴ７８Ｄ２とは異なるＵＤＰ−糖及び受容体（acceptor）に対して異なる特異性を示すことが知られている。このように、異なる種類のＵＧＴにおいては、基質特異性及び位置特異性が異なることがあるので、各ＵＧＴにおける基質特異性及び位置特異性を解明する必要がある。
こうした背景の下、本発明者らは、基質特異性及び位置特異性を有し、特定のジンセノサイドの生合成に用いられる新規なＵＤＰ−糖転移酵素を開発するために鋭意努力した結果、アマチャヅル（Gynostemma pentaphyllum）からジンセノサイドに糖を転移する活性を有する新規な糖転移酵素であるＧｐＵＧＴ２３を見出し、前記ＧｐＵＧＴ２３がＰＰＤ系及びＰＰＴ系ジンセノサイドの２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースに対して糖転移活性を有することを確認し、さらにそれをギペノシド（Gypenoside）ＬＸＸＶ、ギペノシド（Gypenoside）ＸＶＩＩ、Ｒｂ１、ノトジンセノサイド（Notoginsenoside）Ｕ、ノトジンセノサイド（Notoginsenoside）Ｒ３、又はグルコ−Ｒｅ（gluco-Re）などの特定のジンセノサイドの作製に用いることができることを確認し、本発明を完成するに至った。
Ajikumar et al. Science, 330, 70-74. 2010 Ro et al. Nature, 440, 940-943. 2006 Sun et al. BMC genomics, 11, 262, 2010 Oh et al. Plant Cell, 16, 3045-3058. 2004
本発明は、ＰＰＤ（protopanaxadiol）系又はＰＰＴ（protopanaxatriol）系ジンセノサイドの２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースに対して糖転移活性を有するＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターが導入された形質転換体、又は前記形質転換体の培養物を用いて、２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースに糖が転移した、ＰＰＤ又はＰＰＴ系ジンセノサイドを製造する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターが導入された形質転換体、又は前記形質転換体の培養物を有効成分として含む、２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースを有するＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドに糖を転移するための組成物を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記ＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドの２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースに対して選択的な糖転移活性を有する、ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクターを含む形質転換体を提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明の一態様は、ＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドの２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースに対して糖転移活性を有するＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターが導入された形質転換体、又は前記形質転換体の培養物を用いて、２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースがグリコシル化された、ＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドを製造する方法を提供する。
本発明における「ＵＤＰ（uridine diphosphate）−糖転移酵素」とは、グリコシル供与体（glycosyl donor）からグリコシル受容体分子（glycosyl acceptor molecule）に単糖類部分を転移（transfer）する活性を有する酵素であり、具体的にはＵＤＰ−糖をグリコシル供与体として用いる酵素を意味する。本発明における前記ＵＤＰ−糖転移酵素は「ＵＧＴ」と混用される。前記ジンセノサイドＵＤＰ−糖転移酵素についてはほとんど明らかにされておらず、ＵＤＰ−糖転移酵素活性を有するとしてもその基質特異性及び位置特異性が酵素の種類によって異なるので、高麗人参サポニンであるジンセノサイドに特異的に作用するＵＤＰ−糖転移酵素であるか否かは個別に解明する必要がある。
本発明においては、ＰＰＤ系ジンセノサイド及びＰＰＴ系ジンセノサイドの２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースに選択的に糖部分を転移することができる、アマチャヅル（Gynostemma pentaphyllum）由来の新規なＵＤＰ−糖転移酵素が見出された。本発明において見出されたＵＤＰ−糖転移酵素は、ＰＰＤ系ジンセノサイド又はＰＰＴ系ジンセノサイドの２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースにＵＤＰ−グルコースの糖部分を選択的に転移する活性を有する。よって、本発明において見出されたＵＤＰ−糖転移酵素は、特にこれらに限定されるものではないが、２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースに糖を転移することにより、ＰＰＤ系ジンセノサイドであるＣＫ、Ｆ２及びＲｄをそれぞれギペノシドＬＸＸＶ（Ｇｙｐ７５と混用）、ギペノシドＸＶＩＩ（Ｇｙｐ１７と混用）及びジンセノサイドＲｂ１に変換することができ、またＰＰＴ系ジンセノサイドであるＦ１、Ｒｇ１及びＲｅをそれぞれノトジンセノサイドＵ、ノトジンセノサイドＲ３及びグルコ−Ｒｅに変換することができる。このような活性を有するジンセノサイドＵＤＰ−糖転移酵素は明らかにされておらず、本発明者らにより見出されたものである。
本発明において見出されたＵＤＰ−糖転移酵素は、アマチャヅル由来のＵＤＰ−糖転移酵素であり、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記アミノ酸配列により定義されるものであってもよい。本発明の一実施例においては、配列番号１で表されるアミノ酸配列により定義されるＵＤＰ−糖転移酵素を「ＧｐＵＧＴ２３」と命名した。
このような本発明のＵＤＰ−糖転移酵素は、配列番号１で表されるアミノ酸配列だけでなく、前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、さらに具体的には９５％以上、さらになお具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の類似性を示すアミノ酸配列であって、実質的にＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドの２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースに糖を転移できる活性を有するタンパク質であれば制限されず、また実質的にＵＤＰ−糖転移酵素と同一又は対応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、配列番号１で表されるアミノ酸配列において一部の配列が欠失、変更、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質変異体も本発明に含まれることは言うまでもない。
本発明における「類似性」とは、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド部分間の同一性の割合を意味する。一部分から他の部分までの配列間の相同性は周知の当該技術により決定される。例えば、相同性は、配列情報を整列させて容易に入手可能なコンピュータプログラムを用いて、２つのポリヌクレオチド分子又は２つのポリペプチド分子間の配列情報を直接整列させることにより決定される。前記コンピュータプログラムは、ＢＬＡＳＴ（NCBI）、ＣＬＣ Ｍａｉｎ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（CLC bio）、ＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭ（DNASTAR Inc）などであるが、相同性を決定できるプログラムであれば制限なく用いられる。また、ポリヌクレオチド間の相同性は、相同領域間に安定した二本鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドをハイブリッド化し、その後単鎖特異的なヌクレアーゼで分解し、分解したフラグメントのサイズにより決定することができるが、これに限定されるものではない。
本発明の前記ＵＤＰ−糖転移酵素は、ＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドの２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースに選択的に糖を転移する活性を有するので、これを２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースを有するＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドに適用すると、グリコシル化されたジンセノサイドを作製することができる。
本発明における「２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースを有するＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイド」とは、ＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドの２０位の炭素の−ＯＨ基と糖が共有結合した形態のジンセノサイドをいう。前記糖は、特にこれに限定されるものではないが、具体的にはグルコースであり、前記２０位の炭素にグリコシド結合を有するジンセノサイドは、２０位の炭素にＯ−グルコシドを有する。前記２０位の炭素の−ＯＨ基とグルコースが共有結合により連結されたＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドの例としては、ＣＫ（compound K）、Ｆ２、Ｒｄ、Ｆ１、Ｒｇ１又はＲｅが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明における「ＰＰＤ系ジンセノサイド」とは、ダンマラン（dammarane）系サポニンであり、３位、１２位及び２０位の炭素位置に−ＯＨ基を有するＰＰＤ、又は前記ＰＰＤの前記−ＯＨ基が１つ以上のグリコシル化されたジンセノサイドをいう。
本発明における「ＰＰＴ系ジンセノサイド」とは、ダンマラン系サポニンであり、３位、６位、１２位及び２０位の炭素位置に−ＯＨ基を有するＰＰＴ、又は前記ＰＰＴの前記−ＯＨ基がグリコシル化されたジンセノサイドをいう。
前記ＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドは、分離及び精製された形態のジンセノサイドを用いることもでき、植物、例えば高麗人参又は紅参の粉末又は抽出物に含まれるジンセノサイドを用いることもできる。すなわち、サポニンを含む高麗人参又は紅参の粉末又は抽出物を直接ジンセノサイドとして用いて本発明の方法を実施することもできる。また、化学的に合成されたジンセノサイドを用いることもできる。本発明における高麗人参としては、公知の様々な高麗人参を用いることができ、オタネニンジン（Panax ginseng）、アメリカニンジン（P. quiquefolius）、サンシチニンジン（P. notoginseng）、トチバニンジン（P. japonicus）、ミツバニンジン（P. trifolium）、ヒマラヤニンジン（P. pseudoginseng）及びベトナムニンジン（P. vietnamensis）を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明における「２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースがグリコシル化されたＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイド」とは、ＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドの２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースに糖、好ましくはグルコースが転移してグリコシル化されたジンセノサイドであり、例えばギペノシドＬＸＸＶ、ギペノシドＸＶＩＩ、Ｒｂ１、ノトジンセノサイドＵ、ノトジンセノサイドＲ３、グルコ−Ｒｅなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明における「グルコ−Ｒｅ（gluco-Re）」とは、ジンセノサイドＲｅの２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースがグリコシル化された形態のジンセノサイドを意味する。
また、２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースを有するＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドを変換してグリコシル化されたジンセノサイドを作製する際に、前記ＵＤＰ−糖転移酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記ベクターが導入された形質転換体、又は前記形質転換体の培養物が用いられる。
前記ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２で表されるヌクレオチド配列により定義されるポリヌクレオチドであることが好ましく、配列番号２で表されるヌクレオチド配列だけでなく、前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、さらに具体的には９５％以上、最も具体的には９８％以上の類似性を示すヌクレオチド配列であって、実質的にＧｐＵＧＴ２３タンパク質の活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であれば制限なく用いられる。また、遺伝暗号の縮退度（genetic code degeneracy）により配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列及びその変異体も本発明に含まれる。
本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターとは、適当な宿主細胞において標的タンパク質を発現する発現ベクターであり、核酸挿入物が発現するように作動可能に連結された必須の調節因子を含む核酸産物をいう。このように作製された組換えベクターを宿主細胞に形質転換（transformation）又はトランスフェクション（transfection）させることにより、標的とするタンパク質を得ることができる。
本発明が提供するポリヌクレオチドを含む発現ベクターには、特にこれらに限定されるものではないが、大腸菌由来プラスミド（ｐＹＧ６０１ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８及びｐＵＣ１１９）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）由来プラスミド（ｐＵＢ１１０及びｐＴＰ５）、酵母由来プラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４及びＹＣｐ５０）、及びアグロバクテリウム媒介形質転換に用いられるＴｉプラスミドが含まれる。ファージＤＮＡの具体例としては、λ−ファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１及びλＺＡＰ）が挙げられる。また、レトロウイルス（retrovirus）、アデノウイルス（adenovirus）、又はワクシニアウイルス（vaccinia virus）などの動物ウイルス、バキュロウイルス（baculovirus）などの昆虫ウイルス、二本鎖植物ウイルス（例えば、ＣａＭＶ）、一本鎖ウイルス又はジェミニウイルス由来のウイルスベクターも用いられる。
また、本発明のベクターとして、核酸発現活性化タンパク質（例えば、Ｂ４２など）が連結された融合プラスミド（fusion plasmid，例えば、ｐＪＧ４−５）を用いてもよい。また、本発明において回収される標的タンパク質の精製を容易にするために、プラスミドベクターは必要に応じて他の配列をさらに含んでもよい。このような融合プラスミドには、ＧＳＴ、ＧＦＰ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇなどがタグ（tag）として含まれてもよいが、本発明の融合プラスミドがこれらの例に限定されるものではない。
また、前記融合タンパク質の作製において、クロマトグラフィー工程を含んでもよく、前記融合タンパク質は、特にアフィニティークロマトグラフィーにより精製される。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼが融合された場合はこの酵素の基質であるグルタチオンが用いられ、ヘキサヒスチジンが用いられた場合はＮｉ−ＮＴＡ Ｈｉｓ−結合レジンカラム（Novagen, USA）を用いることにより所望の標的タンパク質を容易に回収することができる。
本発明のポリヌクレオチドをベクターに挿入するために、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限部位又はクローニング部位に挿入する方法が用いられる。
本発明のＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ベクターに作動可能に連結されていてもよい。本発明のベクターは、プロモーター及び本発明の核酸以外に、エンハンサー（enhancer）などのシスエレメント（cis element）、スプライシングシグナル（splicing signal）、ポリＡ付加シグナル（poly A addition signal）、選択マーカー（selection marker）、リボソーム結合配列（ribosome binding sequence, SD sequence）などがさらに含まれてもよい。選択マーカーの例として、クロラムフェニコール抵抗性核酸、アンピシリン抵抗性核酸、ジヒドロ葉酸還元酵素（dihydrofolate reductase）、ネオマイシン抵抗性核酸などが挙げられるが、作動可能に連結される追加構成要素がこれらの例に限定されるものではない。本発明における「形質転換」とは、ＤＮＡを宿主に導入してＤＮＡが染色体の因子として又は染色体統合完成により複製可能になることであり、外部のＤＮＡを細胞内に導入して人為的に遺伝的な変化を起こす現象を意味する。
前記形質転換により、本発明のＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター又は前記発現ベクターの一部を宿主細胞内に導入することができるが、ここで前記発現ベクターの一部とは、宿主細胞内に前記ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質の活性を付与できるようにＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分を含む発現ベクターの部分を意味する。例えば、アグロバクテリウム媒介形質転換法において宿主細胞内に転移されるＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明の形質転換方法には任意の形質転換方法が用いられ、当業界の通常の方法で容易に行うことができる。一般に、形質転換方法には、ＣａＣｌ２沈殿法、ＣａＣｌ２法にＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）という還元物質を用いることにより効率を向上させたＨａｎａｈａｎ法、電気穿孔法（electroporation）、リン酸カルシウム沈殿法、原形質融合法、シリコンカーバイド繊維を用いた攪拌法、アグロバクテリウム媒介形質転換法、ＰＥＧを用いた形質転換法、デキストランサルフェート、リポフェクタミン及び乾燥／抑制媒介形質転換方法などがある。本発明のＵＤＰ−糖転移酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを形質転換する方法は、これらの例に限定されるものではなく、当業界で通常用いられる形質転換又はトランスフェクション方法が制限なく用いられる。
本発明において形質転換体の作製に用いられる宿主細胞の種類は、本発明のポリヌクレオチドを発現させるものであれば特に限定されるものではない。本発明に用いられる宿主の特定例としては、大腸菌（E. coli）などのエシェリキア（Escherichia）属細菌、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）などのバチルス（Bacillus）属細菌、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）などのシュードモナス（Pseudomonas）属細菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）などの酵母、動物細胞、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。本発明に用いられる大腸菌菌株の具体例としては、ＣＬ４１（ＤＥ３）、ＢＬ２１又はＨＢ１０１が挙げられ、バチルス・サブチリス菌株の具体例としては、ＷＢ７００又はＬＫＳ８７が挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入された形質転換体は、形質転換細胞又は生物体の形態であってもよい。特にこれらに限定されるものではないが、前記生物体の例としては、タバコ、シロイヌナズナ、ジャガイモ、高麗人参、ゴマ、ユズ、デイジーなどが挙げられる。
本発明のプロモーターは、本発明の核酸を宿主で発現させるものであれば、いかなるプロモーターを用いてもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの大腸菌又はファージ由来プロモーター、Ｔ７プロモーターなどの大腸菌感染性ファージ由来プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓ、ＭＡＳ又はヒストンプロモーターが用いられる。また、ｔａｃプロモーターなどの人工的に変異させたプロモーターも用いられる。
上記方法で形質転換された本発明のＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入された形質転換体は、ＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドの２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースに対して選択的な糖転移活性を有し、例えばＣＫのギペノシドＬＸＸＶへの変換、Ｆ２のギペノシドＸＶＩＩへの変換、ＲｄのＲｂ１への変換、Ｆ１のノトジンセノサイドＵへの変換、Ｒｇ１のノトジンセノサイドＲ３への変換、及びＲｅのグルコ−Ｒｅへの変換からなる群から選択される１つ以上の転移活性を有するが、これらに限定されるものではない。
また、本発明における「形質転換体の培養物」とは、前記形質転換体を培養して得た産物を意味する。前記培養物は、形質転換体を含む形態、及び前記形質転換体を含む培養液から遠心分離などで形質転換体を除去した形態をどちらも含む概念である。
前記培養物は、本発明のＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質を含むので、２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースを有するＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドをグリコシル化されたジンセノサイドに変換する活性を有し、例えばＣＫをギペノシドＬＸＸＶに、Ｆ２をギペノシドＸＶＩＩに、ＲｄをＲｂ１に、Ｆ１をノトジンセノサイドＵに、Ｒｇ１をノトジンセノサイドＲ３に、Ｒｅをグルコ−Ｒｅに変換することができる。
このように、本発明のＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクターが導入された形質転換体、又は前記形質転換体の培養物を用いて、２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースを有するＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドをグリコシル化されたジンセノサイドに変換することができるので、２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースがグリコシル化されたジンセノサイドが必要な分野、特にギペノシドＬＸＸＶ、ギペノシドＸＶＩＩ、Ｒｂ１、ノトジンセノサイドＵ、ノトジンセノサイドＲ３、グルコ−Ｒｅなどのジンセノサイドが必要な分野において上記方法が有用である。
本発明の一実施例においては、ＰＰＤ系及びＰＰＴ系ジンセノサイドの２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースに選択的にＵＤＰ−グルコースのグルコース部分を転移する活性を有し、配列番号１のアミノ酸配列で構成される新規なＵＤＰ−糖転移酵素をアマチャヅルから見出し、これをＧｐＵＧＴ２３と命名した（実施例１）。このようにして見出されたＧｐＵＧＴ２３タンパク質の酵素活性を解明するために、２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースを有する代表的なＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドである、ＣＫ、Ｆ２、Ｒｄ及びＦ１を用いて、本発明のＧｐＵＧＴ２３と反応させてその変換活性を確認した。その結果、本発明のＧｐＵＧＴ２３は、ＣＫをギペノシドＬＸＸＶに、Ｆ２をギペノシドＸＶＩＩに、ＲｄをＲｂ１に、Ｆ１をノトジンセノサイドＵに変換した（図２及び図４）。これに対して、２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースがなく、−ＯＨ基のみ有するＰＰＤ、Ｒｈ２、Ｒｇ３、ＰＰＴ及びＲｈ１には、本発明のＧｐＵＧＴ２３が糖転移を起こさないことが確認された（図３）。これは、ＧｐＵＧＴ２３がＰＰＤ系及びＰＰＴ系ジンセノサイドの２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースにグルコース部分を特異的に転移する活性を有することを示唆するものである。
本発明の他の態様は、ＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドの２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースに対して糖転移活性を有するＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターが導入された形質転換体、又は前記形質転換体の培養物を有効成分として含む、２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースを有するＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドをグリコシル化するための組成物を提供する。
前記ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質、ベクター、形質転換体、ＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイド、及びグリコシル化されたジンセノサイドについては前述した通りである。
本発明のさらに他の態様は、ＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドの２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースに対して糖転移活性を有するＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質を提供する。
前記ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質については前述した通りである。
本発明のさらに他の態様は、前記ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクターを含む形質転換細胞、前記形質転換細胞が含まれる、ヒトを除く生物体を提供する。
前記ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換細胞及び生物体については前述した通りである。
本発明のＵＤＰ−糖転移酵素は、ＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドの２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースに選択的に糖を転移する活性を有するタンパク質であるので、ギペノシドＬＸＸＶ、ギペノシドＸＶＩＩ、Ｒｂ１、ノトジンセノサイドＵなどの２０位の炭素に少なくとも２つの糖を有する特定のジンセノサイドの大量生産に有用である。
本発明のＧｐＵＧＴ２３により糖転移されるＰＰＤ系及びＰＰＴ系ジンセノサイドを例示する図である。 ＵＤＰ−糖転移酵素であるＧｐＵＧＴ２３がＰＰＤ系及びＰＰＴ系ジンセノサイドの２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースにグルコースを付加してグリコシル化する活性を有することを示すＴＬＣ（thin-layer chromatography）の結果である。具体的には、ＧｐＵＧＴ２３がＣＫ（Compound K）をギペノシドＬＸＸＶに、Ｆ２をギペノシドＸＶＩＩに、ＲｄをＲｂ１に、Ｆ１をノトジンセノサイドＵに変換することを示す図である。 ＵＤＰ−糖転移酵素であるＧｐＵＧＴ２３が２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースのないＰＰＤ系及びＰＰＴ系ジンセノサイドには糖転移を起こさないことを示すＨＰＬＣ（High performance liquid chromatography）の結果である。具体的には、２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースがなく、−ＯＨ基のみ有するＰＰＤ（Ａ）、Ｒｈ２（Ｂ）、Ｒｇ３（Ｃ）、ＰＰＴ（Ｄ）及びＲｈ１（Ｅ）にはＧｐＵＧＴ２３が糖転移を起こさないことを示す図である。 ＰＰＤ系及びＰＰＴ系ジンセノサイドの２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースにグルコースを付加してグリコシル化する活性を有することを示すＨＰＬＣの結果である。具体的には、ＧｐＵＧＴ２３がＣＫをギペノシドＬＸＸＶ（Ａ）に、Ｆ２をギペノシドＸＶＩＩ（Ｂ）に、ＲｄをＲｂ１（Ｃ）に、Ｆ１をノトジンセノサイドＵ（Ｄ）に変換することを示す図である。
以下、本発明を下記実施例により詳細に説明する。ただし、下記例は本発明を例示するためのものにすぎず、下記例に本発明の範囲が限定されるものではない。
実施例１：アマチャヅル由来ＵＤＰ−糖転移酵素ＧｐＵＧＴ２３のクローニング及び精製
アマチャヅル（Gynostemma pentaphyllum）ｃＤＮＡからＧｐＵＧＴ２３−Ｆ（５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＡＡＡＴＴＴＴＧＡＴＧＴＴＴＣＣ−３’，配列番号３）、ＧｐＵＧＴ２３−Ｒ（５’−ＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＴＡＴＴＴＴＴＧＣＴＴＧＡＣＡＡＡＧＣ−３’，配列番号４）プライマーを用いて、重合酵素によりＰＣＲで遺伝子を増幅し、制限酵素であるＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩにより遺伝子の各末端を切断した。その後、ｐＥＴ５０（非特許文献４）ベクターにクローニングして発現ベクターを作製し、これを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ＲＩＬ菌株に形質転換してＧｐＵＧＴ２３発現菌株を作製した。この菌株をＩＰＴＧでタンパク質発現を誘導し、その後タンパク質を得て、これをＮｉ−ＮＴＡ Ｈｉｓ−結合レジンを用いてＧｐＵＧＴ２３酵素を精製した。
実施例２：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素アッセイ
精製されたＧｐＵＧＴ２３（３０μｇ）、ジンセノサイド化合物（５ｍＭ）及びＵＤＰ−グルコース（５０ｍＭ）を含む反応緩衝液（１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液，ｐＨ７）において糖転移酵素アッセイを行った。このために、４つの異なる種類のジンセノサイド、すなわちＣＫ（Compound K）、Ｆ２、Ｒｄ及びＦ１を用いて、本発明の酵素と反応させた。
反応混合物は３７℃で１２時間培養して反応させ、その後その産物をＴＬＣ（thin-layer chromatography）又はＨＰＬＣ（high performance liquid chromatography）で分析した。
ＴＬＣ分析は移動相（アセトン：メタノール：ＤＤＷ＝６５：３５：１０ ｖｏｌ／ｖｏｌ）と共に６０Ｆ２５４シリカゲルプレート（Merck, Germany）を用いて行った。ＴＬＣプレートの溶解した生成物（resolved product）を１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）硫酸（Ｈ２ＳＯ４）に噴射して検出し、次いで１１０℃で５分間加熱した（図２）。
ＨＰＬＣ分析は、ＯＤＳ（２）Ｃ１８カラム（Phenomenex, USA）を用いて行った。水及びアセトニトリルの勾配適用（gradient application）時間と成分比は、１分当たり１ｍｌの流速で、０分、６８％水及び３２％アセトニトリル；８分、３５％水及び６５％アセトニトリル；１２分、０％水及び１００％アセトニトリル；２０分、０％水及び１００％アセトニトリル；２０．１分、６８％水及び３２％アセトニトリル；及び２８分、６８％水及び３２％アセトニトリル（図３及び図４）であった。
ジンセノサイドは、ＵＶ感知器（Agilent,USA）を用いて２０３ｎｍ波長でモニターした。
実験例１：ＧｐＵＧＴ２３のＰＰＤ系及びＰＰＴ系ジンセノサイドの２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースに特異的な糖転移酵素活性の確認
実施例２の方法でＧｐＵＧＴ２３の基質特異性及び位置特異性（regioselectivity）の有無を確認した。
まず、実施例１の組換えＧｐＵＧＴであるＧｐＵＧＴ２３をＵＤＰ−グルコース存在下で９種のジンセノサイド（ＰＰＤ、Ｒｈ２、Ｒｇ３、ＣＫ、Ｆ２、Ｒｄ、ＰＰＴ、Ｆ１及びＲｈ１）を用いて反応させたときに、ＣＫ、Ｆ２、Ｒｄ及びＦ１において反応が起こることをＴＬＣにより確認した。
これを再確認するために、異なる４種類のジンセノサイド（ＣＫ、Ｆ２、Ｒｄ及びＦ１）とＧｐＵＧＴ２３を共に培養して反応させ、その後前記組換えＧｐＵＧＴ２３により変換された生成物をＴＬＣで分析した。その結果を図２に示す。変換結果は、移動したスポット（migrating spot）の位置と、標準試料として用いたＣＫ、Ｇｙｐ７５（ギペノシドＬＸＸＶ）、Ｆ２、Ｇｙｐ１７（ギペノシドＸＶＩＩ）、Ｒｄ、Ｒｂ１及びＦ１が移動したスポットの位置を比較して確認した。
その結果、ＧｐＵＧＴ２３は、ＣＫをギペノシドＬＸＸＶに、Ｆ２をギペノシドＸＶＩＩに、ＲｄをＲｂ１に、Ｆ１をノトジンセノサイドＵにそれぞれ変換することが分かった（図２）。
また、本発明者らは、ＴＬＣにより確認した結果をＨＰＬＣにより再確認した。その結果を図３及び図４に示す。
その結果、本発明のＧｐＵＧＴ２３は、ＴＬＣの結果と同様に、ＰＰＤ、Ｒｈ２、Ｒｇ３、ＰＰＴ及びＲｈ１とは反応せず（図３）、ＣＫ、Ｆ２、Ｒｄ及びＦ１のみをギペノシドＬＸＸＶ、ギペノシドＸＶＩＩ、Ｒｂ１及びノトジンセノサイドＵに変換した（図４）。
上記結果は全て、ＧｐＵＧＴ２３がＰＰＤ系及びＰＰＴ系ジンセノサイドの２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースにＵＤＰ−グルコースを転移する活性を有する酵素であることを示すものである。
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書ではなく特許請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。

Claims (12)

  1. ２０位の炭素にグリコシド結合（glycosidic bond）で連結されたグルコースを有するＰＰＤ（protopanaxadiol）系又はＰＰＴ（protopanaxatriol）系ジンセノサイドと、配列番号１のアミノ酸配列からなるＵＤＰ−糖転移酵素（uridine diphosphate glycosyltransferase）タンパク質、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む形質転換体、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む形質転換体、又は前記タンパク質を含む前記形質転換体の培養物とを反応させることを含む、２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースがグリコシル化された、ＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドを製造する方法。
  2. 前記２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースを有するＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドは、ＣＫ（compound K）、Ｆ２、Ｒｄ、Ｆ１、Ｒｇ１及びＲｅからなる群から選択される１つ以上である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記グリコシル化されたジンセノサイドの製造は、ＣＫのギペノシド（Gypenoside）ＬＸＸＶへの変換、Ｆ２のギペノシド（Gypenoside）ＸＶＩＩへの変換、ＲｄのＲｂ１への変換、Ｆ１のノトジンセノサイド（Notoginsenoside）Ｕへの変換、Ｒｇ１のノトジンセノサイド（Notoginsenoside）Ｒ３への変換、及びＲｅのグルコ−Ｒｅ（gluco-Re）への変換からなる群から選択される１つ以上の変換過程を含む、請求項１に記載の方法。
  4. ２０位の炭素にグリコシド結合（glycosidic bond）で連結されたグルコースを有するＰＰＤ（protopanaxadiol）系又はＰＰＴ（protopanaxatriol）系ジンセノサイドと、配列番号１のアミノ酸配列からなるＵＤＰ−糖転移酵素（uridine diphosphate glycosyltransferase）タンパク質、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む形質転換体、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む形質転換体、又は前記タンパク質を含む前記形質転換体の培養物とを反応させることを含む、２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースを有するＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドをグリコシル化するための方法。
  5. 前記２０位の炭素にグリコシド結合で連結されたグルコースを有するＰＰＤ系又はＰＰＴ系ジンセノサイドは、ＣＫ（compound K）、Ｆ２、Ｒｄ、Ｆ１、Ｒｇ１及びＲｅからなる群から選択される１つ以上である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記グリコシル化は、ＣＫのギペノシド（Gypenoside）ＬＸＸＶへのグリコシル化、Ｆ２のギペノシド（Gypenoside）ＸＶＩＩへのグリコシル化、ＲｄのＲｂ１へのグリコシル化、Ｆ１のノトジンセノサイド（Notoginsenoside）Ｕへのグリコシル化、Ｒｇ１のノトジンセノサイド（Notoginsenoside）Ｒ３へのグリコシル化、及びＲｅのグルコ−Ｒｅ（gluco-Re）へのグリコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのグリコシル化である、請求項４に記載の方法。
  7. 配列番号１のアミノ酸配列からなる、分離したＵＤＰ−糖転移酵素（Uridine diphosphate-glycosyltransferase）タンパク質。
  8. 前記タンパク質は、ＰＰＤ（protopanaxadiol）系又はＰＰＴ（protopanaxatriol）系ジンセノサイドの２０位の炭素にグリコシド結合（glycosidic bond）で連結されたグルコースに対して糖転移活性を有する、請求項７に記載のＵＤＰ−糖転移酵素（uridine diphosphate glycosyltransferase）タンパク質。
  9. 請求項７のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  10. 請求項９のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  11. 請求項１０の発現ベクターを含む形質転換細胞。
  12. 請求項１１の形質転換細胞が含まれる、ヒトを除く生物体。
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