CN114829577A - 葡萄糖醛酸转移酶、编码该酶的基因及其利用方法 - Google Patents

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Abstract

鉴定对齐墩果烷型三萜类化合物的3位的羟基催化葡萄糖醛酸转移的葡萄糖醛酸第1转移酶的基因。提供来源于豆科植物(大豆、甘草、和日本百脉根)、分别包含序列号2、4和6所示的碱基序列的具有目的活性的葡萄糖醛酸第1转移酶基因。

Description

葡萄糖醛酸转移酶、编码该酶的基因及其利用方法
技术领域
本发明涉及对齐墩果烷型三萜类化合物中的3位的羟基转移葡萄糖醛酸的酶、编码该酶的基因、和甘草皂苷的制造方法。
背景技术
甘草(Glycyrrhiza uralensis)是豆科的多年生草本植物。该植物的根部和匍匐茎(stolon：地下茎)作为中医上重要的草药“甘草”已知，在世界上被广泛利用。甘草的主活性成分是作为齐墩果烷型三萜类化合物皂苷的甘草皂苷(glycyrrhizin)(非专利文献1)。关于甘草皂苷，从其草药学的、药理学的有用性、和育种学的研究等各个侧面进行了研究。
为了通过生物生产系统稳定且持续地提供优质的甘草皂苷作为药物，需要使用参与甘草皂苷的生物合成系统的基因、该基因的表达量作为标志物，通过最适产生条件的确立、甘草皂苷高生产株的筛选或合成酶基因的导入而进行甘草皂苷高产生植物的育种等。因此，参与甘草皂苷的生物合成系统的基因群的鉴定是不可缺少的。
甘草皂苷在植物中都含有，以属于齐墩果烷型三萜类化合物的β-香树脂醇作为起始物质，通过2阶段的氧化反应和2阶段的糖基化反应来生物合成。所谓β-香树脂醇，已知是在三萜类化合物皂苷生物合成系统中成为甘草皂苷与大豆皂苷I(soyasaponin I)的生物合成分支点的前体物质(图1)。
如图2所示，关于由β-香树脂醇合成甘草皂苷的合成酶，到目前为止已知分别催化用于由β-香树脂醇生物合成作为甘草皂苷的苷元(非糖部)的甘草次酸的上述2阶段的氧化反应的2种氧化酶CYP88D6(专利文献1)和CYP72A154(专利文献2)，以及对所得的甘草次酸催化上述2阶段的糖基化反应而生物合成甘草皂苷的合成酶基因中催化第2阶段的糖转移酶UGT73P12(专利文献3)。但是，对于催化对甘草次酸直接转移葡萄糖醛酸的第1阶段的糖基化反应的糖转移酶、即葡萄糖醛酸第1转移酶，虽然大量的本领域技术人员多次尝试了其分离，但到目前为止完全没有得到。因此，成为由β-香树脂醇利用生物生产系统、体外(invitro)合成系统合成甘草皂苷上的瓶颈，不能稳定且持续地获得充分量的甘草皂苷。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第5526323号
专利文献2：日本专利第5771846号
专利文献3：日本专利第6344774号
非专利文献
非专利文献1：Gibson,M.R.,1978,Lloydia-the journal of Natural Products,41(4):348-354
发明内容
发明要解决的课题
本发明为了解决上述课题，而分离催化对以甘草次酸为代表的齐墩果烷型三萜类化合物的3位的羟基转移葡萄糖醛酸的葡萄糖醛酸第1转移酶的基因，并且使用该基因表达系统制作、提供能够在个体内或细胞内由β-香树脂醇大量地生物合成甘草皂苷的生物表达系统。
用于解决课题的手段
为了鉴定在由β-香树脂醇向甘草皂苷的生物合成途径中最后剩下的葡萄糖醛酸第1转移酶，大量本领域技术人员尝试了从甘草的分离，但不能整个长度地进行鉴定。于是，本发明者们考虑，在由甘草属植物的葡萄糖醛酸第1转移酶的分离中，存在某些阻碍因素，尝试了从甘草属植物以外的植物分离葡萄糖醛酸第1转移酶的战略。在甘草属植物所述的豆科植物中，一般存在由β-香树脂醇经由大豆皂醇B作为中间产物生物合成大豆皂苷I的途径(图1)。作为齐墩果烷型三萜类化合物的大豆皂醇B在3位具有羟基，但作为最终产物的大豆皂苷I在3位结合有葡萄糖醛酸。这与作为中间产物的也是齐墩果烷型三萜类化合物的甘草次酸在3位具有羟基、与此相对作为最终产物的甘草皂苷的3位结合有葡萄糖醛的情况相同。即，在由β-香树脂醇向甘草皂苷的生物合成途径中发挥功能的葡萄糖醛酸第1转移酶，可能在由β-香树脂醇向大豆皂苷I的生物合成途径中也发挥功能。本发明者们基于该假说，尝试了从具有由β-香树脂醇向大豆皂苷I的生物合成途径的大豆鉴定能够具有葡萄糖醛酸第1转移活性的基因，结果成功地分离出具体的功能未知的纤维素合成酶类似基因。以大豆皂醇B作为糖受体底物验证了该酶的糖转移活性，结果表明对大豆皂醇B的3位的羟基糖转移葡萄糖醛酸。该酶活性在糖受体底物为甘草次酸的情况下也同样。这样，本发明者们通过将来源植物不是甘草属植物、而是变成大豆，从而成功地鉴定出到目前为止不能分离的葡萄糖醛酸第1转移酶。本发明是基于该研究结果的，提供以下(1)至(15)。
(1)包含以下的(a)～(c)所示的任一氨基酸序列的多肽或其片段，该多肽或其片段具有对齐墩果烷型三萜类化合物中的3位的羟基转移葡萄糖醛酸的活性，
(a)序列号1、3和5的任一项所示的氨基酸序列、
(b)在序列号1、3和5的任一项所示的氨基酸序列中缺失、替换或者添加了1个或者多个氨基酸的氨基酸序列、或
(c)与序列号1、3和5的任一项所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。
(2)根据(1)所述的多肽，所述齐墩果烷型三萜类化合物从β-香树脂醇、11-氧代-β-香树脂醇、30-羟基-11-氧代-β-香树脂醇、30-羟基-β-香树脂醇、24-羟基-β-香树脂醇、11-脱氧甘草次酸、甘草次酸、齐墩果酸、苜蓿酸、大豆皂醇B、大豆皂醇A、常春藤皂苷元、山茶皂苷元和柴胡皂苷元中选择。
(3)根据(1)或(2)所述的多肽，来源于豆科(Fabaceae)植物。
(4)编码(1)～(3)的任一项所述的多肽的多核苷酸。
(5)根据(4)所述的多核苷酸，包含以下的(a)～(d)所示的任一碱基序列。
(a)序列号2、4和6的任一项所示的碱基序列、
(b)在序列号2、4和6的任一项所示的碱基序列中缺失、替换或者添加了1个或者多个碱基的碱基序列、
(c)与序列号2、4和6的任一项所示的碱基序列具有80％以上的同一性的碱基序列、或
(d)与序列号2、4和6的任一项所示的碱基序列的互补碱基序列在高严格条件下杂交的碱基序列
(6)CSyGT表达载体，包含(4)或(5)所述的多核苷酸。
(7)包含(4)或(5)所述的多核苷酸或(6)所述的CSyGT表达载体的转化体或其后代，所述后代保持有所述多核苷酸或所述CSyGT表达载体。
(8)根据(7)所述的转化体或其后代，宿主是豆科(Fabaceae)植物。
(9)根据(7)所述的转化体或其后代，宿主是酵母。
(10)由(9)所述的转化体或其后代得到的、添加有酵母来源的糖链的(1)～(3)的任一项所述的多肽。
(11)根据(10)所述的多肽，所述酵母来源的糖链是高甘露糖型糖链。
(12)具有对齐墩果烷型三萜类化合物中的葡萄糖醛酸的2位的羟基转移葡萄糖醛酸的活性的多肽的制造方法，所述方法包括：培养(7)或(8)所述的转化体或其后代的工序、和从所述的培养物提取(1)～(3)的任一项所述的多肽的工序。
(13)甘草皂苷制造用的基因重组体，能够生物合成β-香树脂醇，并且包含以下的(A)～(D)所示的全部表达载体。
(A)具有氧化齐墩果烷型三萜类化合物中的11位的活性、并且包含含有以下的(a)～(c)所示的任一氨基酸序列的多肽的CYP88D6表达载体、
(a)序列号7所示的氨基酸序列、
(b)在序列号7所示的氨基酸序列中缺失、替换或者添加了1个或者多个氨基酸的氨基酸序列、或
(c)与序列号7所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列、
(B)具有氧化齐墩果烷型三萜类化合物中的30位的活性、并且包含含有以下的(d)～(f)所示的任一氨基酸序列的多肽的CYP72A154表达载体、
(d)序列号9、11和13的任一项所示的氨基酸序列、
(e)在序列号9、11和13的任一项所示的氨基酸序列中缺失、替换或者添加1个或者多个氨基酸的氨基酸序列、或
(f)与序列号9、11和13的任一项所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列、
(C)具有对齐墩果烷型三萜类化合物单葡糖苷酸中的葡萄糖醛酸的2位的羟基转移葡萄糖醛酸的活性、并且包含含有以下的(g)～(i)所示的任一氨基酸序列的多肽的UGT73P12表达载体、
(g)序列号15所示的氨基酸序列、
(h)在序列号15所示的氨基酸序列中缺失、替换或者添加了1个或者多个氨基酸的氨基酸序列、或
(i)与序列号15所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列、和
(D)(6)所述的CSyGT表达载体
(14)根据(13)所述的基因重组体，宿主是豆科植物。
(15)由β-香树脂醇制造甘草皂苷的制造方法，所述制造方法包括培养(13)或(14)所述的基因重组体的工序。
本说明书包含成为本申请的优先权基础的日本申请2019-190060号的公开内容。
发明的效果
根据本发明，能够提供具有对齐墩果烷型三萜类化合物中的3位的羟基转移葡萄糖醛酸的活性的多肽、编码该多肽的多核苷酸、或它们的利用方法。
附图说明
图1显示三萜类化合物皂苷生物合成系统中的甘草皂苷和大豆皂苷I的生物合成途径。
图2显示在由β-香树脂醇到甘草皂苷的生物合成途径中作为中间产物产生的各齐墩果烷型三萜类化合物、参与各转换反应的已知的酶(CYP88D6、CYP72A154、和UGT73P12)、和本说明书中新鉴定出的葡萄糖醛酸第1转移酶CSyGT的催化位置。
图3是显示在实施例中在大豆Glyma.06G324300、以及甘草和日本百脉根来源的Glyma.06G324300同源蛋白质的功能分析中使用的三萜类化合物生产酵母株的概念图。(a)的酵母株能够通过同时表达β-香树脂醇合成酶基因(日本百脉根来源)、CYP88D6(甘草来源)、CYP72A63(蒺藜苜蓿来源)而由酵母内在的2,3-环氧角鲨烯在细胞内生产甘草次酸。(b)的酵母株能够通过同时表达β-香树脂醇合成酶基因(日本百脉根来源)、CYP93E3(甘草来源)、CYP72A566(甘草来源)而由酵母内在的2,3-环氧角鲨烯在细胞内生产大豆皂醇B。
图4是显示导入了Glyma.06G324300和同源基因的甘草次酸生产酵母的代谢物分析结果的图。(a)的样品A是通过使大豆来源的Glyma.06G324300在甘草次酸生产酵母内表达而生成的甘草次酸单葡糖苷酸的检测结果，(b)的样品B是通过使甘草来源的Glyur003152s00037491在甘草次酸生产酵母内表达而生成的甘草次酸单葡糖苷酸的检测结果，(c)的样品C是通过使日本百脉根来源的Lj3g3v1981230在甘草次酸生产酵母内表达而生成的甘草次酸单葡糖苷酸的检测结果。黑箭头的峰表示甘草次酸单葡糖苷酸。另外(d)的样品D是导入了作为阴性对照的空载体的甘草次酸生产酵母中的检测结果。
图5是显示导入了Glyma.06G324300和同源基因的大豆皂醇B生产酵母的代谢物分析结果的图。(a)的样品E是通过使大豆来源的Glyma.06G324300在大豆皂醇B生产酵母内表达而生成的大豆皂醇B单葡糖苷酸的检测结果，(b)的样品F是通过使甘草来源的Glyur003152s00037491在大豆皂醇B生产酵母内表达而生成的大豆皂醇B单葡糖苷酸的检测结果，(c)的样品G是通过使日本百脉根来源的Lj3g3v1981230在大豆皂醇B生产酵母内表达而生成的大豆皂醇B单葡糖苷酸的检测结果。黑箭头的峰表示大豆皂醇B单葡糖苷酸。另外(d)的样品H是导入了作为阴性对照的空载体的大豆皂醇B生产酵母中的检测结果。
图6是显示底物喂养实验(substrate feeding experiment)的概要的图。为了在细胞内供应作为糖供体底物的UDP-葡萄糖醛酸，使拟南芥的UDP-葡萄糖脱氢酶(AtUGD)与Glyma.06G324300及其同源基因在酵母内同时表达。(a)是对酵母培养液加入甘草次酸时的向单葡糖苷酸的转换反应图，另外(b)是对酵母培养液加入大豆皂醇B时的向单葡糖苷酸的转换反应图。
图7是显示喂养了甘草次酸的大豆来源的Glyma.06G324300导入酵母中的代谢物分析结果的图。(a)是使用Glyma.06G324300时向甘草次酸单葡糖苷酸的假想的转换反应概念图。(b)表示转换前的甘草次酸的检测结果。白箭头的峰表示甘草次酸。(c)显示由Glyma.06G324300生成的甘草次酸单葡糖苷酸的检测结果。黑箭头的峰表示甘草次酸单葡糖苷酸。
图8是显示喂养了甘草次酸的甘草来源的Glyur003152s00037491导入酵母中的代谢物分析结果的图。(a)是使用Glyur003152s00037491时向甘草次酸单葡糖苷酸的假想的转换反应概念图。(b)显示转换前的甘草次酸的检测结果。白箭头的峰表示甘草次酸。(c)显示由Glyur003152s00037491生成的甘草次酸单葡糖苷酸的检测结果。黑箭头的峰表示甘草次酸单葡糖苷酸。
图9是显示喂养了甘草次酸的日本百脉根来源的Lj3g3v1981230导入酵母中的代谢物分析结果的图。(a)是使用Lj3g3v1981230时向甘草次酸单葡糖苷酸的假想的转换反应概念图。(b)显示转换前的甘草次酸的检测结果。白箭头的峰表示甘草次酸。(c)显示由Lj3g3v1981230生成的甘草次酸单葡糖苷酸的检测结果。黑箭头的峰表示甘草次酸单葡糖苷酸。
图10是作为图7～9的阴性对照，显示喂养了甘草次酸的空载体导入酵母中的代谢物分析结果的图。(a)是使用空载体时的向甘草次酸单葡糖苷酸的假想的转换反应概念图。由于没有酶活性，因而假想甘草次酸单葡糖苷酸不生成。(b)显示反应前的甘草次酸的检测结果。白箭头的峰表示甘草次酸。(c)表示反应后的甘草次酸单葡糖苷酸的检测结果。黑箭头的峰表示甘草次酸单葡糖苷酸。虚线箭头表示在生成了甘草次酸单葡糖苷酸的情况下的峰发生位置。
图11是显示喂养了大豆皂醇B的Glyma.06G324300及其同源基因导入酵母的代谢物分析结果的图。(a)是由大豆皂醇B向大豆皂醇B单葡糖苷酸的假想的转换反应的概念图。(b)显示由大豆来源的Glyma.06G324300生成的大豆皂醇B单葡糖苷酸的检测结果。黑箭头的峰表示大豆皂醇B单葡糖苷酸。(c)显示由甘草来源的Glyur003152s00037491生成的大豆皂醇B单葡糖苷酸的检测结果。黑箭头的峰表示大豆皂醇B单葡糖苷酸。(d)显示由日本百脉根来源的Lj3g3v1981230生成的大豆皂醇B单葡糖苷酸的检测结果。黑箭头的峰表示大豆皂醇B单葡糖苷酸。(e)是上述(b)～(d)的阴性对照。
图12-1是显示日本百脉根的Glyma.06G324300同源基因功能缺损突变体提取物的LC-PDA/MS/MS分析结果的图。(a)显示野生型(Gifu)来源的植物体提取物的基峰离子色谱图，(b)和(c)显示转座子插入纯合突变体(分别为30006020、30115796)来源的植物体提取物的基峰离子色谱图。
图12-2是显示日本百脉根的Glyma.06G324300同源基因功能缺损突变体提取物的LC-PDA/MS/MS分析结果的图。(a)显示野生型(Gifu)来源的植物体提取物的总离子色谱图，(b)和(c)显示转座子插入纯合突变体(分别为30006020、30115796)来源的植物体提取物的总离子色谱图。
图13是显示了导入了Glyma.06G324300同源基因的功能缺损突变体毛状根的LC-PDA/MS/MS分析结果的图。(a)显示对野生型(Gifu)导入了空载体(pG35N_empty)的株的毛状根提取物的总离子色谱图，(b)～(e)显示对Glyma.06G324300同源基因功能缺损纯合突变体(30115796)株分别导入了pG35N_empty、表达载体pG35N-GmCSL、pG35N-GuCSL、和pG35N-LjCSL的转化体来源的毛状根提取物的总离子色谱图。
图14是显示导入了紫云英Glyma.06G324300种间同源基因和大豆Glyma.06G324300种内同源基因的甘草次酸生产酵母中的代谢物分析结果的图。(a)的样品Q是通过使作为紫云英来源的Glyma.06G324300种间同源基因的AsCSyGT基因在甘草次酸生产酵母内表达而生成的甘草次酸单葡糖苷酸的检测结果，(b)的样品R是通过使作为大豆来源的Glyma.06G324300种内同源基因的Glyma04g255400基因在甘草次酸生产酵母内表达而生成的甘草次酸单葡糖苷酸的检测结果，(c)的样品S是通过使作为大豆来源的Glyma.06G324300种内同源基因的Glyma.11g151800基因在甘草次酸生产酵母内表达而生成的甘草次酸单葡糖苷酸的检测结果。黑箭头的峰表示甘草次酸单葡糖苷酸。
图15是显示导入了紫云英Glyma.06G324300种间同源基因和大豆Glyma.06G324300种内同源基因的大豆皂醇B酸生产酵母中的代谢物分析结果的图。(a)的样品T是通过使紫云英来源的AsCSyGT基因在大豆皂醇B生产酵母内表达而生成的大豆皂醇B单葡糖苷酸的检测结果，(b)的样品U是通过使大豆来源的Glyma04g255400基因在大豆皂醇B生产酵母内表达而生成的大豆皂醇B单葡糖苷酸的检测结果，(c)的样品V是通过使大豆来源的Glyma.11g151800基因在大豆皂醇B生产酵母内表达而生成的大豆皂醇B单葡糖苷酸的检测结果。黑箭头的峰表示大豆皂醇B单葡糖苷酸。
图16是显示喂养了乌苏酸的大豆来源的Glyma.11g151800基因导入酵母中的代谢物分析结果的图。(a)是使用Glyma.11g151800喂养试验提取物(样品W)时的向乌苏酸单葡糖苷酸的假想的转换反应概念图。(b)显示加入了样品W时由Glyma.11g151800生成的乌苏酸单葡糖苷酸的检测结果。黑箭头的峰表示乌苏酸单葡糖苷酸。(c)显示加入了作为阴性对照的样品X时的乌苏酸单葡糖苷酸的检测结果。
图17是显示喂养了白桦脂酸的大豆来源的Glyma.11g151800基因导入酵母中的代谢物分析结果的图。(a)是使用Glyma.11g151800喂养试验提取物(样品Y)时的向白桦脂酸单葡糖苷酸的假想的转换反应概念图。(b)显示加入了样品Y时由Glyma.11g151800生成的白桦脂酸单葡糖苷酸的检测结果。黑箭头的峰表示白桦脂酸单葡糖苷酸。(c)显示加入了作为阴性对照的样品Z时的白桦脂酸单葡糖苷酸的检测结果。
具体实施方式
1.葡萄糖醛酸第1转移酶(CSyGT)
1-1.概要
本发明的第1方案涉及葡萄糖醛酸第1转移酶和具有葡萄糖醛酸第1转移活性的其片段、以及编码它们的核酸。本发明的葡萄糖醛酸第1转移酶在由大量植物能够生物合成的β-香树脂醇生物合成甘草皂苷的甘草属特有的合成途径中，具有催化对由β-香树脂醇经过2阶段的氧化反应而得的甘草次酸的3位的羟基进行的葡萄糖醛酸的糖基化反应的活性。通过本发明的葡萄糖醛酸第1转移酶等，不仅能够对以甘草次酸为代表的齐墩果烷型三萜类化合物的3位的羟基糖转移葡萄糖醛酸，而且通过与参与由β-香树脂醇到甘草皂苷的生物合成途径的已知的酶组合，能够制作出以甘草属植物以外的植物作为宿主的由β-香树脂醇到甘草皂苷的生物生产系统。由此，能够稳定且持续地提供优质的甘草皂苷。
1-2.术语的定义
对于在本说明书频繁使用的以下的术语进行定义。
本说明书中，所谓“葡萄糖醛酸第1转移酶(CSyGT)”(本说明书中经常表述为“CSyGT”)，是指针对在3位的碳具有羟基的齐墩果烷型三萜类化合物，催化对其羟基转移1个作为糖的一种的葡萄糖醛酸的糖转移反应的酶。这里所谓的“第1”，是指在齐墩果烷型三萜类化合物的3位的羟基中的2阶段的糖转移反应中，具有最初的糖转移活性。关于葡萄糖醛酸第1转移酶的具体构成后述。
本说明书中，所谓“具有葡萄糖醛酸第1转移活性的其片段”，是指上述葡萄糖醛酸第1转移酶的活性片段。
本说明书中，所谓“葡萄糖醛酸第1转移活性”，是指上述CSyGT所具有的催化糖转移反应的活性、即对齐墩果烷型三萜类化合物的3位的羟基转移葡萄糖醛酸的活性。通过该活性，由齐墩果烷型三萜类化合物生成齐墩果烷型三萜类化合物单葡糖苷酸。此外，本说明书中经常将CSyGT和具有葡萄糖醛酸第1转移活性的其片段一并表述为“具有葡萄糖醛酸第1转移活性的多肽”或“葡萄糖醛酸第1转移酶等(CSyGT等)”。此外，本说明书中，葡萄糖醛酸第1转移酶等可以是添加了不同的糖链的糖蛋白质。例如，添加了植物来源的糖链的葡萄糖醛酸第1转移酶等、和添加了酵母来源的糖链的葡萄糖醛酸第1转移酶等均包含在本说明书中的葡萄糖醛酸第1转移酶等。
所谓“齐墩果烷型三萜类化合物”，是指具有5环性的齐墩果烷骨格、包含6个异戊二烯单元的C30的类异戊二烯。本发明中相当于作为最终目的物的甘草皂苷的非糖部分(苷元)。本说明书中记载的齐墩果烷型三萜类化合物只要不特别说明，就指3位的碳具有羟基(OH基)的齐墩果烷型三萜类化合物。作为齐墩果烷型三萜类化合物的具体例，不限定，但可列举β-香树脂醇、11-氧代-β-香树脂醇、30-羟基-11-氧代-β-香树脂醇、30-羟基-β-香树脂醇、24-羟基-β-香树脂醇、11-脱氧甘草次酸、甘草次酸、齐墩果酸、苜蓿酸、大豆皂醇B、大豆皂醇A、常春藤皂苷元、山茶皂苷元、和柴胡皂苷元。这些全部可以成为本发明的葡萄糖醛酸第1转移酶的底物。通过葡萄糖醛酸第1转移活性，由上述底物合成β-香树脂醇-3-O-单葡糖苷酸、11-氧代-β-香树脂醇-3-O-单葡糖苷酸、30-羟基-11-氧代-β-香树脂醇-3-O-单葡糖苷酸、30-羟基-β-香树脂醇-3-O-单葡糖苷酸、24-羟基-β-香树脂醇-3-O-单葡糖苷酸、11-脱氧甘草次酸-3-O-单葡糖苷酸、甘草次酸-3-O-单葡糖苷酸、齐墩果酸-3-O-单葡糖苷酸、苜蓿酸-3-O-单葡糖苷酸、大豆皂醇B-3-O-单葡糖苷酸、大豆皂醇A-3-O-单葡糖苷酸、常春藤皂苷元-3-O-单葡糖苷酸、山茶皂苷元-3-O-单葡糖苷酸、和柴胡皂苷元-3-O-单葡糖苷酸。
本说明书中，豆科(Fabaceae)植物不限于甘草属植物，包含植物分类学上属于豆科的全部植物种。例如，落花生属(Arachis)植物、鹰嘴豆属(Cicer)植物、松雀花属(Aspalathus)植物、黄檀属(Dalbergia)植物、紫檀属(Pterocarpus)植物、山蚂蝗属(Desmodium)植物、胡枝子属(Lespedeza)植物、狸尾豆属(Uraria)植物、山羊豆族(Galegeae)植物、黄芪属(Astragalus)植物、甘草属(Glycyrrhiza)植物、棘豆属(Oxytropis)植物、阿特拉斯金雀属(Augyrocytisus)植物、金雀儿属(Cytisus)植物、染料木属(Genista)植物、鹰爪豆属(Spartium)植物、岩黄蓍属(Hedysarum)植物、瓜儿豆属(Cyamopsis)植物、木蓝属(Indigofera)植物、百脉根属(Lotus)植物、羽扇豆属(Lupinus)植物、紫藤属(Wisteria)植物、木豆属(Cajanus)植物、刀豆属(Canavalia)植物、刺桐属(Erythrina)植物、大豆属(Glycine)植物、紫珊豆属(Hardenbergia)植物、扁豆属(Lablab)植物、黧豆属(Mucuna)植物、菜豆属(Phaseolus)植物、四棱豆属(Psophocarpus)植物、葛属(Pueraria)植物、豇豆属(Vigna)植物、刺槐属(Robinia)植物、栗豆属(Castanospermum)植物、马鞍树属(Maackia)植物、红豆属(Ormosia)植物、槐属(Sophora)植物、肉果亚属(Styphnolobium)植物、苜蓿属(Medicago)植物、胡卢巴属(Trigonella)植物、车轴草属(Trifolium)植物、山黧豆属(Lathyrus)植物、兵豆属(Lens)植物、豌豆属(Pisum)植物和野豌豆属(Vicia)植物。甘草(G.uralensis)所属的甘草属植物以及作为其亲缘种的苜蓿属植物在生物合成甘草皂苷方面具有成为CSyGT的底物的甘草次酸的生物合成途径。因此，作为本发明的豆科植物是优选的。作为甘草属植物的具体例，可列举G.glabra(光果甘草)、G.inflata(胀果甘草)、G.aspera(粗毛甘草)、G.eurycarpa(黄甘草)、G.pallidiflora(刺果甘草)、G.yunnanensis(云南甘草)、G.lepidota(北美甘草)、G.echinata(刺果甘草)、和G.acanthocarpa(刺甘草)等，另外作为苜蓿属植物的具体例，可列举M.truncatula(蒺藜苜蓿)等。
1-3.构成
本发明的葡萄糖醛酸第1转移酶(CSyGT)是由序列号1、3和5的任一项所示的氨基酸序列组成的多肽。这些多肽分别相当于大豆(Glycine max)来源的野生型CSyGT(GmCSyGT)、甘草(G.uralensis；乌拉尔甘草)来源的野生型CSyGT(GuCSyGT)、和日本百脉根(Lotus japonicus)来源的野生型CSyGT(LjCSyGT)。甘草来源的GuCSyGT相对于大豆来源的GmCSyGT具有81％的氨基酸同一性。另外日本百脉根来源的LjCSyGT相对于大豆来源的GmCSyGT具有82％的氨基酸同一性。
CSyGT除了前述的植物种以外，还可以在其他大量的植物种、特别是豆科(Fabaceae)植物种中存在种间同源。本发明的CSyGT除了这样的他种野生型CSyGT种间同源之外，也包含具有葡萄糖醛酸第1转移活性的同种野生型CSyGT种内同源、突变型CSyGT。作为这些他种野生型CSyGT种间同源、突变型CSyGT的例子，可列举在序列号1、3和5的任一项所示的氨基酸序列中缺失、替换或者添加了1个或者多个氨基酸的氨基酸序列，或相对于序列号1、3和5的任一项所示的氨基酸序列具有80％以上、82％以上、85％以上、87％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上、且小于100％的氨基酸同一性的多肽。实际上，相对于大豆GmCSyGT，GuCSyGT和LjCSyGT分别为甘草和日本百脉根的CSyGT种间同源，但氨基酸同一性如前所述具有80％以上。另外，具有葡萄糖醛酸第1转移活性的突变型CSyGT不限定，具体可列举剪接突变体、基于SNPs等的突变体等。
本说明书中，所谓“多个”，是指例如，2～20个、2～15个、2～10个、2～7个、2～5个、2～4个或2～3个。另外，所谓“氨基酸同一性”，是指对于所比较的2条多肽的氨基酸序列，以氨基酸残基的一致数为最大限的方式根据需要在一方或双方插入适当间隙而排列化(比对)时，总氨基酸残基数中的一致氨基酸残基数的比例(％)。用于计算氨基酸同一性的2条氨基酸序列的排列化可以使用Blast、FASTA、ClustalW等已知程序来进行。
本说明书中，所谓“(氨基酸的)替换”，是指在构成天然蛋白质的20种氨基酸之间，在电荷、侧链、极性、芳香族性等性质类似的保守氨基酸群内的替换。可列举例如，具有低极性侧链的无电荷极性氨基酸群(Gly,Asn,Gln,Ser,Thr,Cys,Tyr)、支链氨基酸群(Leu,Val,Ile)、中性氨基酸群(Gly,Ile,Val,Leu,Ala,Met,Pro)、具有亲水性侧链的中性氨基酸群(Asn,Gln,Thr,Ser,Tyr,Cys)、酸性氨基酸群(Asp,Glu)、碱基性氨基酸群(Arg,Lys,His)、芳香族氨基酸群(Phe,Tyr,Trp)内的替换。已知只要是这些群内的氨基酸替换，则多肽的性质不易产生变化，因而优选。
本方案中所谓“其活性片段”，是指包含葡萄糖醛酸第1转移酶的一部分区域、且保持葡萄糖醛酸第1转移活性的多肽片段。可列举例如，包含葡萄糖醛酸第1转移酶的底物结合部位的多肽片段。本发明的葡萄糖醛酸第1转移酶的底物可列举前述的齐墩果烷型三萜类化合物。优选为甘草次酸。构成本活性片段的多肽的氨基酸的长度不特别限制。例如，可以是在上述(a)～(c)的多肽中至少10、15、20、25、30、50、100或150个氨基酸连续的区域。
此外，本说明书中，经常将CSyGT及其活性片段一并表述为“CSyGT等(葡萄糖醛酸第1转移酶等)”。
根据本发明的CSyGT等，可以以齐墩果烷型三萜类化合物作为糖受体底物，通过葡萄糖醛酸第1转移活性而对3位的羟基糖转移葡萄糖醛酸，从而获得齐墩果烷型三萜类化合物单葡糖苷酸。
在甘草中的甘草皂苷的生物合成系统中，由可以说是起源物质的齐墩果烷型三萜类化合物的β-香树脂醇到甘草次酸的生物合成途径已经阐明，也可以进行人工的生物合成。进而，对在甘草次酸上糖转移了1分子葡萄糖醛酸的甘草次酸单葡糖苷酸进一步糖转移葡萄糖醛酸而生物合成甘草皂苷的途径也明确了。即，在由β-香树脂醇生物合成甘草皂苷的途径中，仅仅对甘草次酸糖转移葡萄糖醛酸而生物合成甘草皂苷酸单葡糖苷酸的途径到目前为止未知。但是，通过本发明，甘草中的甘草皂苷的生物合成途径全部明确了，能够进行由β-香树脂醇到甘草皂苷的体外(in vitro)合成。另外，β-香树脂醇能够由甘草以外的为数众多的植物种生物合成，因而以它们之中一般的植物种为宿主的体内(in vivo)合成系统成为可能。进而另外，如果是不包含β-香树脂醇但能够生物合成β-香树脂醇的前体的生物，则通过与生物合成β-香树脂醇的基因一起使用，对于植物以外的生物，以它们为宿主的体内(in vivo)合成系统也成为可能。
2.葡萄糖醛酸第1转移酶基因(CSyGT基因)及其活性片段
2-1.概要
本发明的第2方案涉及编码第1方案中记载的多肽(CSyGT等)的多核苷酸、即葡萄糖醛酸第1转移酶基因及其活性片段。通过本发明的多核苷酸，能够构建后述的第3方案的重组载体。
2-2.构成
所谓“葡萄糖醛酸第1转移酶基因”(本说明书中经常表述为“CSyGT基因”)，是指编码第1方案中记载的CSyGT的多核苷酸。只要是编码CSyGT的多核苷酸，则对其碱基序列不特别限定。优选为编码包含序列号1、3、5所示的氨基酸序列的野生型CSyGT的多核苷酸。例如，作为编码由序列号1所示的氨基酸序列组成的大豆来源的野生型GmCSyGT的多核苷酸，具体可列举例如，由序列号2所示的碱基序列组成的多核苷酸、即大豆来源的野生型GmCSyGT基因。另外，作为编码由序列号3所示的氨基酸序列组成的甘草来源的野生型GuCSyGT的多核苷酸，具体可列举例如，由序列号4所示的碱基序列组成的多核苷酸、即甘草来源的野生型GuCSyGT基因。并且，作为编码由序列号5所示的氨基酸序列组成的日本百脉根来源的野生型LjCSyGT的多核苷酸，具体可列举例如，由序列号6所示的碱基序列组成的多核苷酸、即日本百脉根来源的野生型LjCSyGT基因。
另外，也包含上述野生型CSyGT基因的他种种间同源、和维持着酶活性的突变型CSyGT基因。作为这样的CSyGT基因的例子，可列举包含野生型CSyGT基因的缺失、替换或者添加了1个或者多个碱基的碱基序列的多核苷酸。具体为例如，包含在大豆来源的野生型GmCSyGT基因(例如，由序列号2所示的碱基序列组成的多核苷酸)、甘草来源的野生型GuCSyGT基因(例如，由序列号4所示的碱基序列组成的多核苷酸)、和日本百脉根来源的野生型LjCSyGT基因(例如，由序列号6所示的碱基序列组成的多核苷酸)的任一碱基序列中缺失、替换或者添加了1个或者多个碱基的碱基序列的多核苷酸。
进而，可列举包含与野生型CSyGT基因具有80％以上、85％以上、87％以上、90％以上、95％以上、或99％以上且小于100％的氨基酸同一性的碱基同一性的碱基序列的多核苷酸。具体可列举例如，与大豆来源的野生型GmCSyGT基因(例如，由序列号2所示的碱基序列组成的多核苷酸)、甘草来源的野生型GuCSyGT基因(例如，由序列号4所示的碱基序列组成的多核苷酸)、和日本百脉根来源的野生型LjCSyGT基因(例如，由序列号6所示的碱基序列组成的多核苷酸)的任一碱基序列具有80％以上、85％以上、87％以上、90％以上、95％以上、或99％以上且小于100％的碱基同一性的碱基序列的多核苷酸。
并且，也包含与由野生型CSyGT基因的部分碱基序列的互补碱基序列组成的核苷酸片段在高严格条件下杂交的碱基序列的多核苷酸、且保持酶活性的核苷酸。
本说明书中，所谓“严格条件”，是指不易形成非特异性的杂合体的条件。“高严格条件”是指非特异性的杂合体更加不易形成、或不形成的条件。一般地反应条件盐浓度越低且越高温，则越为高严格条件。例如，在杂交后的清洗中例如以50℃～70℃、55℃～68℃、或65℃～68℃且0.1×SSC和0.1％SDS进行清洗的条件。此外，可以适当组合探针浓度、探针碱基长、杂交时间等其他条件来提高杂交的严格度。
本方案中所谓“其活性片段”，是指CSyGT基因的片段，且由该片段编码的多肽具有CSyGT活性。实质上，相当于编码上述第1方案中记载的CSyGT的活性片段的多核苷酸。因此，构成本活性片段的多核苷酸的碱基序列的长度、即碱基数是上述第1方案中记载的CSyGT的活性片段中的氨基酸序列数的3倍即可。
通过本发明的多核苷酸或其活性片段，可以构建能够在宿主细胞内表达CSyGT及其活性片段的重组载体。
此外，本说明书中，经常将CSyGT基因及其活性片段一并表述为“CSyGT基因等(葡萄糖醛酸第1转移酶基因等)”。
本方案的CSyGT基因等可以由适当的植物、例如豆科植物使用公知的方法分离。例如，基于序列号2所示的大豆来源的野生型GmCSyGT基因的碱基序列，设计具有适当的碱基序列长的引物对。具体可列举例如，序列号17和18所示的引物对。GmCSyGT基因可以使用该引物对，以大豆的DNA文库或基因组DNA文库来源的核酸作为模板进行PCR等核酸扩增反应，从而获得。另外，本发明的多核苷酸可以以由序列号2所示的碱基序列的一部分组成的核酸片段作为探针，由上述文库等通过杂交而获得。这些方法可以参照Green&Sambrook,Molecular Cloning,2012,Fourth Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press中记载的方法。
3.重组载体
3-1.概要
本发明的第3方案涉及重组载体。本发明的重组载体包含上述第2方案中记载的多核苷酸，能够在宿主细胞内克隆CSyGT基因等，或表达CSyGT等。本方案中，特别优选应用表达CSyGT等的CSyGT表达载体。
3-2.构成
本发明的重组载体可以通过将第2方案中记载的多核苷酸导入适当的重组载体而构建。载体的种类不特别限定。根据目的、或根据导入的宿主而适当选择克隆用(转化用)、或基因表达用等的载体即可。特别优选植物转化用载体或(基因)表达载体。
本发明中所谓“(基因)表达载体”，是能够将编码所内包的多肽的多核苷酸搬运到目的植物细胞内，使该多肽表达的基因表达系统。可列举例如，利用质粒或病毒的表达载体。本发明中相当于整合了CSyGT基因等的表达CSyGT等的CSyGT表达载体。
在利用质粒的表达载体(以下，经常表述为“质粒表达载体”)的情况下，对质粒不限定，可列举例如，pPZP系、pSMA系、pUC系、pBR系、pBluescript系(Agilent Technologies社)、pTriEXTM系(TaKaRa社)、或pBI系、pRI系或者pGW系的双元载体等。
在利用病毒的表达载体(以下，经常表述为“病毒表达载体”)的情况下，病毒可以利用花椰菜花叶病毒(CaMV)、菜豆金色花叶病毒(BGMV)、烟草花叶病毒(TMV)等。
上述重组载体包含启动子和终止子的表达调节区域。此外，可以包含增强子、多聚A添加信号、5’-UTR(非翻译区)序列、标记或者筛选标志物基因、多克隆位点、复制起始位点等。各自的种类只要能够在宿主细胞内发挥其功能，就不特别限定。根据导入的宿主而适当选择该领域公知的即可。优选以植物细胞或植物体作为宿主的情况。
启动子可以使用各种启动子，例如，过表达型启动子、组成型启动子、位点特异性启动子、时间特异性启动子、和/或诱导性启动子。作为能够在植物细胞中工作的过表达型且组成型的启动子的具体例，可列举花椰菜花叶病毒(CaMV)来源的35S启动子、Ti质粒来源的胭脂碱合酶基因的启动子Pnos、玉米来源的泛素启动子、稻来源的肌动蛋白启动子、烟草来源PR蛋白质启动子等。也可以使用各种植物种的核酮糖二磷酸羧化酶的小亚基(Rubiscossu)启动子、或组蛋白启动子。另外，作为能够在细菌细胞中工作的启动子，可列举Bacillus stearothermophilus(嗜热脂肪芽孢杆菌)的麦芽糖淀粉酶基因的启动子、Bacillus licheniformis(地衣芽孢杆菌)的α淀粉酶基因的启动子、Bacillusamyloliquefaciens(解淀粉芽孢杆菌)的BAN淀粉酶基因的启动子、Bacillus subtillis(枯草芽孢杆菌)碱性蛋白酶基因的启动子或者Bacillus pumilus(短小芽孢杆菌)的木糖苷酶基因的启动子、或λ噬菌体的PR或者PL启动子、大肠杆菌的lac、trp或者tac启动子等。作为能够在酵母宿主细胞中工作的启动子，可列举酵母糖酵解系统基因来源的启动子、醇脱氢酶基因启动子、TPI1启动子、ADH2-4c启动子等。作为能够在真菌中工作的启动子，可列举ADH3启动子、tpiA启动子等。作为能够在动物细胞中工作的启动子，可列举SV40早期启动子、SV40晚期启动子、CMV启动子等，作为能够在昆虫细胞中工作的启动子，可列举多角体蛋白启动子、P10启动子、作为杆状病毒的Autographa californica polyhedrosis(苜蓿银纹夜蛾多角体病毒)的碱基性蛋白启动子、杆状病毒即时型早期基因1启动子、杆状病毒39K延迟型早期基因启动子等。
终止子可列举例如，胭脂碱合酶(NOS)基因的终止子、章鱼碱合酶(OCS)基因的终止子、CaMV 35S终止子、大肠杆菌脂多聚蛋白lpp的3’终止子、trp操纵子终止子、amyB终止子、ADH1基因的终止子等。只要是能够结束由上述启动子转录出的基因的转录的序列，就不特别限定。
如果是增强子，可列举例如，包含CaMV 35S启动子内的上游侧的序列的增强子区域。只要能够增强编码活性肽的核酸等的表达效率，就不特别限定。
作为筛选标志物基因，可列举耐药性基因(例如，四环素耐性基因、氨苄青霉素耐性基因、卡那霉素耐性基因、潮霉素耐性基因、壮观霉素耐性基因、氯霉素耐性基因、或新霉素耐性基因)、荧光或发光报告物基因(例如，萤光素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、或绿色荧光蛋白(GFP))、新霉素磷酸转移酶II(NPT II)、二氢叶酸还原酶等的酶基因。
通过本发明的重组载体，除了上述第2方案中记载的多核苷酸的操作和/或表达等的控制变得容易以外，还能够操作宿主细胞内的CSyGT等的表达。
4.转化体或其后代
4-1.概要
本发明的第4方案涉及转化体或其后代。本发明的转化体或其后代在细胞内包含上述第2方案中记载的多核苷酸或上述第3方案中记载的重组载体，能够表达CSyGT基因等的克隆、和/或CSyGT等。通过本发明的转化体，能够利用体内(in vivo)表达系统稳定地生物合成CSyGT等。
4-2.构成
本说明书中，所谓“转化体”是指通过导入第2方案中记载的多核苷酸或第3方案中记载的重组载体而被转化了的宿主。
被转化的宿主不特别限定。可列举例如，大肠杆菌(Escherichia coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)这样的细菌，例如芽殖酵母(酿酒酵母，Saccharomycescerevisiae)、裂殖酵母(粟酒裂殖酵母，Schizosaccharomyces pombe)或甲醇同化性酵母(毕赤酵母，Pichia pastoris)这样的酵母、曲霉属(Aspergillus)、脉孢菌属(Neurospora)、镰刀菌属(Fuzarium)或木霉属(Trichoderma)这样的真菌、单子叶植物、双子叶植物、或者植物细胞、哺乳动物细胞、或昆虫细胞(例如，sf9、或sf21)。优选为豆科植物或酵母。
本发明的转化体包含具有相同的遗传信息的克隆体。例如，如果宿主是大肠杆菌、酵母等进行无性生殖的单细胞微生物，则由转化体第1代通过分裂或出芽等而新生的克隆体也包含在本发明的转化体中。另外，如果宿主是植物，则由将转化体第1代采集的植物体的一部分、例如表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部或者维管束这样的植物组织、叶、花瓣、茎、根或者种子这样的植物器官、或植物细胞通过植物组织培养法或扦插、嫁接或者压条而得的克隆体、或者根茎、块根、球茎、纤匍枝等这样的转化体第1代利用无性生殖而得的营养繁殖器官而新生成的新的克隆体也包含在本发明的转化体中。
本发明的转化体除了第2方案中记载的多核苷酸或第3方案中记载的重组载体之外，可以进一步具有一种以上的其他多核苷酸或其他重组载体。这里所谓其他多核苷酸，是指除了第2方案中记载的多核苷酸以外的多核苷酸。例如，相当于β-香树脂醇合成酶基因、CYP88D6或者CYP72A154、或任一齐墩果烷型三萜类化合物单葡糖苷酸合成酶基因。另外，所谓其他重组载体是指第3方案中记载的重组载体以外的重组载体。
本发明的转化体可以通过将上述多核苷酸或重组载体导入适当的宿主中来制作。
上述多核苷酸或重组载体的导入方法可以使用在该领域公知的方法，例如，农杆菌法、PEG-磷酸钙法、电穿孔法、脂质体法、基因枪法、显微注射法。被导入后的多核苷酸可以整合到宿主的基因组DNA中，也可以以被导入后的多核苷酸的状态(例如，一直在外来载体中含有)存在。进而，被导入后的多核苷酸可以如整合到宿主的基因组DNA中的情况那样在宿主细胞内持续维持，也可以暂时性地保持。
在通过上述的方法将第2方案中记载的多核苷酸或第3方案中记载的重组载体导入宿主之后，可以通过PCR法、DNA印迹杂交法、RNA印迹杂交法、原位(in situ)杂交等来确认目的多核苷酸的导入的有无。
本说明书中，所谓“其后代”是上述转化体第1代经由有性生殖获得的后代，是指以能够表达的状态保持着本发明的第2方案中记载的多核苷酸或第3方案中记载的重组载体的宿主。优选是指以能够表达的状态保持着上述多核苷酸或上述重组载体中的第2方案中记载的多核苷酸的宿主后代。例如，在转化体是植物的情况下，相当于其转化体的由种子发芽而生长出的植物体。后代的世代不限制。
根据本方案的转化体，能够通过增强被导入后的多核苷酸的表达而将存在于宿主细胞内的齐墩果烷型三萜类化合物转换成齐墩果烷型三萜类化合物单葡糖苷酸。另外，能够通过改变转化体的宿主，从而获得添加了不同的糖链的葡萄糖醛酸第1转移酶。例如，在转化体的宿主是酵母的情况下，与以豆科植物为宿主的情况不同，添加了高甘露糖型糖链的葡萄糖醛酸第1转移酶表达。这时因为酵母中的糖链添加反应与植物中的该反应不同(Strasser R.Glycobiology,2016,26(9):926-939)。
5.葡萄糖醛酸第1转移酶及其活性片段(CSyGT等)的制造方法
5-1.概要
本发明的第5方案涉及CSyGT等的制造方法，包括培养第4方案的转化体或其后代，由其培养物提取第1方案中记载的具有葡萄糖醛酸第1转移活性的多肽、即CSyGT等。根据本发明的多核苷酸的制造方法，能够通过利用宿主作为生物生产系统，从而稳定且大量地获得CSyGT等。
5-2.方法
本发明的制造方法作为必需的工序包括培养工序和提取工序。以下对于各工序具体进行说明。
(1)培养工序
本方案中“培养工序”是培养第4方案的转化体或其后代的工序。本发明中使用的转化体或其后代优选使用能够过表达或能够组成性地表达第1方案中记载的多肽的转化体或其后代。例如，如果是具有第3方案中记载的重组载体的转化体或其后代，则优选重组载体是包含过表达型启动子、组成型启动子的表达载体。第4方案的转化体或其后代可以使用任意宿主，优选为豆科植物或酵母。通过改变宿主，即使表达相同的第1方案中记载的葡萄糖醛酸第1转移酶，也可以获得添加了不同的糖链的糖蛋白质。
培养中使用的培养基只要适当使用适合宿主的培养的培养基即可。培养基可以使用在该领域公知的培养基。例如，虽然不限定，但如果在以大肠杆菌等细菌作为宿主进行培养的情况下，可列举LB培养基或者M9培养基等，如果在以酵母作为宿主进行培养的情况下，可列举YPD培养基、YPG培养基、YPM培养基、YPDM培养基、SMM培养基等，如果在以植物作为宿主进行培养的情况下，可列举适当的培养土、水耕栽培用培养基。
培养基适当含有碳源(例如，葡萄糖、甘油、甘露糖醇、果糖、乳糖等)、氮源(例如，硫酸铵、氯化铵等无机氮、酪蛋白分解物、酵母提取物、多聚蛋白胨、细菌用胰蛋白胨、牛肉膏等有机氮源)、无机盐(例如，二磷酸钠、二磷酸钾、氯化镁、硫酸镁、氯化钙等)、维生素(维生素B1等)、药剂(氨苄青霉素、四环素、卡那霉素等抗生素)等。
培养条件只要适合多核苷酸的表达就不特别限定，通常在10～45℃、15～40℃、18～37℃的温度下根据需要一边进行通气、照射、和/或搅拌，一边培养数小时～数百小时。
(2)提取工序
本方案中“提取工序”是由通过上述培养工序所得的培养物提取CSyGT等的工序。
本说明书中，所谓“培养物”是指培养上清或培养后的转化体。转化体的细胞内当然包含CSyGT等，内容上清中也可以包含由转化体分泌出的CSyGT等。
为了由培养物回收第1方案中记载的多肽，只要将培养物中存在的多肽通过公知的方法提取、根据需要纯化即可。例如，可以将溶剂提取法、盐析法、溶剂沉淀法、透析法、超滤法、凝胶电泳法、凝胶过滤层析、离子交换层析、反相层析、亲和层析等单独或者适当组合而获得目的多肽。具体地，参照前述的Hayashi等的方法(Hayashi et al.,1996,Phytochemistry,42:665-666)、Noguchi等的方法(Noguchi et al.,2007,J.Biol.Chem.,282:23581-23590)即可。另外，也可以基于宿主特异性的糖链，来回收作为目的的第1方案中记载的多肽。例如，在第4方案的转化体或其后代是酵母的情况下，因为所表达的本发明的多肽添加有高甘露糖型糖链，所以可以使用甘露糖结合凝集素(例如，UDA凝集素、BC2L-A凝集素等)来进行提取、纯化。
6.甘草皂苷制造用基因重组体
6-1.概要
本发明的第6方案是甘草皂苷制造用基因重组体。本发明的基因重组体表达包含甘草属植物中的由β-香树脂醇至甘草皂苷的生物合成途径所需的1组酶群、即催化2阶段的氧化反应和2阶段的糖基化反应的4种酶群的表达载体。本发明的基因重组体能够在生物细胞内由β-香树脂醇生物合成甘草皂苷，由此能够作为甘草皂苷的生物生产系统利用。
6-2.构成
6-2-1.包含的表达载体
本发明的基因重组体作为其特征，至少含有包含编码在宿主细胞内由β-香树脂醇至甘草皂苷的生物合成途径所需的4种1组酶群和/或各自的活性片段的多核苷酸的表达载体。根据需要，可以进一步含有包含编码β-香树脂醇合成酶基因的多核苷酸的表达载体。上述4种酶是分别催化β-香树脂醇的第1阶段氧化反应和第2阶段氧化反应、齐墩果烷型三萜类化合物的第1阶段糖基化反应和第2阶段糖基化反应的多肽。将包含各个酶或其活性片段的表达载体在以下的(1)～(4)中显示，具体进行说明。此外，在(1)～(4)中，将上述4种的表达载体分别逐个记载，但各酶的基因可以包含在各自不同的表达载体中，也可以在同一表达载体中包含2种以上。
(1)CYP88D6表达载体
“CYP88D6表达载体”包含编码具有将齐墩果烷型三萜类化合物中的11位氧化的活性的多肽、即CYP88D6及其活性片段(本说明书中经常表述为“CYP88D6等”)的基因及其片段(本说明书中经常表述为“CYP88D6基因等”)。因此，在基因重组体内通过CYP88D6表达载体而CYP88D6等表达。
作为上述CYP88D6的具体例，不限定，但可列举由序列号7所示的氨基酸序列组成的甘草(G.uralensis)来源的CYP88D6。另外，还可例示具有上述氧化第1阶段的活性、且由在序列号7所示的氨基酸序列中缺失、替换或者添加了1个或者多个氨基酸的氨基酸序列组成、或由与序列号7所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列组成的多肽。
虽然不限定，但在本发明的基因重组体中，可以通过由CYP88D6表达载体表达的CYP88D6等的催化活性等，从而主要以内源性或外源性的β-香树脂醇作为底物，将其11位氧化而生产11-氧代-β-香树脂醇。另外，可以以30-羟基-β-香树脂醇作为底物，将其11位氧化而生产30-羟基-11-氧代-β-香树脂醇。进而另外，可以以11-脱氧甘草次酸作为底物，将其11位氧化而生产甘草次酸。
CYP88D6表达载体中的质粒区域的构成依照上述第3方案中记载的重组载体中的表达载体。另外，也可以利用日本专利第5526323号中记载的重组载体。
(2)CYP72A154表达载体
“CYP72A154表达载体”包含编码具有将齐墩果烷型三萜类化合物中的30位氧化的活性的多肽、即CYP72A154及其活性片段(本说明书中经常表述为“CYP72A154等”)的基因及其片段(本说明书中经常表述为“CYP72A154基因等”)。因此，在基因重组体内，通过CYP72A154表达载体，从而CYP72A154等表达。
作为上述CYP72A154的具体例，不限定，但可列举由序列号9所示的氨基酸序列组成的甘草(G.uralensis)来源的CYP72A154、由序列号11所示的氨基酸序列组成的光果甘草(G.glabra)来源的CYP72A154、和由序列号13所示的氨基酸序列组成的蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)来源的CYP72A63。另外，还可例示具有上述氧化第2阶段的活性、且由在序列号9、11和13的任一项所示的氨基酸序列中缺失、替换或者添加了1个或者多个氨基酸的氨基酸序列组成、或由与序列号9、11和13的任一项所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列组成的多肽。
虽然不限定，但在本发明的基因重组体中，可以通过由CYP72A154表达载体表达的CYP72A154等的催化活性等，从而主要以β-香树脂醇和11-氧代-β-香树脂醇作为底物，将其30位氧化，分别生产30-羟基-β-香树脂醇和30-羟基-11-氧代-β-香树脂醇。另外，可以以30-羟基-11-氧代-β-香树脂醇作为底物，将其30位进一步氧化而生产甘草次酸。
CYP72A154表达载体中的质粒区域的构成依照上述第3方案中记载的重组载体中的表达载体。另外，也可以利用日本专利第5771846号中记载的重组载体。
(3)UGT73P12重组载体
“UGT73P12重组载体”包含编码具有对齐墩果烷型三萜类化合物单葡糖苷酸中的葡萄糖醛酸的2位的羟基转移葡萄糖醛酸的活性的多肽、即UGT73P12及其活性片段(本说明书中经常表述为“UGT73P12等”)的基因及其片段(本说明书中经常表述为“UGT73P12基因等”)。因此，在基因重组体内中，通过UGT73P12表达载体，从而UGT73P12等表达。
作为上述UGT73P12的具体例，不限定，可列举由序列号15所示的氨基酸序列组成的甘草(G.uralensis)来源的UGT73P12。另外，还可例示具有上述第2阶段糖基化活性、且由在序列号15所示的氨基酸序列中缺失、替换或者添加了1个或者多个氨基酸的氨基酸序列组成、或由与序列号15所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列组成的多肽。
UGT73P12表达载体中的质粒区域的构成依照上述第3方案中记载的重组载体中的表达载体。另外，也可以利用日本专利第6344774号中记载的重组载体。
(4)CSyGT表达载体
“CSyGT表达载体”相当于上述第3方案中记载的CSyGT重组载体中的CSyGT表达载体，所以这里省略详细的说明。
6-2-2.甘草皂苷制造用基因重组体
本发明的所谓“甘草次酸制造用基因重组体”，是指导入了包含至少上述4种酶基因群的表达载体的转化体、或保持这些酶基因群的其后代。因此，如果排除包含的表达载体的种类不同，则其基本构成可以与上述第4方案中记载的转化体及其后代相同。但是，本发明由于是能够在细胞内由β-香树脂醇生物合成甘草皂苷的基因重组体，因而优选能够在细胞内生物合成作为上述生物合成系统中的起始物质的β-香树脂醇的宿主。宿主中的β-香树脂醇的生物合成既可以基于内源性的合成系统，也可以基于外源性的合成系统。作为齐墩果烷型三萜类化合物的β-香树脂醇可以由大量植物生物合成，因而在基于内源性的合成系统的情况下，本发明的宿主优选为植物。优选为β-香树脂醇合成能高、繁殖力旺盛、且容易培育的植物种。更优选为与甘草亲缘关系比较近的植物、即豆科植物。可列举例如，属于甘草属的种、属于大豆属的种、属于百脉根属的种等。另一方面，在β-香树脂醇的生物合成基于外源性的合成系统的情况下，宿主自身也可以是不能生物合成β-香树脂醇的生物种。例如，通过预先将包含β-香树脂醇合成酶基因的表达载体导入酵母，可以将该酵母的转化体作为能够在细胞内生物合成β-香树脂醇的宿主利用。
根据本发明，即使是以往不能生物合成甘草皂苷的宿主，也变得能够以β-香树脂醇作为起始物质，作为其代谢产物而生物合成甘草皂苷。
7.甘草皂苷的制造方法
7-1.概要
本发明的第7方案是甘草皂苷的制造方法。本发明的制造方法的特征在于，使用上述第6方案的甘草皂苷制造用基因重组体作为生物生产系统，由β-香树脂醇制造甘草皂苷。
根据本发明的制造方法，能够不依赖于由甘草的提取、稳定且大量地制造以往昂贵的甘草皂苷。
7-2.方法
本发明的制造方法作为必需的工序包括培养工序，另外作为选择工序包含“提取工序”。
(1)培养工序
本方案中的“培养工序”基本上依照第5方案中记载的培养工序即可。在基因重组体是植物的情况下，应用培养公知的条件植物的方法即可。通过本工序，可以在上述第6方案的甘草皂苷制造用基因重组体中制造甘草皂苷。
(2)提取工序
本方案中的“提取工序”基本上依照第5方案中记载的提取工序即可。在基因重组体是植物的情况下，可以使用与由甘草提取甘草皂苷的方法相同的方法。
通过本发明的制造方法，能够不依赖于由甘草的提取、稳定且大量地由各种基因重组体制造甘草皂苷。
实施例
在以下的实施例中，列举本发明的一例具体进行说明。
＜实施例1：大豆来源纤维素合成酶类似基因Glyma.06G324300的分离＞
采集在温室栽培而得的大豆(Glycine max)品种“Williams 82”的催熟中的种子。使用RNA提取试剂RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN社)按照附带的方案制备总RNA。使用所得的总RNA 200ng，使用QuantiTech Reverse Transcription Kit(QIAGEN社)按照附带的方案合成第一链cDNA。以5倍稀释后的第一链cDNA各1μL作为模板，使用相当于由Glyma.06G324300推定的多肽的N末端和C末端的位置的寡聚DNA分别作为正向引物(序列号17)和反向引物(序列号18)，使用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(タカラバイオ社)在退火温度55℃、反应温度68℃的条件下进行30循环的PCR。此外，由于向pDONRTM221(ThermoFisher Technologies社)的克隆时的碱基序列特异性的重组反应(GATEWAY attB×attP反应)的需要，上述正向引物在5’末端人工添加了12碱基(AAAAAGCAGGCT)，并且上述反向引物在5’末端人工添加了12碱基(AGAAAGCTGGGT)。将由种子来源的第一链cDNA扩增而得的DNA片段使用Gateway BP Clonase II Enzyme Mix(Thermo Fisher Technologies社)通过碱基序列特异性的重组反应(GATEWAY attB×attP反应)而克隆到pDONRTM221中，对于所得的3个独立克隆确定多核苷酸序列。由此得到的序列是序列号2，由其推定的多肽序列是序列号1。
＜实施例2：甘草来源Glyma.06G324300同源基因的探索＞
由已知与大豆同样是豆科植物、且生物合成甘草皂苷的甘草(Glycyrrhizauralensis)，通过基因同源检索作为Glyma.06G324300的种间同源基因候选探索到Glyma.06G324300同源基因。使用作为甘草的基因组信息数据库的GlycyrrhizauralensisGDB(http://ngs-data-archive.psc.riken.jp/Gur-genome/index.pl)内的BLAST同源性探索功能，发现了编码与Glyma.06G324300显示高氨基酸同一性的蛋白质的1种碱基序列Glyur003152s00037491。由Glyur003152s00037491推定的多肽相对于Glyma.06G324300显示81％的氨基酸同一性。
＜实施例3：甘草来源Glyma.06G324300同源基因的分离＞
由甘草的根使用RNA提取试剂PureLink Plant RNA Reagent(Thermo FisherScientific社)制备总RNA。使用所得的总RNA 1μg，使用SMART RACE cDNA amplificationkit(Clontech社)按照附带的方案进行第一链cDNA合成。以第一链cDNA 2μL作为模板，使用相当于由Glyur003152s00037491推定的多肽的N末端和C末端的位置的寡聚DNA分别作为正向引物(序列号19)和反向引物(序列号20)，使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase(タカラバイオ社)在退火温度55℃、反应温度72℃的条件下进行30循环的PCR。此外，由于向pENTRTM/D-TOPO(注册商标)入门载体(Thermo Fisher Technologies社)的克隆的需要，上述正向引物在5’末端人工地添加了4碱基(cacc)。将扩增而得的DNA片段克隆到pENTRTM/D-TOPO入门载体中，对于所得的4个独立克隆确定碱基序列。由此获得的甘草的Glyma.06G324300同源基因的碱基序列是序列号4，由其推定的多肽序列是序列号3。序列号3的氨基酸序列相对于序列号1所示的氨基酸序列具有82％的同一性。
＜实施例4：日本百脉根来源Glyma.06G324300同源基因的探索＞
通过与实施例2同样的方法，作为日本百脉根(Lotus japonicus)来源的Glyma.06G324300种间同源基因候选，探索到Glyma.06G324300同源基因。使用作为日本百脉根的基因组信息数据库的miyakogusa.jp(http://www.kazusa.or.jp/lotus/release1/index.html)内的BLAST同源性检索功能，发现了编码与Glyma.06G324300显示高氨基酸同一性的蛋白质的1种碱基序列Lj3g3v1981230。由Lj3g3v1981230推定的多肽相对于Glyma.06G324300显示81.4％的氨基酸同一性。
＜实施例5：日本百脉根来源Glyma.06G324300同源基因的分离＞
使用由日本百脉根获得的总RNA 1μg，使用SMART RACE cDNA amplification kit(Clontech社)按照附带的方案合成第一链cDNA。以第一链cDNA 2μl作为模板，使用相当于由Lj3g3v1981230推定的多肽的N末端和C末端的位置的寡聚DNA分别作为正向引物(序列号37)和反向引物(序列号38)，使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase(タカラバイオ社)在退火温度55℃、反应温度72℃的条件下进行30循环的PCR。此外，由于向pENTRTM/D-TOPO(注册商标)入门载体(Thermo FisherTechnologies社)的克隆的需要，上述正向引物在5’末端人工地添加了4碱基(cacc)。将扩增而得的DNA片段克隆到pENTRTM/D-TOPO入门载体中，对于所得的2个独立克隆确定多核苷酸序列。由此获得的日本百脉根的Glyma.06G324300同源基因的碱基序列是序列号6，由其推定的多肽序列是序列号5。序列号5相对于序列号1所示的氨基酸序列具有82％的同一性。
＜实施例6：酵母表达用目的载体的构建＞
为了调查实施例1、3和5中分离的Glyma.06G324300和被预计为其同源蛋白质的糖转移活性，使用酵母表达系统，构建了各蛋白质的表达载体。
所使用的酵母(Saccharomyces cerevisiae)INVSc1株内部不存在在对于候选基因产物被假想的糖基化反应中成为糖供体底物的UDP-葡萄糖醛酸。于是，将以酵母内在的UDP-葡萄糖作为底物合成UDP-葡萄糖醛酸的UDP-葡萄糖脱氢酶(UGD)基因导入到酵母表达用目的载体中。具体地，以拟南芥来源UGD(AtUGD2)的cDNA作为模板使用相当于多肽的N末端和C末端的位置的寡聚DNA分别作为正向引物(序列号21)和反向引物(序列号22)，使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase(タカラバイオ社)在退火温度55℃、反应温度72℃的条件下进行30循环的PCR。此外，由于In-fusion克隆的需要，正向引物在序列号23(gggcggccgcactag)所示的多核苷酸的5’末端人工地添加了目的载体的克隆位置的上游15碱基、和4碱基(aaaa)的共计19碱基。另外，上述反向引物在序列号24(atccatcgatactag)所示的多核苷酸的3’末端人工地添加了目的载体的克隆位置的下游15碱基。将在pESC-HIS(注册商标)酵母表达载体(Agilent Technologies)所具有的MCS2内的SrfI限制性酶位点导入Gateway cassette A(Thermo Fisher Technologies社)而制成的目的载体pESC-HIS-GW用SpeI限制性酶处理，与由cDNA扩增而得的DNA片段混合，使用In-Fusion(注册商标)HDCloning Kit(タカラバイオ社)将序列号25所示的DNA片段导入pESC-HIS-GW内的MCS1中，获得目的载体pESC-HIS-AtUGD2-GW。
＜实施例7：酵母表达克隆的构建＞
将实施例1中制作的具有序列号2所示的多核苷酸的质粒(入门克隆)与实施例6中制作的目的载体pESC-HIS-AtUGD2-GW混合，使用Gateway LR ClonaseII Enzyme Mix(Thermo Fisher Technologies社)，通过碱基序列特异性的重组反应(GATEWAY attL×attR反应)，将序列号2所示的DNA片段转移到pESC-HIS，从而获得序列号2所示的基因的酵母表达载体pESC-HIS-AtUGD2-Glyma.06G324300。另外，通过与上述相同的方法分别获得在实施例3、5中制作的序列号4和6所示的基因的酵母表达载体pESC-HIS-AtUGD2-Glyur003152s00037491、pESC-HIS-AtUGD2-Lj3g3v1981230。
＜实施例8：向甘草次酸和大豆皂醇B生产酵母株的导入＞
对酵母INVScI株(Thermo Fisher Technologies社)(MATa his3D1 leu2trp1-289ura3-52 MATAlpha his3D1 leu2 trp1-289 ura3-52)导入日本百脉根的β-香树脂醇合成酶(LjOSC1)基因的表达载体pYES3-BAS、CYP88D6基因与日本百脉根的细胞色素P450还原酶(LjCPR1)的同时表达载体pESC-CPR-CYP88D6、作为甘草CYP72A154基因的蒺藜苜蓿种间同源的CYP72A63基因的表达载体pDEST52-CYP72A63，使其同时表达，从而获得甘草次酸生产酵母株(图3(a))。同时，导入β-香树脂醇合成酶基因的表达载体pYES3-BAS、CYP93E3基因与日本百脉根的细胞色素P450还原酶(LjCPR1)的同时表达载体pESC-CPR-CYP93E3、CYP72A566基因的表达载体pDEST52-CYP72A566使其同时表达，从而获得大豆皂醇B生产酵母(图3(b))。对这些酵母株分别导入实施例7中得到的pESC-HIS-AtUGD2-Glyma.06G324300、pESC-HIS-AtUGD2-Glyur003152s00037491、pESC-HIS-AtUGD2-Lj3g3v1981230。作为阴性对照，对甘草次酸生产酵母株导入相当于空载体的pESC-HIS-AtUGD2。酵母的转化使用Frozen-EZ Yeast Transformation II(Zymo Research社)按照附带的方案进行。
＜实施例9：使用重组酵母的体内(in vivo)酶测定＞
将保持实施例8中得到的pESC-HIS-AtUGD2-Glyma.06G324300、pESC-HIS-AtUGD2-Glyur003152s00037491、pESC-HIS-AtUGD2-Lj3g3v1981230或阴性对照用pESC-HIS-AtUGD2的甘草次酸生产酵母株，使用包含2％葡萄糖的1mL的Yeast nitrogen base(YNB)培养基(-Trp/-Leu/-Ura/-His)，在30℃、200rpm的条件下振荡培养24小时。然后，将培养液以3,000g、4℃离心5分钟获得酵母细胞的团粒。将所得的酵母细胞的团粒在1mL的Yeastnitrogen base(YNB)培养基(-Trp/-Leu/-Ura/-His)中悬浮之后，再次以3,000g、4℃离心5分钟而获得酵母细胞的团粒。将所得的酵母细胞的团粒在包含2％半乳糖的5mL的Yeastnitrogen base(YNB)培养基(-Trp/-Leu/-Ura/-His)中悬浮，以30℃、200rpm振荡培养5天。然后，在培养液中加入相当于1mL的体积的玻璃珠(SIGMA社)、和4mL的1-丁醇。为了破碎酵母细胞，用强力摇床剧烈搅拌30分钟，将所得的液体以10,000g、4℃离心10分钟后，回收上清作为酵母代谢产物提取物。在剩余的液体中新加入4mL的1-丁醇，再次搅拌30分钟，将所得的液体以10,000g、4℃离心10分钟后，提取上清。其结果获得了表达序列号1所示的多肽(Glyma.06G324300)的甘草次酸生产酵母株来源的代谢产物提取物(样品A)、表达序列号3所示的多肽(Glyur003152s00037491)的甘草次酸生产酵母株来源的代谢产物提取物(样品B)、表达序列号5所示的多肽(Lj3g3v1981230)的甘草次酸生产酵母株来源的代谢产物提取物(样品C)、和哪个基因也不表达的仅空载体的甘草次酸生产酵母株来源的代谢产物提取物(样品D)。
对于保持pESC-HIS-AtUGD2-Glyma.06G324300、pESC-HIS-AtUGD2-Glyur003152s00037491、pESC-HIS-AtUGD2-Lj3g3v1981230或阴性对照用pESC-HIS-AtUGD2的大豆皂醇B生产酵母株，也同样地进行培养、和代谢产物的提取。其结果获得了表达序列号1所示的多肽(Glyma.06G324300)的大豆皂醇B生产酵母株来源的代谢产物提取物(样品E)、表达序列号3所示的多肽(Glyur003152s00037491)的大豆皂醇B生产酵母株来源的代谢产物提取物(样品F)、表达序列号5所示的多肽(Lj3g3v1981230)的大豆皂醇B生产酵母株来源的代谢产物提取物(样品G)、和哪个基因也不表达的仅空载体的大豆皂醇B生产酵母株来源的代谢产物提取物(样品H)。
＜实施例10：酵母代谢产物提取物的分析＞
使用旋转蒸发仪使实施例9中得到的样品A、B、C、和D、以及样品E、F、G、和H蒸发。将沉淀物在300μL的甲醇中悬浮之后，使用マイレクス(Millex)-GV、0.22μm、PVDF、4mm(Merck社)过滤，作为LC-MS分析的试样。
LC-MS分析利用ACQUITY UPLC/TQD-MS(Waters Corp.)进行。柱使用UPLC HSS C18(2.1mm×150mm,1.7μm)(Waters Corp.)，在溶剂为0.1％乙酸-乙腈:0.1％乙酸-水＝30:70(0～5分钟),40:60-100:0(5～28分钟),100:0(28～31.5分钟)、流速为0.2mL/分钟的条件下进行分析。MS使用SIM模式，以各化合物的m/z为甘草次酸＝469.7、甘草次酸单糖苷＝631.9、甘草次酸单葡糖苷酸＝645.8、甘草皂苷＝821.9作为参数进行分析。代谢产物的鉴定以将市售的甘草次酸单葡糖苷酸和甘草皂苷以1μM的浓度在甲醇中溶解而得的样品作为标准品，通过比较LC的保持时间和MS谱来确定。
其结果示于图4和图5。
图4是以甘草次酸和葡萄糖醛酸作为底物时的Glyma.06G324300或其同源物的酶活性的结果。由(a)的样品A，检测到相当于甘草次酸单葡糖苷酸的单一峰(黑箭头)。该峰的保持时间、和质谱图与甘草次酸单葡糖苷酸良好地一致。相同地，由(b)的样品B、和(c)的样品C也检测到相当于甘草次酸单葡糖苷酸的峰(黑箭头)。各峰的保持时间、和质谱图与甘草次酸单葡糖苷酸良好地一致。另一方面，对于作为阴性对照的(d)的样品D没有检测到相当于甘草次酸单葡糖苷酸的峰。
图5是以大豆皂醇B和葡萄糖醛酸作为底物时的Glyma.06G324300或其同源物的酶活性的结果。由(a)的样品E检测到相当于大豆皂醇B单葡糖苷酸的单一峰(黑箭头)。由(b)的样品F、和(c)的样品G也检测到相当于大豆皂醇B单葡糖苷酸的峰(黑箭头)。各峰的保持时间、和质谱图与大豆皂醇B单葡糖苷酸良好地一致。另一方面，对于作为阴性对照的(d)的样品H没有检测到相当于大豆皂醇B单葡糖苷酸的峰。
＜实施例11：底物喂养试验用转化酵母的制作＞
对酵母INVScI株分别导入实施例8中得到的pESC-HIS-AtUGD2-Glyma.06G324300、pESC-HIS-AtUGD2-Glyur003152s00037491、pESC-HIS-AtUGD2-Lj3g3v1981230。作为阴性对照，在相同的酵母INVScI株中导入相当于空载体的pESC-HIS-AtUGD2。酵母的转化使用Frozen-EZ Yeast Transformation II(Zymo Research社)按照附带的方案进行。
＜实施例12：使用重组酵母的底物喂养试验＞
将实施例11中得到的保持pESC-HIS-AtUGD2-Glyma.06G324300、pESC-HIS-AtUGD2-Glyur003152s00037491、pESC-HIS-AtUGD2-Lj3g3v1981230、或阴性对照用pESC-HIS-AtUGD2的转化酵母使用包含2％葡萄糖的2mL的Yeast nitrogen base(YNB)培养基(-His)，以30℃、200rpm振荡培养24小时。然后，将培养液以3,000g、4℃离心5分钟，获得酵母细胞的团粒。将所得的酵母细胞的团粒在2mL的Yeast nitrogen base(YNB)培养基(-His)中悬浮之后，再次以3,000g、4℃离心5分钟而获得酵母细胞的团粒。将所得的酵母细胞的团粒在包含2％半乳糖的10mL的Yeast nitrogen base(YNB)培养基(-His)中悬浮，二等分成各5mL。在一份样品中加入终浓度5μM的甘草次酸，在另一份样品中加入终浓度5μM的大豆皂醇B(图4)。然后，以30℃、200rpm振荡培养10天。在培养液中加入相当于1mL体积的玻璃珠(SIGMA社)、和4mL的1-丁醇。为了破碎酵母细胞，用强力摇床剧烈搅拌30分钟，将所得的液体以10,000g、4℃离心10分钟之后，回收上清作为酵母喂养试验提取物。在剩余的液体中新加入4mL的1-丁醇，再次提取。其结果得到了对表达序列号1所示的多肽(Glyma.06G324300)的转化酵母加入了甘草次酸的喂养试验提取物(样品I)、加入了大豆皂醇B的喂养试验提取物(样品M)、对表达序列号3所示的多肽(Glyur003152s00037491)的转化酵母加入了甘草次酸的喂养试验提取物(样品J)、加入了大豆皂醇B的喂养试验提取物(样品N)、对表达序列号5所示的多肽(Lj3g3v1981230)的转化酵母加入了甘草次酸的喂养试验提取物(样品K)、加入了大豆皂醇B的喂养试验提取物(样品O)、对哪个基因都不表达的仅空载体的转化酵母加入了甘草次酸的喂养试验提取物(样品L)、和加入了大豆皂醇B的喂养试验提取物(样品P)。
＜实施例13：底物喂养试验提取物的分析＞
使用旋转蒸发仪使实施例12中得到的样品I、J、K、L、M、N、O、和P蒸发。将沉淀物在300μL的甲醇中悬浮之后，使用マイレクス(Millex)-GV、0.22μm、PVDF、4mm(Merck)进行过滤，作为LC-MS分析的试样。
LC-MS分析在与实施例10相同的条件下实施，但MS使用SIM模式，在样品I、J、K、L的情况下，以各化合物的m/z为甘草次酸＝469.7、甘草次酸单糖苷＝631.9、甘草次酸单葡糖苷酸＝645.8、甘草皂苷＝821.9作为参数进行分析，在样品M、N、O、P的情况下，以各化合物的m/z为大豆皂醇B＝457.8、大豆皂醇B单糖苷＝619.8、大豆皂醇B单葡糖苷酸＝633.8、大豆皂醇B二葡糖苷酸＝809.9作为参数进行分析。代谢产物的鉴定以将市售的甘草次酸单葡糖苷酸、甘草皂苷、大豆皂醇B单葡糖苷酸以1μM的浓度在甲醇溶解而得的样品作为标准品，通过比较LC的保持时间和MS谱来确定。
将以甘草次酸作为糖受体底物时的结果示于图7～10。图7是样品I中的底物喂养试验的结果。由(b)检测到相当于作为糖受体底物的甘草次酸的峰(白箭头)，此外由(c)检测到被认为是对甘草次酸添加了1分子的葡萄糖醛酸的单一峰(黑箭头)。该峰的保持时间、和质谱图与甘草次酸单葡糖苷酸良好地一致。
由图8所示的样品J、和图9所示的样品K也分别如(b)和(c)所示，检测到了相当于甘草次酸(白箭头)和甘草次酸单葡糖苷酸(黑箭头)的峰。各峰的保持时间、和质谱图与甘草次酸单葡糖苷酸良好地一致。
另一方面，在图10所示的作为阴性对照的样品L中，对于(b)检测到相当于作为糖受体底物的甘草次酸的峰(白箭头)，但对于(c)在相当于甘草次酸单葡糖苷酸的位置(虚线箭头)没有检测到峰。
另外，将以大豆皂醇B作为糖受体底物时的底物喂养试验的结果示于图11。在(b)所示的包含大豆来源的Glyma.06G324300的样品M、(c)所示的包含甘草来源的Glyur003152s00037491的样品N、和(d)所示的包含日本百脉根来源的Lj3g3v1981230的样品O中，均检测到对大豆皂醇B添加了1分子的葡萄糖醛酸的相当于大豆皂醇B单葡糖苷酸的峰(黑箭头)。该峰的保持时间、和质谱图与大豆皂醇B单葡糖苷酸良好地一致。另一方面，在(e)所示的作为阴性对照的样品P中，没有检测到相当于大豆皂醇B单葡糖苷酸的峰。
由以上的结果和实施例10所得的结果表明，上述实施例1中得到的大豆来源的新酶Glyma.06G324300、实施例3中得到的甘草来源的新酶Glyur003152s00037491、实施例5中得到的日本百脉根来源的新酶Lj3g3v1981230具有通过对甘草次酸的3位的羟基转移葡萄糖醛酸而将甘草次酸转换为甘草次酸单葡糖苷酸的葡萄糖醛酸第一转移活性。另外，证明了具有通过对大豆皂醇B的3位的羟基也转移葡萄糖醛酸而将大豆皂醇B转换为大豆皂醇B单葡糖苷酸的葡萄糖醛酸第一转移活性。通过以上，将所得的新酶鉴定为对齐墩果烷型三萜类化合物3位的羟基转移葡萄糖醛酸的葡萄糖醛酸第一转移酶。
＜实施例14：日本百脉根的Glyma.06G324300同源基因功能缺损突变体的分离＞
基于日本百脉根的基因和蛋白质的序列信息、以及作为它们的表达数据库的Lotus Base(https://lotus.au.dk/)，对Lj3g3v1981230检索了具有LORE的插入的突变体系统，结果命中了19个系统。从这些系统中，基于对Lj3g3v1981230的LORE1插入位置、对其他基因的LORE1插入数，挑选出2个系统(30006020、30115796)。从分配机构(デンマークAarhus大学)获得种子。将该种子播种，从展开的子叶的一部分提取基因组DNA，通过PCR确认了LORE1向Lj3g3v1981230的插入。PCR使用GoTaq(注册商标)Colorless Master Mix(Promega社)，在退火温度60℃、反应温度72℃的条件下进行25循环的PCR。PCR使用正向引物(30006020为序列号26、30115796为序列号28)和反向引物(30006020为序列号27、30115796为序列号29)和P2引物(序列号30)。
＜实施例15：日本百脉根的Glyma.06G324300同源基因功能缺损突变体的三萜类化合物皂苷组成分析＞
在实施例14中播种，使1个月后的日本百脉根的Glyma.06G324300同源基因功能缺损突变体系统(30006020、30115796)的植物体全体冷冻干燥之后，加入干燥重量的10倍量的80％甲醇。在室温振荡1小时，以15krpm离心分离5分钟。将离心分离而得的上清用孔径0.45μm的膜式过滤器(GLクロマトディスク4P、GLサイエンス)净化，将各提取液2μL供于LC-PDA/MS/MS分析。装置使用Ultimate 3000SD HPLC/LTQ orbitrap discovery MS(均为Thermo Fisher Scientific社)。将提取液上样至反相柱(C30、Develosil C30-UG-3、野村化学)，以流速0.15ml/min利用包含0.1％(v/v)甲酸的乙腈的线性梯度(20-80％/60分钟)溶出皂苷类。溶出物通过UV吸收和质谱法(对母体离子使用静电场轨道阱(Orbitrap)型、对碎片离子使用离子阱型)进行检测。在质谱仪中注入通过电喷雾电离法气化/正离子化了的溶出物。分析的标准品使用大豆皂苷Bb(m/z＝943.52)，通过利用MS/MS分析的碎片图案进行各皂苷分子的标注。
其结果在图12-1和图12-2中，如(b)和(c)所示，在纯合突变体(mutant homo)中通常蓄积的皂苷类(Bb、βg等)变为检测限以下，皂苷组成确认到异常。该结果表明，日本百脉根的Glyma.06G324300同源基因(Lj3g3v1981230)在皂苷生物合成系统中实际上在生物体内发挥功能。
＜实施例16：日本百脉根用表达载体的构建＞
以实施例4中制成的包含甘草来源的Glyma.06G324300同源基因的克隆用载体作为模板，使用扩增序列号4的从起始密码子到终止密码子的正向引物(序列号31)和反向引物(序列号32)，使用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(タカラバイオ社)在退火温度60℃、反应温度68℃的条件下进行30循环的PCR。将扩增而得的DNA片段使用Gateway BP ClonaseII Enzyme Mix(Thermo Fisher Technologies社)通过碱基序列特异性的重组反应(GATEWAY attB×attP反应)克隆到pDONRTM221中，对于所得的3个独立克隆确定多核苷酸序列，确认了与序列号4一致。获得了具有该多核苷酸的质粒pDONR-Glyur003152s00037491作为入门克隆。
接着，以实施例5中制成的包含日本百脉根来源的Glyma.06G324300同源基因的克隆用载体作为模板，使用扩增序列号6的从起始密码子到终止密码子的正向引物(序列号33)和反向引物(序列号34)，与上述同样进行PCR，克隆到pDONRTM221中，对于所得的3个独立克隆确定多核苷酸序列，确认了与序列号6一致。获得了具有该多核苷酸的质粒pDONR-Lj3g3v1981230作为入门克隆。此外，由于对pDONRTM221(Thermo Fisher Technologies社)克隆时的碱基序列特异性的重组反应(GATEWAY attB×attP反应)的需要，正向引物在5’末端添加了序列号35所示的12碱基(AAAAAGCAGGCT)，并且反向引物在5’末端添加了序列号36所示的12碱基(AGAAAGCTGGGT)。将实施例1中制作的具有序列号2所示的多核苷酸的质粒(入门克隆)pDONR-Glyma.06g324300或具有序列号4所示的多核苷酸的质粒(入门克隆)pDONR-Glyur003152s00037491、具有序列号6所示的多核苷酸的质粒(入门克隆)pDONR-Lj3g3v1981230与目的载体pG35NGw混合，使用Gateway LR Clonase II Enzyme Mix(Thermo Fisher Technologies社)，通过碱基序列特异性的重组反应(GATEWAY attL×attR反应)，将序列号6所示的DNA片段转移到pCAMBIA-G35NGw，从而获得了包含序列号6所示的日本百脉根来源的Glyma.06G324300同源基因的日本百脉根转化用载体pG35N-LjCSL。另外，通过与上述相同的方法，转移序列号2所示的大豆来源的Glyma.06G324300基因、和序列号4所示的甘草来源的Glyma.06G324300同源基因，分别获得了日本百脉根转化用载体pG35N-GmCSL、pG35N-GuCSL。
＜实施例17：通过大豆Glyma.06G324300、以及甘草和日本百脉根的Glyma.06G324300同源基因向日本百脉根突变体的导入进行的拯救实验＞
将Glyma.06G324300同源基因按照Diaz et al.,(2005)Induction of hairyroots for symbiotic gene expression studies.In Lotus japonicus Handbook,A.J.Marquez,ed(Dordrecht,The Netherlands:Springer),pp.261-277.中记载的方法导入到日本百脉根的Glyma.06G324300同源基因功能缺损突变体中。将由实施例14中得到的日本百脉根的Glyma.06G324300同源基因功能缺损突变体30006020的突变体纯合系统得到的种子，用有效氯浓度2％的次氯酸(包含0.02％Tween20)灭菌20分钟后，在灭菌蒸馏水中使其吸水一晚。除去吸水后的种子的种皮，接种在0.8％水琼脂培养基中，用铝箔遮光，在25℃培养4天后，照射光1天。将实施例16中制成的载体导入农杆菌(LBA1334)中，在L培养基前面铺板，在28℃培养1天。将在10mL的灭菌水中悬浮培养了1天的农杆菌悬浮，加入到圆型灭菌培养皿之后，在其中浸泡日本百脉根的Glyma.06G324300同源基因功能缺损突变体30006020的突变体纯合系统的幼苗,用剃须刀片切断胚轴。将切断的幼苗摆放在共培养基中，用铝箔遮光，在21℃共培养4天。共培养后，将植物摆放在HRE培养基中，以光照期16小时、25℃/黑暗期8小时、23℃使其生长2周。产生了毛状根的植物在荧光立体显微镜下确认了GFP荧光。
＜实施例18：日本百脉根毛状根的三萜类化合物皂苷组成分析＞
将实施例17中得到的产生了毛状根的植物移植到填充了蛭石的盆中，加入B&D水耕液(Diaz et al.,2005)，使其生长1个月。将充分生长了的植物冷冻干燥，用多珠振荡器(安井器械株式会社)以2500rpm粉碎30秒。加入冷冻干燥物的重量的100倍量的80％甲醇，在室温振荡1小时后，以15krpm离心分离5分钟，回收上清。将该上清用实施例15所示的方法进行LC-PDA/MS/MS分析，结果如图13所示，在突变体中消失的皂苷在转化毛状根中复苏了。由此认为，Glyma.06G324300同源基因在生物体内也催化皂苷合成反应。
＜实施例19：紫云英来源Glyma.06G324300同源基因的探索和分离＞
由与大豆同为豆科植物的紫云英(Astragalus sinicus)，通过基因同源检索作为Glyma.06G324300的种间同源基因候选探索到Glyma.06G324300同源基因。从整合了由紫云英的根、茎、叶得到的RNA序列数据的序列数据集，发现了编码与Glyma.06G324300显示高氨基酸同一性的蛋白质的1种碱基序列AsCSyGT。使用由紫云英的茎得到的总RNA 1μg，使用SMART RACE cDNA amplification kit(Clontech社)，按照附带的方案合成第一链cDNA。以第一链cDNA 2μL作为模板，使用相当于由AsCSyGT推定的多肽的N末端和C末端的位置的寡聚DNA分别作为正向引物(序列号39)和反向引物(序列号40)，使用PrimeSTAR Max DNAPolymerase(タカラバイオ社)在退火温度55℃、反应温度72℃的条件下进行30循环的PCR。此外，由于对pENTRTM/D-TOPO(注册商标)入门载体(Thermo Fisher Technologies社)的克隆的需要，上述正向引物在5’末端人工地添加了4碱基(cacc)。将扩增而得的DNA片段克隆到pENTRTM/D-TOPO入门载体中，对于所得的2个独立克隆确定多核苷酸序列。由此获得的紫云英的Glyma.06G324300同源基因的碱基序列是序列号41，由其推定的多肽序列是序列号42。序列号42相对于序列号1所示的氨基酸序列具有77％的同一性。
＜实施例20：大豆来源Glyma.06G324300同源基因的分离＞
由大豆通过基因同源检索作为Glyma.06G324300的种内同源基因候选探索到Glyma.06G324300同源基因。使用作为大豆的基因组信息数据库的Soybase(https://soybase.org)内的BLAST同源性探索功能，发现了编码与Glyma.06G324300显示高氨基酸同一性的蛋白质的2种碱基序列Glyma.04g255400和Glyma.11g151800。通过实施例1所示的方法扩增2种Glyma.06G324300同源基因Glyma.04g255400和Glyma.11g151800，克隆到pDONRTM221(Thermo Fisher Technologies社)中。使用相当于由Glyma.04g255400推定的多肽的N末端和C末端的位置的寡聚DNA分别作为正向引物(序列号43)和反向引物(序列号44)，使用相当于由Glyma.11g151800推定的多肽的N末端和C末端的位置的寡聚DNA分别作为正向引物(序列号45)和反向引物(序列号46)。此外，由于向pDONRTM221(Thermo FisherTechnologies社)克隆时的碱基序列特异性的重组反应(GATEWAY attB×attP反应)的需要，上述正向引物在5’末端人工地添加了12碱基(AAAAAGCAGGCT)，并且上述反向引物在5’末端人工地添加了12碱基(AGAAAGCTGGGT)。将由种子来源的第一链cDNA扩增而得的DNA片段使用Gateway BP Clonase II Enzyme Mix(Thermo Fisher Technologies社)，通过碱基序列特异性的重组反应(GATEWAY attB×attP反应)克隆到pDONRTM221中，对于各自所得的3个独立克隆分别确定多核苷酸序列。由此获得的序列是序列号47和序列号49，由它们推定的多肽序列是序列号48和序列号50。序列号48和序列号50相对于序列号1所示的氨基酸序列具有分别为93.9％和71.1％的同一性。
＜实施例21：紫云英和大豆的Glyma.06G324300同源基因向甘草次酸和大豆皂醇B生产酵母株的导入＞
通过实施例7所示的方法，构建作为实施例19中得到的紫云英、和实施例20中得到的大豆的Glyma.06G324300同源基因的酵母表达克隆的pESC-HIS-AsCSyGT、pESC-HIS-AtUGD2-Glyma04g255400、pESC-HIS-AtUGD2-Glyma.11g151800，通过实施例8所示的方法，分别导入甘草次酸和大豆皂醇B生产酵母株中。
＜实施例22：使用导入了紫云英和大豆的Glyma.06G324300同源基因的重组酵母的体内(in vivo)酶测定＞
通过实施例9所示的方法，进行重组酵母的培养、和代谢物的提取。其结果获得了表达序列号42所示的多肽(AsCSyGT)的甘草次酸生产酵母株来源的代谢产物提取物(样品Q)、表达序列号48所示的多肽(Glyma04g255400)的甘草次酸生产酵母株来源的代谢产物提取物(样品R)、表达序列号50所示的多肽(Glyma.11g151800)的甘草次酸生产酵母株来源的代谢产物提取物(样品S)。对于保持pESC-HIS-AsCSyGT、pESC-HIS-AtUGD2-Glyma04g255400、pESC-HIS-AtUGD2-Glyma.11g151800的大豆皂醇B生产酵母株也同样地进行培养、和代谢产物的提取。其结果获得了表达序列号42所示的多肽(AsCSyGT)的大豆皂醇B生产酵母株来源的代谢产物提取物(样品T)、表达序列号48所示的多肽(Glyma04g255400)的大豆皂醇B生产酵母株来源的代谢产物提取物(样品U)、表达序列号50所示的多肽(Glyma.11g151800)的大豆皂醇B生产酵母株来源的代谢产物提取物(样品V)。
＜实施例23：导入了紫云英和大豆的Glyma.06G324300同源基因的酵母的代谢产物提取物的分析＞
通过实施例10所示的方法制备LC-MS分析的试样，并进行分析。其结果示于图14和图15。
由图14所示的(a)的样品Q，检测到相当于甘草次酸单葡糖苷酸的单一峰(黑箭头)。该峰的保持时间、和质谱图与甘草次酸单葡糖苷酸良好地一致。相同地，由(b)的样品R、和(c)的样品S也检测到相当于甘草次酸单葡糖苷酸的峰(黑箭头)。各峰的保持时间、和质谱图与甘草次酸单葡糖苷酸良好地一致。
由图15所示的(a)的样品T检测到相当于大豆皂醇B单葡糖苷酸的单一峰(黑箭头)。由(b)的样品U、和(c)的样品V也检测到相当于大豆皂醇B单葡糖苷酸的峰(黑箭头)。各峰的保持时间、和质谱图与大豆皂醇B单葡糖苷酸良好地一致。
由以上的结果表明，实施例19中得到的紫云英来源的AsCSyGT、和实施例20中得到的大豆来源的Glyma04g255400和Glyma.11g151800具有通过对甘草次酸的3位的羟基转移葡萄糖醛酸，从而将甘草次酸转换为甘草次酸单葡糖苷酸的葡萄糖醛酸第一转移活性。另外，证明了具有对大豆皂醇B的3位的羟基也通过转移葡萄糖醛酸而将大豆皂醇B转换为大豆皂醇B单葡糖苷酸的葡萄糖醛酸第一转移活性。
＜实施例24：大豆的Glyma.06G324300同源基因的底物喂养试验用转化酵母的制作＞
对酵母INVScI株分别导入实施例21中得到的pESC-HIS-AtUGD2-Glyma04g255400和pESC-HIS-AtUGD2-Glyma.11g151800。酵母的转化使用Frozen-EZ YeastTransformation II(Zymo Research社)，按照附带的方案进行。
＜实施例25：使用导入了大豆的Glyma.06G324300同源基因的转化酵母的底物喂养试验＞
将实施例24中得到的重组酵母通过实施例12所示的方法进行了培养。将所得的各酵母细胞的悬浮液等分，分别加入终浓度5μM的乌索烷型三萜类化合物乌苏酸、或羽扇豆烷型三萜类化合物白桦脂酸。然后，通过实施例12所示的方法进行再次培养、和代谢物的提取。其结果获得了对表达序列号48所示的多肽(Glyma04g255400)、或序列号50所示的多肽(Glyma.11g151800)的转化酵母加入了作为乌索烷型三萜类化合物的乌苏酸的喂养试验提取物、和加入了作为羽扇豆烷型三萜类化合物的白桦脂酸喂养试验提取物。
＜实施例26：使用导入了大豆的Glyma.06G324300同源基因的转化酵母的底物喂养试验提取物的分析＞
将实施例25中得到的样品通过与实施例10相同的条件进行分析。MS使用SIM模式，以假想的各反应生成物的m/z为乌苏酸单葡糖苷酸＝631(图16、a)、白桦脂酸单葡糖苷酸＝631(图17、a)作为参数进行分析。图16是对表达序列号50所示的多肽(Glyma.11g151800)的转化酵母加入了乌苏酸的喂养试验提取物(样品W)的分析结果。由(b)所示的样品W检测到了推定为乌苏酸单葡糖苷酸的峰。另一方面，在(c)所示的作为阴性对照的样品X中，没有检测到推定为乌苏酸单葡糖苷酸的峰。
图17是对表达序列号50所示的多肽(Glyma.11g151800)的转化酵母加入了白桦脂酸的喂养试验提取物(样品Y)的分析结果。由(b)所示的样品Y检测到了推定为白桦脂酸单葡糖苷酸的峰。另一方面，在(c)所示的作为阴性对照的样品Z中，没有检测到推定为白桦脂酸单葡糖苷酸的峰。
由以上考虑，序列号50所示的多肽(Glyma.11g151800)是不仅对齐墩果烷型三萜类化合物，而且对乌苏酸、β-乳香酸等乌索烷型三萜类化合物、和白桦脂酸等羽扇豆烷型三萜类化合物的3位的羟基也能够转移葡萄糖醛酸的葡萄糖醛酸第一转移酶。
本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请均直接通过引用而并入本说明书中。
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Claims (12)

1.包含以下的(a)～(c)所示的任一氨基酸序列的多肽或其片段，该多肽或其片段具有对齐墩果烷型三萜类化合物中的3位的羟基转移葡萄糖醛酸的活性，
(a)序列号1、3和5的任一项所示的氨基酸序列、
(b)在序列号1、3和5的任一项所示的氨基酸序列中缺失、替换或者添加了1个或者多个氨基酸的氨基酸序列、或
(c)与序列号1、3和5的任一项所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，所述齐墩果烷型三萜类化合物从β-香树脂醇、11-氧代-β-香树脂醇、30-羟基-11-氧代-β-香树脂醇、30-羟基-β-香树脂醇、24-羟基-β-香树脂醇、11-脱氧甘草次酸、甘草次酸、齐墩果酸、苜蓿酸、大豆皂醇B、大豆皂醇A、常春藤皂苷元、山茶皂苷元和柴胡皂苷元中选择。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，来源于豆科(Fabaceae)植物。
4.编码权利要求1～3的任一项所述的多肽的多核苷酸。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，包含以下的(a)～(d)所示的任一碱基序列，
(a)序列号2、4和6的任一项所示的碱基序列、
(b)在序列号2、4和6的任一项所示的碱基序列中缺失、替换或者添加了1个或者多个碱基的碱基序列、
(c)与序列号2、4和6的任一项所示的碱基序列具有80％以上的同一性的碱基序列、或
(d)与序列号2、4和6的任一项所示的碱基序列的互补碱基序列在高严格条件下杂交的碱基序列。
6.包含权利要求4或5所述的多核苷酸的CSyGT表达载体。
7.包含权利要求4或5所述的多核苷酸或权利要求6所述的CSyGT表达载体的转化体或其后代，所述后代保持有所述多核苷酸或所述CSyGT表达载体。
8.根据权利要求7所述的转化体或其后代，是豆科(Fabaceae)植物。
9.具有对齐墩果烷型三萜类化合物中的葡萄糖醛酸的2位的羟基转移葡萄糖醛酸的活性的多肽的制造方法，所述方法包括：
培养权利要求7或8所述的转化体或其后代的工序、和
从所述的培养物提取权利要求1～3的任一项所述的多肽的工序。
10.甘草皂苷制造用的基因重组体，能够生物合成β-香树脂醇，并且包含以下的(1)～(4)所示的全部表达载体,
(1)具有氧化齐墩果烷型三萜类化合物中的11位的活性、并且包含含有以下的(a)～(c)所示的任一氨基酸序列的多肽的CYP88D6表达载体,
(a)序列号7所示的氨基酸序列、
(b)在序列号7所示的氨基酸序列中缺失、替换或者添加了1个或者多个氨基酸的氨基酸序列、或
(c)与序列号7所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列，
(2)具有氧化齐墩果烷型三萜类化合物中的30位的活性、并且包含含有以下的(d)～(f)所示的任一氨基酸序列的多肽的CYP72A154表达载体，
(d)序列号9、11和13的任一项所示的氨基酸序列、
(e)在序列号9、11和13的任一项所示的氨基酸序列中缺失、替换或者添加1个或者多个氨基酸的氨基酸序列、或
(f)与序列号9、11和13的任一项所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列，
(3)具有对齐墩果烷型三萜类化合物单葡糖苷酸中的葡萄糖醛酸的2位的羟基转移葡萄糖醛酸的活性、并且包含含有以下的(g)～(i)所示的任一氨基酸序列的多肽的UGT73P12表达载体，
(g)序列号15所示的氨基酸序列、
(h)在序列号15所示的氨基酸序列中缺失、替换或者添加了1个或者多个氨基酸的氨基酸序列、或
(i)与序列号15所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列，
以及
(4)权利要求6所述的CSyGT表达载体。
11.根据权利要求10所述的基因重组体，宿主是豆科植物。
12.由β-香树脂醇制造甘草皂苷的制造方法，所述制造方法包括培养权利要求10或11所述的基因重组体的工序。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116732060A (zh) * 2023-05-25 2023-09-12 四川农业大学 喜树中的cyp716c氧化酶基因、载体、微粒体蛋白及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040031072A1 (en) * 1999-05-06 2004-02-12 La Rosa Thomas J. Soy nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription plants and uses thereof for plant improvement
CN102286057A (zh) * 2011-07-07 2011-12-21 北华大学 齐墩果烷型三帖类化合物及其制备方法和医疗用途
CN102702298A (zh) * 2012-05-18 2012-10-03 中国药科大学 一种甘草次酸衍生物、其制备方法及医药用途
CN104673765A (zh) * 2014-12-22 2015-06-03 武汉康复得生物科技股份有限公司 一组在生理pH条件下有活力的草酸氧化酶及其应用
CN105830184A (zh) * 2013-08-06 2016-08-03 联邦科学与工业研究组织 具有高水平β-葡聚糖的小麦

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GR61624B (en) 1977-03-17 1978-12-04 A H C Fischer Dowel
JPS57108135A (en) 1980-12-26 1982-07-06 Asahi Glass Co Ltd Method for removing common salt from polyphenylene sulfide resin
WO2009020231A1 (ja) * 2007-08-06 2009-02-12 Riken カンゾウ属植物由来トリテルペン酸化酵素、それをコードする遺伝子およびその利用
EP2336312B1 (en) * 2008-08-29 2015-10-28 Riken Triterpene oxidase derived from glychyrrhiza plant, gene encoding the oxidase, and method for utilizing the gene
JP6344774B2 (ja) * 2013-04-04 2018-06-20 国立研究開発法人理化学研究所 グルクロン酸転移酵素、それをコードする遺伝子及びその利用方法
WO2016200987A1 (en) * 2015-06-08 2016-12-15 Indigo Agriculture, Inc. Streptomyces endophyte compositions and methods for improved agronomic traits in plants
WO2019090181A1 (en) * 2017-11-03 2019-05-09 Kaleido Biosciences, Inc. Methods of producing glycan polymers
JP6638017B2 (ja) 2018-04-20 2020-01-29 タキゲン製造株式会社 マグネットキャッチ
US12041907B2 (en) * 2018-09-06 2024-07-23 Yeda Research And Development Co. Ltd. Cellulose-synthase-like enzymes and uses thereof

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040031072A1 (en) * 1999-05-06 2004-02-12 La Rosa Thomas J. Soy nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription plants and uses thereof for plant improvement
CN102286057A (zh) * 2011-07-07 2011-12-21 北华大学 齐墩果烷型三帖类化合物及其制备方法和医疗用途
CN102702298A (zh) * 2012-05-18 2012-10-03 中国药科大学 一种甘草次酸衍生物、其制备方法及医药用途
CN105830184A (zh) * 2013-08-06 2016-08-03 联邦科学与工业研究组织 具有高水平β-葡聚糖的小麦
CN104673765A (zh) * 2014-12-22 2015-06-03 武汉康复得生物科技股份有限公司 一组在生理pH条件下有活力的草酸氧化酶及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK: "Genbank登录号RZC10151.1", GENBANK, pages 1 *
韩腾飞等: "甘草次酸醇质体的制备研究", 西北药学杂志, vol. 27, no. 1, pages 64 - 66 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116732060A (zh) * 2023-05-25 2023-09-12 四川农业大学 喜树中的cyp716c氧化酶基因、载体、微粒体蛋白及应用
CN116732060B (zh) * 2023-05-25 2024-05-03 四川农业大学 喜树中的cyp716c氧化酶基因、载体、微粒体蛋白及应用

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