KR101662268B1 - 감초속 식물 유래 트리테르펜 산화 효소, 그것을 코딩하는 유전자 및 그의 이용법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 올레아난형 트리테르펜을 산화하는 활성을 갖는 단백질, 및 그것을 코딩하는 유전자를 동정하고, 상기 단백질, 유전자 및 이들의 이용을 제공하는 것에 관한 것이다. 예를 들면, 콩과 식물로부터 얻어지는 올레아난형 트리테르펜을 산화하는 활성을 갖는 단백질, 그것을 코딩하는 유전자 및 그의 사용에 관한 것이며, 단백질은 예를 들면 서열번호 4, 14 또는 18로 나타내어지고, 그것을 코딩하는 유전자는, 예를 들면 서열번호 3, 13 또는 17로 나타내어진다. 상기 유전자를 도입한 형질 전환체를 제작하여 트리테르펜 산화 효소를 얻을 수 있다.

Description

감초속 식물 유래 트리테르펜 산화 효소, 그것을 코딩하는 유전자 및 그의 이용법{TRITERPENE OXIDASE DERIVED FROM GLYCYRRHIZA PLANT, GENE ENCODING THE OXIDASE, AND METHOD FOR UTILIZING THE GENE}

본 발명은 콩과 식물 유래, 특히 감초속 식물 또는 개자리속 식물 유래의 올레아난형 트리테르펜을 산화하는 효소, 상기 효소를 코딩하는 유전자, 상기 효소의 제조 방법, 및 상기 효소 또는 유전자의 이용 방법에 관한 것이다.

콩과의 다년생 초본 식물인 감초속(Glycyrrhiza속: 글리시리자속) 식물은 한방상 중요한 원료로서 알려져 있고, 세계적으로 널리 이용되고 있다. 상기 식물에서 생약으로서 이용되는 부분은, 주로 뿌리 및 기는 줄기(stolon: 지하경)이다. 이들 부분에 포함되는 주활성 성분은, 감초속 식물에 속하는 G. 우랄렌시스(G. uralensis), G. 글라브라(G. glabra), 및 G. 인플라타(G. inflata)에서는 글리시리진(glycyrrhizin)인 것이 판명되어 있다. 글리시리진은 올레아난형 트리테르펜사포닌(트리테르페노이드사포닌)에 속하는 감미 물질이고, 그의 유용성 때문에 생약학적, 약리학적, 육종학적으로 다양한 연구가 행하여지고 있다.

의약품으로서 양질의 글리시리진을 생물 생산계에 의해 안정적이며 지속적으로 제공하기 위해서는, 글리시리진의 생합성 관련 유전자나 해당 유전자의 발현량을 마커로 하여, 최적 생산 조건의 확립이나 글리시리진 고생산주의 선발, 또는 합성 효소 유전자의 도입에 의한 글리시리진 고생산 식물의 육종 등을 행할 필요가 있다. 그렇게 하기 위해서는, 글리시리진의 생합성 관련 유전자의 동정이 불가결하다. 글리시리진의 생합성 경로에 관여하는 합성 효소 유전자에 대해서는, β-아미린 합성 효소 유전자까지가 동정되어 있지만, 그 이후의 생합성 경로 및 그것에 관여하는 합성 효소 유전자에 대해서는 대부분 분명하게 되어 있지 않다. β-아미린이란, 올레아난형 트리테르펜(트리테르페노이드)에 속하며, 트리테르펜사포닌 생합성 경로에서 글리시리진과 소야사포닌(soyasaponin)의 생합성 분기점이 되는 전구체이다(도 1a). 지금까지, β-아미린으로부터 소야사포닌에 이르는 경로의 합성 효소 유전자로서, β-아미린 및 소포라디올의 24 위치를 수산화하는 시토크롬 P450 산화 효소 유전자 CYP93E1가 대두로부터 단리되어 있다(특허문헌 1, 비특허문헌 1)(도 1a). 또한, β-아미린으로부터 글리시리진에 이르는 경로의 합성 효소 유전자로서는, β-아미린의 11 위치의 탄소를 산화하는 시토크롬 P450 산화 효소 유전자(CYP88D6)가 본 발명자들에 의해 감초로부터 단리되어 있다(특허문헌 2)(도 1a, 도 8). 그러나, 글리시리진의 생합성 경로 및 그것에 관여하는 합성 효소 유전자의 해명이 충분하지 않기 때문에, 지금까지 글리시리진을 생물 생산계에 의해 효율적으로 얻을 수 없었다.

국제 공개 제WO/2005/080572호 일본 특허 출원 2007-204769

Shibuya et al. Identification of beta-amyrin and sophoradiol 24-hydroxylase by expressed sequence tag mining and functional expression assay. FEBS J. 2006 Mar; 273(5): 948-59.

본 발명의 과제는, 안정적이며 지속적으로 글리시리진을 제공하기 위해서, 글리시리진의 생합성 경로에 관여하며, 올레아난형 트리테르펜을 산화하는 활성을 갖는 효소 및 그것을 코딩하는 유전자를 동정하고, 상기 효소, 유전자, 및 이들의 이용 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 노력한 결과, β-아미린으로부터 글리시리진에 이르는 생합성 경로에서, 올레아난형 트리테르펜의 30 위치의 탄소를 산화하는 신규의 시토크롬 P450 분자종 및 그것을 코딩하는 유전자를 단리하는 것에 처음으로 성공하였다. 구체적으로는, 콩과 식물로부터 mRNA를 제조하고, cDNA 라이브러리를 제작하여 EST 해석을 행하였다. 상기 생합성 경로에서, 시토크롬 P450 유전자가 관계하고 있다고 예상하여, 공지된 시토크롬 P450 유전자의 염기 서열을 이용하여 상기 cDNA 라이브러리를 검색하여, 후보 유전자를 좁혔다. 각 후보 유전자에 대해서 유전자 발현 해석을 행하여, 목적 활성을 가지며, 기는 줄기나 뿌리에서 고발현하고 있는 시토크롬 P450 분자의 유전자를 동정함으로써, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본원은 이하의 발명을 제공한다.

제1 실시 형태에서, 본 발명은 올레아난형 트리테르펜의 30 위치의 탄소를 산화하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 본 실시 형태의 하나의 양태에 있어서, 상기 올레아난형 트리테르펜은 예를 들면 β-아미린, 11-옥소-β-아미린 또는 30-히드록시-11-옥소-β-아미린이다. 또한, 본 실시 형태의 다른 양태에 있어서, 상기 폴리펩티드는 콩과(Fabaceae) 식물에서, 바람직하게는 콩아과(Faboideae) 식물에서, 예를 들면 땅콩속(Arachis) 식물, 병아리콩속(Cicer) 식물, 아스팔라투스속(Aspalathus) 식물, 달버기아속(Dalbergia) 식물, 자단속(Pterocarpus) 식물, 도둑놈의갈고리속(Desmodium) 식물, 싸리속(Lespedeza) 식물, 우라리아속(Uraria) 식물, 자운영연(Galegeae) 식물, 자운영속(Astragalus) 식물, 감초속(Glycyrrhiza) 식물, 두메자운속(Oxytropis) 식물, 은잎 금작화속(Augyrocytisus) 식물, 금작화속(Cytisus) 식물, 양골담초속(Genista) 식물, 스파르티움속(Spartium) 식물, 나도황기속(Hedysarum) 식물, 구아속(Cyamopsis) 식물, 낭아초속(Indigofera) 식물, 벌노랑이속(Lotus) 식물, 루피너스속(Lupinus) 식물, 등나무속(Wisteria) 식물, 나무콩속(Cajanus) 식물, 작두속(Canavalia) 식물, 에리스리나속(Erythrina) 식물, 대두속(Glycine) 식물, 하덴버지아속(Hardenbergia) 식물, 편두속(Lablab) 식물, 무쿠나속(Mucuna) 식물, 강낭콩속(Phaseolus) 식물, 날개콩속(Psophocarpus) 식물, 칡속(Pueraria) 식물, 동부속(Vigna) 식물, 아카시아속(Robinia) 식물, 카스타노스페르뭄속(Castanospermum) 식물, 다릅나무속(Maackia) 식물, 오르모시아속(Ormosia) 식물, 고삼속(Sophora) 식물, 회화나무속(Styphnolobium) 식물, 개자리속(Medicago) 식물, 호로파속(Trigonella) 식물, 달구지풀속(Trifolium) 식물, 연리초속(Lathyrus) 식물, 렌즈콩속(Lens) 식물, 완두속(Pisum) 식물 및 잠두속(Vicia) 식물에서, 특히 바람직하게는 감초속(Glycyrrhiza속: 글리시리자속) 식물 또는 개자리속(Medicago속: 메디카고속) 식물에서, 보다 한층 바람직하게는 G. 우랄렌시스(G. uralensis), G. 글라브라(G. glabra) 또는 M. 트런카툴라(통개자리; M. truncatula)에서 유래한다. 또한, 본 실시 형태의 별도의 양태에 있어서, 상기 폴리펩티드는 시토크롬 P450에 속하는 단백질이다. 또한, 본 실시 형태의 다른 양태에 있어서, 상기 폴리펩티드는 (a) 서열번호 4, 14 또는 18로 나타내는 아미노산 서열, (b) 서열번호 4, 14 또는 18로 나타내는 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열, 또는 (c) 서열번호 4, 14 또는 18로 나타내는 아미노산 서열에 대하여 80％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 어느 하나를 갖는다.

제2 실시 형태에서, 본 발명은 실시 형태 1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 실시 형태의 하나의 양태에 있어서, 상기 올레아난형 트리테르펜은 β-아미린, 11-옥소-β-아미린 또는 30-히드록시-11-옥소-β-아미린이다. 또한, 본 실시 형태의 다른 양태에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는, 콩과 식물에서, 바람직하게는 콩아과 식물에서, 예를 들면 땅콩속 식물, 병아리콩속 식물, 아스팔라투스속 식물, 달버기아속 식물, 자단속 식물, 도둑놈의갈고리속 식물, 싸리속 식물, 우라리아속 식물, 자운영연 식물, 자운영속 식물, 감초속 식물, 두메자운속 식물, 은잎 금작화속 식물, 금작화속 식물, 양골담초속 식물, 스파르티움속 식물, 나도황기속 식물, 구아속 식물, 낭아초속 식물, 벌노랑이속 식물, 루피너스속 식물, 등나무속 식물, 나무콩속 식물, 작두속 식물, 에리스리나속 식물, 대두속 식물, 하덴버지아속 식물, 편두속 식물, 무쿠나속 식물, 강낭콩속 식물, 날개콩속 식물, 칡속 식물, 동부속 식물, 아카시아속 식물, 카스타노스페르뭄속 식물, 다릅나무속 식물, 오르모시아속 식물, 고삼속 식물, 회화나무속 식물, 개자리속 식물, 호로파속 식물, 달구지풀속 식물, 연리초속 식물, 렌즈콩속 식물, 완두속 식물 및 잠두속 식물에서, 특히 바람직하게는 감초속 식물 또는 개자리속 식물에서, 보다 한층 바람직하게는 G. 우랄렌시스(G. uralensis), G. 글라브라(G. glabra) 또는 M. 트런카툴라(M. truncatula)에서 유래한다. 또한, 본 실시 형태의 별도의 양태에 있어서, 상기 폴리펩티드는 시토크롬 P450에 속하는 단백질을 코딩한다. 또한, 본 실시 형태의 다른 양태에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는, (d) 서열번호 3, 13 또는 17로 나타내는 염기 서열, (e) 서열번호 3, 13 또는 17로 나타내는 염기 서열에서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열, (f) 서열번호 3, 13 또는 17로 나타내는 염기 서열에 대하여 80％ 이상의 동일성을 갖는 염기 서열, 또는 (g) 서열번호 3, 13 또는 17로 나타내는 염기 서열과 상보적인 염기 서열에 대하여 엄격한 조건에서 혼성화하는 염기 서열 중 어느 하나를 갖는다.

제3 실시 형태에서, 본 발명은 상기 제2 실시 형태에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

제4 실시 형태에서, 본 발명은 상기 제2 실시 형태에 기재된 폴리뉴클레오티드, 및/또는 제3 실시 형태에 기재된 재조합 벡터를 갖는 형질 전환체를 제공한다. 본 실시 형태의 하나의 양태에 있어서, 상기 형질 전환체는 콩과 식물이고, 바람직하게는 콩아과 식물, 예를 들면 땅콩속 식물, 병아리콩속 식물, 아스팔라투스속 식물, 달버기아속 식물, 자단속 식물, 도둑놈의갈고리속 식물, 싸리속 식물, 우라리아속 식물, 자운영연 식물, 자운영속 식물, 감초속 식물, 두메자운속 식물, 은잎 금작화속 식물, 금작화속 식물, 양골담초속 식물, 스파르티움속 식물, 나도황기속 식물, 구아속 식물, 낭아초속 식물, 벌노랑이속 식물, 루피너스속 식물, 등나무속 식물, 나무콩속 식물, 작두속 식물, 에리스리나속 식물, 대두속 식물, 하덴버지아속 식물, 편두속 식물, 무쿠나속 식물, 강낭콩속 식물, 날개콩속 식물, 칡속 식물, 동부속 식물, 아카시아속 식물, 카스타노스페르뭄속 식물, 다릅나무속 식물, 오르모시아속 식물, 고삼속 식물, 회화나무속 식물, 개자리속 식물, 호로파속 식물, 달구지풀속 식물, 연리초속 식물, 렌즈콩속 식물, 완두속 식물 및 잠두속 식물이고, 특히 바람직하게는 감초속 식물 또는 개자리속 식물이고, 보다 바람직하게는 G. 우랄렌시스(G. uralensis), G. 글라브라(G. glabra) 또는 M. 트런카툴라(M. truncatula)이다. 본 실시 형태의 다른 양태에 있어서, 상기 형질 전환체는 상기 제2 실시 형태에 기재된 폴리뉴클레오티드의 발현이 증강 또는 억제된 특징을 갖는다.

제5 실시 형태에서, 본 발명은 상기 제4 실시 형태에 기재된 형질 전환체를 배양 또는 육성시키고, 그 배양물 또는 육성물로부터 상기 실시 형태 1에 기재된 폴리펩티드를 추출하는 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다.

제6 실시 형태에서, 상기 실시 형태 1에 기재된 폴리펩티드 및 올레아난형 트리테르펜의 11 위치의 탄소를 산화하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 올레아난형 트리테르펜에 작용시켜, 글리시르레틴산 및 20-에피-글리시르레틴산을 제조하는 방법을 제공한다.

제7 실시 형태에서, 본 발명은 식물에서의 상기 실시 형태 1에 기재된 폴리펩티드의 유무 또는 발현을 판정하여 식물을 선발하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 식물로부터 제조된 핵산 함유 샘플에 대해서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편을 이용하여 핵산 증폭법 또는 핵산 혼성화를 행하여 상기 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 정량하는 것을 포함한다.

또한, 본 명세서에서 말하는 글리시리진, β-아미린으로부터 글리시리진에 이르는 생합성 경로, 및 상기 경로에서의 중간 산물은, 특별한 언급이 없는 한, 글리시리진의 20 위치 이성체인 20-에피-글리시리진, β-아미린으로부터 20-에피-글리시리진에 이르는 생합성 경로, 및 상기 경로에서의 중간 산물을 포함하는 것으로 한다.

본 발명에 따르면, 글리시리진의 생합성 경로에 관여하며, 올레아난형 트리테르펜의 30 위치의 탄소를 산화하는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들을 이용하는 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 글리시리진, 소야사포닌 I의 생합성 경로와 RT-PCR법에 의한 유전자 발현 해석 결과를 나타낸다.
도 2는 트리테르펜의 합성 방법을 나타낸다.
도 3은 트리테르펜의 합성 방법을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 폴리펩티드에 의한 11-옥소-β-아미린의 변환물의 검출 결과, 및 β-아미린으로부터 글리시리진에 이르는 추정 생합성 경로에서의 상기 폴리펩티드의 촉매 위치를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 폴리펩티드에 의한 β-아미린의 변환물의 검출 결과, 및 β-아미린으로부터 글리시리진에 이르는 추정 생합성 경로에서의 상기 폴리펩티드의 촉매 위치를 나타낸다.
도 6은 NMR에 의한 30-히드록시-β-아미린의 측정 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 폴리펩티드(GuCYP72.1)
도 8은 본 발명의 폴리펩티드(GuCYP72.1), 및 β-아미린 11 위치 산화 효소(CYP88D6)에 의한 β-아미린으로부터 글리시리진에 이르는 추정 생합성 경로에서의 상기 폴리펩티드 및 효소의 촉매 위치를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 폴리펩티드(GuCYP72.1) 발현 효모에 대한 30-히드록시-11-옥소-β-아미린 첨가에 의한 글리시르레틴산의 생성을 나타낸다.
도 10은 NMR에 의한 글리시르레틴산의 측정 결과를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 폴리펩티드(MtCYP72.1)에 의한 β-아미린의 변환물의 검출 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명에 대해서 상세히 진술한다.

<실시 형태 1>

실시 형태 1에 있어서의 발명은 올레아난형 트리테르펜의 30 위치의 탄소를 산화하는 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다. 올레아난형 트리테르펜이란, 5환성의 올레아난 골격을 갖고, 6개의 이소프렌 단위로 이루어지는 C30의 이소프레노이드를 말한다. 올레아난형 트리테르펜의 예로서는, 올레아놀산, 헤데라게닌, β-아미린, 카멜리아게닌, 소야사포게놀, 사이코게닌, 11-옥소-β-아미린 및 30-히드록시-11-옥소-β-아미린을 들 수 있다. 다만, 이들에 한정은 하지 않는다. 본 발명의 올레아난형 트리테르펜에는, β-아미린, 11-옥소-β-아미린, 및 30-히드록시-11-옥소-β-아미린이 특히 바람직하다.

본 발명의 폴리펩티드는 올레아난형 트리테르펜의 30 위치의 탄소를 산화하는 활성을 갖는 폴리펩티드이면 특별히 한정은 하지 않는다. 하나의 양태에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드는 시토크롬 P450에 속하는 폴리펩티드이다. 시토크롬 P450(시토크롬 P450; CYP)이란, 약물 대사 효소로서 알려진 일군의 환원형 프로토헴 함유 단백질 효소를 말한다. 어느 하나의 효소도 NAD(P)H 등의 전자 공여체와 산소를 이용하여 기질에 일 산소 원자를 결합시키고, 동시에 물을 발생시키는 일원자 산소 첨가 반응(monooxygenation)을 촉매한다. 본 발명의 시토크롬 P450은 상기 활성을 갖는 것이면 분자종 및 생물종은 특별히 한정하지 않는다. 또한, 다른 양태에 있어서 본 발명의 폴리펩티드는 콩과 식물 유래, 바람직하게는 콩아과 식물 유래, 예를 들면 땅콩속 식물, 병아리콩속 식물, 아스팔라투스속 식물, 달버기아속 식물, 자단속 식물, 도둑놈의갈고리속 식물, 싸리속 식물, 우라리아속 식물, 자운영연 식물, 자운영속 식물, 감초속 식물, 두메자운속 식물, 은잎 금작화속 식물, 금작화속 식물, 양골담초속 식물, 스파르티움속 식물, 나도황기속 식물, 구아속 식물, 낭아초속 식물, 벌노랑이속 식물, 루피너스속 식물, 등나무속 식물, 나무콩속 식물, 작두속 식물, 에리스리나속 식물, 대두속 식물, 하덴버지아속 식물, 편두속 식물, 무쿠나속 식물, 강낭콩속 식물, 날개콩속 식물, 칡속 식물, 동부속 식물, 아카시아속 식물, 카스타노스페르뭄속 식물, 다릅나무속 식물, 오르모시아속 식물, 고삼속 식물, 회화나무속 식물, 개자리속 식물, 호로파속 식물, 달구지풀속 식물, 연리초속 식물, 렌즈콩속 식물, 완두속 식물 및 잠두속 식물 유래, 특히 바람직하게는 감초속 식물 또는 개자리속 식물 유래, 보다 한층 바람직하게는 G. 우랄렌시스(G. uralensis), G. 글라브라(G. glabra) 또는 M. 트런카툴라(M. truncatula) 유래의 폴리펩티드이다. 또한, 다른 양태에 있어서 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 (a) 서열번호 4, 14 또는 18로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 여기서, 서열번호 4로 나타내는 폴리펩티드는 G. 우랄렌시스(G. uralensis)에서의 시토크롬 P450의 일분자종(GuCYP72.1)에 상당한다. 또한, 서열번호 14로 나타내는 폴리펩티드는 G. 글라브라(G. glabra)에서의 시토크롬 P450의 일분자종(GgCYP72.1)에 상당한다. 또한, 서열번호 18로 나타내는 폴리펩티드는 M. 트런카툴라(M. truncatula)에서의 시토크롬 P450의 일분자종(MtCYP72.1)에 상당한다. 또한, (b) 서열번호 4, 14 또는 18로 나타내는 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며, 올레아난형 트리테르펜의 30 위치의 탄소를 산화하는 활성을 보유한 폴리펩티드일 수도 있다. 또는, (c) 서열번호 4, 14 또는 18로 나타내는 아미노산 서열에 대하여 80％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 올레아난형 트리테르펜의 30 위치의 탄소를 산화하는 활성을 유지한 폴리펩티드일 수도 있다.

상기 「서열번호 4, 14 또는 18로 나타내는 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열」이란, 예를 들면 서열번호 4, 14 또는 18로 나타내는 아미노산 서열로부터 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 5개, 보다 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산이 결실된 아미노산 서열, 서열번호 4, 14 또는 18로 나타내는 아미노산 서열에 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 5개, 보다 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산이 부가된 아미노산 서열, 또는 서열번호 4, 14 또는 18로 나타내는 아미노산 서열의 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 5개, 보다 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 말한다. 예를 들면, 올레아난형 트리테르펜의 30 위치의 탄소를 산화하는 활성을 보유한, 서열번호 4, 14 또는 18에 나타내는 시토크롬 P450의 일아미노산 치환 변이체가 해당한다.

본 실시 형태에서의 상기 「동일성」이란, 서열번호 4, 14 또는 18로 나타내는 아미노산 서열에 대하여 80％ 이상, 바람직하게는 85％ 이상, 보다 바람직하게는 90％, 더욱 바람직하게는 95％, 한층 바람직하게는 97％ 이상이다. 또한, 「서열번호 4, 14 또는 18로 나타내는 아미노산 서열에 대하여 80％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 올레아난형 트리테르펜의 30 위치의 탄소를 산화하는 활성을 보유한 폴리펩티드」의 예로서는, G. 우랄렌시스(G. uralensis)의 시토크롬 P450에 속하는 단백질 유전자(서열번호 3)의 타생물종 이종상동성 유전자(orthologous gene)로 코딩되는 폴리펩티드, 또는 서열번호 3으로 나타내어지는 유전자의 유사 유전자(paralogous gene)로 코딩되고, 또한 서열번호 4로 나타내어지는 폴리펩티드와 동일한 기능을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다.

이 외에, 본 발명의 폴리펩티드는 올레아난형 트리테르펜의 30 위치의 탄소를 산화하는 활성을 보유하는 상기 (a) 내지 (c)의 폴리펩티드의 단편일 수도 있다. 이것은, 본 발명의 주된 목적이 올레아난형 트리테르펜의 30 위치의 탄소를 산화하는 것이고, 상기 활성을 갖는 폴리펩티드이면 예를 들면 서열번호 4, 14 또는 18로 나타내는 폴리펩티드의 전장은 반드시 필요한 것은 아니기 때문이다. 여기서 「폴리펩티드의 단편」이란, 상기 (a) 내지 (c)의 폴리펩티드에서 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100 또는 150 아미노산의 연속하는 영역을 말한다.

본 발명의 폴리펩티드의 기원 생물종은, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 콩과(Fabaceae) 식물이고, 보다 바람직하게는 콩아과 식물, 예를 들면 땅콩속 식물, 병아리콩속 식물, 아스팔라투스속 식물, 달버기아속 식물, 자단속 식물, 도둑놈의갈고리속 식물, 싸리속 식물, 우라리아속 식물, 자운영연 식물, 자운영속 식물, 감초속 식물, 두메자운속 식물, 은잎 금작화속 식물, 금작화속 식물, 양골담초속 식물, 스파르티움속 식물, 나도황기속 식물, 구아속 식물, 낭아초속 식물, 벌노랑이속 식물, 루피너스속 식물, 등나무속 식물, 나무콩속 식물, 작두속 식물, 에리스리나속 식물, 대두속 식물, 하덴버지아속 식물, 편두속 식물, 무쿠나속 식물, 강낭콩속 식물, 날개콩속 식물, 칡속 식물, 동부속 식물, 아카시아속 식물, 카스타노스페르뭄속 식물, 다릅나무속 식물, 오르모시아속 식물, 고삼속 식물, 회화나무속 식물, 개자리속 식물, 호로파속 식물, 달구지풀속 식물, 연리초속 식물, 렌즈콩속 식물, 완두속 식물 및 잠두속 식물이고, 특히 바람직하게는 감초속 식물 또는 개자리속 식물이다. 감초속 식물이란, 콩과 감초속으로 분류되는 식물로서, 구체적으로는 G. 우랄렌시스(G. uralensis), G. 글라브라(G. glabra), G. 인플라타(G. inflata), G. 아스페라(G. aspera), G. 유라카르파(G. eurycarpa), G. 팔리디플로라(G. pallidiflora), G. 유나넨시스(G. yunnanensis), G. 레피도타(G. lepidota), G. 에키나타(G. echinata), G. 아칸토카르파(G. acanthocarpa) 등을 들 수 있다. 이 중, G. 우랄렌시스(G. uralensis) 및 G. 글라브라(G. glabra)는, 본 발명의 폴리펩티드의 기원 생물종으로서 특히 바람직하다. 또한, 개자리속 식물이란, 콩과 개자리속으로 분류되는 식물이며, 구체적으로는 M. 트런카툴라(M. truncatula), M. 사티바(M. sativa), M. 폴리모르파(M. polymorpha), M. 아라비카(M. Arabica), M. 히스피다(M. hispida), M. 미니마(M. minima), M. 스쿠텔라타(M. scutellata), M. 무렉스(M. murex), M. 루필리나(M. lupilina) 등을 들 수 있다. 이 중, M. 트런카툴라(M. truncatula)는 본 발명의 폴리펩티드의 기원 생물종으로서 특히 바람직하다.

본 발명의 폴리펩티드는, 예를 들면 감초속 식물 또는 개자리속 식물의 기는 줄기 또는 뿌리로부터 공지된 방법을 이용하여 얻을 수 있지만, 서열번호 4, 14 또는 18로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 공지된 화학 합성법에 의해서 합성할 수도 있고, 후술하는 해당 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 취득하고, 공지된 유전자 재조합 기술, 및 대장균, 효모, 곤충 세포, 포유동물 세포를 이용한 단백질 발현계에 의해 생합성할 수도 있다.

서열번호 4, 14 또는 18로 나타내는 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열, 또는 서열번호 4, 14 또는 18로 나타내는 아미노산 서열에 대하여 80％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열은, 예를 들면 실시 형태 2에 기재된 폴리뉴클레오티드를 해당 기술분야에서 공지된 방법으로 개변함으로써 얻을 수 있다. 예를 들면, 유전자에 변이를 도입하는 방법은 쿤켈(Kunkel)법 또는 갭드 듀플렉스(Gapped duplex)법 등의 공지 방법 또는 이것에 준하는 방법에 의해 행할 수 있다. 부위 특이적 돌연 변이 유발법을 이용한 시판되고 있는 변이 도입용 키트(예를 들면, Mutant-K(TaKaRa사)나 Mutant-G(TaKaRa사)), 또는 LA PCR in vitro Mutagenesis 시리즈 키트(TaKaRa사) 등을 이용하여 변이 도입할 수도 있다. 또한, 돌연 변이 유발제(예를 들면, 메탄술폰산에틸, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 등의 알킬화제)에 접촉 작용시키는 방법, 자외선을 조사하는 방법을 이용할 수도 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드를 올레아난형 트리테르펜에 작용시켜, 상기 트리테르펜의 30 위치의 탄소를 산화시킬 수 있다. 예를 들면, 실시 형태 1의 폴리펩티드를 기질인 β-아미린, 11-옥소-β-아미린 또는 30-히드록시-11-옥소-β-아미린에 작용시킴으로써, 각 30 위치의 탄소를 산화할 수 있다.

본 실시 형태의 폴리펩티드에 따르면, 올레아난형 트리테르펜의 30 위치의 탄소를 산화할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드를 이용하여, 올레아난형 트리테르펜의 30 위치의 탄소를 산화하는 방법을 제공할 수도 있다. 따라서, 본 폴리펩티드 및 산화 방법을 이용하면, 글리시리진 생합성 경로의 추가 해명이나 글리시리진 합성에 적용하는 것이 가능해진다.

<실시 형태 2>

실시 형태 2에 있어서의 발명은 실시 형태 1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 하나의 양태에 있어서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 실시 형태 1에 기재된 시토크롬 P450에 속하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 실시 형태 1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이면 특별히 한정하지는 않는다. 바람직하게는 (d) 서열번호 3, 13 또는 17로 나타내는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드이다. 서열번호 3으로 나타내는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는, G. 우랄렌시스(G. uralensis)에서의 시토크롬 P450의 일분자종(GuCYP72.1)을 코딩한다. 또한, 서열번호 13으로 나타내는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는, G. 글라브라(G. glabra)에서의 시토크롬 P450의 일분자종(GgCYP72.1)을 코딩한다. 또한, 서열번호 17로 나타내는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는, M. 트런카툴라(M. truncatula)에서의 시토크롬 P450의 일분자종(MtCYP72.1)을 코딩한다. 또한, (e) 서열번호 3, 13 또는 17로 나타내는 염기 서열에서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열로서, 실시 형태 1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수도 있다. 또는, (f) 서열번호 3, 13 또는 17로 나타내는 염기 서열에 대하여 80％ 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로서, 실시 형태 1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수도 있다. 또한, (g) 서열번호 3, 13 또는 17로 나타내는 염기 서열과 상보적인 염기 서열에 대하여 엄격한 조건에서 혼성화하는 염기 서열로서, 실시 형태 1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 염기 서열일 수도 있다.

본 발명에서 「서열번호 3, 13 또는 17로 나타내는 염기 서열에서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열」이란, 예를 들면 서열번호 3으로 나타내는 염기 서열의 1 내지 15개, 바람직하게는 1 내지 9개, 보다 바람직하게는 3 내지 6개의 염기가 결실된 염기 서열, 서열번호 3 또는 13으로 나타내는 염기 서열에 1 내지 15개, 바람직하게는 1 내지 9개, 보다 바람직하게는 3 내지 6개의 염기의 염기가 부가된 염기 서열, 또는 서열번호 3으로 나타내는 염기 서열의 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 5개, 보다 바람직하게는 1 내지 3개의 염기가 다른 염기로 치환된 염기 서열을 말한다.

본 실시 형태에서의 상기 염기 서열의 「동일성」이란, 80％ 이상, 바람직하게는 85％ 이상, 보다 바람직하게는 90％, 더욱 바람직하게는 95％ 이상, 한층 바람직하게는 97％ 이상이다.

본 발명에서 「엄격한 조건」이란, 특이적인 혼성이 형성되는, 즉 비특이적인 혼성이 실질적으로 형성되지 않는 조건을 말한다. 예를 들면, 동일성이 높은 핵산, 즉 서열번호 3, 13 또는 17로 나타내는 염기 서열과 80％ 이상, 바람직하게는 85％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상, 더욱 바람직하게는 95％ 이상의 동일성을 갖는 염기성 배열로 이루어지는 핵산의 상보쇄가 혼성화하고, 또한 동일성이 낮은 핵산의 상보쇄가 혼성화하지 않는 조건을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 나트륨염 농도가 15 내지 750 mM, 바람직하게는 15 내지 500 mM, 보다 바람직하게는 15 내지 300 mM 또는 15 내지 200 mM이고, 온도가 25 내지 70도, 바람직하게는 50 내지 70℃, 보다 바람직하게는 55 내지 68℃이고/이거나, 포름아미드 농도가 0 내지 50％, 바람직하게는 20 내지 50％, 보다 바람직하게는 35 내지 45％인 조건을 말한다. 또한, 엄격한 조건에서의 혼성화 후의 필터의 세정 조건은 나트륨염 농도가 15 내지 750 mM, 바람직하게는 15 내지 500 mM, 보다 바람직하게는 15 내지 300 mM 또는 15 내지 200 mM이고/이거나, 온도가 50 내지 70℃, 바람직하게는 55 내지 70℃, 보다 바람직하게는 60 내지 65℃이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 이 외, 올레아난형 트리테르펜의 30 위치의 탄소를 산화하는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 코딩하는 상기 (d) 내지 (g)의 폴리뉴클레오티드의 단편일 수도 있다. 여기서, 「폴리뉴클레오티드의 단편」이란, (d) 내지 (g)의 폴리뉴클레오티드의 염기 서열에서 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100 또는 150 염기의 연속하는 영역을 말한다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 스플라이싱되기 전의 염기 서열, 즉 인트론을 포함하는 mRNA 전구체에 대응하는 염기 서열을 가질 수도 있다. 왜냐하면, 이러한 mRNA 전구체의 염기 서열에 상당하는 게놈 상의 염기 서열은 유전자 발현 후, 즉 전사 후에 스플라이싱 반응에 의해서 실질적으로 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 동일 배열이 되고, 또한 그것으로 코딩되는 폴리펩티드는 실시 형태 1에 기재된 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 기능을 가질 수 있기 때문이다. 예를 들면, G. 우랄렌시스(G. uralensis) 게놈 상에 존재하는 염기 서열을 갖고, 스플라이싱 후의 성숙 mRNA의 염기 서열이 서열번호 3으로 나타내는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 해당한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편은, 콩과 식물로부터 공지된 방법을 이용하여 단리할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 3, 13 또는 17로 나타내는 염기 서열에 기초하여 설계한 적당한 염기 서열 길이를 갖는 프라이머를 이용하고, G. 우랄렌시스(G. uralensis), G. 글라브라(G. glabra) 또는 M. 트런카툴라(M. truncatula)의 DNA 라이브러리 또는 게놈 DNA 라이브러리 등 유래의 핵산을 주형으로 하여 PCR 증폭을 행함으로써 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 상기 라이브러리 등 유래의 핵산을 주형으로 하여, 해당 폴리뉴클레오티드의 일부인 적당한 염기 서열 길이를 갖는 핵산 단편을 프로브로 하여 혼성화를 행함으로써 얻을 수 있다. 또는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 화학 합성법 등의 공지된 핵산 배열 합성법에 의해서 합성할 수도 있다.

또한, 서열번호 3, 13 또는 17로 나타내는 염기 서열에서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열, 또는 서열번호 3, 13 또는 17로 나타내는 염기 서열에 대하여 80％ 이상의 동일성을 갖는 염기 서열은, 실시 형태 1에서 진술한 방법으로 변이를 도입하는 것 등에 의해 제작할 수 있다.

본 실시 형태의 폴리뉴클레오티드에 따르면, 그것을 직접 또는 실시 형태 3의 재조합 벡터에 조립하여 콩과 식물을 비롯한 다양한 생물종 또는 세포에 도입하여, 고발현시킴으로써 글리시리진의 생산량을 높이는 것 등이 가능해진다.

<실시 형태 3>

실시 형태 3에 있어서의 발명은 상기 실시 형태 2에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 재조합 벡터는 실시 형태 2에 기재된 폴리뉴클레오티드를 적당한 벡터에 도입함으로써 구축할 수 있다. 벡터의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 목적(예를 들면, 클로닝용 또는 유전자 발현용)에 따라, 또는 도입하는 숙주(예를 들면, 대장균, 효모, 곤충 세포, 동물 세포, 식물 세포 또는 식물체, 특히 콩과 식물)에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 한정은 하지 않지만, 사용 가능한 벡터의 구체예로서는, 예를 들면 pBI계, pPZP계, pSMA계, pUC계, pBR계, pBluescript계(stratagene사), pTriEXTM계(TaKaRa사) 등의 플라스미드 벡터나, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV), 강낭콩 모자이크 바이러스(BGMV), 담배 모자이크 바이러스(TMV) 등의 바이러스 벡터, 또는 pBI계 등의 바이너리 벡터를 들 수 있다.

상기 벡터에 목적 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 방법은, 해당 분야에서 공지된 방법을 사용할 수 있다. 통상은, 정제된 실시 형태 2에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편을 적당한 제한 효소로 절단하고, 상기 적당한 벡터의 대응하는 제한 효소 부위 또는 멀티클로닝 사이트에 삽입하여 연결하는 방법 등이 채용된다. 구체적 방법에 대해서는, 예를 들면 문헌 [Sambrook, J. et. al.,(1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]을 참조한다.

본 발명의 재조합 벡터는 목적 폴리뉴클레오티드 외에, 예를 들면 프로모터, 인핸서, 또는 터미네이터 등의 조절 영역, 또는 선발 마커 유전자 및/또는 β-아미린 합성 효소 유전자 등의 다른 유전자를 연결할 수 있다.

프로모터, 인핸서, 터미네이터 또는 선발 마커의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 목적(예를 들면, 클로닝, 유전자 발현, 또는 스크리닝)에 따라, 또는 도입하는 숙주(예를 들면, 세균, 효모, 곤충 세포, 동물 세포, 또는 식물 세포 또는 식물체)에 따라 적절하게 선택할 수 있다.

식물 세포에서 작동 가능한 프로모터로서는, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 합성 효소 유전자의 프로모터(Pnos), 옥수수 유래 유비퀴틴 프로모터, 벼 유래의 액틴 프로모터, 담배 유래 PR 단백질 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 세균 세포에서 작동 가능한 프로모터로서는, 바실러스 스테아로테르모필루스 말토제닉 아밀라아제 유전자, 바실러스 리케니포르미스 α 아밀라아제 유전자, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 BAN 아밀라아제 유전자, 바실러스 서브틸리스 알칼리프로테아제 유전자 또는 바실러스 퍼밀러스 크실로시다아제 유전자의 프로모터, 또는 파지 람다의 PR 또는 PL 프로모터, 대장균의 lac, trp 또는 tac 프로모터 등을 들 수 있다. 효모 숙주 세포에서 작동 가능한 프로모터로서는, 효모 해당계 유전자 유래의 프로모터, 알코올디히드로게나아제 유전자 프로모터, TPI1 프로모터, ADH2-4c 프로모터 등을 들 수 있다. 진균에서 작동 가능한 프로모터로서는, ADH3 프로모터, tpiA 프로모터 등을 들 수 있다. 동물 세포에서 작동 가능한 프로모터로서는, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, CMV 프로모터 등, 곤충 세포에서 작동 가능한 프로모터로서는, 폴리헤드린 프로모터, P10 프로모터, 오토그라파 칼리포르니카 폴리헤드로시스 염기성 단백질 프로모터, 바큘로 바이러스 즉시형 초기 유전자 1 프로모터, 바큘로 바이러스 39K 지연형 초기 유전자 프로모터 등을 들 수 있다.

인핸서로서는, CaMV 35S 프로모터 내의 상류측의 배열을 포함하는 인핸서 영역, SV40 인핸서, CMV 인핸서 등을 들 수 있다.

터미네이터로서는, 노팔린 합성 효소(NOS) 유전자의 터미네이터, 옥토핀 합성 효소(OCS) 유전자의 터미네이터, CaMV 35S 터미네이터, 대장균 리포폴리프로테인 lpp의 3' 터미네이터, trp 오페론 터미네이터, amyB 터미네이터, ADH1 유전자의 터미네이터 등을 들 수 있다.

선발 마커 유전자로서는, 약제 내성 유전자(예를 들면, 테트라 사이클린 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 스펙티노마이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자 또는 네오마이신 내성 유전자), 형광 또는 발광 리포터 유전자(예를 들면, 루시페라제, β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제(GUS), 또는 녹색 형광 단백질(GFP), 네오마이신포스포트랜스페라제 II(NPT II), 디히드로엽산 환원 효소 등의 효소 유전자를 들 수 있다.

본 실시 형태의 재조합 벡터에 따르면, 상기 실시 형태 2에 기재된 폴리뉴클레오티드의 조작 및/또는 제어가 용이해진다.

<실시 형태 4>

실시 형태 4는, 실시 형태 2에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 실시 형태 3에 기재된 재조합 벡터를 갖는 형질 전환체에 관한 것이다.

본 발명의 형질 전환체는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 벡터를 적당한 숙주에 도입함으로써 제작할 수 있다. 이 때, 본 발명의 형질 전환체는 실시 형태 2에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 실시 형태 3에 기재된 재조합 벡터에 추가로, 1개 이상의 다른 폴리뉴클레오티드 또는 다른 재조합 벡터를 가질 수도 있다. 여기서 말하는 다른 폴리뉴클레오티드란, 실시 형태 2에 기재된 폴리뉴클레오티드 이외의 폴리뉴클레오티드를 말한다. 예를 들면, β-아미린 합성 효소 유전자가 해당한다. 또한, 다른 재조합 벡터란, 실시 형태 3에 기재된 재조합 벡터 이외의 재조합 벡터를 말한다. 숙주는 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현 가능하면 한정되지 않는다. 예를 들면, 세균(예를 들면, 대장균(Escherichia coli), 또는 고초균(Bacillus subtilis)), 효모(예를 들면, 출아 효모(Saccharomyces cerevisiae),분열 효모(Schizosaccharomyces pombe), 또는 메탄올 자화성 효모(Pichia pastoris)), 진균(누룩 곰팡이(Aspergillus), 붉은빵곰팡이(Neurospora), 푸사리움(Fuzarium), 또는 트리코데르마(Trichoderma)), 단자엽 식물(예를 들면, 벼과), 또는 쌍자엽 식물(예를 들면, 콩과, 또는 유채과), 또는 식물 세포, 동물 세포, 또는 곤충 세포(예를 들면, sf9 또는 sf21)를 들 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 재조합 벡터의 도입 방법은 해당 분야에서 공지된 방법 예를 들면 아그로박테리움법, PEG-인산칼슘법, 전기 천공법, 리포솜법, 파티클건법, 미세 주입법을 사용할 수 있다. 도입된 폴리뉴클레오티드는 숙주의 게놈 DNA 중에 삽입될 수도 있고, 도입된 폴리뉴클레오티드의 상태(예를 들면, 외래 벡터에 함유된 채)로 존재하고 있을 수도 있다. 또한, 도입된 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면 숙주의 게놈 DNA 중에 삽입된 경우와 같이 숙주 세포 내에서 계속 유지될 수도 있고, 일과적으로 보유될 수도 있다.

상술한 방법으로 실시 형태 2에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 실시 형태 3에 기재된 재조합 벡터를 숙주에게 도입한 후, 목적 폴리뉴클레오티드의 도입을 PCR법, 서던 혼성화법, 노던 혼성화법, 계내 혼성화 등에 의해서 확인할 수 있다.

형질 전환체가 식물인 경우, 바람직하게는 콩과 식물이고, 보다 바람직하게는 콩아과 식물, 예를 들면 땅콩속 식물, 병아리콩속 식물, 아스팔라투스속 식물, 달버기아속 식물, 자단속 식물, 도둑놈의갈고리속 식물, 싸리속 식물, 우라리아속 식물, 자운영연 식물, 자운영속 식물, 감초속 식물, 두메자운속 식물, 은잎 금작화속 식물, 금작화속 식물, 양골담초속 식물, 스파르티움속 식물, 나도황기속 식물, 구아속 식물, 낭아초속 식물, 벌노랑이속 식물, 루피너스속 식물, 등나무속 식물, 나무콩속 식물, 작두속 식물, 에리스리나속 식물, 대두속 식물, 하덴버지아속 식물, 편두속 식물, 무쿠나속 식물, 강낭콩속 식물, 날개콩속 식물, 칡속 식물, 동부속 식물, 아카시아속 식물, 카스타노스페르뭄속 식물, 다릅나무속 식물, 오르모시아속 식물, 고삼속 식물, 회화나무속 식물, 개자리속 식물, 호로파속 식물, 달구지풀속 식물, 연리초속 식물, 렌즈콩속 식물, 완두속 식물 및 잠두속 식물이고, 특히 바람직하게는 감초속 식물 또는 개자리속 식물이고, 더욱 바람직하게는 G. 우랄렌시스(G. uralensis), G. 글라브라(G. glabra) 또는 M. 트런카툴라(M. truncatula)이다. 본 발명에서 「식물」이란, 식물체, 식물 기관, 식물 조직, 식물 세포, 이들의 배양물, 종자를 포함하고, 「형질 전환 식물」은, 유전자 조작에 의해 제작된 형질 전환 식물 및 그의 후대를 포함한다. 형질 전환의 대상은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 식물체, 식물 조직(예를 들면, 표피, 사부, 유조직, 목부, 관다발), 식물 기관(예를 들면, 잎, 꽃잎, 줄기, 뿌리, 종자) 또는 식물 세포이면 된다.

형질 전환의 결과 얻어지는 종양 조직, 슈트, 모상근 등은, 그대로 세포 배양, 조직 배양 또는 기관 배양에 이용하는 것이 가능하고, 또한 종래 알려져 있는 식물 조직 배양법을 이용하여, 적당한 농도의 식물 호르몬(옥신, 사이토카이닌, 지베렐린, 아브시스산, 에틸렌, 브라시놀라이드 등)의 투여 등에 의해 식물체에 재생시킬 수 있다. 식물체의 재생은 일반적으로는 적당한 종류의 옥신과 사이토카이닌을 섞은 배지 상에서 뿌리를 분화시키고 나서, 사이토카이닌을 많이 포함하는 배지에 이식시켜 슈트를 분화시킨 후에 호르몬을 포함하지 않는 토양에 이식함으로써 행한다.

또한, 실시 형태 2에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 실시 형태 3에 기재된 재조합 벡터를 발현 가능하도록 도입하여, 해당 폴리뉴클레오티드의 발현을 증강한 형질 전환체를 제공할 수 있다. 또한, 실시 형태 2에 기재된 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제한 형질 전환체를 제공할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 발현의 억제에는, 해당 폴리뉴클레오티드의 전사 억제 및 단백질에의 번역 억제가 포함된다. 또한, 발현이 완전한 정지 뿐만 아니라 발현의 부분적 억제도 포함된다. 폴리뉴클레오티드의 발현의 억제는, 인위적인 또는 천연의 변이 또는 파괴에 의한 것일 수도 있다. 폴리뉴클레오티드의 발현의 인위적인 변이 또는 파괴는 각종 유전자 공학적 수법, 예를 들면 RNA 간섭법, 안티센스법, 리보자임법, 공억제법, 전사 인자를 제어하는 방법 등을 이용함으로써 가능하다.

본 실시 형태의 형질 전환체에 따르면, 도입된 폴리뉴클레오티드의 발현이 증강됨으로써 글리시리진의 생산량이 증가한 형질 전환체를 제공할 수 있다. 또한, 도입된 폴리뉴클레오티드의 발현이 억제된 형질 전환체를 이용함으로써 글리시리진 생합성 경로를 해명할 수 있다.

<실시 형태 5>

실시 형태 5는 실시 형태 4의 형질 전환체를 배양 또는 육성시키고, 그 배양물 또는 육성물로부터 실시 형태 1에 기재된 폴리펩티드를 추출하는 것을 포함하는, 폴리뉴클레오티드의 제조 방법에 관한 것이다.

숙주를 배양함으로써 실시 형태 1에 기재된 폴리펩티드를 생산하는 경우, 배지는 각 숙주의 배양에 적합한 배지를 이용한다. 이들 배지는 해당 분야에서 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, 한정은 하지 않지만, 통상 대장균 등의 세균을 숙주로서 배양하는 경우이면 LB 배지 또는 M9 배지 등을, 효모를 숙주로 하여 배양하는 경우이면, YPD 배지, YPG 배지, YPM 배지, YPDM 배지, SMM 배지 등을 들 수 있다. 배지는 탄소원(예를 들면, 글루코오스, 글리세린, 만니톨, 프럭토오스, 락토오스 등), 질소원(예를 들면, 황산암모늄, 염화암모늄 등의 무기 질소, 카제인분해물, 효모 추출물, 폴리펩톤, 백토 트립톤, 비프 추출물 등의 유기 질소원), 무기염(예를 들면, 이인산나트륨, 이인산칼륨, 염화마그네슘, 황산마그네슘, 염화칼슘 등), 비타민(비타민 B1 등), 약제(암피실린, 테트라 사이클린, 카나마이신 등의 항생 물질) 등을 적절하게 함유한다. 또한, 실시 형태 1에 기재된 폴리펩티드의 기질이 되는 올레아난형 트리테르펜, 바람직하게는 β-아미린, 11-옥소-β-아미린 또는 30-히드록시-11-옥소-β-아미린을 포함하고 있을 수도 있다.

배양 조건은 폴리뉴클레오티드의 발현에 적절하면 특별히 한정되지 않지만, 통상 10 내지 45℃의 온도 하에서, 필요에 따라 통기, 교반하면서, 수시간 내지 수백시간 배양한다. 구체적인 방법은, 예를 들면 문헌 [Sambrook, J. et. al., (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]을 참조한다.

배양물(배양상청 또는 배양된 형질 전환체를 포함함)로부터 실시 형태 1에 기재된 폴리펩티드를 채취하기 위해서는, 배양물에 축적된 폴리펩티드를 공지된 방법으로 추출하고, 필요에 따라 정제할 수 있다. 예를 들면, 용매 추출법, 염석법, 용매 침전법, 투석법, 초여과법, 겔 전기 영동법, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 어피니티-크로마토그래피 등을 단독으로, 또는 적절하게 조합하여 목적 폴리펩티드를 얻을 수 있다.

또한, 실시 형태 1에 기재된 폴리펩티드의 기질이 되는 상기 β-아미린 등의 올레아난형 트리테르펜, 바람직하게는 β-아미린, 11-옥소-β-아미린 또는 30-히드록시-11-옥소-β-아미린을 배지에 첨가하여 형질 전환체를 배양하면, 올레아난형 트리테르펜의 30 위치의 탄소가 산화된 유도체(예를 들면, 30-히드록시-β-아미린 또는 글리시르레틴산)을 얻는 것이 가능하다.

형질 전환 식물 등을 육성하여 실시 형태 1에 기재된 폴리펩티드를 생산하는 경우, 재생한 식물체 등으로부터 상기 공지된 방법으로 추출하고, 필요에 따라 정제할 수 있다. 또한, 감초속 식물의 경우, 실시 형태 1에 기재된 폴리펩티드는 기는 줄기나 뿌리에 많이 포함된다. 따라서, 기는 줄기나 뿌리를 채취하여, 해당 부분에서 실시 형태 1에 기재된 폴리펩티드를 보다 효율적으로 얻을 수 있다.

본 실시 형태의 폴리뉴클레오티드의 제조 방법에 따르면, 콩과 식물의 형질 전환체로부터 올레아난형 트리테르펜의 30 위치의 탄소가 산화된 유도체 또는 글리시리진 생합성 경로를 경유하여 생산된 글리시리진을 다량으로 얻는 것이 가능해진다.

<실시 형태 6>

실시 형태 6은 실시 형태 1에 기재된 폴리펩티드 및 올레아난형 트리테르펜의 11 위치의 탄소를 산화하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 올레아난형 트리테르펜에 작용시키는 글리시르레틴산 및 20-에피-글리시르레틴산의 제조 방법에 관한 것이다. 상술한 바와 같이, β-아미린 이후의 글리시리진의 생합성 경로는 지금까지 미해명인데, 본 발명에 의해 실시 형태 1에 기재된 폴리펩티드와, 본 발명자들에 의해서 이전에 단리된 올레아난형 트리테르펜의 11 위치의 탄소를 산화하는 효소를 조합함으로써 β-아미린으로부터 글리시르레틴산 및 20-에피-글리시르레틴산을 생성하는 것이 처음으로 가능해졌다. 글리시르레틴산이란, 글리시리진의 전구체이고, 구조상으로는 글리시리진의 아글리콘(사포게닌)에 상당한다. 또한, 20-에피-글리시르레틴산이란, 글리시르레틴산의 이성체의 하나로서, 글리시리진의 이성체의 하나인 20-에피-글리시리진의 아글리콘에 상당한다. 20-에피-글리시리진도 약학상 중요한 물질이다.

「올레아난형 트리테르펜의 11 위치의 탄소를 산화하는 활성을 갖는 폴리펩티드」에는, 예를 들면 (h) 시토크롬 P450형 효소 유전자 CYP88D6(GenBank Accession No.AB433179; 핵산 배열을 서열번호 15로 나타냄)으로 코딩되는 폴리펩티드(아미노산 서열을 서열번호 16으로 나타냄)를 들 수 있다(특허문헌 2). 또는, (i) 서열번호 16로 나타내는 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖고, 올레아난형 트리테르펜의 11 위치의 탄소를 산화하는 활성을 갖는 폴리펩티드, 또한 (j) 서열번호 16로 나타내는 아미노산 서열에 대하여 80％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고, 올레아난형 트리테르펜의 11 위치의 탄소를 산화하는 활성을 갖는 폴리펩티드일 수도 있다. 또는, (k) 서열번호 15로 나타내는 염기 서열에서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열, 서열번호 15로 나타내는 염기 서열에 대하여 80％ 이상의 동일성을 갖는 염기 서열, 또는 서열번호 15로 나타내는 염기 서열과 상보적인 염기 서열에 대하여 엄격한 조건에서 혼성화하는 염기 서열로 코딩된 폴리펩티드일 수도 있다. 또한, 올레아난형 트리테르펜의 11 위치의 탄소를 산화하는 활성을 보유하는 상기 (h) 내지 (k)의 폴리펩티드의 단편으로 할 수도 있다.

본 실시 형태에서 기질이 되는 올레아난형 트리테르펜은 실질적으로 실시 형태 1에 기재된 올레아난형 트리테르펜이면 된다. 바람직하게는, β-아미린, 11-옥소-β-아미린 또는 30-히드록시-β-아미린이다.

본 발명은 시험관내 및/또는 생체내에서 행할 수 있다. 시험관내에서 작용시키는 경우에는, 상기 2개의 폴리펩티드를 반응 버퍼 내에서 기질이 되는 올레아난형 트리테르펜과 반응시키면 좋다. 반응 버퍼의 조성은 NADPH 등의 전자 공여체를 갖고, pH 및 염 농도 등이 상기 2개의 폴리펩티드의 가장 적합한 활성 조건에 있으면 특별히 한정은 하지 않는다. 예를 들면, NADPH 등의 공여체를 가한 1 M 인산칼륨 버퍼(pH 7.2) 등이 이용할 수 있다. 생체내에서 작용시키는 경우에는, 예를 들면 상기 2개의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 즉 실시 형태 2에 기재된 폴리뉴클레오티드, 및 올레아난형 트리테르펜의 11 위치의 탄소를 산화하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 그의 단편을 조립한 발현 벡터를 적당한 숙주(생물 또는 세포) 내에 도입하면 된다. 또는, 이들 폴리펩티드 중 어느 하나 또는 둘다를 숙주에 직접 부여할 수도 있다. 숙주는 해당 숙주 내에서 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현 가능, 및/또는 부여된 폴리펩티드가 기능 가능하면 특별히 한정은 되지 않는다. 예를 들면, 세균(예를 들면, 대장균, 또는 고초균), 효모(예를 들면, 출아 효모, 분열 효모, 또는 메탄올 자화성 효모), 진균(예를 들면, 누룩 곰팡이, 붉은빵곰팡이, 푸사리움, 또는 트리코데르마), 단자엽 식물(예를 들면, 벼과), 또는 쌍자엽 식물(예를 들면, 콩과, 또는 유채과), 또는 식물 세포(식물 조직 및 식물 기관을 포함함), 동물 세포, 또는 곤충 세포(예를 들면, sf9 또는 sf21)을 숙주로서 사용할 수 있다. 바람직하게는, 효모, 진균, 단자엽 식물, 쌍자엽 식물 또는 식물 세포이다. 보다 바람직하게는, 콩과 식물이다. 더욱 바람직하게는, 콩아과 식물, 예를 들면 땅콩속 식물, 병아리콩속 식물, 아스팔라투스속 식물, 달버기아속 식물, 자단속 식물, 도둑놈의갈고리속 식물, 싸리속 식물, 우라리아속 식물, 자운영연 식물, 자운영속 식물, 감초속 식물, 두메자운속 식물, 은잎 금작화속 식물, 금작화속 식물, 양골담초속 식물, 스파르티움속 식물, 나도황기속 식물, 구아속 식물, 낭아초속 식물, 벌노랑이속 식물, 루피너스속 식물, 등나무속 식물, 나무콩속 식물, 작두속 식물, 에리스리나속 식물, 대두속 식물, 하덴버지아속 식물, 편두속 식물, 무쿠나속 식물, 강낭콩속 식물, 날개콩속 식물, 칡속 식물, 동부속 식물, 아카시아속 식물, 카스타노스페르뭄속 식물, 다릅나무속 식물, 오르모시아속 식물, 고삼속 식물, 회화나무속 식물, 개자리속 식물, 호로파속 식물, 달구지풀속 식물, 연리초속 식물, 렌즈콩속 식물, 완두속 식물 및 잠두속 식물이다. 한층 바람직하게는, 감초속 식물 또는 개자리속 식물이다. 보다 한층 바람직하게는, G. 우랄렌시스(G. uralensis), G. 글라브라(G. glabra) 또는 M. 트런카툴라(M. truncatula)이다.

상기 숙주가 상기 기질이 되는 올레아난형 트리테르펜을 생합성할 수 없는 경우에는, 숙주가 기질을 생합성할 수 있도록 1개 이상의 적당한 올레아난형 트리테르펜 합성 효소 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주에 도입할 수도 있다. 또는, 기질을 숙주에게 직접 부여할 수도 있다. 기질 합성 효소를 코딩하는 유전자로서는, 예를 들면 β-아미린 합성 효소(예를 들면, OSC1)을 들 수 있다. 본 발명의 상기 2개의 폴리뉴클레오티드, 및 필요하면 상기 기질 합성 효소 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 조립한 발현 벡터를 갖는 형질 전환체를 적당한 발현 유도 조건에 둠으로써 숙주 내에서 글리시르레틴산 및 20-에피-글리시르레틴산이 생성된다. 구체적인 예를 들면, 효모를 숙주로 하는 경우, 효모는 기질이 되는 β-아미린을 생합성할 수 없다. 따라서, 적당한 생물종의 β-아미린 합성 효소를 코딩하는 유전자를 조립한 발현 벡터 등을 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 조립한 발현 벡터와 함께 효모에 도입하고, 해당 효모를 사용함으로써 본 발명을 달성할 수 있다. 후술하는 실시예 22를 참조한다.

또한, 상기 2개의 폴리뉴클레오티드, 및 필요하면 상기 기질 합성 효소 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 각각 독립적으로 또는 동조하여 제어(증강 또는 억제)할 수도 있다. 독립한 발현 제어는, 예를 들면 상기 폴리뉴클레오티드를 각각 유도 조건이 다른 프로모터에 연결하거나 또는 발현 강도가 다른 프로모터에 연결함으로써 달성할 수 있다. 동조적 발현 제어는, 예를 들면 각각의 폴리뉴클레오티드를 동일종의 프로모터에 연결함으로써 달성할 수 있다. 이 외에, 상기 실시 형태 4에 기재된 수법을 이용하여 각각의 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어할 수도 있다.

본 실시 형태의 제조 방법에 따르면, 감초속 식물 내 등에서 β-아미린으로부터 글리시리진 및 20-에피-글리시리진의 전구체인 글리시르레틴산 및 20-에피-글리시르레틴산을 안정적이며 지속적으로 생성할 수 있다.

또한, 본 실시 형태의 제조 방법에 따르면, 숙주 내에서의 글리시르레틴산 및 20-에피-글리시르레틴산의 생성을 제어할 수 있다.

또한, 본 실시 형태의 제조 방법에 따르면, 본래 글리시르레틴산 및 20-에피-글리시르레틴산을 생합성할 수 없는 생물종 또는 생물 세포에서도, 글리시르레틴산 및 20-에피-글리시르레틴산의 생합성이 가능해진다. 그 때문에, 예를 들면 효모와 같이 배양이 용이하고, 또한 증식능이 높은 숙주 내에서 생합성시킴으로써, 글리시르레틴산 및 20-에피-글리시르레틴산을 대량으로, 안정적으로, 또한 저비용으로 생성하는 것이 가능해진다. 글리시르레틴산 및 20-에피-글리시르레틴산은, 종래 감초 등의 식물체로부터 추출하는 이외에 입수하는 방법이 없고, 그 때문에 비싸지만, 본 실시 형태의 제조 방법에 따르면, 염가로 제공할 수 있다.

<실시 형태 7>

실시 형태 7은 실시 형태 2에 기재된 폴리뉴클레오티드를 이용한 식물 선발법에 관한 것이다. 해당 방법은 식물에서의 실시 형태 2에 기재된 폴리뉴클레오티드의 유무 또는 발현을 판정하여 해당 식물을 선발하는 방법이다. 본 방법은 상기 식물로부터 제조된 핵산 함유 샘플에 대해서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편을 이용하여 핵산 증폭법 또는 핵산 혼성화를 행하여 상기 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 정량하는 것을 포함한다.

상기 핵산 함유 샘플은 해당 분야에서 공지된 수법, 예를 들면 페놀 추출법, 페놀 클로로포름 추출법, CTAB법 등을 이용하여 제조할 수 있다.

상기 「핵산 증폭법」이란, 특정한 핵산 영역을 핵산폴리메라아제에 의해서 증폭시키는 방법을 말한다. 예를 들면, PCR(폴리메라제 연쇄 반응)법, RT-PCR(역전사 폴리메라아제 연쇄 반응)법, ICAN(등온 유전자 증폭)법, 또는 이들의 응용적인 방법(예를 들면, 리얼 타임 PCR법)을 들 수 있다. 바람직하게는 PCR법이다. 이것은, 상기 방법이 해당 분야에서 현재 세계에서 가장 널리 사용되고 있는 방법이며, 시약, 키트, 및 반응 기기 등이 충실하다는 것 외에, 다양한 응용 기술이 알려져 있기 때문이다.

상기 「핵산 혼성화법」이란, 목적 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편의 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 핵산 단편을 이용하여, 해당 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편과 핵산 단편 사이의 염기 대합을 이용하여 목적 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편을 검출 또는 정량하는 방법이다. 핵산 혼성화법은 예를 들면 DNA-DNA 혼성화법, DNA-RNA 혼성화법 또는 RNA-RNA 혼성화법을 들 수 있다. 이들 구체적인 방법에 대해서는, 예를 들면 노던 혼성화(분자 생물학 실험 프로토콜 I(1997년), 니시노·사노 공역, 마루젠 가부시끼가이샤 참조), DNA 마이크로 어레이법(DNA 마이크로 어레이와 최신 PCR법(2000년) 무라마쯔, 나와 감수, 슈쥰샤 참조) 등을 참조한다.

상기 핵산 증폭법 또는 핵산 혼성화에서 이용하는 프라이머 또는 프로브는, 실시 형태 2로 나타내는 어느 하나의 염기 서열, 바람직하게는 서열번호 4 또는 14로 나타내는 염기 서열, 또는 이들의 변이체 또는 오르토로그 유전자의 염기 서열에 기초하여 설계할 수 있다. 본 발명의 프라이머 및/또는 프로브를 구성하는 핵산은 통상 DNA, RNA이지만, 필요에 따라 PNA(Peptide Nucleic Acid), LNA(Locked Nucleic Acid; 등록상표), 메틸포스포네이트형 DNA, 포스포로티오에이트형 DNA, 2'-O-메틸형 RNA 등의 화학 수식 핵산이나 의사 핵산을 포함하고 있을 수도 있다. 또는 이들의 조합으로 구성할 수도 있다. 또한, 프라이머 및 프로브는 형광 색소(예를 들면, 플루오레사민 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, FITC, cy3, cy5, FAM, HEX, VIC), 켄처 물질(TAMRA, DABCYL, BHQ-1, BHQ-2, 또는 BHQ-3), 비오틴 또는 (스트렙토)아비딘, 또는 자기 비드 등의 수식 물질, 또는 동위원소(예를 들면, ³²P, ³³P, ³⁵S) 등을 이용하여 수식 또는 표지할 수도 있다. 프라이머 및 프로브에서의 이들 수식 물질 등의 수식/표지 위치는, 그 수식 물질 등의 특성이나 사용 목적에 따라 적절하게 정하면 된다. 일반적으로는, 5' 또는 3' 말단부에 수식되는 경우가 많다. 또한, 하나의 프라이머 및 프로브 분자가 1개 이상의 수식 물질 등으로 수식되어 있더라도 상관없다.

본 발명에서 이용하는 프라이머 및 프로브의 크기는 특별히 한정되지 않지만, 프라이머의 경우, 통상 약 15 내지 약 50 염기 길이, 바람직하게는 약 17 내지 약 30 염기 길이이다. 프로브의 경우, 서던 또는 노던 혼성화에 사용하는 것이면, 적어도 약 10 염기 길이 이상에서부터 전장, 바람직하게는 약 15 염기 길이 이상에서부터 전장, 보다 바람직하게는 약 30 염기 길이 이상에서부터 전장, 더욱 바람직하게는 약 50 염기 길이 이상에서부터 전장이고, DNA 마이크로 어레이에 사용하는 것이면, 약 10 내지 약 50 염기 길이, 바람직하게는 약 15 내지 약 30 염기 길이, 보다 바람직하게는 약 20 내지 약 25 염기 길이이다. 다만, 이들에 한정은 되지 않는다. 일반적으로, 프로브가 길수록 혼성화 효율이 상승하고, 감도는 높아진다. 한편, 프로브가 짧을수록 감도는 낮아지지만, 반대로 특이성이 상승한다. 고상 상의 프로브는 통상 0.1 μg 내지 0.5 μg의 용액을 이용하여 스폿한다. 프라이머, 프로브의 구체예로서 예를 들면 프라이머이면 서열번호 1과 2를 이용할 수 있다.

핵산 증폭 조건은 증폭하는 핵산 단편의 염기 길이 및 양, 및 사용하는 프라이머의 염기 길이 및 Tm값 등에 따라 변동하기 때문에, 이들 조건에 따라 적절하게 정한다. 일례로서, PCR법이면, 통상 94 내지 95℃에서 5초 내지 5분간, 어닐링 반응을 50 내지 70℃에서 10초 내지 1분간, 신장 반응을 68 내지 72℃에서 30초 내지 3분간 행하고, 이것을 1 사이클로 하여 15 내지 40 사이클 정도 행하고, 마지막으로 68 내지 72℃에서 30초 내지 10분간의 신장 반응을 행할 수 있다.

핵산 증폭 산물은, 예를 들면 아가로스 전기 영동, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동, 도트 혼성화 등을 이용하여 검출할 수 있다. 또한, 이들 핵산 증폭 산물의 정량은, 화학 발광 촬영 해석 장치(예를 들면, ATTO사: 라이트캡쳐 시리즈), 이미징 애널라이저(예를 들면, FUJIFILM사: BAS 시리즈)를 이용하여 행할 수 있다.

실시 형태 2에 기재된 폴리뉴클레오티드의 발현량을 PCR법으로 정량하는 방법의 일례로서, 내부 표준 물질을 이용한 RT-PCR법을 들 수 있다(PCR법 최전선(1996년) 세끼야, 후지나가편, 고우리쯔 슛빤 참조). 사용하는 내부 표준으로서는, 일반적으로 하우스키핑 유전자(예를 들면, GAPDH, β-액틴 등)이 이용된다. 이 방법으로, 표적 mRNA 양의 내부 표준 시료에 대한 상대적인 결과가 얻어진다. 1개의 샘플에 대한 PCR 중에, 수 사이클마다 반응액을 샘플링하고, PCR 산물의 양을 정량하고, 그래프로 플롯하여 간다. 그렇게 하여 얻어진 그래프의 지수 증가기의 포인트에 대하여 회귀 분석을 하여, y 세그먼트를 구함으로써 초기 주형량을 산출할 수 있다(바이오 실험 일러스트레이티드 3「정말로 증가하는 PCR」(1998년) 나카야마 히로키저, 슈쥰샤).

또한, 실시 형태 2에 기재된 폴리뉴클레오티드의 발현량을 리얼 타임 정량 PCR법으로 정량할 수 있다. PCR 산물이 특이적으로 형광 표지되는 반응계에서, 형광 강도를 검출하는 장치가 구비된 온도 사이클러 장치를 이용하여 PCR을 행함으로써 반응 중의 산물의 양을 샘플링 필요없이 리얼 타임으로 모니터할 수 있고, 그 결과를 컴퓨터로 회귀 분석할 수 있다. PCR 산물을 표지하는 방법으로서는, 형광표지한 프로브를 이용하는 방법(예를 들면, TaqMan(등록상표) PCR법)과, 2본쇄 DNA에 특이적으로 결합하는 시약을 이용하는 방법이 있다. TaqMan(등록상표) PCR법은, 5' 말단부가 켄처 물질로, 또한 3' 말단부가 형광 색소로 수식된 프로브를 이용한다. 통상은, 5' 말단부의 켄처 물질이 3' 말단부의 형광 색소를 억제하고 있지만, PCR이 행해지면 Taq 폴리메라아제가 갖는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 해당 프로브가 분해되고, 그것에 의해 켄처 물질의 억제가 해제되기 때문에 형광을 발하도록 된다. 그 형광량은 PCR 생성물의 양을 반영한다. PCR 산물이 검출한계에 도달할 때의 사이클수(CT)와 초기 주형량은 역상관의 관계에 있는 것으로부터, 리얼 타임 측정법에서는 CT를 측정함으로써 초기 주형량을 정량하고 있다. 수단계의 기지량의 주형을 이용하여 CT를 측정하여 검량선을 제작하면, 미지 시료의 초기 주형량의 절대값을 산출할 수 있다. RT-PCR에서 사용하는 역전사 효소는, 예를 들면 M-MLV RTase, ExScript RTase(TaKaRa 사), Super Script II RT(GIBCO BRL사) 등을 사용할 수 있다.

핵산 혼성화를 행하는 경우에는, 상기 프로브뿐만 아니라, 샘플 중의 핵산을 수식/표지할 수도 있다. 수식/표지에는, 동위원소(예를 들면, ³²P, ³³P, ³⁵S) 또는 형광(플루오레사민 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, FITC, Cy3, Cy5)를 사용할 수 있다. 목적에 따라서 적당한 수식/표지를 하면 되고, 특별히 한정은 되지 않는다.

혼성화는 상기 엄격한 조건으로 행하는 것이 바람직하다. 비특이적으로 혼성화하는 목적 외의 핵산을 배제하기 위해서이다.

노던 혼성화법은 일반적으로 RNA 배열의 검출, 정량을 위해 사용된다. 식물로부터 공지된 수법으로 얻은 RNA 샘플을 아가로스 겔 전기 영동으로 분리하고, 그 후, 나일론 또는 니트로셀룰로오스막질에 RNA를 전사하고, 실시 형태 2에 기재된 폴리뉴클레오티드를 표지화한 cDNA 또는 그의 단편을 프로브로 하여 혼성화를 행하여, 목적 폴리뉴클레오티드를 검출, 또는 정량할 수 있다.

DNA 마이크로 어레이법은 유리나 필터 등의 어레이 상에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 cDNA 또는 그의 센스쇄 또는 안티센스쇄, 또는 이들의 단편을 프로브로 하여 고정화한다. 공지된 수법으로 얻은 RNA에 대해서 역전사 반응을 행하여, Cy3-dUTP, Cy5-dUTP 등을 받아들여 라벨화 cDNA를 얻는다. 어레이 상의 고정화 프로브와 표지화 cDNA와의 혼성화를 행하고, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 검출, 정량한다. 이에 따라, 글리시리진 고함량의 식물을 선발, 스크리닝할 수 있다.

또한, 상기 분자 생물학적 수법에 관한 구체적 방법 등은, 문헌 [Sambrook, J. et. al., (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]을 참조한다.

[실시예]

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

<실시예 1>

감초속 식물로부터의 mRNA 제조와 cDNA 라이브러리 제작 (1)

도꾸리쯔 교세 호우진 이야꾸 기반 겐뀨쇼의 야꾸요우 쇼꾸부쯔 시겐 겐뀨 센터 홋카이도 겐뀨부(홋카이도 나요로시)에서 밭재배되고 있던 7년생의 G. 우랄렌시스(G. uralensis)의 기는 줄기를 6월에 채취하였다. RNA 추출 시약 RNAwiz™(Ambion사)를 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라서 토탈 RNA를 제조하였다. 얻어진 토탈 RNA로부터 mRNA를 제조하고, 벡터 캡핑법(Kato, S. et al., DNA Res., 12, 53-62, 2005)에 의해서 cDNA 합성을 행하였다. cDNA 단편을 플라스미드 벡터 pGCAPzf3(Tsugane, T. et al., Plant Biotechnology., 22, 161-165, 2005)에 조립하여 cDNA 라이브러리를 구축하였다.

<실시예 2>

감초속 식물로부터의 mRNA 제조와 cDNA 라이브러리 제작 (2)

도꾸리쯔 교세 호우진 이야꾸 기반 겐뀨쇼의 야꾸요우 쇼꾸부쯔 시겐 겐뀨 센터쯔꾸바 연구부(이바라기껭 쯔꾸바시)에 있어서 밭재배되고 있던 정식 후 4년 이상 경과했다고 생각되는 G. 우랄렌시스(G. uralensis)의 기는 줄기를 10월에 채취하였다. RNA 추출 시약 TRIzol(등록상표)(Invitrogen사) 및 정제 칼럼 RNeasy(등록상표)(Quiagen사)를 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라서 토탈 RNA를 제조하였다. 얻어진 토탈 RNA로부터 mRNA를 제조하고, 올리고캡법(Murayama, K. et al., Gene, 138, 171-174, 1994, 및 Suzuki, Y. et al., Gene, 200, 149-156)에 의해 cDNA 합성을 행하였다. cDNA 단편을 플라스미드 벡터 pCMVFL3에 조립하여 cDNA 라이브러리를 구축하였다.

<실시예 3>

시퀀스 해석 ( 1)

실시예 1에서 얻어진 cDNA 라이브러리에서 대장균주 DH12S(Invitrogen사) 또는 DH10B T1 파지 레지스턴트(Invitrogen사)를 형질 전환하고, 얻어진 약 30,000개의 단일 콜로니를 픽업하여, 384매의 플레이트 상에 식균하였다. 콜로니 PCR로 시퀀스 반응의 주형으로 하는 DNA를 증폭하고, 에탄올 침전에 의한 정제를 행하였다. 그것을 주형으로 하여, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사의 BigDye ver3.1을 이용하여, 각 cDNA 단편의 5' 말단측으로부터 시퀀스 반응을 행하였다. 에탄올 침전에 의한 정제 후, 어플라이드 바이오시스템즈사의 3730xl DNA 어낼라이저(Analyzer)를 이용하여 염기 서열의 해석을 행하였다.

<실시예 4>

시퀀스 해석 ( 2)

실시예 2에서 얻어진 cDNA 라이브러리에서 대장균주 DH5α를 형질 전환하고, 얻어진 약 26,000개의 단일 콜로니를 픽업하고, 384매의 플레이트 상에 식균하였다. 콜로니 PCR로 시퀀스 반응의 주형으로 하는 DNA를 증폭하고, 에탄올 침전에 의한 정제를 행하였다. 그것을 주형으로 하여, 어플라이드 바이오시스템즈사의 BigDye ver3.1을 이용하여, 각 cDNA 단편의 5' 말단측으로부터, 시퀀스 반응을 행하였다. 에탄올 침전에 의한 정제 후, 어플라이드 바이오시스템즈사의 3730xl DNA 어낼라이저를 이용하여 염기 서열의 해석을 행하였다.

<실시예 5>

EST ( Expression Sequence Tag )의 클러스터링

실시예 3에서 얻어진 약 30,000개의 EST 데이터와 실시예 4에서 얻어진 약 26,000개의 EST 데이터를 1개의 데이터 세트에 통합하고, PHRAP 프로그램 (http://www.phrap.org)를 이용하여 클러스터링을 행하였다. 그 결과, 10,372개의 고유한 콘티그를 얻었다.

<실시예 6>

상동성 검색에 의한 시토크롬 P450 유전자의 추출

실시예 5에서 얻어진 10,372개의 콘티그 배열을 쿼리로 하여, NCBI(National Center for Biotechnology Information) 데이터 베이스에 등록되어 있는 기지 단백질에 대한 BLASTX 검색(Altschul, S.F. et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402, 1997)를 행하였다. 시토크롬 P450 산화 효소가 β-아미린 이후의 글리시리진 생합성 경로에 관여한다고 예측하여, 해당 데이터 베이스에 등록되어 있는 기지의 시토크롬 P450 산화 효소에 높은 상동성을 나타내는 콘티그를 선발하였다. 선발한 콘티그를 구성하는 복수의 EST 클론으로부터, 가장 긴 5' 말단 영역을 보유한다고 판정되는 것에 대해서 플라스미드 DNA를 제조하고, 클론화된 각 cDNA 단편(36개)의 전장 염기 서열을 결정하였다.

<실시예 7>

유전자 발현 해석(후보 유전자의 스크리닝)

실시예 6에서 얻어진 36개의 시토크롬 P450 유전자군으로부터 글리시리진 생합성에 관한 가능성이 높은 분자종을 선발하기 위해서, 각 시토크롬 P450 분자종이 식물체의 어떤 기관에서 발현하고 있는 것인지를 RT-PCR법에 의해 조사하였다.

글리시리진을 고축적하는 지하부 조직(비대근 및 기는 줄기)와 글리시리진이 검출되지 않은 지상부 조직(잎 및 줄기)의 계4종의 상이한 식물 조직으로부터 토탈 RNA를 제조하였다. 얻어진 토탈 RNA 1 μg을 이용하여, SMART RACE cDNA 앰플리피케이션 키트(amplification kit; clontech사)를 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라서 제1 스트랜드 cDNA 합성을 행하였다.

계속해서, 각 시토크롬 P450 유전자에 특이적으로 어닐링하는 감지 및 안티센스 프라이머를 설계하고, 상기 4종의 제1 스트랜드 cDNA 각 2 μl를 주형으로 하여, Ex Taq™ DNA 폴리메라아제(TaKaRa사)를 이용하여, 25 내지 30 사이클의 PCR을 행하였다. 얻어진 PCR 단편을 아가로스 겔 전기 영동으로 분석하였다(도 1b). 뿌리 및 기는 줄기에서의 발현이 높은 시토크롬 P450 분자종을 선발하였다. 그 중에서 트리테르펜을 산화하는 효소 활성이 인정된 시토크롬 P450 분자종(GuCYP72.1)에 대해서 이하의 실시예를 행하였다.

<실시예 8>

GuCYP72. 1의 전장 코드 영역의 증폭 및 엔트리 벡터에의 클로닝

GuCYP72.1의 전장 코드 영역을 포함하는 플라스미드 클론(pGCAPzf3을 이용하여 제작)을 주형으로, GuCYP72.1 폴리펩티드의 N 말단과 C 말단에 상당하는 개소의 올리고 DNA를 프라이머(서열번호 1 및 2)로 하여, Pfu-Turbo DNA Polymerase(Stratagene사)를 사용하여, 어닐링 온도 55℃에서 30 사이클의 PCR을 행하였다. 서열번호 1의 프라이머에는 5' 말단에 4 염기(cacc)가 부가되어 있는데, 이것은 pENTR™/D-TOPO(등록상표) 엔트리 벡터(Invitrogen사)에의 클로닝 시에 필요하게 된다. 상기 PCR에 의해 증폭된 DNA 단편을 pENTR™/D-TOPO(등록상표) 엔트리 벡터에 클로닝하고, 얻어진 4개의 독립 클론에 대해서 염기 서열을 결정하였다. 이에 따라 얻어진 폴리뉴클레오티드의 염기 서열이 서열번호 3이고, 또한 그것으로부터 추정되는 폴리펩티드 배열이 서열번호 4이다.

<실시예 9>

바큘로 바이러스-곤충 세포 발현 계에 의한 본 발명의 단백질 발현 벡터의 구축

실시예 8에서 제작한, 서열번호 3에 나타내는 폴리뉴클레오티드를 갖는 플라스미드(엔트리클론)과 데스티네이션 벡터 pDEST™8(Invitrogen사)를 혼합하고, 염기 서열 특이적인 재조합 반응(GATEWAY™attL×attR 반응)에 의해, 서열번호 3에 나타내는 폴리뉴클레오티드를 pDEST™8 벡터로 옮김으로써 곤충 세포 발현용 컨스트럭트를 구축하였다. 염화칼슘법에 의해서, 얻어진 컨스트럭트로 대장균주 DH10Bac(Invitrogen사)를 형질 전환하였다. 첨부된 프로토콜에 따라서, 형질 전환체 콜로니로부터 Bacmid DNA(초대 재조합 바큘로 바이러스)를 제조하였다.

<실시예 10>

바큘로 바이러스-곤충 세포 발현 계에 의한 본 발명의 단백질의 발현

통상법(Invitrogen사, Bac-to-Bac Baculovirus Expression System, 카타로그번호 10359016)를 이용하여, 첨부된 프로토콜에 따라, 실시예 9에서 제조한 Bacmid DNA를 곤충 세포(Spodoptera frugiperda 9)에 감염·증식시켜, 순화한 고역가 바이러스액(역가=약 1×10⁸ pfu/ml)을 제조하였다. 1.0×10⁶개의 곤충 세포를 3 ml의 그레이스 인섹트 셀 컬쳐 미디움(Grace's Insect Cell Culture Medium; GIBCO BRL사)에 현탁하고, 30 μl의 고역가 바이러스액을 가하고, 실온에서 30분간 인큐베이트하였다. 50 ml의 그레이스 인섹트 셀 컬쳐 미디움(최종 농도 100 ㎛의 아미노레불린산, 최종 농도 10％의 소 태아 혈청, 최종 농도 100 ㎛의 시트르산철, 최종 농도 0.1％의 Pluronic F68을 첨가한 것)을 가한 후, 300 ml 용량 플라스크에 옮기고, 27℃, 150 rpm에서 96시간 배양하였다.

<실시예 11>

곤충 세포로부터의 마이크로솜 분획의 제조

실시예 10에서 얻어진 곤충 세포 배양액 50 ml를 2,330 g, 4℃에서 5분간 원심하여, 곤충 세포를 회수하였다. 곤충 세포를 빙냉한 인산 버퍼로 3회 세정한 후, 5 ml의 50 mM 인산-칼륨 버퍼(pH 7.2, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 20％ Glycerol을 포함함)에 현탁하였다. 브랜슨 소니퍼(BRANSON SONIFER) 250(브랜슨사)를 이용하여, 세포를 초음파 파쇄한 후, 2,330 g, 4℃에서 20분간 원심 분리를 행하였다. 상청을 회수하고, 100,000 g, 4℃에서 1시간 원심 분리하고, 얻어진 펠릿(마이크로솜 분획)을 2 ml의 50 mM 인산-칼륨 버퍼(pH 7.2, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 20％ 글리세롤을 포함함)에 현탁하였다.

<실시예 12>

기질 트리 테르펜의 제조

실시예 11에서 얻어진 마이크로솜 분획의 활성 시험에 이용하는 기질로서의 트리테르펜은, 도 2 및 도 3에 도시하는 방법으로 합성하였다.

(1) β-아미린

올레아놀산(SIGMA사)를 트리메틸실릴디아조메탄과 반응시켜, 카르복실산을 메틸에스테르체로 하고, 수산기를 tert-부틸디메틸실릴기로서 보호하였다. 메틸에스테르를 환원하여 알코올로 유도하고, 메실클로라이드를 작용시켜 메실에스테르체로 한 후, 환원적 치환 반응에 의해 메틸체로 유도하였다. 이 메틸체를 탈보호하여 β-아미린을 얻었다. 구조는 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 스펙트럼을 해석하고 확정하였다.

(2) 11-옥소-β-아미린

β-아미린의 3 위치 수산기를 테트라히드로피라닐기로 보호하고, 염화루테늄과 tert-부틸히드로퍼옥시드를 작용시켜 11 위치 메틸렌탄소를 카르보닐기로 유도하였다. 그 후, 탈보호를 행하여 11-옥소-β-아미린을 얻었다. 구조는 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 스펙트럼을 해석하고 확정하였다.

(3) 11-데옥소글리시르레틴산

글리시르레틴산(SIGMA사)에 아연과 염산을 작용시켜 11 위치의 카르보닐기를 환원하여 11-데옥소글리시르레틴산을 얻었다. 구조는 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 스펙트럼을 해석하고 확정하였다.

(4) 30-히드록시-β-아미린

11-데옥소글리시르레틴산에 트리메틸실릴디아조메탄을 작용시켜, 카르복실산을 메틸에스테르체로 유도하고, 에스테르를 환원하여 30-히드록시-β-아미린을 얻었다. 구조는 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 스펙트럼을 해석하고 확정하였다.

(5) 30-히드록시-11-옥소-β-아미린

30-히드록시-β-아미린의 수산기를 테트라히드로피라닐기로서 보호하고, 염화루테늄과 tert-부틸히드로퍼옥시드를 작용시켜 11 위치 메틸렌탄소를 카르보닐기로 변환하고, 탈보호를 행하여 30-히드록시-11-옥소-β-아미린을 얻었다. 구조는 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 스펙트럼을 해석하고 확정하였다.

<실시예 13>

마이크로솜 분획을 이용한 시험관내 어세이

실시예 11에서 얻어진 마이크로솜 분획 50 μl와, 25 μl의 1 M 인산-칼륨 버퍼(pH 7.2), 1 μl(최종 농도 0.1 unit/ml)의 정제 애기장대 시토크롬 P450 환원 효소(Mizutani, M. and Ohta, D., Plant Physiol. 116, 357-367, 1998), 25 μl(최종 농도 1 mM)의 NADPH, 5 μl(최종 농도 20 ㎛)의 반응 기질(11-옥소-β-아미린), 394 μl의 멸균수를 혼합한 후, 30℃, 1,000 rpm에서 교반시키면서 2시간 인큐베이트하였다.

<실시예 14>

변환물의 동정

실시예 13에서 얻어진 반응 용액을 아세트산에틸로 추출하였다. 아세트산에틸구는 용매를 건조 제거한 후, N-메틸-N-트리메틸실릴트리플루오로아세트아미드를 가하고, 80℃에서 30분간 가열하고, 트리메틸실릴에테르체에 유도체화하여 GC-MS 분석의 시료로 하였다. GC-MS는 Automass (JEOL)-6890N(Agilent technologies사)를, 칼럼은, HP-5 column(J&W Scientific사; 0.32 mm×30 m; 0.25 mm film thickness)을 이용하여 변환물을 분석하였다. 변환물의 동정은 실시예 12에서 제조한 기질 트리테르펜을 표품으로 하여 GC의 유지 시간 및 MS 스펙트럼을 비교함으로써 결정하였다.

여기서, 서열번호 4로 나타내는 폴리펩티드(GuCYP72.1)를 발현하는 곤충 세포로부터 제조한 마이크로솜을 이용하여 효소 어세이를 행한 결과, 기질로서 제공한 11-옥소-β-아미린(도 4, 흰색 화살표 A)이 수산화되었다고 생각되는 3개의 피크(도 4, 검은색 화살표)가 검출되었다. 그 중에서 B에서 나타낸 피크의 유지 시간 및 매스 스펙트럼이 30-히드록시-11-옥소-β-아미린과 잘 일치하였다. 이들 피크는 공벡터를 도입한 곤충 세포에서 유래하는 마이크로솜 분획(네가티브 컨트롤)을 이용한 동일한 실험에서는 검출되지 않았다.

이상의 결과로부터, 글리시리진의 생합성에 관여한다고 생각되는 30 위치의 수산화 반응에 관여하는 효소(GuCYP72.1)가 처음으로 동정되었다(도 4).

<실시예 15>

벌노랑이β- 아미린 합성 효소(OSC1 ) 유전 자 cDNA 의 효모 발현 벡터 pYES3 -ADH-OSC1의 구축

콩과의 모델 식물로서 EST 및 게놈 해석이 진행하고 있는 벌노랑이(Lotus japonicus)를 이용하여 β-아미린 합성 효소(OSC1) 유전자의 효모 발현 벡터를 구축하였다.

벌노랑이 OSC1 유전자 cDNA 도입 플라스미드(Sawai et al. (2006) Plant Sci 170: 247-257)를 KpnI, XbaI로 소화하고, OSC1 cDNA 영역을 추출하였다. pAUR123(TaKaRa사)도 마찬가지로 KpnI, XbaI로 소화하고, DNA ligation Kit Ver. 2.1(TaKaRa사)로 양자를 라이게이션하여 AUR123-OSC1을 얻었다. pAUR123-OSC1의 PADH1로부터 TADH1 영역을 AUR123-F(GGATGATCCACTAGTGGATCCTCTAGCTCCCTAACATGTAGGTGG: 서열번호 5) 및 AUR123-R(TAATGCAGGGCCGCAGGATCCGTGTGGAAGAACGATTACAACAGG: 서열번호 6)의 양 프라이머를 이용하여, KOD-Plus-DNA 폴리메라아제(TOYOBO사)에 의해 94℃에서 2분간 처리한 후, (94℃ 20초간→55℃ 40초간→68℃ 90초간)×20 사이클로 이루어지는 PCR을 행하였다. 그 후, 68℃에서 2분간 보온하였다. 또한, pYES3/CT(Invitrogen사)의 1번부터 960번 염기(PGAL1부터 CYC1TT)를 제외하는 영역을 YES3-F(TGCGGCCCTGCATTAATGAATCGGCCAACG: 서열번호 7) 및 YES3-R(ACTAGTGGATCATCCCCACGCGCCCTGTAG: 서열번호 8)의 양 프라이머를 이용하여 KOD-Plus-DNA 폴리메라아제(TOYOBO사)에 의해 상기와 같이 PCR을 행하였다. 양 PCR 산물을 인-퓨전 드라이-다운 PCR 클로닝 키트(In-Fusion Dry-Down PCR Cloning Kit; clontech사)를 이용하여 결합하여, 벌노랑이 OSC1 효모 발현 벡터 pYES3-ADH-OSC1을 얻었다.

<실시예 16>

벌노랑이 시토크롬 P450 환원 효소를 포함하는 효모 발현 벡터 pESC-LjCPR1의 구축

벌노랑이 EST 데이터 베이스(가즈사 DNA 연구소)를 검색하여, 애기장대 시토크롬 P450 환원 효소와 아미노산 레벨로 70％ 이상의 상동성을 갖는 핵산 배열을 선발하였다. 전장 코드 영역을 포함한다고 생각되는 EST 클론(accession no. AV778635)를 가즈사 DNA 연구소로부터 입수하여, ABI PRISM 3100 지네틱 어낼라이저(Genetic Analyzer)를 이용하여 DNA 배열을 결정하였다(이하, LjCPR1로 함). LjCPR1 도입 플라스미드(pBluescript SK (-))를 주형으로 하여, CPR-F(Not)(GGGCGGCCGCACTAGTATCGATGGAAGAATCAAGCTCCATGAAG: 서열번호 9) 및 CPR-R(Pac)(TTAATTAATCACCATACATCACGCAAATAC: 서열번호 10)의 양 프라이머를 이용하여, KOD-Plus- DNA 폴리메라아제(TOYOBO사)에 의해 94℃에서 2분간 처리한 후, (94℃ 20초간→60℃ 40초간→68℃ 120초간)×15 사이클로 이루어지는 PCR을 행하였다. 그 후, 68℃에서 2분간 보온하였다. PCR 산물을 TAget Clone-Plus-(TOYOBO사)를 이용하여, pT7Blue T-vector(Novagen사)와 라이게이션하였다. 염기 서열을 확인후, NotI, PacI로 소화하고, 또한 효모 발현용 벡터 pESC-LEU(Stratagene사)도 마찬가지로 NotI, PacI로 소화하였다. 그 후, DNA ligation Kit Ver. 2.1(TaKaRa사)를 이용하여 양자를 라이게이션하여, LjCPR1의 효모 발현 벡터 pESC-LjCPR1을 얻었다.

<실시예 17>

G. 우랄렌시스 (G. uralensis ) 유래 β- 아미린 11 위치 산화 효소( CYP88D6 )와 LjCPR1의 효모에 있어서의 동시 발현 벡터 pELC88BN 의 구축

우선, 본 발명자들이 G. 우랄렌시스(G. uralensis)로부터 이전에 단리한 β-아미린 11 위치 산화 효소(CYP88D6)를 코딩하는 유전자(GenBank accession no. AB433179)를 이하에 나타내는 방법에 의해 효모 발현 벡터인 pESC-LEU(Stratagene사)에 클로닝하였다.

pENTR™/D-TOPO(등록상표) 엔트리 벡터에 클로닝된 CYP88D6을 코딩하는 cDNA를 주형으로 하여, 88S1(CGCCGGATCCACCATGGAAGTACATTGGGTTTGCATGTCC: 서열번호 11) 및 88AS4 Xba(GCCCTCTAGACTAAGCACATGAAACCTTTATCACCTTAGC: 서열번호 12)의 양 프라이머를 이용하여, KOD-Plus-(TOYOBO사)에 의해 94℃에서 2분간 처리한 후, (94℃ 15초간→62℃ 40초간→68℃ 90초간)×25 사이클로 이루어지는 PCR을 행하여, CYP88D6 cDNA를 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. PCR 용액을 전기 영동하고, 약 1.5 kb의 증폭 단편을 Wizard SV Gel and PCR Clean-up System(Promega사)로 정제하였다. 제한 효소 BamHI, XbaI로 소화하고, 반응물을 위자드 SV 겔 앤드 PCR 클린-업 시스템(Wizard SV Gel and PCR Clean-up System; Promega사)으로 정제하였다. 한편, pESC-LEU(Stratagene사)를 제한 효소 BamHI, NheI로 소화하였다. 이들을 DNA ligation Kit Ver2.1(TaKaRa사)를 이용하여 라이게이션하여, CYP88D6 효모 발현 벡터인 pESC-CYP88D6을 얻었다.

다음으로, 실시예 16에 나타내는 방법에 의해, 제한 효소 NotI, PacI를 이용하여 LjCPR1의 cDNA를 포함하는 DNA 단편을 제조하였다. 얻어진 DNA 단편을, 제한 효소 NotI, PacI로 소화한 pESC-CYP88D6에 DNA 라이게이션 키트 Ver2.1(TaKaRa사)를 이용하여 조립함으로써 CYP88D6과 LjCPR1의 효모에서의 동시 발현 벡터 pELC88BN을 얻었다.

<실시예 18>

효모에서의 GuCYP72.1 발현 벡터의 구축

실시예 8에서 제작한, 서열번호 3에 나타내는 폴리뉴클레오티드를 갖는 플라스미드(엔트리클론)과 데스티네이션 벡터 pYES-DEST™52(Invitrogen사)를 혼합하여, Gateway LR Clonase II Enzyme Mix(Invitrogen사)를 이용하여 염기 서열 특이적인 재조합 반응(GATEWAY™ attL×attR 반응)에 의해, 서열번호 3으로 나타내는 DNA 단편을 pYES-DEST™52에 바꿔서 옮김으로써 서열번호 3에 나타내는 유전자의 효모 발현 벡터 pDEST52-GuCYP72.1을 얻었다.

<실시예 19>

형질 전환 효모의 제작

효모 BJ2168주(닛본 진사)(MATa prc1-407 prb1-1122 pep4-3 leu2 trp1 ura3-52 gal2)의 형질 전환은 Frozen-EZ Yeast Transformation II(Zymo Research사)를 이용하여 행하였다. 우선, 효모 BJ2168주를 pYES3-ADH-OSC1로 형질 전환하였다. 다음으로, 얻어진 형질 전환 효모를 pESC-LjCPR1 및 pELC88BN의 각각에서 형질 전환하였다. 얻어진 2종의 효모주를 또한 pDEST52-GuCYP72.1, 또는 공벡터에 상당하는 pYES2(Invitrogen사)로 형질 전환하였다.

<실시예 20>

형질 전환 효모( pYES3 - ADH -OSC1, pESC -LjCPR1, pDEST52 - GuCYP72. 1)에 있어서의 생성물의 확인

pYES3-ADH-OSC1(벌노랑이β-아미린 합성 효소 발현 벡터), pESC-LjCPR1(벌노랑이 시토크롬 P450 환원 효소 발현 벡터), pDEST52-GuCYP72.1(G. 우랄렌시스(G. uralensis) 유래의 β-아미린 30 위치 산화 효소 GuCYP72.1 발현 벡터)의 3개의 벡터를 보유하는 효모를 400 ml의 SC-Trp/Leu/Ura 배지에서, 28℃에서 135 rpm의 진탕에 의해 2일간 배양하였다. 배양한 효모를 3,000 g으로 10분간 원심하여 집균하고, 갈락토오스(20 mg/ml), 염화헤민(13 μg/ml)을 첨가한 400 ml의 SC-Trp/Leu/Ura-글루코오스 배지에 현탁하였다. 그 후, 28℃에서 135 rpm의 진탕에 의해 2일간 배양하였다. 상기 원심 처리에 의해서 집균하여, 펠릿에 동결 건조 처리를 행하였다. 얻어진 샘플에 5 ml의 아세트산에틸을 추가로 혼합한 후, 아세트산에틸 추출물을 회수하였다. 이 조작을 3회 반복하였다. 아세트산에틸 추출물을 감압 하에서 농축하였다. pYES3-ADH-OSC1, pESC-LjCPR1, pYES2(공벡터)의 3개의 벡터를 보유하는 컨트롤의 효모에 대해서도 마찬가지로, 배양, 추출을 행하였다. 실시예 14에 기술한 방법과 같이, 아세트산에틸구는 용매를 건조 제거한 후, N-메틸-N-트리메틸실릴트리플루오로아세트아미드를 가하고, 80℃에서 30분간 가열하여 트리메틸실릴에테르체에 유도체화하여, GC-MS 분석의 시료로 하였다. 변환물의 동정은 실시예 12에서 제조한 기질 트리테르펜을 표품으로 하여 GC의 보유 시간 및 MS 스펙트럼을 비교함으로써 결정하였다.

pYES3-ADH-OSC1, pESC-LjCPR1, pDEST52-GuCYP72.1의 3개의 벡터를 보유하는 효모의 추출물(도 5: OSC1/LjCPR1/GuCYP72.1로 나타낸 GC 차트)로부터는, β-아미린(흰색 화살표 A)에 추가로 30-히드록시-β-아미린(검은색 화살표 B)이 검출되었다. 한편, 대조 실험으로서 행한 pYES3-ADH-OSC1, pESC-LjCPR1, pYES2의 3개의 벡터를 보유하는 효모의 추출물(도 5: OSC1/LjCPR1과 나타낸 GC 차트)로부터는 β-아미린(흰색 화살표 A)만이 검출되고, 30-히드록시-β-아미린은 검출되지 않았다.

이상의 결과로부터, 본 발명의 유전자(GuCYP72.1)가 코딩하는 효소는 β-아미린 합성 효소(OSC1)를 발현하는 효모에서 생기는 β-아미린의 30 위치의 메틸렌탄소를 히드록실기로 변환하여, 30-히드록시-β-아미린을 생성할 수 있는 것이 판명되었다.

<실시예 21>

NMR 에 의한 30-히드록시-β- 아미린의 동정

pYES3-ADH-OSC1, pESC-LjCPR1, pDEST52-GuCYP72.1의 3개의 벡터를 보유하는 효모를 400 ml의 SC-Trp/Leu/Ura 배지(12본, 계 4.8 L)에서 28℃에서 125 rpm의 진탕에 의해 2일간 배양하였다. 배양한 효모를 3,000 g에서 10분간 원심하여 집균하여, 갈락토오스(20 mg/ml), 염화헤민(13 μg/ml)을 첨가한 400 ml의 SC-Trp/Leu/Ura-글루코오스 배지(12본, 계 4.8 L)에 현탁하였다. 그 후, 28℃에서 125 rpm의 진탕에 의해 2일간 배양하였다. 상기 원심 처리에 의해서 집균한 후, 펠릿에 동결 건조 처리를 행하였다. 동결 건조한 균에 100 ml 클로로포름을 가하여, 혼합한 후, 클로로포름 추출물을 회수하였다. 이 조작을 3회 반복하였다. 클로로포름 추출물을 감압 하에서 농축하였다. 물 100 ml를 가한 클로로포름 추출물에 100 ml 아세트산에틸을 가하여, 혼합한 후, 아세트산에틸 추출물 회수하였다. 이 조작을 3회 반복하였다. 아세트산에틸 추출물을 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 감압 하에서 농축하였다. 그 후, 아세트산에틸 추출물을 실리카겔 크로마토그래피로 분획하였다. 실리카겔 크로마토그래피는 Wako gel C-200(와코 준야꾸 고교), 2.8×40 cm에서 행하고, 헥산:아세트산에틸(1:1)을 흘려, 용출액을 7 ml씩 분획하였다. 41 내지 51번 프랙션을 모아 용매 제거하고, 실리카겔 TLC 플레이트 LK6F20×20 cm(Whatman사)에 처하였다. 헥산:아세트산에틸(1:1)로 전개한 후에, 30-히드록시-β-아미린과 동일한 Rf값의 실리카겔을 긁어내고, 클로로포름으로 용출하였다. 용매 제거 후, 중클로로포름에 용해하고, 니혼 덴시사 제조(500 MHz) NMR를 이용하여 ¹H-NMR 스펙트럼을 측정하였다. 이 분획의 ¹H-NMR 스펙트럼은 실시예 3에서 제조한 표품의 30-히드록시-β-아미린과 완전히 일치하였다.

도 6에 결과를 나타낸다.

<실시예 22>

형질 전환 효모( pYES3 - ADH -OSC1, pELC88BN , pDEST52 - GuCYP72. 1)에 있어서의 생성물의 확인

pYES3-ADH-OSC1(벌노랑이β-아미린 합성 효소 발현 벡터), pELC88BN(G. 우랄렌시스(G. uralensis) 유래의 β-아미린 11 위치 산화 효소 CYP88D6과 벌노랑이 유래의 시토크롬 P450 환원 효소 LjCPR1의 동시 발현 벡터), pDEST52-GuCYP72.1(G. 우랄렌시스(G. uralensis) 유래의 β-아미린 30 위치 산화 효소 GuCYP72.1 발현 벡터)의 3개의 벡터를 보유하는 효모를 실시예 20에 나타낸 방법으로 배양하고, 추출을 행하였다. 변환물의 동정은 실시예 12에서 제조한 기질 트리테르펜을 표품으로 하여, GC의 보유 시간 및 MS 스펙트럼을 비교함으로써 결정하였다.

그 결과, pYES3-ADH-OSC1, pELC88BN, pDEST52-GuCYP72.1의 3개의 벡터를 보유하는 효모의 추출물(도 7: OSC1/LjCPR1/CYP88D6/GuCYP72.1로 나타낸 GC 차트)로부터는, β-아미린(도 7: 피크 A, 도 8: 화합물 A) 및 11-옥소-β-아미린(도 7: 피크 B, 도 8: 화합물 B)에 추가로, 30-히드록시-β-아미린(도 7: 피크 C, 도 8: 화합물 C), 30-히드록시-11-옥소-β-아미린(도 7: 피크 D, 도 8: 화합물 D), 글리시르레틴산(도 7: 피크 H, 도 8: 화합물 H) 및 20-에피-글리시르레틴산(도 7: 피크 I)이 검출되었다. 또한, 구조는 확정되어 있지 않지만, 매스 스펙트럼 패턴으로부터 11-옥소-β-아미린이 수산화된 화합물로 추정되는 피크 E 및 F, 및 화합물 D가 더 산화된 30 위치 알데히드체로 추정되는 피크 G가 검출되었다.

한편, 컨트롤인 pYES3-ADH-OSC1 및 pELC88BN의 2개의 벡터만을 보유하는 효모의 추출물(도 7: OSC1/LjCPR1/CYP88D6로 나타낸 GC 차트)로부터는 β-아미린(피크 A) 및 11-옥소-β-아미린(피크 B)는 검출되었지만, 30-히드록시-β-아미린, 30-히드록시-11-옥소-β-아미린, 글리시르레틴산 및 20-에피-글리시르레틴산은 검출되지 않았다.

이상의 결과로부터, 본 발명의 유전자(GuCYP72.1)가 코딩하는 효소는, β-아미린 합성 효소(OSC1) 및 β-아미린 11 위치 산화 효소(CYP88D6)를 동시 발현하는 효모에서 생기는 11-옥소-β-아미린의 30 위치의 메틸렌탄소를 카르복실기로 변환하여, 글리시리진의 전구 물질(사포게닌)인 글리시르레틴산 및 그의 이성체인 20-에피-글리시르레틴산을 생성할 수 있는 것이 분명해졌다.

<실시예 23>

G. 글라브라(G. glabra)에서의 본 발명의 폴리펩티드의 단리

G. 글라브라(G. glabra)에서, 서열번호 3으로 표시되는 유전자와 동등한 기능을 가진다고 추측되는 상동 유전자(GgCYP72.1)를 RT-PCR법에 의해 단리하였다.

(독)이야꾸 기반 겐뀨쇼, 야꾸요우 쇼꾸부쯔 시겐 겐뀨 센터, 홋카이도 연구부(홋카이도 나요로시)로부터 분양된 G. 글라브라(G. glabra)의 기는 줄기로부터 토탈 RNA를 제조하였다. 얻어진 토탈 RNA 1 μg으로부터, SMART RACE cDNA amplification kit (Clontech사)를 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라서, 제1 스트랜드 cDNA 합성을 행하였다. 서열번호 1과 2로 나타내는 뉴클레오티드를 프라이머로 하여, Pfu-Turbo DNA Polymerase(Stratagene사)를 사용하여, 어닐링 온도 55℃에서 30 사이클의 PCR을 행하였다. 해당 PCR에 의해 증폭된 DNA 단편을 pENTR™/D-TOPO(엔트리 벡터)에 클로닝하고, 얻어진 4개의 독립 클론에 대해서 증폭 DNA 단편의 염기 서열을 결정하였다. 그 결과 얻어진 배열이 서열번호 13이고, 그로부터 추정되는 폴리펩티드 배열이 서열번호 14이다. 서열번호 14로 나타내는 아미노산 서열은 서열번호 4로 나타내는 아미노산 서열에 대하여 98.5％의 동일성을 갖고 있었다.

<실시예 24>

GuCYP72.1 발현 효모에 대한 30-히드록시-11-옥 소-β- 아미린의 첨가 실험

최초로, 효모 BJ2168주(닛본 진사)를 pESC-LjCPR1로 형질 전환하였다. 다음으로, 얻어진 형질 전환 효모를 pDEST52-GuCYP72.1 또는 공벡터에 상당하는 pYES2(Invitrogen사)로 형질 전환하였다.

각각의 형질 전환 효모주를 100 ml의 SC-Leu/Ura 배지에서 28℃에서 135 rpm에서 진탕하면서 2일간 배양하였다. 배양한 효모를 3000 g에서 10분간 원심함으로써 집균하여, 갈락토오스(20 mg/ml), 염화헤민(13 μg/ml) 및 2 ㎛의 30-히드록시-11-옥소-β-아미린을 첨가한 100 ml의 SC-Leu/Ura-글루코오스 배지에 현탁한 후, 28℃에서 135 rpm에서 2일간 배양하였다. 효모 배양액에 아세트산에틸을 추가로 혼합한 후, 아세트산에틸 추출물을 회수하였다. 아세트산에틸구는 용매를 건조 제거한 후, N-메틸-N-트리메틸실릴트리플루오로아세트아미드를 가하고, 80℃에서 30분간 가열하고, 트리메틸실릴에테르체로 유도체화하여 GC-MS 분석의 시료로 하였다.

30-히드록시-11-옥소-β-아미린을 첨가한 배지에서 pESC-LjCPR1 및 pDEST52-GuCYP72.1의 2개의 벡터를 보유하는 효모를 배양한 경우의 추출물(도 9, GC 차트 B)로부터는, 30-히드록시-11-옥소-β-아미린(점선 화살표; 도 8의 화합물 D)에 추가로, 글리시르레틴산(피크 2; 도 8의 화합물 H)이 검출되었다. 또한, 구조는 확정되지 않지만, 매스 스펙트럼 패턴으로부터 30 위치 알데히드체로 추정되는 피크 1도 검출되었다. 한편, 동효모주를 30-히드록시-11-옥소-β-아미린을 첨가하지 않은 배지에서 배양한 경우(도 9, GC 차트 A)에는 어느쪽의 피크도 검출되지 않았다.

또한, pESC-LjCPR1 및 pYES2(공벡터)의 2개의 벡터를 보유하는 효모를 30-히드록시-11-옥소-β-아미린 첨가 배지에서 배양한 경우(도 9, GC 차트 C)에는 30-히드록시-11-옥소-β-아미린(점선 화살표)만이 검출되고, 피크 2의 글리시르레틴산은 검출되지 않았다.

<실시예 25>

NMR 에 의한 글리시르레틴산의 동정

400 ml의 SC-Leu/Ura 배지(12본, 계 4.8 L)에, pESC-LjCPR1, pDEST52-GuCYP72.1의 2개의 벡터를 보유하는 효모와 30-히드록시-β-아미린의 에탄올 용액(0.9 μg/ml)을 첨가한 후, 28℃, 125 rpm에서 진탕하면서 2일간 배양하였다. 배양한 효모를 3,000 g에서 10분간 원심하여 집균하고, 갈락토오스(20 mg/ml), 염화헤민(13 μg/ml)을 첨가한 400 ml의 SC-Leu/Ura-글루코오스 배지(12본, 계 4.8 L)에 현탁하였다. 그 후, 28℃에서 125 rpm의 진탕에 의해 2일간 배양하였다. 배양액에 400 ml 아세트산에틸을 추가로 혼합한 후, 아세트산에틸 추출물을 회수하였다. 이 조작을 3회 반복하였다. 아세트산에틸 추출물을 감압 하에서 농축한 후, 실리카겔 크로마토그래피로 분획하였다. 실리카겔 크로마토그래피는, 실리카겔 60 N(간토 가가꾸), 3.0×15 cm에서 행하고, 헥산:아세트산에틸(1:1)을 흘려, 용출액을 50 ml씩 분획하였다. 그 후, 5 내지 7번 프랙션을 모아 용매 제거하였다. 잔사를 메탄올에 용해하고, 멤브레인 필터-(아드반테크 도요사)로 여과한 후, 역송 HPLC의 샘플로 하여 분취를 행하였다(분취 조건: 칼럼, PEGASIL ODS, 25 cm×6 mm i.d.(센슈 가가꾸); 이동상, 아세토니트릴(0.1％ 아세트산); 유속, 1.5 ml/분; UV detector 248 nm). 5분부터 10분까지 30초마다 분취하여, 3,4번 프랙션을 모으고 용매 제거하였다. 잔사를 실리카겔 TLC 플레이트(Merck사 제조, Silica gel 60 F₂₅₄ 20×10 cm)에 처하였다. 헥산:아세트산에틸(1:1, 0.5％ 아세트산)으로 전개한 후에, 글리시르레틴산과 동일한 Rf값의 실리카겔을 긁어 내고, 아세트산에틸:클로로포름(1:1)으로 용출하였다. 용매 제거 후, 중클로로포름에 용해하고, 니혼 덴시사 제조(500 MHz) NMR를 이용하여 ¹H-NMR 스펙트럼을 측정하였다. 이 분획의 ¹H-NMR 스펙트럼은 표품의 글리시르레틴산과 완전히 일치하였다.

도 10에 결과를 나타낸다.

<실시예 26>

통개자리(Medicago truncatula)의 GuCYP72.1 상동 유전자의 검색

본 발명의 올레아난형 트리테르펜의 30 위치의 탄소를 산화하는 활성을 갖는 효소가, 감초속에 한정되지 않고, 콩과 전반에 존재하는 것을 검증하기 위해서, 감초속과 동일 콩과 콩아과의 식물에 속하고, 또한 감초속과는 계통적으로 먼 개자리속의 식물, 통개자리(Medicago truncatula)를 이용하여 이하의 실험을 행하였다.

콩과 개자리속 식물인 통개자리는 글리시리진과 같이 β-아미린을 기본 골격에 갖는 복수의 트리테르페노이드사포닌을 생산하는 것이 알려져 있다. 통개자리에 있어서 서열번호 3으로 표시되는 GuCYP72.1 유전자와 유사한 기능을 가진다고 기대되는 상동 유전자를 탐색하였다. 상동성 검색에 의해, 통개자리의 공개 EST 데이터 베이스 DFCI Medicago Gene Index Release 8.0(http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/cgi-bin/tgi/gimain.pl?gudb=medicago)에 등록되어 있는 TC(Tentative consensus=EST clone의 중복으로부터 추측한 보다 긴 cDNA 배열) 배열 중으로부터 GuCYP72.1의 전장 코드 영역과 83％의 염기 서열 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오티드 배열, TC113088을 발견하였다.

<실시예 27>

통개자리의 GuCYP72.1 상동 유전자의 단리

통개자리, 친환경형 R108-1을 인공 기상기 내(23℃, 긴 낮 16시간)에서 육성하고, 발아 후 4주일째의 식물의 잎, 줄기, 뿌리로부터 각각 토탈 RNA를 제조하였다. 얻어진 토탈 RNA를 1 μg 이용하여, SMART RACE cDNA amplification kit(Clontech사)를 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라서 제1 스트랜드 cDNA 합성을 행하였다.

3종의 제1 스트랜드 cDNA 각 2 μl를 주형으로 하여, TC113088로부터 추정되는 폴리펩티드(524아미노산)의 N 말단과 C 말단에 상당하는 개소의 올리고 DNA, 즉 서열번호 19(caccATGGAAGTGTTTATGTTTCCCACAGG)와 서열번호 20(TTACAGTTTATGCAAAATGATGCTTGCA)를 프라이머에 이용하고, 어닐링 온도 54℃에서 PCR(34 사이클, TOYOBO사 제조 KOD plus ver.2 polymerase를 사용)을 행하였다. 또한, pENTR™/D-TOPO(등록상표) 엔트리 벡터(Invitrogen사)에의 클로닝 시에 필요한 것으로부터, 서열번호 19의 프라이머에는, 5' 말단에 4염기(cacc)가 인공적으로 부가되어 있다. PCR의 결과, 어느 제1 스트랜드 cDNA를 주형에 이용한 경우에도, 약 1.6 kb의 DNA 단편이 동일 정도 증폭되었다. 줄기 유래의 제1 스트랜드 cDNA로부터 증폭된 DNA 단편을 pENTR™/D-TOPO 엔트리 벡터에 클로닝하고, 얻어진 4개의 독립 클론에 대해서 폴리뉴클레오티드 배열을 결정하였다. 이에 따라 얻어진 배열은 서열번호 17이고, 그로부터 추정되는 폴리펩티드 배열은 서열번호 18이다. 서열번호 18은 서열번호 4로 나타내는 아미노산 서열에 대하여 75.5％의 동일성을 갖고 있었다. 서열번호 18에 나타내는 P450 분자종을 이하 MtCYP72.1로 한다.

<실시예 28>

LjCPR1과 MtCYP72. 1의 효모 동시 발현 벡터 pELC - MtCYP72. 1의 구축

실시예 16에 있어서 구축한 pESC-LjCPR1을 이하에 나타내는 방법에 의해 Gateway 테크놀로지 대응 발현 벡터로 변환하였다.

pAM-PAT-GW 벡터(Max Planck Institute의 Bekir Ulker 박사와 Imre E. Somssich 박사로부터 증여)를 제한 효소 XhoI 및 SpeI로 이중 소화하여, Gateway conversion cassette(Invitrogen사)를 포함하는 DNA 단편을 추출하였다. 얻어진 DNA 단편을, pESC-LjCPR1을 SalI와 NheI의 이중 소화로 얻어지는 2개의 단편 중 큰 단편과 연결함으로써 pELC-MCS2-GW를 구축하였다. pELC-MCS2-GW의 구축에는, 대장균 DB3.1주(Invitrogen사)를 사용하였다.

다음으로, 실시예 27에서 제작한, 서열번호 17에 나타내는 폴리뉴클레오티드를 갖는 플라스미드(엔트리클론)와 pELC-MCS2-GW를 혼합하고, Gateway LR Clonase II Enzyme Mix(Invitrogen사)를 이용하여 염기 서열 특이적인 재조합 반응(attL x attR 반응)에 의해, 서열번호 17로 나타내는 DNA 단편을 pELC-MCS2-GW에 바꿔서 옮김으로써 LjCPR1과 서열번호 17에 나타내는 유전자의 동시 발현 벡터 pELC-MtCYP72.1을 얻었다.

<실시예 29>

OSC1과 MtCYP72. 1을 동시 발현하는 형질 전환 효모의 제작

INVSc1주(Invitrogen사)(MATa his3D1 leu2 trp1 -289 ura3 -52 MATAlpha his3D1 leu2 trp1 -289 ura3 -52)의 형질 전환은 Frozen-EZ Yeast Transformation II(Zymo Research사)를 이용하여 행하였다. 최초로, 효모 INVSc1주를 pYES3-ADH-OSC1로 형질 전환하고, 계속해서, 얻어진 형질 전환 효모를 pELC-MtCYP72.1 또는 컨트롤로서 pESC-LjCPR1로 형질 전환하였다.

<실시예 30>

형질 전환 효모( pYES3-ADH-OSC1, pELC-MtCYP72.1)에 있어서의 생성물의 확인

pYES3-ADH-OSC1, pELC-MtCYP72.1의 2개의 벡터를 보유하는 효모를 5 ml의 SC-Trp/Leu 배지 30℃, 135 rpm, 1일간 배양하였다. 배양한 효모를 3000 g, 10분간 원심함으로써 집균하여, 갈락토오스(20 mg/ml), 염화헤민(13 μg/ml)을 첨가한 10 ml의 SC-Trp/Leu-글루코오스 배지에 현탁하여, 30℃, 135 rpm, 2일간 배양하였다. 효모 배양액에 5 ml의 아세트산에틸을 가하여 혼합한 후, 아세트산에틸 추출물을 회수하였다. 이 조작을 3회 반복하였다. 아세트산에틸 추출물을 감압 하에서 농축하였다. pYES3-ADH-OSC1, pESC-LjCPR1의 2개의 벡터를 보유하는 효모에 대해서도 마찬가지로, 배양, 추출을 행하였다. 실시예 14에 기술한 방법과 같이, 아세트산에틸구는 용매를 건조 제거한 후, N-메틸-N-트리메틸실릴트리플루오로아세트아미드를 가하여, 80℃에서 30분간 가열하고, 트리메틸실릴에테르체에 유도체화하여 GC-MS 분석의 시료로 하였다. 변환물의 동정은 실시예 12에서 제조한 트리테르페노이드를 표품으로 하여 GC의 보유 시간 및 MS 스펙트럼을 비교함으로써 결정하였다.

pYES3-ADH-OSC1 및 pELC-MtCYP72.1의 2개의 벡터를 보유하는 효모의 추출물(도 11a, OSC1/LjCPR1/MtCYP72.1로 나타낸 GC 차트)로부터는, β-아미린(점선 화살표; 도 8의 화합물 A)에 추가로, 특이적인 2개의 피크(피크 1과 피크 2)가 검출되었다. 그 중, 피크 1의 매스 스펙트럼은 30-히드록시-β-아미린(도 8의 화합물 C)의 매스 스펙트럼과 매우 잘 일치하였다(도 11b). 또한, 피크 2의 매스 스펙트럼은 11-데옥소글리시르레틴산(도 8의 화합물 J)의 매스 스펙트럼과 매우 잘 일치하였다(도 11c). 이에 따라, 피크 1은 30-히드록시-β-아미린에, 피크 2는 11-데옥소글리시르레틴산에 각각 상당하는 것이 판명되었다.

한편, pYES3-ADH-OSC1 및 pESC-LjCPR1의 2개의 벡터를 보유하는 효모의 추출물(도 11a, OSC1/LjCPR1과 나타낸 GC 차트)로부터는 β-아미린(점선 화살표)은 검출되었지만, 30-히드록시-β-아미린(피크 1) 및 11-데옥소글리시르레틴산(피크 2)은 검출되지 않았다.

이상의 결과로부터, MtCYP72.1은, β-아미린 합성 효소(OSC1)를 발현하는 효모에서 생기는 β-아미린(도 8, 화합물 A)의 30 위치의 메틸렌탄소를 카르복실기로 변환하여, 11-데옥소글리시르레틴산(도 8, 화합물 J)을 생성할 수 있는 것이 분명해졌다.

SEQUENCE LISTING <110> RIKEN TOKIWA PHYTOCHEMICAL CO., LTD. NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION CHIBA UNIVERSITY <120> Triterpene oxidase derived from plant belonging to genus Glycyrrhiza, gene encoding the same, and method of using the same <130> PH-4106-PCT <150> JP 2008-222483 <151> 2008-08-29 <160> 20 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 1 caccatggat gcatcttcca caccag 26 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 2 ttacagttta tgcagaatga tgggtgcc 28 <210> 3 <211> 1572 <212> DNA <213> Glycyrrhiza uralensis <400> 3 atggatgcat cttccacacc aggggctatc tgggttgttc tgacagtgat actagctgcg 60 attcccatat gggtatgcca tatggtgaac acgctgtggc tgaggccaaa gaggttggaa 120 aggcatctca gagctcaagg tcttcatggc gacccttaca agctctcact tgacaactcc 180 aagcaaacct atatgctcaa gttgcaacaa gaagcacaat caaaatccat tggtctctcc 240 aaagatgatg ctgcaccacg aatcttctcc cttgcccatc aaactgtaca caaatatgga 300 aagaactcct ttgcatggga agggacagca ccaaaggtga tcatcacaga cccagagcaa 360 attaaggaag tctttaacaa gattcaggac 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Asp Pro Glu Gln Ile Lys Glu Val Phe Asn Lys Ile 115 120 125 Gln Asp Phe Pro Lys Pro Lys Leu Asn Pro Ile Ala Lys Tyr Ile Ser 130 135 140 Ile Gly Leu Val Gln Tyr Glu Gly Asp Lys Trp Ala Lys His Arg Lys 145 150 155 160 Ile Ile Asn Pro Ala Phe His Leu Glu Lys Leu Lys Gly Met Leu Pro 165 170 175 Ala Phe Ser His Ser Cys His Glu Met Ile Ser Lys Trp Lys Gly Leu 180 185 190 Leu Ser Ser Asp Gly Thr Cys Glu Val Asp Val Trp Pro Phe Leu Gln 195 200 205 Asn Leu Thr Cys Asp Val Ile Ser Arg Thr Ala Phe Gly Ser Ser Tyr 210 215 220 Ala Glu Gly Ala Lys Ile Phe Glu Leu Leu Lys Arg Gln Gly Tyr Ala 225 230 235 240 Leu Met Thr Ala Arg Tyr Ala Arg Ile Pro Leu Trp Trp Leu Leu Pro 245 250 255 Ser Thr Thr Lys Arg Arg Met Lys Glu Ile Glu Arg Gly Ile Arg Asp 260 265 270 Ser Leu Glu Gly Ile Ile Arg Lys Arg Glu Lys Ala Leu Lys Ser Gly 275 280 285 Lys Ser Thr Asp Asp Asp Leu Leu Gly Ile Leu Leu Gln Ser Asn His 290 295 300 Ile Glu Asn Lys Gly Asp Glu Asn Ser Lys Ser Ala Gly Met Thr Thr 305 310 315 320 Gln Glu Val Met Glu Glu Cys Lys Leu Phe Tyr Leu Ala Gly Gln Glu 325 330 335 Thr Thr Ala Ala Leu Leu Ala Trp Thr Met Val Leu Leu Gly Lys His 340 345 350 Pro Glu Trp Gln Ala Arg Ala Arg Gln Glu Val Leu Gln Val Phe Gly 355 360 365 Asn Gln Asn Pro Asn Phe Glu Gly Leu Gly Arg Leu Lys Ile Val Thr 370 375 380 Met Ile Leu Tyr Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Ile Tyr Leu 385 390 395 400 Thr Arg Ala Leu Arg Lys Asp Leu Lys Leu Gly Asn Leu Leu Leu Pro 405 410 415 Ala Gly Val Gln Val Ser Val Pro Ile Leu Leu Ile His His Asp Glu 420 425 430 Gly Ile Trp Gly Asn Asp Ala Lys Glu Phe Asn Pro Glu Arg Phe Ala 435 440 445 Glu Gly Ile Ala Lys Ala Thr Lys Gly Gln Val Cys Tyr Phe Pro Phe 450 455 460 Gly Trp Gly Pro Arg Ile Cys Val Gly Gln Asn Phe Ala Leu Leu Glu 465 470 475 480 Ala Lys Ile Val Leu Ser Leu Leu Leu Gln Asn Phe Ser Phe Glu Leu 485 490 495 Ser Pro Thr Tyr Ala His Val Pro Thr Thr Val Leu Thr Leu Gln Pro 500 505 510 Lys His Gly Ala Pro Ile Ile Leu His Lys Leu 515 520 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 5 ggatgatcca ctagtggatc ctctagctcc ctaacatgta ggtgg 45 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 6 taatgcaggg ccgcaggatc cgtgtggaag aacgattaca acagg 45 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 7 tgcggccctg cattaatgaa tcggccaacg 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 8 actagtggat catccccacg cgccctgtag 30 <210> 9 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 9 gggcggccgc actagtatcg atggaagaat caagctccat gaag 44 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 10 ttaattaatc accatacatc acgcaaatac 30 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 11 cgccggatcc accatggaag tacattgggt ttgcatgtcc 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 12 gccctctaga ctaagcacat gaaaccttta tcaccttagc 40 <210> 13 <211> 1572 <212> DNA <213> Glycyrrhiza glabra <400> 13 atggatgcat cttccacacc aggggctatc tgggttgttc 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900 caatcaaatc acattgaaaa taaaggagat gaaaacagta agagtgctgg aatgaccacc 960 caagaagtaa tggaggaatg caaacttttt tacctggcag ggcaagagac caccgcggct 1020 ttgctggcct ggacaatggt gttattaggc aagcatcctg aatggcaagc acgtgcaagg 1080 caggaagttt tgcaagtttt tgggaatcaa aatccaaact tcgaagggtt aggtcgcctc 1140 aaaattgtaa ccatgatttt atatgaggta ctcaggctgt acccacctgg gatttacctc 1200 acccgagctc ttcaaaagga tttgaaactt ggaaaccttt tgctacctgc tggagtacag 1260 gtttccgtac caatactttt gattcaccat gatgaaggta tatggggcaa tgatgcaaag 1320 gagttcaatc ctgaaaggtt tgctgaagga attgcaaagg caacaaaagg ccaagtttgc 1380 tatttccctt ttggatgggg tcctagaata tgtgttgggc aaaactttgc cttattagaa 1440 gccaagattg tattgtcatt gctgctgcag aatttctcat ttgagttatc tccgagttat 1500 gcacatgttc ctaccacggt gcttactttg cagccaaaac atggggcacc catcattctg 1560 cataaactgt aa 1572 <210> 14 <211> 523 <212> PRT <213> Glycyrrhiza glabra <400> 14 Met Asp Ala Ser Ser Thr Pro Gly Ala Ile Trp Val Val Leu Thr Val 1 5 10 15 Ile Leu Ala Ala Ile Pro Ile Trp Ala Cys His Met Val Asn Thr Leu 20 25 30 Trp Leu Arg Pro Lys Arg Leu Glu Arg His Leu Arg Ala Gln Gly Leu 35 40 45 His Gly Asp Pro Tyr Lys Leu Ser Leu Asp Asn Ser Lys Gln Ile Tyr 50 55 60 Met Leu Lys Leu Gln Gln Glu Ala Gln Ser Lys Ser Ile Gly Leu Ser 65 70 75 80 Lys Asp Asp Ala Ala Pro Arg Ile Phe Ser Leu Ala His Gln Thr Val 85 90 95 His Lys Tyr Gly Lys Asn Ser Phe Ala Trp Glu Gly Thr Thr Pro Lys 100 105 110 Val Ile Ile Thr Asp Pro Glu Gln Ile Lys Glu Val Phe Asn Lys Ile 115 120 125 Gln Asp Phe Pro Lys Pro Lys Leu Asn Pro Ile Ala Lys Tyr Ile Ser 130 135 140 Ile Gly Leu Val His Tyr Glu Gly Asp Lys Trp Ala Lys His Arg Lys 145 150 155 160 Ile Ile Asn Pro Ala Phe His Leu Glu Lys Leu Lys Gly Met Leu Pro 165 170 175 Ala Phe Ser His Ser Cys His Glu Met Ile Ser Lys Trp Lys Gly Leu 180 185 190 Leu Ser Val Asp Gly Thr Cys Glu Val Asp Val Trp Pro Phe Leu Gln 195 200 205 Asn Leu Thr Cys Asp Val Ile Ser Arg Thr Ala Phe Gly Ser Ser Tyr 210 215 220 Ala Glu Gly Ala Ile Ile Phe Glu Leu Leu Lys Arg Gln Gly Tyr Ala 225 230 235 240 Leu Met Thr Ala Arg Tyr Ala Arg Ile Pro Leu Trp Trp Leu Leu Pro 245 250 255 Ser Thr Thr Lys Arg Arg Met Lys Glu Ile Glu Arg Gly Ile Arg Asp 260 265 270 Ser Leu Glu Gly Ile Ile Arg Lys Arg Glu Lys Ala Leu Lys Ser Gly 275 280 285 Lys Ser Thr Asp Asp Asp Leu Leu Gly Ile Leu Leu Gln Ser Asn His 290 295 300 Ile Glu Asn Lys Gly Asp Glu Asn Ser Lys Ser Ala Gly Met Thr Thr 305 310 315 320 Gln Glu Val Met Glu Glu Cys Lys Leu Phe Tyr Leu Ala Gly Gln Glu 325 330 335 Thr Thr Ala Ala Leu Leu Ala Trp Thr Met Val Leu Leu Gly Lys His 340 345 350 Pro Glu Trp Gln Ala Arg Ala Arg Gln Glu Val Leu Gln Val Phe Gly 355 360 365 Asn Gln Asn Pro Asn Phe Glu Gly Leu Gly Arg Leu Lys Ile Val Thr 370 375 380 Met Ile Leu Tyr Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Ile Tyr Leu 385 390 395 400 Thr Arg Ala Leu Gln Lys Asp Leu Lys Leu Gly Asn Leu Leu Leu Pro 405 410 415 Ala Gly Val Gln Val Ser Val Pro Ile Leu Leu Ile His His Asp Glu 420 425 430 Gly Ile Trp Gly Asn Asp Ala Lys Glu Phe Asn Pro Glu Arg Phe Ala 435 440 445 Glu Gly Ile Ala Lys Ala Thr Lys Gly Gln Val Cys Tyr Phe Pro Phe 450 455 460 Gly Trp Gly Pro Arg Ile Cys Val Gly Gln Asn Phe Ala Leu Leu Glu 465 470 475 480 Ala Lys Ile Val Leu Ser Leu Leu Leu Gln Asn Phe Ser Phe Glu Leu 485 490 495 Ser Pro Ser Tyr Ala His Val Pro Thr Thr Val Leu Thr Leu Gln Pro 500 505 510 Lys His Gly Ala Pro Ile Ile Leu His Lys Leu 515 520 <210> 15 <211> 1482 <212> DNA <213> Glycyrrhiza uralensis <400> 15 atggaagtac attgggtttg catgtccgct gccactttgt tggtatgcta catttttgga 60 agcaagtttg tgaggaattt gaatgggtgg tattatgatg taaaactaag aaggaaagaa 120 cacccactac ccccaggtga catgggatgg cctcttatcg gcgatctatt gtccttcatc 180 aaagatttct catcgggtca ccctgattca ttcatcaaca accttgttct caaatatgga 240 cgaagtggta tctacaagac tcacttgttt gggaatccaa gcatcattgt ttgtgagcct 300 cagatgtgta ggcgagttct cactgatgat gtgaacttta agcttggtta tccaaaatct 360 atcaaagagt tggcacgatg tagacccatg attgatgtct ctaatgcgga acataggctt 420 tttcgacgcc tcattacttc cccaatcgtg ggtcacaagg cgctagcaat gtacctagag 480 cgtcttgagg 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Thr Phe Arg Glu Ala Thr Ala Asp Val Asn Ile Asn 370 375 380 Gly Tyr Ile Ile Pro Lys Gly Trp Arg Val Leu Ile Trp Ala Arg Ala 385 390 395 400 Ile His Met Asp Ser Glu Tyr Tyr Pro Asn Pro Glu Glu Phe Asn Pro 405 410 415 Ser Arg Trp Asp Asp Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Thr Phe Leu Pro Phe 420 425 430 Gly Ala Gly Ser Arg Leu Cys Pro Gly Ala Asp Leu Ala Lys Leu Glu 435 440 445 Ile Ser Ile Phe Leu His Tyr Phe Leu Arg Asn Tyr Arg Leu Glu Arg 450 455 460 Ile Asn Pro Glu Cys His Val Thr Ser Leu Pro Val Ser Lys Pro Thr 465 470 475 480 Asp Asn Cys Leu Ala Lys Val Ile Lys Val Ser Cys Ala 485 490 <210> 17 <211> 1575 <212> DNA <213> Medigago truncatula <400> 17 atggaagtgt ttatgtttcc cacaggaaca acagtaatca tctctgttct ttcagttcta 60 cttgctgtga ttccatggta tcttctcaac aagttatggc ttaagccaaa gaggtttgag 120 aaacttctca aagctcaagg ttttcaaggt gaaccttata acctttcagt attaaaggac 180 aaatcaaaac aaaattatat gttgaagttg caacaagaag ataaatctaa atccattggt 240 ctctccaaag aagctgcacc gtctatcttc actcctgttc atcaaactgt acgcaaatat 300 ggaaacaatt cctttttatg ggaaggtaca acaccaaggg ttatcatcac agaccctgat 360 caaattaagg atgtatttaa caagattgat gacttcccca aaccaaaact aagatccatc 420 gccaagtatt tgagcgttgg tatactagat catgagggta agaaatgggc taaacatagg 480 aagatcgcca atccagcatt ccacctagaa aaattgaaag ttatgctgcc tgcattttct 540 cacagttgca atgaaatgat aagcaaatgg aaggaactat tgtcatcaga tggaacatgt 600 gagattgatg tttggccttc ccttcagaat tttacctgtg atgtaatttc tcggacggca 660 tttggaagca gctacgcaga aggaacaaaa ctatttcaac ttctaaagaa gcagggattt 720 cttttgatga cagggcgaca cacgaacaat ccattatggg ggcttctagc aacaactacc 780 aagacgaaga tgaaagaaat tgatagagaa atccatgatt cacttgaggg aatcattgaa 840 aaacgagaaa aagcactgaa gaatggtgaa accaccaatg acgatttatt aggcattctt 900 ttgcaatcaa atcatgccga aaaacaagga caaggaaata gtaagaatat tgggatgacc 960 acccaagatg tgatagatga atgcaaattg ttttaccttg ctgggcaaga gacgacttca 1020 agtttgctgg tttggacaat ggtgttatta ggcaggtatc ctgaatggca agcacgtgca 1080 agggaggaag ttttgcaagt ttttgggaac caaaatccta acaacgaagg attaagtcaa 1140 cttaaaattg ttaccatgat tttgtacgag gtactaaggt tattcccacc tttaatttac 1200 ttcaaccgag ctcttcgaaa ggatttgaaa cttggaaacc ttttgctacc tgaaggaaca 1260 caaatttccc taccaatact attgattcac caagatcatg atctatgggg tgatgatgca 1320 aaggagttca aacctgaaag gtttgctgaa ggaattgcga aggcaacaaa aggacaagtt 1380 tcttatttcc cttttggatg gggtcctaga atttgtcttg gacaaaactt tgccttatta 1440 gaagcaaaga tagcagtatc attgttgctg cagaatttct cattcgaact ttctccaaat 1500 tatgtgcatg ttcctaccac ggtgcttact ttgcagccaa aaaatggggc aagcatcatt 1560 ttgcataaac tgtaa 1575 <210> 18 <211> 524 <212> PRT <213> Medigago truncatula <400> 18 Met Glu Val Phe Met Phe Pro Thr Gly Thr Thr Val Ile Ile Ser Val 1 5 10 15 Leu Ser Val Leu Leu Ala Val Ile Pro Trp Tyr Leu Leu Asn Lys Leu 20 25 30 Trp Leu Lys Pro Lys Arg Phe Glu Lys Leu Leu Lys Ala Gln Gly Phe 35 40 45 Gln Gly Glu Pro Tyr Asn Leu Ser Val Leu Lys Asp Lys Ser Lys Gln 50 55 60 Asn Tyr Met Leu Lys Leu Gln Gln Glu Asp Lys Ser Lys Ser Ile Gly 65 70 75 80 Leu Ser Lys Glu Ala Ala Pro Ser Ile Phe Thr Pro Val His Gln Thr 85 90 95 Val Arg Lys Tyr Gly Asn Asn Ser Phe Leu Trp Glu Gly Thr Thr Pro 100 105 110 Arg Val Ile Ile Thr Asp Pro Asp Gln Ile Lys Asp Val Phe Asn Lys 115 120 125 Ile Asp Asp Phe Pro Lys Pro Lys Leu Arg Ser Ile Ala Lys Tyr Leu 130 135 140 Ser Val Gly Ile Leu Asp His Glu Gly Lys Lys Trp Ala Lys His Arg 145 150 155 160 Lys Ile Ala Asn Pro Ala Phe His Leu Glu Lys Leu Lys Val Met Leu 165 170 175 Pro Ala Phe Ser His Ser Cys Asn Glu Met Ile Ser Lys Trp Lys Glu 180 185 190 Leu Leu Ser Ser Asp Gly Thr Cys Glu Ile Asp Val Trp Pro Ser Leu 195 200 205 Gln Asn Phe Thr Cys Asp Val Ile Ser Arg Thr Ala Phe Gly Ser Ser 210 215 220 Tyr Ala Glu Gly Thr Lys Leu Phe Gln Leu Leu Lys Lys Gln Gly Phe 225 230 235 240 Leu Leu Met Thr Gly Arg His Thr Asn Asn Pro Leu Trp Gly Leu Leu 245 250 255 Ala Thr Thr Thr Lys Thr Lys Met Lys Glu Ile Asp Arg Glu Ile His 260 265 270 Asp Ser Leu Glu Gly Ile Ile Glu Lys Arg Glu Lys Ala Leu Lys Asn 275 280 285 Gly Glu Thr Thr Asn Asp Asp Leu Leu Gly Ile Leu Leu Gln Ser Asn 290 295 300 His Ala Glu Lys Gln Gly Gln Gly Asn Ser Lys Asn Ile Gly Met Thr 305 310 315 320 Thr Gln Asp Val Ile Asp Glu Cys Lys Leu Phe Tyr Leu Ala Gly Gln 325 330 335 Glu Thr Thr Ser Ser Leu Leu Val Trp Thr Met Val Leu Leu Gly Arg 340 345 350 Tyr Pro Glu Trp Gln Ala Arg Ala Arg Glu Glu Val Leu Gln Val Phe 355 360 365 Gly Asn Gln Asn Pro Asn Asn Glu Gly Leu Ser Gln Leu Lys Ile Val 370 375 380 Thr Met Ile Leu Tyr Glu Val Leu Arg Leu Phe Pro Pro Leu Ile Tyr 385 390 395 400 Phe Asn Arg Ala Leu Arg Lys Asp Leu Lys Leu Gly Asn Leu Leu Leu 405 410 415 Pro Glu Gly Thr Gln Ile Ser Leu Pro Ile Leu Leu Ile His Gln Asp 420 425 430 His Asp Leu Trp Gly Asp Asp Ala Lys Glu Phe Lys Pro Glu Arg Phe 435 440 445 Ala Glu Gly Ile Ala Lys Ala Thr Lys Gly Gln Val Ser Tyr Phe Pro 450 455 460 Phe Gly Trp Gly Pro Arg Ile Cys Leu Gly Gln Asn Phe Ala Leu Leu 465 470 475 480 Glu Ala Lys Ile Ala Val Ser Leu Leu Leu Gln Asn Phe Ser Phe Glu 485 490 495 Leu Ser Pro Asn Tyr Val His Val Pro Thr Thr Val Leu Thr Leu Gln 500 505 510 Pro Lys Asn Gly Ala Ser Ile Ile Leu His Lys Leu 515 520 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 19 caccatggaa gtgtttatgt ttcccacagg 30 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 20 ttacagttta tgcaaaatga tgcttgca 28 1/23

Claims (30)

1. 올레아난형 트리테르펜의 30 위치의 탄소를 산화하는 활성을 갖는 폴리펩티드로서, 이하의 (a) 내지 (c)로 나타내는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드:
   (a) 서열번호 4, 14 또는 18로 나타내는 아미노산 서열
   (b) 서열번호 4, 14 또는 18로 나타내는 아미노산 서열에서 1 또는 10개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열
   (c) 서열번호 4, 14 또는 18로 나타내는 아미노산 서열에 대하여 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열.
2. 제1항에 있어서, 올레아난형 트리테르펜이 β-아미린, 11-옥소-β-아미린 또는 30-히드록시-11-옥소-β-아미린인 폴리펩티드.
3. 제1항에 있어서, 콩과(Fabaceae) 식물에서 유래하는 폴리펩티드.
4. 제3항에 있어서, 콩과 식물이 콩아과(Faboideae) 식물인 폴리펩티드.
5. 제4항에 있어서, 콩아과 식물이 감초속(Glycyrrhiza속: 글리시리자속) 식물 또는 개자리속(Medicago속: 메디카고속) 식물인 폴리펩티드.
6. 제5항에 있어서, 감초속 식물이 G. 우랄렌시스(G. uralensis) 또는 G. 글라브라(G. glabra)인 폴리펩티드.
7. 제5항에 있어서, 개자리속 식물이 M. 트런카툴라(M. truncatula)인 폴리펩티드.
8. 제1항에 있어서, 시토크롬 P450에 속하는 단백질인 폴리펩티드.
9. 삭제
10. 올레아난형 트리테르펜의 30 위치의 탄소를 산화하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 이하의 (d) 내지 (f)로 나타내는 어느 하나의 염기 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드:
    (d) 서열번호 3, 13 또는 17로 나타내는 염기 서열
    (e) 서열번호 3, 13 또는 17로 나타내는 염기 서열에서 1 또는 15개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열
    (f) 서열번호 3, 13 또는 17로 나타내는 염기 서열에 대하여 97％ 이상의 동일성을 갖는 염기 서열.
11. 제10항에 있어서, 올레아난형 트리테르펜이 β-아미린, 11-옥소-β-아미린 또는 30-히드록시-11-옥소-β-아미린인 폴리뉴클레오티드.
12. 제10항에 있어서, 콩과(Fabaceae) 식물에서 유래하는 폴리뉴클레오티드.
13. 제12항에 있어서, 콩과 식물이 콩아과(Faboideae) 식물인 폴리뉴클레오티드.
14. 제13항에 있어서, 콩아과 식물이 감초속(Glycyrrhiza속) 식물 또는 개자리속(Medicago속: 메디카고속)인 폴리뉴클레오티드.
15. 제14항에 있어서, 상기 감초속 식물이 G. 우랄렌시스(G. uralensis) 또는 G. 글라브라(G. glabra)인 폴리뉴클레오티드.
16. 제14항에 있어서, 상기 개자리속 식물이 M. 트런카툴라(M. truncatula)인 폴리뉴클레오티드.
17. 제10항에 있어서, 시토크롬 P450에 속하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
18. 삭제
19. 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
20. 제10항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 또는 상기 폴리뉴클레오티드 및 상기 재조합 벡터 둘 다를 갖는 형질 전환체.
21. 제20항에 있어서, 콩과(Fabaceae) 식물인 형질 전환체.
22. 제21항에 있어서, 콩과 식물이 콩아과(Faboideae) 식물인 형질 전환체.
23. 제22항에 있어서, 콩아과 식물이 감초속(Glycyrrhiza속) 식물 또는 개자리속(Medicago속: 메디카고속) 식물인 형질 전환체.
24. 제23항에 있어서, 감초속 식물이 G. 우랄렌시스(G. uralensis) 또는 G. 글라브라(G. glabra)인 형질 전환체.
25. 제23항에 있어서, 상기 개자리속 식물이 M. 트런카툴라(M. truncatula)인 형질 전환체.
26. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증강된 형질 전환체.
27. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 억제된 형질 전환체.
28. 제20항에 기재된 형질 전환체를 배양 또는 육성시키고, 그 배양물 또는 육성물로부터 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드를 추출하는 것을 포함하는, 폴리펩티드의 제조 방법.
29. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 및 올레아난형 트리테르펜의 11 위치의 탄소를 산화하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 올레아난형 트리테르펜에 작용시켜 글리시르레틴산 및 20-에피-글리시르레틴산을 제조하는 방법.
30. 식물에서의 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 유무 또는 발현을 판정하여 해당 식물을 선발하는 방법이며, 해당 식물로부터 제조된 핵산 함유 샘플에 대해서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편을 이용하여 핵산 증폭법 또는 핵산 혼성화를 행하여 상기 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 정량하는 것을 포함하는 식물 선발법.

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