CN116732060B - 喜树中的cyp716c氧化酶基因、载体、微粒体蛋白及应用 - Google Patents

喜树中的cyp716c氧化酶基因、载体、微粒体蛋白及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物工程技术领域。本发明提供了喜树中的CYP716C氧化酶基因和所述基因编码的相应蛋白，还提供了包含本发明所述基因的质粒及包含所述表达质粒的酿酒酵母WAT11宿主细胞，同时利用宿主细胞诱导表达了CYP716C80、CYP716C81和CYP716C82三种微粒体蛋白，并将编码的蛋白作为氧化生物催化剂用于β‑香树脂醇C‑28位连续氧化，制备得到齐墩果酸。

Description

喜树中的CYP716C氧化酶基因、载体、微粒体蛋白及应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及喜树中的CYP716C氧化酶基因、载体、微粒体蛋白及应用。
背景技术
三萜是植物天然产物中最大的类别之一，现已有报道的三萜类成分已超过20000种。该类别成分常与葡萄糖基偶联形成三萜皂苷，对于植物而言，主要作为化学防御性物质用于抵御病虫侵袭。由于其生物活性多样，目前已在食品、化妆品、药品等行业广泛应用。植物三萜常由线性化关键前体2,3-氧化鲨烯，先经折叠形成椅式-椅式-椅式构象，再由OSC酶介导环化反应，生成齐墩果烷型、乌苏烷型、羽扇豆烷型等三萜骨架。以这些三萜骨架为基础，再经三萜修饰蛋白进行氧化(CYP450)、糖基化(葡萄糖基转移酶)和酰基化(酰基转移酶)修饰，由此衍生出结构多样的三萜成分。虽然植物中仍有大量三萜类成分尚待发掘，但探索不同植物中三萜类成分的合成代谢途径和发掘具有催化活性的功能基因更为重要。
喜树是中国特有植物。自Wall从喜树茎中发现拓扑异构酶I抑制剂喜树碱以后，人们累计从喜树中分离了100余种化学成分，主要分为生物碱、黄酮和三萜三个类别。截止目前为止，人们从喜树中发现的三萜类成分共有26种，其中齐墩果烷型7种，乌苏烷型12种，羽扇豆烷型4种，其他三萜3种。其中有18种三萜均由从果实中分离发现，由此表明，喜树果实中三萜类成分的合成代谢旺盛。有趣地是，7种齐墩果烷型三萜和10种乌苏烷型三萜的C28位均为羧基，而两种类型的三萜的合成前体分别为β-和α-香树脂醇，通过C28位连续氧化生成。CYP716被归入CYP85家族，大多数双子叶植物CYP716被发现具有香树脂醇/羽扇豆醇C28位氧化酶活性，参与五环三萜骨架C28位的氧化修饰。但对于CYP716基因是否参与喜树三萜合成代谢，以及喜树CYP716基因的发掘与功能表征的情况并不是很清楚，也未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供喜树中的CYP716C氧化酶基因、载体、微粒体蛋白及应用，通过结合转录组和蛋白组多组学数据对喜树中CYP716基因进行筛选与优选，得到了所述CYP716C氧化酶基因和所述基因编码的相应蛋白，包含所述基因的质粒及包含所述表达质粒的酿酒酵母WAT11宿主细胞，同时利用宿主细胞诱导表达了CYP716C80、CYP716C81和CYP716C82三种微粒体蛋白，并将编码的蛋白作为氧化生物催化剂用于β-香树脂醇C-28位连续氧化，制备得到齐墩果酸。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了喜树中的CYP716C氧化酶基因，包括CYP716C80基因、CYP716C81基因或CYP716C82基因。
作为优选，所述CYP716C80基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述CYP716C81基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述CYP716C82基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
本发明提供了所述喜树中CYP716C氧化酶基因编码的蛋白，包括CYP716C80蛋白、CYP716C81蛋白或CYP716C82蛋白。
作为优选，所述CYP716C80蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述CYP716C81蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述CYP716C82蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
本发明提供了含有所述CYP716C氧化酶基因的重组表达质粒。
作为优选，使用的原始质粒为pYES2/CT质粒。
作为优选，所述CYP716C氧化酶基因插入在所述原始质粒的Kpn I位点和Not I位点之间。
本发明还提供了所述喜树中CYP716C氧化酶基因编码的蛋白作为氧化生物催化剂的应用。
作为优选，所述应用包括以下步骤：在含有反应底物、NADPH、所述CYP716C氧化酶基因编码的蛋白以及磷酸钾缓冲液的反应体系中进行氧化反应，然后萃取、过滤。
作为优选，所述反应底物为β-香树脂醇。
作为优选，所述CYP716C氧化酶基因编码的蛋白用于β-香树脂醇C-28位连续氧化。
作为优选，氧化的产物为齐墩果酸。
通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
1.本发明通过结合转录组和蛋白组多组学数据对喜树中CYP716基因进行筛选与优选，有效缩小表征范围，并最终确定三种CYP716C氧化酶基因。
2.本发明提供了三种细胞色素CYP716C酶的氨基酸序列和编码该蛋白的核苷酸序列，包含本发明基因的质粒及包含本表达质粒的酿酒酵母WAT11宿主细胞。
3.利用本发明构建的宿主细胞可诱导表达CYP716C羧基化氧化酶，将三种CYP716C微粒体蛋白(CYP716C80、CYP716C81和CYP716C82)用于β-香树脂醇的C-28位连续氧化，以制备齐墩果酸。
4.利用本发明构建的CYP716体外反应方法和分离纯化方法，制备毫克级的齐墩果酸。
附图说明
图1为目标CaCYP716蛋白保守结构分析(图1中的A为CYP716-Cac_g033542的蛋白三级结构，图1中的B为目标喜树CYP716蛋白的多序列比对情况)；
图2为喜树CYP716与其他植物CYP716蛋白系统进化树；
图3为目标CYP716候选基因与参与五环三萜(PT)生物合成基因层次聚类分析(图3中的A为成年喜树不同组织部位转录组层次聚类分析，图3中的B为喜树幼苗转录组层次聚类分析，图3中的C为喜树蛋白组层次聚类分析)；
图4为目标CYP716基因重组质粒双酶切产物电泳情况(M表示DNAMarker，1表示pYES2/CT-CYP716C80酶切产物，2表示pYES2/CT-CYP716C82酶切产物，3表示pYES2/CT-CYP716C81酶切产物，4表示pYES2/CT-CYP716A395酶切产物，5表示pYES2/CT-CYP716A394酶切产物)；
图5为WAT11重组酿酒酵母菌株菌落PCR验证情况(M表示DNA Marker，1表示CYP716C80重组WAT11菌株，2表示CYP716C82重组WAT11菌株，3表示CYP716C81重组WAT11菌株，4表示CYP716A395重组WAT11菌株，5表示CYP716A394重组WAT11菌株，6表示阴性对照)；
图6为目标CYP716重组蛋白Western blot检测结果(M表示Protein Marker(18kDa-100kDa)，1表示CYP716C80，2表示CYP716C82，3表示CYP716C81，4表示CYP716A395，5表示pYES2/CT空载体)；
图7为CYP716C80、CYP716C81、CYP716C82微粒体蛋白反应体系的提取离子流图(图7中的A为以原人参二醇为底物的反应体系，图7中的B为以β-香树脂醇为底物的反应体系)；
图8为CYP716A395微粒体蛋白反应体系的提取离子流图(图8中的A为以原人参二醇为底物的反应体系，图8中的B为以β-香树脂醇为底物的反应体系)；
图9为反应体系中硅烷化氧化产物的二级质谱图及裂解过程(图9中的A为β-香树脂醇底物的二级质谱图及裂解过程，图9中的B为CYP716C80反应体系中硅烷化氧化产物二级质谱图及裂解过程，图9中的C为CYP716C81反应体系中硅烷化氧化产物二级质谱图及裂解过程，图9中的D为CYP716C82反应体系中硅烷化氧化产物二级质谱图及裂解过程)；
图10为氧化产物的1H和13C NMR谱图(图10中的A为氧化产物的1HNMR谱，图10中的B为氧化产物的13C NMR谱)；
图11为CYP716C80微粒体蛋白反应条件优化情况(图11中的A表示NADPH浓度，图11中的B表示反应pH，图11中的C表示反应时间，图11中的D表示反应温度)；
图12为CYP716C81微粒体蛋白反应条件优化情况(图12中的A表示NADPH浓度，图12中的B表示反应pH，图12中的C表示反应时间，图12中的D表示反应温度)；
图13为CYP716C82微粒体蛋白反应条件优化情况(图13中的A表示NADPH浓度，图13中的B表示反应pH，图13中的C表示反应时间，图13中的D表示反应温度)；
图14为三种CYP716C微粒体蛋白稳态动力学特征(图14中的A表示CYP716C80对β-香树脂醇的稳态动力学；图14中的B表示CYP716C81对底物β-香树脂醇的稳态动力学；图14中的C为CYP716C82对底物β-香树脂醇的稳态动力学)；
图15为注射CYP716C质粒和pEAQ-HT空质粒的烟草叶片提取物的EIC图；
图16为CYP716C基因在本氏烟草中硅烷化氧化产物的二级质谱图(图16中的A表示β-香树脂醇底物的二级质谱图及裂解过程，图16中的B表示CYP716C80基因在烟草中硅烷化氧化产物二级质谱图及裂解过程，图16中的C表示CYP716C81基因在烟草中硅烷化氧化产物二级质谱图及裂解过程，图16中的D表示CYP716C82基因在烟草中硅烷化氧化产物二级质谱图及裂解过程)；
图17为三条目标CYP716C基因在喜树幼苗中的相对定量分析(图17中的A表示CYP716C80相对定量分析，图17中的B表示CYP716C81相对定量分析，图17中的C表示CYP716C82相对定量分析)。
具体实施方式
本发明提供了喜树中的CYP716C氧化酶基因，包括CYP716C80基因、CYP716C81基因或CYP716C82基因。
在本发明中，所述CYP716C80基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示：
ATGGAGATATTTCTTTTATCTGTCTCTCTTGCAATTTTTGCTCTCTGCATCTTTGCTTTCAGACGCCGATCTGATAGCCATGTCAAACTGCCACCGGGTAGCTTTGGATGGCCTATAATGGGTGAAACCATTGAATTCTTGTTTGGCAAGCCAGAAAATTTTGTGGGGGATAGGATGAAAAAGTACTCTTCAGATATTTTCAAGACTCATATTCTTGGAGAGAAAACTGCGGTGATATGCGGCCCTAGTGGACATAAATTTCTGTTCTCCAATGAGCAGAAGCTCTTCACTGCATTCCGTCCACATCCGATGCAAAAGCTCTTTCGTTCATACAAAACCCAGAATCAGAATCAGAACGCTGATGCTCCGTCTCAAATGGCAAGAACCGACGAGACCAAAGTGATTCGATCACCTGGGTTCTTGAAGCCCGAAGCTCTGGTGCGGTACTTGGGGAAAATGGAAGCCATAACACAAGACCAGTTGAAGGTTAACTGGGAAGGCAGAGATGAAGTGAAGGCCTTTCCTCTTTGCAAGACTATAACATTGACTCTTGCTTGTCGCTTCTTTCTGGGCATTGATAATCCAGAGAGAATTGCAAGGCTGGTCAATCATTTCGATGATATAACTTTGGGGATGCATTCCATTACTCTGAACATCCCGGGGACTATATTTTATCGCGCTAACAGAGCTGCAACTGCGATAAGGAAGGAGCTTTTGGCTGTAATTAAGGAGAAGAAGGCAGCCATGGCGACAGGAGCACCCATGCAGGACATACTGTCCCATATGATCGTTGCCAGTGACCCAACTGGGAAATTCATGCCTGAGGCTGAGATTGCTGATAAGATCATGGGGCTGTTGACTGCTGGATATAGTACTGTTGCTACTACCATGACTTTGTTCATGAAGTATGTTGGAGAGAGACCAGATATTTACAATAAGATATTAGCAGAGCAATTAGAGGTTTCAGAATCCAAAAAGCCCGGCGAATCATTAGATTGGGATGATATGCAGAAAATGAAATACTCGTGGAATGTTGTTTGTGAAGTGATGAGACTCAATCCTCCACTTCAAGGAACCTTCAGAGAGGCCTTGACTGACTTCACCTATGCTGGTTATACCATTCCAAAGGGGTGGAAGGTATACTGGACAGTGAGTACAACTCAAAAGAACCCAGAATACTTCAAAGAGCCAGAAAAATTTGATCCATCAAGATATGATGGAGGTGATGGTTCCATTCCTTACACATATGTTCCATTTGGAGGTGGACCCAGAATGTGCCCAGGAAAGGAGTATGCTAGATTAGCTGTACTCACTTTTGTTCACAATGTGGTCAAGAAGTTTAAATGGGACCTAGTAATTCCCAATGAAAAGATAATAGGTGATATGATGCCAAGCCCTGAGAAAGGACTTCCAATCCACCTTTACACACACTAG。
在本发明中，所述CYP716C81基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示：
ATGGAATTCTTTGTCCAATCATCTGTTTTAGTTGTCCTCTCTCTTGCTATTACCATCTTTGCTTTCAAACGGAGATCTAATGGCGGAGTTAAACTCCCACCTGGTAGTTTTGGATGGCCAATGATGGGCGAAACCATTGAATTCCTGTTTGGAAAGCCGGAAAACTTTGTGGGCGATAGGATGAAGAAGTACTCTCCTGACATTTTCAAGACTCATATTCTTGGAGAGAAAACTGCAGTGATATGCGGTCCCAATGGACACAAGTTTCTGTTTTCCAACGAACAGAAGCTCTTCACTGCTTTCCGTCCACATCCGATGCAGAAGCTCTTTCGTTCTTACCAAACTCAGAGCTCTGCTCCGGCTCAACTGGCACGCAATGATGAGACAAAAGTGATTCGCTCACCTGGGTTCTTGAAGCCGGAAGCTTTGGTGCGGTATTTGGGGAAGATGGACTCCATCACGCAGCAACAGTTGCAGACAAACTGGGAAGGCAGAGATGAAGTCAA GGCCTTTCCTCTTTGCAAGACTATAACCTTGACGCTTGCCTGCCGCTTCTTTTTGGGAATCGACAATCCAGAGCGTATTGCGAGGCTCGTCAGCAATTTCGATGATATTACTTTGGGGATGCACTCAATTACTCTGAACATCCCGGGGACTATATTCTTTCGCGCTAACAAAGCTGCAACTGCAATTCGGAGGGAGCTTCTGGCTGTGATAAAGGAGAAGAAGGCAGCCATGGAGACAGGAGCACCGATGCAAGACATACTGTCCCATATGATTGTTGCGAGTGACCCAAGTGGTAGATTCATGCCTGAGGCTGAGATTGCTGATAAGGTAATGGGTCTGCTCACTGCTGGATATAGCACTGTTGCTACGACCATGACTTTATTCATGAAGTATGTTGGAGAGAGACCAGACATTTACAAAAAGGTTCAAGAAGAACAATTGGAAGTTTCTGCTTCTAAAAAGGCAGGGGACTTACTGGAATGGGATGACATGCAGAAAATGAAGTACTCATGGAATGTAATATGTGAAGTGATGAGATTCAATCCTCCACTTCAAGGAACCTTCAGAGACGCCTTGACAGATTTCACCTATGCCGGCTACACCATTCCAAAGGGGTGGAAGGTATATTGGACAGTGAGCACAACAAACATGAATCCTGAATACTTCCGAGAACCACATAAATTTAACCCATCAAGGTATGACGAAGGTGATGTGTCTATTCCTTACACATACGTTCCATTCGGAGGTGGGCCACGAATGTGCCCGGGGAAAGAATATGCTCGATTAGCAATTCTCACTTTTGTGCATAATGTGGTGAAGAGGTTTAATTGGGAGCTGATGGTCCCTAATGAAAAGATTATAGGTGATATGATGCCAAGCCCTGAGAAAGGACTTCCAATCCGCCTTCATCCATATATATCTGAACAAGGTTATAACTTTCCCGATCTAAAAGGACTTACACTTGAGTGTCATACCGAAAGGAAACATAAAACTATCCATACCAAAGCTAGTAAGGTGTTTAGCAGAGGAATTCAAGGCTGGGGTTTAGTGCTACCTTATGTCCGCTTTTATCATCAATCTTGA。
在本发明中，所述CYP716C82基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示：
ATGGAGTTCGTCATCATCATCCTATCACTCGTTCTAGTTGTTCTCTCTCTTGTCTTTGTTATCATTGCTTTGATCATAAGGAGATCGGACGGAGGTGTCAAACTGCCACCGGGTAGCTTTGGATGGCCCATTATGGGCGAAACCATTGAATTCCTGTTTGGAAAGCCGGAAAATTTTGTGGGTGATAGGATGAAGAAGTACTCTCCGGACATTTTCAAGACTCATATTCTTGGAGAGAAAACTGCAGTGATATGCGGTCCCAATGGACACAAGTTTCTGTTTTCCAACGAGCAGAAGCTCTTCACTGCTTTCCGTCCACATCCGATGCAGAAGCTCTTTCGTTCTTACCAAACTCAGAGCTCTGCTCCGGCTCAACTGGCACGCAATGATGAGACAAAAGTGATCCGCTCACCTGGGTTCTTGAAGCCCGAAGCTTTGGTGCGGTATTTGGGGAAGATGGACTCCATCACGCAGCAACAATTGCAGACAAGCTGGGAAGGCAGAGGTGAAGTCAAGGCATTTCCTCTTTGCAAGACTATAACCTTGACGCTTGCCTGCCGCTTCTTTTTGGGAATCGACAATCCAGAGCGTATTGCGAGGCTGGTCAGCAATTTCGATGATATTACCTTGGGGATGCACTCAATTACTCTGAACATCCCGGGGACAATATTCTATCGCGCTAACAAAGCTGCAACTGCAATTCGGAAGGAGCTTCTGGCTGTGATTAAGGAGAAGAAGGCAGCCATGGAGACAGGAGCACCGATGCAAGACATACTGTCCCATATGATTGTTGCGAGTGACCCAAGTGGTAGATTCATGCCTGAGGCTGAGATTGCTGATAAGGTAATGGGTCTGCTCACTGCTGGATATAGCACTGTTGCTACGACCATGACTTTATTCATGAAGTATGTTGGACGGAGACCAGACATTTACAAAAAGGTTCAAGAAGAACAATTGGAA GTTTCTGCTTCTAAAAAGGCAGGGGACTTACTGGAATGGGATGACATGCAGAAAATGAAGTACTCGTGGAATGTAATATGTGAAGTGATGAGATTCAATCCGCCACTTCAAGGAACCTTCAGAGATGCCTTAACAGACTTCACTTATGCTGGTTATACCATTCCAAAGGGGTGGAAGGTATATTGGACAGTGAGCACAACAAACATGAATCCTGAATACTTCCGAGAACCACATAAATTTAACCCATCAAGGTATGACGAAGGTGATGTGTCTATTCCTTACACATACGTTCCATTCGGAGGTGGGCCACGAATGTGTCCGGGGAAAGAGTATGCTCGATTAGCAATTCTCACTTTTGTGCATAATGTGGTGAAGAGGTTCAATTGGGAGCTGATGGTTCCTAATGAGAAGATTATAGGTGATATGATGCCAAGCCCTGAGAAAGGACTTCCAATCCGCCTTCATCCACACTAG。
本发明还提供了所述喜树中CYP716C氧化酶基因编码的蛋白，包括CYP716C80蛋白、CYP716C81蛋白或CYP716C82蛋白。
在本发明中，所述CYP716C80蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示：
MEIFLLSVSLAIFALCIFAFRRRSDSHVKLPPGSFGWPIMGETIEFLFGKPENFVGDRMKKYSSDIFKTHILGEKTAVICGPSGHKFLFSNEQKLFTAFRPHPMQKLFRSYKTQNQNQNADAPSQMARTDETKVIRSPGFLKPEALVRYLGKMEAITQDQLKVNWEGRDEVKAFPLCKTITLTLACRFFLGIDNPERIARLVNHFDDITLGMHSITLNIPGTIFYRANRAATAIRKELLAVIKEKKAAMATGAPMQDILSHMIVASDPTGKFMPEAEIADKIMGLLTAGYSTVATTMTLFMKYVGERPDIYNKILAEQLEVSESKKPGESLDWDDMQKMKYSWNVVCEVMRLNPPLQGTFREALTDFTYAGYTIPKGWKVYWTVSTTQKNPEYFKEPEKFDPSRYDGGDGSIPYTYVPFGGGPRMCPGKEYARLAVLTFVHNVVKKFKWDLVIPNEKIIGDMMPSPEKGLPIHLYTH。
在本发明中，所述CYP716C81蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示：
MEFFVQSSVLVVLSLAITIFAFKRRSNGGVKLPPGSFGWPMMGETIEFLFGKPENFVGDRMKKYSPDIFKTHILGEKTAVICGPNGHKFLFSNEQKLFTAFRPHPMQKLFRSYQTQSSAPAQLARNDETKVIRSPGFLKPEALVRYLGKMDSITQQQLQTNWEGRDEVKAFPLCKTITLTLACRFFLGIDNPERIARLVSNFDDITLGMHSITLNIPGTIFFRANKAATAIRRELLAVIKEKKAAMETGAPMQDILSHMIVASDPSGRFMPEAEIADKVMGLLTAGYSTVATTMTLFMKYVGERPDIYKKVQEEQLEVSASKKAGDLLEWDDMQKMKYSWNVICEVMRFNPPLQGTFRDALTDFTYAGYTIPKGWKVYWTVSTTNMNPEYFREPHKFNPSRYDEGDVSIPYTYVPFGGGPRMCPGKEYARLAILTFVHNVVKRFNWELMVPNEKIIGDMMPSPEKGLPIRLHPYISEQGYNFPDLKGLTLECHTERKHKTIHTKASKVFSRGIQGWGLVLPYVRFYHQS。
在本发明中，所述CYP716C82蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示：
MEFVIIILSLVLVVLSLVFVIIALIIRRSDGGVKLPPGSFGWPIMGETIEFLFGKPENFVGDRMKKYSPDIFKTHILGEKTAVICGPNGHKFLFSNEQKLFTAFRPHPMQKLFRSYQTQSSAPAQLARNDETKVIRSPGFLKPEALVRYLGKMDSITQQQLQTSWEGRGEVKAFPLCKTITLTLACRFFLGIDNPERIARLVSNFDDITLGMHSITLNIPGTIFYRANKAATAIRKELLAVIKEKKAAMETGAPMQDILSHMIVASDPSGRFMPEAEIADKVMGLLTAGYSTVATTMTLFMKYVGRRPDIYKKVQEEQLEVSASKKAGDLLEWDDMQKMKYSWNVICEVMRFNPPLQGTFRDALTDFTYAGYTIPKGWKVYWTVSTTNMNPEYFREPHKFNPSRYDEGDVSIPYTYVPFGGGPRMCPGKEYARLAILTFVHNVVKRFNWELMVPNEKIIGDMMPSPEKGLPIRLHPH。
本发明还提供了含有所述CYP716C氧化酶基因的重组表达质粒。本发明中得到的所述重组表达质粒包括pYES2/CT-CYP716C80、pYES2/CT-CYP716C81或pYES2/CT-CYP716C82。
在本发明中，使用的原始质粒优选为pYES2/CT质粒。
在本发明中，所述CYP716C氧化酶基因优选的插入在所述原始质粒的Kpn I位点和Not I位点之间。
本发明还提供了所述喜树中CYP716C氧化酶基因编码的蛋白作为氧化生物催化剂的应用。
在本发明中，所述应用优选的在含有反应底物、NADPH、所述CYP716C氧化酶基因编码的蛋白以及磷酸钾缓冲液的反应体系中进行。本发明中，所述反应底物优选为β-香树脂醇，在反应底物使用前优选的用DMSO将其配置成50mM的标品母液；所述反应底物的浓度优选为80-120μM，进一步的优选为90-110μM，更进一步的优选为100μM；所述反应底物的用量优选为0.2-2μL，进一步的优选为0.5-1.5μL，更进一步的优选为1μL。本发明中所述NADPH的浓度优选为900-1100μM，进一步的优选为950-1050μM，更进一步的优选为1000μM；所述NADPH的用量优选为5-15μL，进一步的优选为8-12μL，更进一步的优选为10μL。本发明中所述CYP716C氧化酶基因编码蛋白的用量优选为0.5-1.5mg，进一步的优选为0.8-1.2mg，更进一步的优选为1mg。本发明中所述磷酸钾缓冲液的浓度优选为80-110mM，进一步的优选为90-105mM，更进一步的优选为100mM；所述磷酸钾缓冲液的pH优选为7-7.6，进一步的优选为7.2-7.5，更进一步的优选为7.4。在本发明所述反应体系中，最后用磷酸钾缓冲液补足至500μL。
在本发明中，所述反应的时间优选为25-35℃，进一步的优选为28-32℃，更进一步的优选为30℃；所述反应的时间优选为1.5-2.5h，进一步的优选为1.7-2.2h，更进一步的优选为2h。
在本发明中，所述反应结束后优选的使用正己烷终止反应并萃取产物。所述正己烷的用量优选为400-600μL，进一步的优选为450-550μL，更进一步的优选为500μL。本发明中萃取完成后优选的进行离心，所述离心的转速优选为800-1200g，进一步的优选为900-1100g，更进一步的优选为1000g；所述离心的时间优选为1-5min，进一步的优选为2-4min，更进一步的优选为3min。
在本发明中，离心后将上层有机相转移，然后用氮气吹干，得到的残渣进行烷化处理得到样液。所述烷化处理优选的采用N,O-双(三甲基硅酰胺)进行，所述N,O-双(三甲基硅酰胺)的用量优选为80-120μL，进一步的优选为90-110μL，更进一步的优选为100μL；所述烷化的温度优选为70-90℃，进一步的优选为75-85℃，更进一步的优选为80℃；所述烷化的时间优选为20-40min，进一步的优选为25-35min，更进一步的优选为30min。本发明中得到的样液优选的进行过滤处理，所述过滤优选的采用针头式过滤器进行，过滤规格优选为0.22μm。
在本发明中，所述CYP716C氧化酶基因编码的蛋白用于β-香树脂醇C-28位连续氧化。
在本发明中，氧化的产物为齐墩果酸。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1CYP716候选基因挖掘、生信与表达聚类分析
(一)CYP716候选基因的挖掘、筛选与保守结构分析
由发明人完成的喜树转录组测试后得到的数据(BioProject No.PRJNA704189)以及喜树公共基因组数据(Medicinal Plant Genomics Resource(http://mpgr.uga.edu/pub/data/MPGR/Camptotheca_acuminata/))整合得到喜树基因数据库。从喜树基因数据库中挖掘出编码CYP450所有候选基因序列，通过NCBI数据库进行比对进行家族分类，利用DNAMAN软件对其进行相似度比对，相似度超过97％的序列即视为重复序列，删除重复CYP716序列，最终筛选出CYP716家族候选基因完整序列5条，分别为Cac_g017057、Cac_g031399、Cac_g016511、Cac_g033542、Cac_g033543。
同源性分析结果显示5条候选CYP716序列与其他物种中的CYP716序列相似度较高，均大于60％，表明挖掘的序列均隶属于CYP716家族。
使用BioEdit软件(版本7.2.6.1)，与3条已表征功能的CYP716家族基因(MtCYP716A12，Swiss-Prot：Q2MJ20；VvCYP716A15，Swiss-Prot：F6H9N6，PgCYP716A52v2，Swiss-Prot：I7C6E8)氨基酸序列进行保守性分析，(见图1中的B)。并用Phyre2预测蛋白质三级结构，如图1中的A所示。结果均表明5条CaCYP716基因编码蛋白均包括Heme-binding结构域，K螺旋E-X-X-R保守结构域、I/V/L-P-K/A-G保守结构域、O-binding region结构域及Proline-rich region结构域等特征保守结构域，具有植物CYP716家族蛋白的典型结构特征。
(二)CaCYP716蛋白的系统发育与表达聚类分析
从NCBI和UniProtKB蛋白数据库中检索并提取得到49条不同植物的CYP716蛋白质序列，同待分析的5条喜树CYP716候选序列一起，使用MEGA软件(版本7.0.14)利用邻接法构建CYP716的系统进化树，并使用iTOL软件(版本V6)对系统发育树进行可视化作图，如图2所示。进化树枝上的圆圈大小则表示自展值(bootstr)大小，可反映进化树分支的可信度，自展值的范围为0.3-1，圆圈越大则可信度越高，最小圆圈代表自展值为0.3，最大圆圈代表自展值为1。不同物种的CYP716蛋白系统进化树聚类分为管状花目(Tubiflorae)、卷柏目(Selaginellales)、鼠李目(Rhamnales)、蔷薇目(Rosales)、桔梗目(Campanulales)、伞形目(Apiales)、山茱萸目(Cornales)。5条候选CaCYP716编码蛋白分为2个进化枝，其中CYP716-Cac_g016511、CYP716-Cac_g033542、CYP716-Cac_g033543与海榄雌AmCYP716C54(A0A3G9HYJ5)、AmCYP716C53(A0A3G9HX35)、毛喉鞘蕊花PbCYP716C10(A0A1B0VTC4)和丹参SmCYP716C12(A0A0B4VRN9)聚在同一进化枝；CYP716-Cac_g017057、CYP716-Cac_g031399与海榄雌AmCYP716A260(A0A3G9IDE2)、AmCYP716A259(A0A3G9ICU8)、毛喉鞘蕊花PbCYP716A69(A0A1B0VRK2)、PbCYP716A68(A0A1B0VRK5)和丹参SmCYP716A89(A0A0B4VT24)聚在同一进化枝，两进化枝均与管状花目(Tubiflorae)亲缘关系最近。上述结果表明，CYP716-Cac_g016511、CYP716-Cac_g033542、CYP716-Cac_g033543隶属于CYP7I6C亚家族，而CYP716-Cac_g017057、CYP716-Cac_g031399隶属于CYP716A亚家族。
由发明人测试完成的喜树转录组数据库(BioProject No.PRJNA704189)和公共转录组数据Medicinal Plant GenomicsResource(http://mpgr.uga.edu/pub/data/MPGR/Camptotheca_acuminata/)整合得到喜树基因数据库。从喜树基因数据库中提取CYP716候选基因的表达量(FPKM)值以及参与五环三萜(PT)生物合成的基因，并将所述5条目标CaCYP716序列与参与PT生物合成的基因使用Multi-Experiment Viewer(4.9版)进行表达聚类分析。
成年喜树不同组织部位转录组水平聚类分析结果表明(如图3中的A)，CYP716-Cac_g017057、CYP716-Cac_g031399、CYP716-Cac_g016511、CYP716-Cac_g033542、CYP716-Cac_g033543与参与PT上游合成途径的DXR-Cac_g016318和HMGR-Cac_g020627聚类，其中CYP716-Cac_g016511、CYP716-Cac_g033542、CYP716-Cac_g033543在茎上部、子叶和根中富集表达，CYP716-Cac_g017057在各部位表达量均较低，CYP716_Cac_g031399在花、成熟叶片、成熟果实、茎底部、根和子叶中富集表达。
喜树幼苗转录组聚类分析结果表明(如图3中的B)，CYP716-Cac_g017057、CYP716-Cac_g016511、CYP716-Cac_g033542、CYP716-Cac_g033543与参与PT上游合成途径的HMGR-Cac_g033987、HMGR-Cac_g030267和HMGS-Cac_g028532聚类，与参与PT下游合成途径的SQE-Cac_g006088、OSC-Cac_g030289、OSC-Cac_g032314、SQS-Cac_g014566、FPS-Cac_g003073聚类，在茉莉酸甲酯(MeJa)、聚乙二醇(PEG)处理的喜树苗中表达显著上调，在AgNO3处理的喜树苗中表达下调。CYP716-Cac_g031399与参与PT上游合成途径的CMK-Cac_g021688、HDS-Cac_g022763、DXR-Cac_g016318聚类，与参与PT下游合成途径的OSC-Cac_g014095聚类，在MeJa、PEG处理的喜树苗中表达明显上调，而在AgNO3处理的喜树苗中表达下调。
从喜树蛋白质组数据(ProteomeXchange Consortium,PXD036384)集中提取CYP716蛋白的丰度和参与三萜合成代谢的蛋白丰度，使用Multi-Experiment Viewer(4.9版)进行表达聚类分析。喜树蛋白组聚类分析结果表明(如图3中的C)，CYP716-Cac_g016511与参与PT上游合成途径的CMS-Cac_g018722、MECS-Cac_g008169聚类，并在叶和幼苗中富集。CYP716-Cac_g031399与参与PT上游合成途径的MVK-Cac_g022930、HMGR-Cac_g003668、HMGS-Cac_g028532聚类，与参与PT下游合成途径的OSC-Cac_g008371、OSC-Cac_g030292、FPS-Cac_g003073聚类，且在茎、幼苗、果实、花和叶中富集。CYP716-Cac_g033542、CYP716-Cac_g033543与参与PT上游合成途径的CMK-Cac_g021688、AACT-Cac_g012755聚类，CYP716-Cac_g033543在叶和幼苗中富集，Cac_g033542在各个部位丰度均较低。在蛋白水平未检出CYP716-Cac_g017057。
综上分析，可确定候选序列CYP716-Cac_g017057、CYP716-Cac_g031399、CYP716-Cac_g016511、CYP716-Cac_g033542、CYP716-Cac_g033543表达模式与PT生物合成相关基因高度关联。CYP716-Cac_g031399是存在于各部位的组成性表达基因。CYP716-Cac_g016511呈现组织特异性表达。CYP716-Cac_g017057、CYP716-Cac_g033542、CYP716-Cac_g033543在各组织部位低表达。因此将Cac_g031399、Cac_g017057、Cac_g016511、Cac_g033543、Cac_g033542作为目标CYP716基因进行研究。它们被分别正式命名为CYP716A394、CYP716A395、CYP716C80、CYP716C81、CYP716C82。
所述CYP716A394基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：
ATGGAGTTGTTCTATGTCTCTTTCCTCTCTCTATTTGTTCTCTGTGTCACTCTCTCACTACACTTTCTCTTCTACAAGAACAAAGGGGGAAACCGGCTACCTCCGGGCAAAACGGGATGGCCAGTCATAGGAGAGAGCCTGGAGTTCCTGTCCACGGGATGGAAAGGACACCCAGAGAAATTCATTTTCGATCGCATAGCCAAGTATTCCTCCCACGTCTTCAGAACATCTCTTCTCGGAGAGCAGGCTGCAGTGTTCTGTGGAGCCAGCGGCAACAGATTCTTGTTCTCCAACGAGAACAAGCTCGTTCAAGCATGGTGGCCCGACTCTGTCAACAAAGTATTTCCTTCTTCCACCCAAACGTCTTCTAAGGAAGAGGCCATCAAGATGAGAAAGATGCTCCCCAACTTCCTCAAGCCCGAGGCTTTGCAGCGTTACATCGGCATCATGGACACCATAGCGCAGCGTCACTTTGCAGCCGGCTGGGAAAACAAGGATCAAGTTGTTGTGTTCCCACTGGCCAAGCGCTACACTTTCTGGTTGGCTTGTCGCGTGTTTGTGAGCGTAGAAGATCCAGATCATGTTGCTAGGTTTGCTGACCCATTTAACCTGTTGGCATCGGGCCTTATTTCCATCCCTATTGACCTGCCCGGCACCCCTTTCCATCGAGCCATCAAGGCCTCTAACTTCATCAGGAAGGAGCTTGTCTCCATCATCAAGCAGAGAAAGATTGACTTGGCCGAAGGGAAGGCATCGCCTACACAAGATATATTGTCACACATGCTTCTCAGCAGCGATGAGAATGGCAAGTTCATGAATGAGTTAGACATAGCTGACAAAATCTTGGGTTTGTTAATTGGTGGCCATGATACCGCAAGTTCTGCATGCACTTTTGTTGTTAAGTATCTTGCTGAGCTGCCCGAGATCTACGAAGGAGTCTACAAGGAGCAAATGGAGATTGCACGGTCAAAGGCTCCAGGCGAATTGCTGAATTGGGACGATATTCAGAAAATGAAATATTCATGGAACGTCGCATGTGAAGTGTTGAGACTTGCACCACCCCTTCAAGGAGCTTTCAGAGAAGCTATTACTGATTTCATGTACAGCGGTTTCTCGATTCCAAAGGGTTGGAAGATATATTGGAGCGCAAACTCAACACATAAAAATCCAGAAGTGTTCCCAGAGCCTATGAAATTTGATCCTTCAAGATTTGATGGAAGTGGTCCTGCGCCTTATACATTTGTACCATTCGGAGGAGGACCAAGAATGTGCCCAGGGAAAGAGTATGCCCGTGTGGAAATATTAGTTTTCATGCACCATCTTGTGAAGAGGTTCAAGTGGGAGAAAATGATTCCTGACGAGAAAATTATTGTGGATCCCATGCCCATTCCAGCCAAAGGACTTCCAGTTCGCCTCTATCCTCACAAAGCTTAA；
所述CYP716A395基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示：
ATGGAGTTCTTCTATGTCTCCCTCCTCTCCCTATTTGTTGTCTCTGTCTCTCTTTCATTACACTTCCTCTTCTACAAGAACAAAAACAAAAACTTTCCTCCCGGCAAGACTGGATGGCCAGTTGTTGGAGAGAGTCTTGAATTCCTCTCCACCGGCTGGAAAGGACAC CCAGAGAAGTTCATATTCGACCGCATGACCAAATATTCATCTCATGTTTTCAGGACATCTCTTCTTGGGGAGCAAGCTGCAGTGTTTTGTGGAGCTGCTGGTAACAAGTTCTTGTTCTCCAACGAGAACAAGCTCGTCCAGGCATGGTGGCCTGATTCTGTGAACAAAGTCTTTCCATCATCCACCCAAACTTCTTCAAAAGAGGAGGCCATCAAAATGAGAAAAATGCTTCCCAACTTCCTCAAGCCAGAAGCTTTGCAGCGATACGTTGGCATCATGGACACAATTGCTCAACGACACTTTGCTTCAGGTTGGGAGAACAAAGATGAAGTCACAGTGTTCCCTTTGGCCAAGAACTACACATTCTGGCTTGCCTGTCGCTTGTTTGTAAGCGTAGAGGACCCTGACCATGTCGCCAGGTTTGCAGACCCTTTTAACATGTTGGCTTCTGGGCTTATTTCCATCCCAATTGACTTGCCTGGCACTCCATTCCACCGTGCCATCAAGGCCTCCAATTTCATCAGGAAGGAACTTGTGGCAATCATCAAACAGAGGAAGATCGACTTGGCGGAGGGGAAAGCGTCTCCCACACAAGATATACTGTCGCACATGCTTTTGACAAGCGACGAGAACGGGAAATTCATGAATGAATTGGATATAGCTGATAAGATCTTGGGTTTGTTGATTGGTGGTCATGACACTGCAAGTTCGGCCTGCACTTTCATTGTTAAGTATCTTGCTGAGCTTCCAGAAATATACCAAGGAGTTTACAGGGAGCAAATGGAAATTGCAAAGTCAAAGGGTCCGGGTGAACTGTTGAATTGGGACGATATTCAGAAGATGAAGTATTCATGGAACGTGGCATGTGAAGTATTAAGACTTGCACCACCTCTCCAAGGAGCTTTCAGAGAAGCCCTTACCGATTTCATGTACAACGGTTTCTCAATTCCAAAGGGTTGGAAGATTTATTGGAGTGCAAATTCAACACATAAAAATCCAGATGTCTTTCCTGAACCTATGAAATTCGATCCTTCAAGATTTGAGGGAAGCGGACCTGCACCTTACACATTTGTGCCCTTCGGTGGAGGACCAAGGATGTGCCCCGGAAAAGAGTATGCTCGATTGGAAATTCTCGTTTTCATGCACCACCTTGTGAAGAGATTTAAGTGGGATAAGTTGATTCCTGATGAGAAAATTGTTGTGGATCCCATGCCCATCCCTGCCAAAGGCCTTCCAGTTCGCCTTTATCCTCACAAAGCTTAA；
所述CYP716C80基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述CYP716C81基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述CYP716C82基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
所述CYP716A394基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示：
MELFYVSFLSLFVLCVTLSLHFLFYKNKGGNRLPPGKTGWPVIGESLEFLSTGWKGHPEKFIFDRIAKYSSHVFRTSLLGEQAAVFCGASGNRFLFSNENKLVQAWWPDSVNKVFPSSTQTSSKEEAIKMRKMLPNFLKPEALQRYIGIMDTIAQRHFAAGWENKDQVVVFPLAKRYTFWLACRVFVSVEDPDHVARFADPFNLLASGLISIPIDLPGTPFHRAIKASNFIRKELVSIIKQRKIDLAEGKASPTQDILSHMLLSSDENGKFMNELDIADKILGLLIGGHDTASSACTFVVKYLAELPEIYEGVYKEQMEIARSKAPGELLNWDDIQKMKYSWNVACEVLRLAPPLQGAFREAITDFMYSGFSIPKGWKIYWSANSTHKNPEVFPEPMKFDPSRFDGSGPAPYTFVPFGGGPRMCPGKEYARVEILVFMHHLVKRFKWEKMIPDEKIIVDPMPIPAKGLPVRLYPHKA；
所述CYP716A395基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示：
MEFFYVSLLSLFVVSVSLSLHFLFYKNKNKNFPPGKTGWPVVGESLEFLSTGWKG HPEKFIFDRMTKYSSHVFRTSLLGEQAAVFCGAAGNKFLFSNENKLVQAWWPDSVNKVFPSSTQTSSKEEAIKMRKMLPNFLKPEALQRYVGIMDTIAQRHFASGWENKDEVTVFPLAKNYTFWLACRLFVSVEDPDHVARFADPFNMLASGLISIPIDLPGTPFHRAIKASNFIRKELVAIIKQRKIDLAEGKASPTQDILSHMLLTSDENGKFMNELDIADKILGLLIGGHDTASSACTFIVKYLAELPEIYQGVYREQMEIAKSKGPGELLNWDDIQKMKYSWNVACEVLRLAPPLQGAFREALTDFMYNGFSIPKGWKIYWSANSTHKNPDVFPEPMKFDPSRFEGSGPAPYTFVPFGGGPRMCPGKEYARLEILVFMHHLVKRFKWDKLIPDEKIVVDPMPIPAKGLPVRLYPHKA；
所述CYP716C80基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述CYP716C81基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述CYP716C82基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
实施例2CYP716基因异源表达和微粒体蛋白制备
(一)目标CYP716基因重组表达载体的构建与验证
CYP716A394、CYP716A395、CYP716C80、CYP716C81和CYP716C82基因序列经密码子优化后，构建pYES2/CT-CYP716表达载体(目标CYP716基因的密码子优化和全序列合成由上海生工完成)。使用Kpn I和Not I位点将目标CYP716基因插入pYES2/CT质粒，构建重组质粒pYES2/CT-CYP716A394、pYES2/CT-CYP716A395、pYES2/CT-CYP716C80、pYES2/CT-CYP716C81、pYES2/CT-CYP716C82。
将上述构建的重组表达载体分别转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，重组菌液在LB培养基中经37℃过夜培养后，使用质粒提取试剂盒(购自于Omega)进行纯化。
纯化后的重组质粒pYES2/CT-CYP716A394、pYES2/CT-CYP716A395、pYES2/CT-CYP716C80、pYES2/CT-CYP716C81、pYES2/CT-CYP716C82通过KpnⅠ、NotⅠ双酶切验证，质粒酶切电泳结果如图4所示，酶切产物条带大小与5条目标CYP716基因长度一致，表明目的CYP716基因重组质粒构建成功。测序结果表明目标CYP716基因未发生碱基突变，可用于后续蛋白异源表达实验。
(二)CYP716目标蛋白表达与微粒体蛋白制备
选取对数生长期的WAT11酿酒酵母培养液制作感受态细胞。用MicroPulser165-2100(Bio-Rad，California，USA)将经验证的重组质粒pYES2/CT-CYP716C80、pYES2/CT-CYP716C82、pYES2/CT-CYP716C81、pYES2/CT-CYP716A395、pYES2/CT-CYP716A394电转化(1.5kV)WAT11酿酒酵母感受态细胞，pYES2/CT空载体同时转化作为阴性对照。菌体在1mL无菌无抗生素的YPDA液体培养基中30℃，180g摇床振荡培养复苏2h；3000g室温离心5min，弃上清，用1mL无菌水重悬洗涤菌体，重复三次，最后加200μL无菌水重悬菌体。将获得的菌体涂布于SC-Ura营养缺陷型培养基(购自于北京泛基诺科技有限公司)，30℃培养72h。挑取WAT11单克隆进行菌落PCR验证阳性克隆。PCR条件如下：95℃，10min；(95℃，30s；57℃，30s；72℃，1min)30个循环；12℃保温10min。
其中CYP716A394-F引物序列如SEQ ID NO:11所示，CYP716A394-R引物序列如SEQID NO:12所示；CYP716A395-F引物序列如SEQ ID NO:13所示，CYP716A395-R引物序列如SEQID NO:14所示；CYP716C80-F引物序列如SEQ ID NO:15所示，CYP716C80-R引物序列如SEQID NO:16所示；CYP716C81-F引物序列如SEQ ID NO:17所示，CYP716C81-R引物序列如SEQID NO:18所示；CYP716C82-F引物序列如SEQ ID NO:19所示，CYP716C82-R引物序列如SEQID NO:20所示。具体见表1。
表1菌落PCR验证引物
PCR产物电泳结果如图5，PCR产物大小与预期相符，分别为1046、979、1011、1043、809bp，表明成功构建5条CYP716序列的WAT11重组酿酒酵母菌株。
用无菌牙签挑取验证阳性的单克隆接种于15mL SC-Ura液体培养基中，30℃，180g振荡培养24h。取1mL上述菌液接种到新鲜的50mL SC-Ura液体培养基中，30℃，180g振荡培养至生长平台期；3000g，室温离心5min，弃上清，收集菌体。加入50mL无菌水重悬洗涤菌体，3000g，室温离心5min，弃上清，收集菌体，重复三次。将洗涤后的菌体用5mLYPGal液体培养基重悬，转移到100mLYPGal液体培养基中，30℃，180g诱导培养24h；3500g，4℃离心5min，弃上清，收集菌体。用预冷的TES缓冲液(50mM Tris，1mM EDTA，0.6M山梨醇，pH＝7.4)重悬菌体(0.5g菌体/mL)。向菌液中加入的无菌陶瓷珠(0.5mm)，至淹没菌体，冰上静置5min。用三维冷冻研磨仪(净信，上海，中国)破碎WAT11细胞。破碎条件如下：强度，20m/s；工作时间，30s；间歇时间，1min；破坏循环20次。取适量上清使用电子显微镜(巴拓，上海)观察破碎情况，无肉眼可见完整细胞结构，即可用于提取微粒体蛋白。将上清液用TES缓冲液稀释2-3倍，12000g，4℃离心12min后收集破碎上清液。将1.5M NaCl溶液和PEG4000加入上清液中，使最终浓度分别为0.15M NaCl和0.1g/mLPEG4000。将溶液在冰上孵育40min，并在12000g和4℃条件下离心30min，以沉淀微粒体蛋白。收集微粒体蛋白，称重，并用TEG缓冲液(50mMTris、1mM EDTA、20％甘油)重悬微粒体蛋白，至浓度为40mg/mL，置于-80℃冻存。
采用Western-Blot法验证CYP716在WAT11酿酒酵母中的表达情况，结果见图6。Western-Blot结果表明4条目标CYP716重组蛋白均已成功表达，且条带大小与目标条带大小一致(59.11kDa、59.06kDa、65.27kDa、59.01kDa)，且阴性对照空载体无条带，其中CYP716A394未检测到目标蛋白表达。使用ExPasy ProtParam计算CYP716蛋白消光系数(ε280nm)，根据消光系数法测定CYP716蛋白的浓度。CYP716A395、CYP716C80、CYP716C81、CYP716C82蛋白浓度分别为0.93、1.14、0.20、1.22mg/ml。
实施例3CYP716微粒体蛋白催化底物筛选和氧化产物鉴定
将β-香树脂醇(购自于维克奇生物)、原人参二醇(购自于维克奇生物)作为CYP716A395、CYP716C80、CYP716C81、CYP716C82微粒体蛋白的酶活测试底物。用二甲亚砜(DMSO)分别溶解底物并配置成浓度为50mM的标品母液。酶活测试反应体系：100μM底物1μL、1mM NADPH 10μL、40mg/mL微粒体蛋白1mg，最后用磷酸钾缓冲液(100mM KH2PO4，pH 7.4)补足至500μL。然后在恒温孵育器(博日科技，杭州)中，30℃，2h下进行微粒体蛋白活性测定。反应结束后用500μL正己烷终止反应并萃取产物，10000g离心3min，转移上层有机层并用氮气吹干。残渣用100μL的N,O-双(三甲基硅酰胺)(阿拉丁，上海)在80℃下三甲基硅烷化30min，随后用0.22μm针头式过滤器过滤。将转化pYES2/CT空载体的菌株制备的微粒体蛋白用作阴性对照。每个反应重复三次。
采用Agilent 7890B-7000C气质联用系统监测反应。采用石英毛细管色谱柱HP-5MS(30m×0.32mm×0.25μm)进行色谱分析。起始温度80℃，2min；以20℃/min升至180℃；再以10℃/min升至320℃，并保持3min。分流进样，分流比5:1；载气是He，流速：1.5mL/min。电离方式EI，电子能量70eV，离子源温度230℃，进样口温度280℃，传输线温度300℃质量范围40-900amu。
根据目标产物分子量与二级质谱进行氧化产物判断。各微粒体蛋白酶促反应液的提取离子流图(EIC)见图7。使用原人参二醇(m/z 460.7)作为测试底物，在各反应体系中均未检测到+100Da的三甲基硅烷化后的氧化产物(图7中的A)。使用β-香树脂醇(m/z 499.5)作为测试底物，在CYP716C80、CYP716C81、CYP716C82三个微粒体蛋白反应体系中检测到+100Da的三甲基硅烷化后的氧化产物(图7中的B)，而在CYP716A395微粒体蛋白反应体系中未检测到该氧化产物(如图8所示)。说明仅有CYP716C家族的微粒体蛋白存在β-香树脂醇氧化活性。
为确定氧化产物结构，将CYP716C80、CYP716C82、CYP716C81微粒体蛋白以β-香树脂醇为底物的反应液进行MS/MS二级质谱分析，结果如图9。结果表明CYP716C80、CYP716C81、CYP716C82在β-香树脂醇反应体系中硅烷化氧化产物(m/z 600.3629)的二级质谱裂解规律基本相同，母离子通过连续裂解102Da(-TMS-CHO)、90Da(-TMS-H2O)形成m/z498.3和m/z 407.9的碎片离子，说明氧化产物中存有两个羟基。中间体离子m/z407.9通过裂解15Da(-CH3)形成m/z 393.0的碎片离子，再通过C环的RDA特征裂解形成m/z 218.0和m/z 189.9的碎片离子。同时与齐墩果酸标准品保留时间进行比对，最终确定氧化产物为齐墩果烷型三萜齐墩果酸(Oleanolic acid)。
实施例4氧化产物分离纯化与NMR结构鉴定
为了明确地鉴定氧化产物结构，使用1H和13CNMR来确认氧化产物的结构。
将得到的氧化产物通过半制备型LC3050N HPLC纯化。色谱柱：Cosmosil5C18-MS-II(10ID×250mm)填充柱，流速3.0mL/min。流动相A为含有0.1％HCOOH的水溶液，流动相B为乙腈。梯度洗脱条件设定如下：0-10min，5-20％(B相)；10-30min，20-80％(B相)；30-32min，80-98％(B相)；32-37min，98-98％(B相)；37-39min，98-5％(B相)；39-45min，5-5％(B相)。波长设置为206nm。
将纯化的产物溶于500μL氘代氯仿中，1H和13C NMR测试在BrukerAscendTM 600上完成。NMR谱图如图10所示。在1HNMR谱图中，共观察到四十八个氢质子信号。位于δH 5.27的单峰被注释为H-28。位于δH 2.81和δH 3.21的质子信号分别注释为C-3羟基质子和C-28羧基质子。其余的烷基质子分布在高场。在13C NMR谱图中，总共检测到30个碳。在δC 122.62、δC143.59处存在两个烯碳，在δC 183.30处存在一个羧基碳，这进一步证实了氧化产物中存在C-28羧基。由此表明，氧化产物是一种具有一个C-28羧基的齐墩果烷型三萜。通过与现有记载的NMR谱图进行比对，最终将氧化产物的结构确定为齐墩果酸。
实施例5CYP716C微粒体蛋白的反应条件优化和动力学表征
配置系列浓度的齐墩果酸标准品溶液(20、30、40、50、60、70、80μM)，使用上述方法进行GC-MS分析，根据浓度与对应峰面积建立标准曲线，以进行产物的定量分析。通过单因素实验确定最佳反应条件，包括反应温度(20-60℃)、反应时间(0.5-8h)、pH(6.0-8.0)、NADPH浓度(0μM-1500μM)，反应条件优化过程如图11-13所示。最终确定CYP716C80微粒体蛋白的最佳反应条件为：诱导时间为1h，反应温度30℃，pH值为6.0，NADPH浓度为1000μM；CYP716C81微粒体蛋白的最佳反应条件为：诱导时间为0.5h，反应温度20℃，pH值为7.5，NADPH浓度为500μM；CYP716C82微粒体蛋白的最佳反应条件为：诱导时间为0.5h，反应温度40℃，pH值为7.0，NADPH浓度为500μM。
为研究CYP716C重组蛋白对β-香树脂醇的催化性能，分别对CYP716C80、CYP716C82、CYP716C81微粒体蛋白在最佳反应条件下进行不同底物浓度(100-1000μmol/L)和反应时间(10-60min)测试，根据氧化产物生成量结果计算反应速度。构建速度-底物浓度曲线，并拟合米氏方程。结果见图14，CYP716C80微粒体蛋白的Vmax＝2.18±0.46μmol/L/min、Km＝92.79±4.30μmol/L，CYP716C81微粒体蛋白的Vmax＝1.52±0.30μmol/L/min、Km＝158.55±7.40μmol/L，CYP716C82微粒体蛋白的Vmax＝1.92±0.225μmol/L/min、Km＝87.47±3.90μmol/L。
综上表明了CYP716C80和CYP716C82对于β-香树脂醇的亲和力相近，均优于CYP716C81；CYP716C80微粒体蛋白对β-香树脂醇呈现出最优的转化速率。三种CYP716C80、CYP716C81和CYP716C82微粒体蛋白均可用于齐墩果酸的制备。
实施例6CYP716C基因在本氏烟草中的体内功能验证
为了进一步验证三种CYP716C蛋白在植物体内的氧化活性，在本氏烟草中进行了瞬时表达实验。
使用AgeI和XhoI位点将目标CYP716基因插入pEAQ-HT质粒中，构建重组质粒pEAQ-HT-CYP716，并将pEAQ-HT-CYP716重组质粒转化到根癌农杆菌GV3101感受态菌株中。将获得的重组GV3101菌株在LB培养基(20μg/mL利福平、50μg/ml卡那霉素)中培养至OD600＝0.6。离心收集细胞沉淀，将其重悬在渗透缓冲液(50mM MES，30mM葡萄糖，10mM MgCl2，100μM乙酰丁香酮)中，并稀释至OD600＝0.6。
用5周龄的本氏烟草叶片瞬时表达CYP716基因。使用注射器将GV3101菌株渗透烟叶背面，3天后，将β-香树脂醇(100μM，溶于含有1％DMSO的水溶液中)和NADPH(500μM水溶液)渗透到相同的叶片中。在渗透后2天收获叶片，并用液氮研磨成细粉末。取0.1g烟叶粉末用正己烷脱色，并用500μL甲醇在25℃下萃取30min；并将提取物以12000g离心10min，收集上清并用氮气干燥。残留物用100μLN,O-双(三甲基硅酰胺)乙酰胺在80℃下三甲基硅烷化30min，然后通过0.22μm针头式过滤器过滤。每条序列三个重复。使用上述GC-MS方法对所获得的提取物进行产物分析。同时以pEAQ-HT空质粒转化GV3101菌株，按上述方法注入烟叶后进行酶活测试，作为阴性对照。结果如图15所示，在携带EV的叶提取物中没有观察到+102Da的氧化产物，而在每一种转化CYP716C质粒的烟草叶提取物中均观察到+102Da的氧化产物。在70eV的电子碰撞能量下进一步裂解观察到的植物体内氧化产物，氧化产物的裂解特征(见图16)与体外酶活实验中的裂解模式相同。这些结果表明，新鉴定的CYP716Cs在烟草体内也显示出β-香树脂醇氧化酶活性。
实施例7CYP716C基因在喜树幼苗中的表达特征
在四川农业大学雅安校区采集喜树成熟种子，使用实验室构建的方法培育20、30、40、60、75天龄的喜树幼苗。
10月底至11月中旬采集喜树成熟种子，采集后25±1℃风干。小心剥除优良成熟种子的果壳，用表面活性剂(3％Triton X-100)冲洗3-5min，洗去表面杂质，随后用无菌水反复冲洗除去洗涤剂。将脱壳后种子浸泡于75％乙醇，搅拌消毒30-60s，再将种子转入1％NaClO溶液中，冲洗消毒1-3min，用无菌水冲洗3-5次除去种皮上残余的试剂。用无菌滤纸吸干种皮外的水分，用无菌枪形镊将其夹入装有1/2MS培养基培养瓶中，4-8粒/瓶。黑暗培养直到子叶萌发(25℃、60-75％湿度)，然后进行光照培养周期(与暗培养相同温度与湿度，光周期为16h/d)，以培育20、30、40、60、75天龄的喜树幼苗。
将上述培育得到的不同时期的喜树幼苗的根、茎、叶样品分别在液氮中研磨成细粉，参照RNAprep purer多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(天根，北京)的方法提取喜树幼苗的总RNA，并使用Nanodrop2000(ThermoFisher，United States)进行RNA质量控制，当总RNA的OD260/OD280数值在1.8-2.1之间，则RNA质量合格，可用于后续实验。
利用提取出的喜树RNA使用GoldenstarTM RT6 cDNA Synthesis Mix试剂盒(擎科，中国)反转录合成单链cDNA。根据目标CYP716基因序列设计定量引物，然后使用 Master qPCR Mix(SYBR GreenⅠ)试剂盒(擎科，中国)进行cDNA扩增，使用CFX Connect荧光定量PCR仪(BioRad，United States)进行qRT-PCR，每个样本重复三次，同时设阴性对照。使用Ca18S rRNA作为内参基因，以各组织部位20d的样品表达量为基准，用比较阈值法/>进行目标CYP716基因相对表达水平计算。
其中，Ca-18S-F引物序列如SEQ ID NO:21所示，Ca-18S-R引物序列如SEQ ID NO:22所示；CYP716C80-F引物序列如SEQ ID NO:23所示，CYP716C80-R引物序列如SEQ ID NO:24所示；CYP716C81-F引物序列如SEQ ID NO:25所示，CYP716C81-R引物序列如SEQ ID NO:26所示；CYP716C82-F引物序列如SEQ ID NO:27所示，CYP716C82-R引物序列如SEQ ID NO:28所示。具体见表2。
表2qRT-PCR引物序列
结果如图17所示，相较于20d，CYP716C80、CYP716C81、CYP716C82在叶中的表达量随时间的增长呈显著增加趋势，且均在75d时达到最高。3种基因在茎中的表达量在不同时间无明显差异。相较于20d，CYP716C80、CYP716C81和CYP716C82在根中的表达量随时间的增长整体上呈先增多后减少的趋势，其中CYP716C80在30d和60d表达量分别出现峰值，CYP716C81和CYP716C82均在40d表达量最大。
由以上实施例和试验例可知，本发明通过结合基因组、转录组和蛋白组多组学数据对喜树中CYP716基因进行筛选与优选，最终得到了三种CYP716C氧化酶基因和所述基因编码的相应蛋白，包含所述基因的质粒及包含所述表达质粒的酿酒酵母WAT11宿主细胞；同时利用宿主细胞诱导表达了CYP716C80、CYP716C81和CYP716C82三种微粒体蛋白，并将编码的蛋白作为氧化生物催化剂用于β-香树脂醇C-28位连续氧化，氧化产物为齐墩果酸。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.喜树中的CYP716C氧化酶基因，其特征在于，包括CYP716C80基因、CYP716C81基因或CYP716C82基因；
所述CYP716C80基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述CYP716C81基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述CYP716C82基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
2.权利要求1所述喜树中的CYP716C氧化酶基因编码的蛋白，其特征在于，包括CYP716C80蛋白、CYP716C81蛋白或CYP716C82蛋白；
所述CYP716C80蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；
所述CYP716C81蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；
所述CYP716C82蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
3.含有权利要求1所述CYP716C氧化酶基因的重组表达质粒。
4.根据权利要求3所述的重组表达质粒，其特征在于，使用的原始质粒为pYES2/CT质粒。
5.根据权利要求4所述的重组表达质粒，其特征在于，所述CYP716C氧化酶基因插入在所述原始质粒的Kpn I位点和Not I位点之间。
6.权利要求2所述喜树中的CYP716C氧化酶基因编码的蛋白作为氧化生物催化剂的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：在含有反应底物、NADPH、所述CYP716C氧化酶基因编码的蛋白以及磷酸钾缓冲液的反应体系中进行氧化反应，然后萃取、过滤；
所述反应底物为β-香树脂醇；
所述CYP716C氧化酶基因编码的蛋白用于β-香树脂醇C-28位连续氧化。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，氧化的产物为齐墩果酸。
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