KR20160039867A - 올레아난계 진세노사이드 생합성 촉진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 올레아난계 진세노사이드(Oleanane-Type Ginsenoside; Ginsenoside Ro) 생합성 촉진용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 올레아난계 진세노사이드에 관여하는 CYP716A52v2 단백질 또는 이를 코딩하는 CYP716A52v2 유전자를 포함하는 올레아난계 진세노사이드 생합성 촉진용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 올레아난계 진세노사이드를 대량 합성하거나 올레아난계 계열의 인삼 사포닌 생합성을 증가시키기 위한 방법에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

올레아난계 진세노사이드 생합성 촉진용 조성물{Composition for Promoting Biosysthesis of Oleanane-Type Ginsenoside}

본 발명은 올레아난계 진세노사이드(Oleanane-Type Ginsenoside; Ginsenoside Ro) 생합성 촉진용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 올레아난계 진세노사이드에 관여하는 CYP716A52v2 단백질 또는 이를 코딩하는 CYP716A52v2 유전자를 포함하는 올레아난계 진세노사이드 생합성 촉진용 조성물에 관한 것이다.

파낙스(Panax) 종들은 아랄리아세아(Araliaceae) 패밀리에 속하는 다년생 초본 식물이다. 이들 종들은 고대부터 전통 의료학적 중요한 약물로 사용되고 있으며 삶의 질을 높이는데 일반적으로 사용되어 왔다(Ellis and Reddy 2002, Coleman et al. 2003). 대략 12개 파낙스 종들이 세계적으로 분포되어 있다(Wen and Zimmer 1996, Zhu et al. 2004)이며 대부분 공통적으로 사용된 종들은 P. ginseng, P. japonicus, P. notoginseng, P. quinquefolius 및 P. vietnamensis이다. Panax 종들은 가장 인기있는 의료학적 허브로 뿌리는 약학적 활성성분인 진세노사이드라고 알려진 트리터펜(triterpene) 사포닌들을 함유하고 있으며 이들 식물의 생물학적 활성을 담당한다. 가장 잘 알려지고 비싼 약물인 인삼 뿌리의 중요한 특징들은 면역체계 조절, 항 스트레스 활성, 항암활성, 항당뇨활성 등을 포함한다(Vogler et al. 1999, Shibata 2001, Yun 2001, Dey et al. 2003, Kiefer and Pantuso 2003).

트리터페노이드 사포닌은 이소프레노이드 화합물의 두 번째로 큰 대사물질 그룹이며, 식물종간에 넓은 범위의 생물학적 활성을 가지고 있으며 매우 큰 구조적 다양성을 보여준다. 이들 화합물은 높은 경제학적 가치가 있으며 많은 것들은 의료학적 약물(medical drugs)로 활용되고 있다((Hostettmann and Marston 1995, Vogler et al. 1999, Shibata 2001). 식물에서 사포닌의 자연적 역할은 병원균이나 곤충의 공격으로부터 방어(defend)하는 기능을 한다(Osbourn 1996). 트리터페노이드 사포닌의 일차적인 구성은 다마렌(dammarane)계, 올레아난(β-아미린)(oleanane (b-amyrin))계, 우르산(β-아미린)(ursane (a-amyrin))계 및 루페올(lupeol)계 트리터페노이드들이다.

테트라사이클릭 다마렌계 및 펜타사이클릭 올레아난계 트리터펜 사포닌들은 주로 인삼 뿌리에서 생성되는 진세노사이드들로 알려져 있다.

Panax 종들에서, 테트라사이클릭 다마렌계 및 펜타사이클릭 올레아난계 트리터펜 사포닌들은 주로 뿌리에서 생성된다. 다마렌계 진세노사이드들은 아글리콘 구조에 따라 프로토파낙사디올(Rb1, Rb2, Rc 및 Rd) 및 파낙사트리올(Rg1, Re, Rf 및 Rg2)의 두 개 그룹으로 분류된다. 이들의 약제학적 효과에 대하여는 주로 면역시스템의 조절, 항스트레스(anti-steress), 항과혈당(anti-hyperglycemic), 항염증(anti-inflammatory), 항산화(anti-oxidant) 및 항암(anti-cancer) 등 광범위하게 보고된바 있다(Briskin 2000, Shibata 2001).

그러나, 식물에서 사포닌의 생리학적 역할은 충분히 규명되지 않고 있다. 사포닌들은 식물에서 발견되는 보호작용을 하는 큰 규모의 분자와 같이 소위 '식물보호제(phytoprotectants)'로 알려진 방어시스템의 일부로 생각되어 질 수 있다(Osbourn 1996).

사포닌들은 신경독성(neurotoxicity)과는 넓은 범위의 다른 해충들에 대한 강력하고 빠른 해충활성을 가지고 있다(Geyter et al. 2007). 사실, 사포닌들은 혐오/억제 활성을 발휘하며, 소화장애 문제를 일으키며, 곤충 탈피결함을 유발시키며 세포독성 효과를 유도한다(Geyter et al. 2007). P.ginseng에서, 다마렌 사포닌들은 식물의 모든 부분에 균등하게 분포되어 지며, 올레아난 사포닌들은 주로 근경(rhizome)에 축적된다(Matsuda et al. 2010). Panax ginseng은 다년초(perennial herbaceous) 식물로서 뿌리의 윗부분에 있는 근경은 다음해의 발아를 위한 싹을 가지고 있기 때문에 장기간의 생존에 매우 중요하다. 다른 다마렌계 진세노사이드가 고르게 분포되는 것에 비하여 근경에서 진세노사이드 Ro의 집중적인 축적은 이 분자가 곤충의 방어기능에 매우 중요하다는 것을 시사한다. 진세노사이드 Ro는 중요한 약제학적 활성을 보유한다(Matsuda et al. 1986, Matsuda et al. 1991, Lee et al. 1997). 진세노사이드 Ro, 28-O-b-Dglucopyranosyl oleanate 3-O-b-D-glucopyranosyl-(1!2)-b-Dglucuronopyranoside는 P. japonicus에서 최초로 분리되었으며(Kondo et al. 1971), Panax 종들 및 많은 다른 식물에서 광범위하게 생성되는 것으로 발견되었다.

진세노사이드 Ro는 P. ginseng에서 유일한 올레아난 사포닌으로 대두되었으며, 실험 도구에서 진세노사이드 Ro는 중요한 항트롬빈, 항염증 및 항간염 활성을 증명하였다(Lee et al. 1997, Matsuda et al. 1986, Matsuda et al. 1991). 더구나, 올레아놀릭산은 강한 간보호(hepatoprotective)효과를 가지는 것으로 보고되고 있다(Liu 1995, Reisman et al. 2009). 이 분자의 생합성에 관련된 유전자들의 확인은 식물에서의 유전적 변형을 통하여 그것의 함량 및 구성을 변형시킬 수 있다는 것이 매우 가치있는 일이라는 것을 보여주는 것이다.

상기와 같이 의료적 활용가치가 있는 올레아난계 진세사이드는 그 합성경로는 알려져 있지 않았다. 올레아난계 트리터펜 아글리콘은 β-아미린으로부터 유래된 올레아놀릭산으로 생각되지만, 올레아난계 트리터펜 아글리콘 합성효소를 코딩하는 CYP 유전자는 아직 규명되지 않고 있어 이를 규명할 경우 올레아난계 진세노사이드의 합성 및 이들의 의료학적 활용가치를 높일 수 있을 것으로 기대된다.

Briskin, D.P.(2000) Medicinal plants and phytomedicines. Linking plant biochemistry and physiology to human health. Plant physiol. 124:507-514. Carelli, M., Biazzi, E, Panara, F., Tava, A., Scramelli, L., Porced여, A. et al. (2011) Medicago truncatula CYP716A12 is multifunctional oxidase involoved in the biosynthesis of hemolytic saponins. Plant Cell 23:3070-3081. Choi, Y. E., Yang, D.C., Kusano, T. and Sano, H. (2001) Rapid and efficient Agrobacterium-mediated genetic transformation by plasmolyzing pretreatment of cotyledons in panax ginseng. Plant Cell Rep. 20: 616-621.

이에 본 발명자들은 인삼 부정근(adventitious roots)의 EST 서열들로부터 얻어진 CYP 유전자 서열들(putative full CYP gene sequences) 중 CYP716A계열의 유전자의 하나인 CYP716A52v2이 진세노사이드 생합성에 매우 중요한 역할을 하는 올레아난계 진세노사이드(Oleanane-Type Ginsenoside) 합성효소라는 것을 실험을 통해 증명하였다.

본 발명의 목적은 올레아난계 진세노사이드 생합성 촉진 유전자인 CYP71652v2 유전자 또는 이로부터 코딩되는 CYP716A52v2 단백질을 포함하는 올레아난계 진세노사이드 생합성 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 조성물로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 조성물로 형질전환된 형질전환 식물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 CYP716A52v2 올레아난계 진세노사이드 생합성 촉진 유전자의 발현을 증가시켜 올레아난계 진세노사이드 생산을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CYP716A52v2 단백질 또는 이를 코딩하는 CYP716A52v2 유전자를 포함하는 올레아난계 진세노사이드 생합성 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성될 수 있고, 상기 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 CYP716A52v2 단백질을 코딩하는 CYP716A52v2 유전자를 포함하는 재조합 벡터 또는 플라스미드를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 CYP716A52v2 단백질은 β-아미린 28-옥시다제(β-amyrin 28-oxidase)인 것을 특징으로 한다. 따라서 본 발명의 올레아난계 진세노사이드 생합성 촉진용 조성물은 β-아미린(β-amyrin)에서 올레아놀릭산(oleanolic acid)의 합성을 증가시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터 또는 플라스미드로 형질전환되어 프로토파낙사트리올의 합성이 가능한 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 숙주세포는 효모 또는 대장균일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터 또는 플라스미드로 형질전환된 형질전환 식물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 구성된 CYP716A52v2 유전자 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 CYP716A52v2 단백질의 발현을 증가시켜 올레아난계 진세노사이드의 생산을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 재조합 벡터 또는 플라스미드로 숙주를 형질전환시켜 CYP716A52v2 유전자 또는 단백질을 과발현시키는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 숙주는 효모, 대장균 또는 인삼(Panax ginseng)을 포함한 식물일 수 있다.

본 발명에 따른 올레아난계 진세노사이드 생합성에 관여하는 인삼 유래의 CYP716A52v2 유전자를 숙주에 형질전환시킬 경우 올레아난계 진세노사이드(Ginsenoside Ro) 생합성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명은 올레아난계 진세노사이드를 대량 합성하거나 올레아난계 계열의 인삼 사포닌 생합성을 증가시키기 위한 방법에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 P. ginseng에서 진세노사이드들의 생합성 과정 도식화
도 2는 세 개 P. ginseng CYPs(굵은 글씨) 및 다른 식물 CYPs의 계통수 트리
도 3은 두 개 PNY1 및 CYP716A52v2를 발현하는 WAT21 효모에서 올레아놀릭산의 GC-MS 분석결과
(A) 대조군으로서 빈 벡터로 인한 효모추출물의 이온 크로마토그램
(B) 36.45분에서 새로운 생성물로 감지되는 β-아미린을 보여주는 PNY1 단독으로 효모 추출물에 대한 이온 크로마토그램
(C) PNY1 및 CYP716A52v2의 모두 발현시키는 효모 추출물의 이온 크로마토그램
(D) 올레아놀릭산 및 에리스로디올 기준물의 이온 크로마토그램
도 4는 올레아놀릭산의 질량 분광분석기 스펙트럼결과
(A) PNY1 및 CYP716A52v2의 모두 발현시키는 호모세포에서 40.2 분의 보유시간(retention time)에서 올레아놀릭산
(B) PNY1 및 CYP716A52v2의 모두 발현시키는 호모세포에서 38.7 분의 보유시간에서 에리스로디올
(A) 및 (B)의 윗부분 스펙트럼은 원래의 올레아놀릭산 및 에리스로디올 기준물
도 5는 in vitro에서 CYP716A52v2를 발현시키는 효모 세포로부터 마이크로좀생성물의 GC-MS 크로마토그램
(A) β-아미린을 가지고 마이크로좀의 반응생성물에 대한 GC-MS 크로마토그램
(B) 올레아놀릭산 및 에리스로디올 기준물의 마이크로그램
(C) 순수한 올레아놀릭산의 패턴
도 6은 과발현 CYP716A52v2(A) 및 CYP716A52v2-RNAi(B)형질전환 인삼 뿌리에서 도입된 유전자들의 전사 확인
(A) 윗 패널 : 플라스미드의 T-DNA 부위의 도식화 도면
중간 패널: genomic RT-PCR에 의한 도입된 유전자들(HPT 및 CYP716A52v2)의 전사 확인. β-actin은 로딩 대조군.
하부 패널 : qRT-PCR에 근거하여 비 형질전환(Nt) 및 과발현 CYP716A52v2의 형질전환된 라인들(1-7)에서의 CYP716A52v2 전사
(B) 상부 패널 : 플라스미드의 T-DNA 부위를 도식화한 도면
중간 패널: genomic RT-PCR에 의한 도입된 유전자들(PPT 및 CYP716A52v2)의 전사 확인. β-actin은 로딩 대조군
하부 패널: qRT-PCR에 근거하여 비 형질전환(Nt) 및 CYP716A52v2-RNAi 의 형질전환된 라인들(1-7)에서의 CYP716A52v2 전사

진세노사이드들은 Panax 종들 뿌리의 주요한 구성성분이며 이들 식물의 생물학적 활성을 담당한다. 테트라사이클릭 다마렌계 및 펜타사이클릭 올레아난계 트리터펜 사포닐들은 주로 인삼 뿌리에서 생성되는 젠세노사이드들로 알려져 있다. 진세노사이드들의 합성경로는 도 1에서와 같다. 2,3-옥시도스쿠알렌(2,3-oxidosqualene)의 고리화는 다마렌계 및 올레아난계 트리터페노이드들 사이의 분기점(branch point)을 형성한다. 다마렌계 진세노사이드들의 생합성은 2,3-옥시도스쿠알렌(2,3-oxidosqualene)으로부터 다마레네디올-II(dammarenediol-II)로부터 다마레네디올 합성효소(dammmarenediol synthase)의 촉매에 의하여 시작된다(Han et al., 2006, Tansakul et al. 2006). 반면, 올레아난계 진세노사이드들은 2,3-옥시도스쿠알렌으로부터 β-아미린을 형성하는 P.ginseng β-아미린 합성효소(PNY1)에 의해 시작된다((Han et al. 2006, Tansakul et al. 2006). 이들 트리터페넨들은 Cyt P450(CYP) 효소들에 의한 수산화반과 추정상 연속적인 클리코실전환효소(glycosyltransferase)에 의한 클리코실화를 통하여 다양한 진세노아시드들로 전환된다(Choi et al. 2005, Shibuya et al. 2006). Panax 종들은 아글리콘(aglycon) 구조에 따라 크게 두그룹으로 분류된다. 그룹I종들은 다마렌계 사포닌을 함유하며 P. ginseng, P. quinquefolius, P. notoginseng 및 P. vietnamensis가 속하며, 그룹 II는 많은 양의 올레아놀릭산 사포닌을 함유하며 P. japonicus, P. zingiberensis 및 P. stipuleanatus가 속한다. P. ginseng에서 다마렌계 아글리콘들은 포로토파낙사디올(protopanaxadiol) 또는 프로토파낙사트리올(protopanaxatriol)로 구성된다. 최근에 CYP716A47이 다마레네디올-II로부터 프로토파낙사디올 트리터펜 아글리콘(protopanaxadiol triterpene aglycone)을 생성하는 다마레네디올 12-히드록실라제(dammarenediol 12-hydroxylase)이라는 것과 CYP716A53v2는 프로토파낙사디올로부터 프로토파낙사트리올 트리터펜 아글리콘을 생성하는 프로토파낙사디올-6-히드록실라제(protopanaxadiol 6-hydroxylase)이라는 것을 발표한 바 있다(Han et al. 2012). 그러나, 올레아난계 트리터펜 아글리콘 합성효소를 코딩하는 CYP 유전자는 아직 규명되지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 P. ginseng에서 분리된 CYP716A52v2에 의하여 코딩되는 단백질이 C-28 위치에서 β-아미린의 산화를 통하여 올레아놀릭산 생성에 작용한다는 것을 보고하고자 한다. 효모에서 CYP716A52v2의 이소성 발현은 PNY1의 동시발현(co-expression) 후 올레아놀릭산을 생성시킨다는 것을 확인하고 또한 CYP716A52v2 단백질의 in vitro반응에서는 β-아미린과 반응에 의하여 올레놀릭산을 생성한다는 것을 확인하였다. 더구나 형질전환 P. ginseng 뿌리에서 진세노사이드 Ro 생합성은 분명하게 CYP716Av2 과발현 및 RNA 간섭(RNA interference)에 의하여 분명하게 조절된다는 것을 확인하였다. 이들 결과는 CYP716A52v2가 β-아미린 28-옥시다제라는 것과 P. ginseng에서 올레아난계 진세노사이드 생합성에서 매우 중요한 단계를 촉매한다는 것을 보여주는 것이다.

따라서 본 발명은 CYP716A52v2 단백질 또는 이를 코딩하는 CYP716A52v2유전자를 포함하는 올레아난계 진세노사이드 생합성 촉진용 조성물을 제공할 수 있다. 상기 CYP716A52v2 단백질의 범위는 인삼으로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.

여기에서 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. 여기에서 "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 올레아난계 진세노사이드 생합성에 관여하는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명에 따른 상기 CYP716A52v2 유전자는 CYP716A52v2 단백질을 코딩하는 게놈 DNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자, 즉 CYP716A52v2의 cDNA는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 구성될 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 변이체는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

여기에서 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(gap)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 CYP716A52v2 유전자를 포함하는 재조합 벡터 또는 플라스미드를 포함하는 프로토파낙사트리올 생합성 촉진용 조성물을 제공할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 효모 발현 벡터 또는 재조합 식물 발현 벡터이다.

여기에서 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 것을 지칭하는 것이다. 상기 벡터로 형질전환된 재조합 세포는 상기 세포의 자연 형태에서는 발현되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 자연 상태의 세포에서 발현되는 유전자를 발현할 수 있으나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

여기에서 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭한다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용될 수 있다. "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

여기에서 RNA 간섭(RNA interfernce)은 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA와 이에 대한 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA로 구성되는 이중나선 RNA(double strand RNA, dsRNA)를 세포 등에 도입하여 표적 유전자 mRNA의 분해를 유도함으로써 단백질의 발현을 억제할 수 있는 현상이다. 특정 이중 나선 RNA를 주입하면 상응 유전자를 침묵시킬 수 있으며 수개의 분자만 주입해도 이러한 현상이 일어날 수 있다.

이중 나선 RNA는 단백질 절단효소(Dicer)에 의해 인식되어, 작은 이중 나선 절편들로 잘린다. 그런 다음, 이 단편들이 단백질 복합체 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합되는데, 이 복합체는 이중 나선 중 한 가닥을 풀어내버리고 작은 한 가닥 RNA(a tiny strip of RNA)를 가지는 복합체가 된다. 이 과정에서 단일 가닥들로 되며, 따라서 단일 가닥의 RNA로 출발될 때는 Dicer나 RISC를 활성화시키지 않기 때문에 그 같은 효과를 가지지 않는다. 이렇게 만들어진 복합체는 자연적으로 생성되는 mRNA에 결합하여 가닥들을 잘라내고 분해함으로써 그의 모 유전자(parent gene)를 침묵시킨다.

표적 유전자의 mRNA를 절단(cleavage)하여 RNA 저해 현상을 유도할 수 있는 이중사슬을 siRNA(short interfering RNA)라고 한다. siRNA는 표적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 80 염기, 바람직하게는 15 내지 60 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 40 염기이다. siRNA 말단 구조는 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 쪽이 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하고 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기, 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 표적유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서, 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다. siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환(transfection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-derived siRNA 발현 카세트 등을 세포 안으로 형질전환 또는 감염(infection) 시키는 방법이 있다.

이러한 RNAi를 이용한 유전자 녹-다운 방법은 간편하고 유전자의 발현 억제 효과가 우수하기 때문에, 최근에 각광받고 있는 방법이다. 상기 유전자의 발현을 억제하는 재조합 벡터로 RNAi 벡터가 바람직하나 이에 제한되지 않는다.

효모 발현 벡터는 프로모터 유전자, 해독개시 및 종결코돈이 제거된 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 터미네이터를 포함할 수 있으며, 프로모터 유전자는 GAPDH, PGK, ADH, PHO5, GAL1 및 GAL10으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

한편, 본 발명의 CYP716A52v2 유전자는 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 이것은 발현된 단백질의 배출(export)을 가능하게 한다. 여기에서 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 발현되는 이형 유전자의 5'에 직접적으로 결합되는 것이 바람직하다. 많은 진핵 세포 단백질의 분비 및 변형에 있어서, 폴리펩타이드를 분비 기구(secretion apparatus) 속으로 배출하기(steer) 위해서는 N-말단에 신호 서열을 가지는 단백질 서열과의 융합이 필요하다. 상기 벡터는 조합 효모 플라스미드(YIp : integrative yeast plasmid) 및 염색체외 플라스미드 벡터(extrachromosomal plasmid vector)가 모두 가능하다. 상기 염색체외 플라스미드 벡터는 에피솜 효모 플라스미드(YEp : episomal yeast plasmid), 복제 효모 플라스미드(YRp : replicative yeast plasmid) 및 효모 중심체 플라스미드(YCp : yeast centromer plasmid)로 나뉘어진다. 더 나아가, 인위적 효모 염색체들(YACs : artificial yeast chromosomes)도 본 발명에 따른 발현 벡터로서 가능하다.

또한, 특히 바람직한 효모 벡터는 복제 원점 ori 및 항생물질 저항성 카세트(antibiotic resistance cassette)를 함유하여 E. coli 에서 증식되고 선택될 수 있는 효모 복제 플라스미드(yeast replication plasmid)이다. 더 나아가, 이들은 H. polymorpha로부터의 HARS1과 같이 효모 세포에서 염색체와 관계없이 독립적 복제를 할 수 있는 ARS 서열, 그리고 URA3 또는 HLEU2와 같은 대사성 효모 선택 마커(metabolic yeast selection marker)를 가진다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0116718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0120516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다.

본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 식물 발현 벡터의 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적 (constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

상기 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 재조합 벡터 또는 플라스미드로 형질전환되어 프로토파낙사트리올 생합성이 가능한 숙주세포를 제공할 수 있다. 이에 제한되지는 않으나, 상기 숙주세포는 효모, 대장균일 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 CYP716A52v2 유전자를 포함하는 재조합 효모 벡터가 형질전환된 형질전환 효모를 제공할 수 있다. 바람직하게는, 상기 효모가 Pichia, Hansenula, Candida, Torulopsis, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces 및 Yarrowia 중에서 선택되는 속(genus)일 수 있다. 특히 바람직하게는, 상기 미생물이 Hansenula polymorpha, Saccharomyces Cervisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis 및 Yarrowia lipolytica 중에서 선택되는 종에 속하는 것일 수 있다.

효모의 형질전환은 핵산 분자 또는 벡터를 당업자에게 공지된 표준 방법, 바람직하게는 전기천공, 화학적 형질 전환, 원형질 융합에 의한 형질전환, 또는 입자 봄바드먼트 (bombardment)에 의해 세포내로 도입되게 할 수 있다(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Edited by: Fred M. Ausubel et al.;Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition), J. Sambrook and D. Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

또한, 본 발명은 본 발명의 CYP716A52v2 유전자를 포함하는 재조합 벡터 또는 플라스미드로 형질전환되어 프로토파낙사트리올 생합성이 가능한 형질전환 식물을 제공할 수 있다.

이에 제한되지는 않으나 상기 식물은 담배, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 바람직하게는 애기장대이다. 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다.

그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등 으로부터 적당하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EPA 120516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

따라서, 본 발명은 CYP716A52v2 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩된 CYP716A52v2 단백질의 발현을 증가시켜 올레아난계 진세노사이드 생산을 증가시키는 방법을 제공할 수 있다. 또한 상기 방법은 본 발명에 따른 상기 재조합 벡터 또는 플라스미드로 숙주를 형질전환시켜 CYP716A52v2 유전자 또는 단백질을 과발현시키는 단계를 포함하게 된다. 이에 제한되지는 않으나, 상기 숙주는 효모, 대장균, 식물, 특히 인삼 일 수 있다.

본 발명의 CYP716A52v2 유전자는 β-아미린에서 올레아놀릭산의 합성을 촉진시키므로, 상기와 같은 올레아난계 진세노사이드 생합성 촉진용 조성물 및 상기 조성물을 이용하여 올레아난계 진세노사이드이 과다 생성된 형질전환된 식물을 제공할 수 있으며, 올레아난계 진세노사이드 생산을 증가시키는 방법 또한 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> CYP 단백질 서열에서의 계통수 분석

전체 길이 cDNA 클론(CYP716A52v2, GenBank accession No. JX036032)은 in vitro에서 배양된 부정근 cDNA 라이브러리로부터 얻어진 ESTs의 전체 유전자 시퀸싱으로 얻었다(Han et al. 2011). Panax의 종들은 CYP716A 서브패밀리의 세가지 유형(CYP716A47, CYP716A52v2 및 CYP716A53v2)을 가진다. P.ginseng에서 CYP716A 서브패밀리 유전자들의 생성물의 기능은 β-아미린으로부터 올레아놀릭산의 생합성 및 다마렌계 트리터페노이드 생합성에 대한 산화효소 활성을 포함하는 것이다. 계통수 분석은 CYP716A52v2는 B. chinense CYP716A41, S. tuberosum CYP716A13 및 N. tabacum CYP716A36와 함께 클러스터 분석이 이루어졌다. 계통 관계를 분석하기 위하여, P. ginseng에서 세 개의 CYP716A 패밀리 유전자들을 포함한 아미노산 서열들은 EMBL, GenBank 및 DDBJ로부터 얻어졌다. 다중서열정렬(Multiple sequence alignments)는 ClustalX를 사용하여 생성되었으며(Thompson et al. 1997), 그리고 계통수는 molecular evolutionary genetics analysis (MEGA5)프로그램을 사용하여 도식화되었다(Tamura et al. 2011). 추론된 아미노산 정렬의 계통분석은 Poisson correction으로 Neighbor-Joining 방법을 사용하여 수행되었다. 1,000 복제물들로 부트스트랩분석(bootstrap analysis)은 계통수에서 노드(nodes)들의 강도를 평가하기 위하여 사용되었다(felsenstein 1985).

계통발생학적 분석(Phylogenetic analysis)에서는 Bupleurum chinese CYP716A41, Solanum tuberosum CYP716A13 및 Nicotiana tabacum CYP716A36와 함께 CYP716A52v2 쿨러스터들은 올레아난계 트리터페노이드 생합성과 관련있는 Medicago truncatula CYP716A12, Vitis vinifera CYP716A15 및 V. vinifera CYP716A17과 같은 다기능적 옥시다제(multifunctional oxidase)을 포함하는 하나의 클러스터에 밀접하게 관련되어 있다(Carelli et al. 2011, Fukushima et al. 2011). CYP716A52v2는 CYP716A12와 73% 상동성(identity)을 공유하고 CYP716A15 및 CYP716A17와 둘다 71% 상동성을 공유한다. M. truncatula CYP716A12는 C-28 위치에서 β-아미린 및 에리스로디올(erythrodiol) 산화를 촉매하여 올레아놀릭산을 생성하는 것이다(Carelli et al. 2011, Fukushima et al. 2011). CYP716A52v2는 M. truncatula CYP716A12와 73% 상동성을 보여주었으며, 이는 CYP716A52v2가 P. ginseng에서 올레아난계 진세노사이드들의 생합성에 참여할 수 있다는 가능성을 시사하는 것이다.

CYP716A52v2의 아미노산 서열은 P. ginseng CYP716A53v2(포로토파낙사트리올 합성효소)와 52% 상동성을 보여주며, P. ginseng CYP716A47(프로토파낙사디올 합성효소)와 44% 상동성을 보여주었다. 이는 CYP716A52v2는 CYP716A47 및 CYP716A53v2 심지어는 CYP716A 서브패밀리의 모든 유전자들과는 진화적으로 구별되는 유전자라는 것을 시사하는 것이다.

<실시예 2> 효모에서의 PNY1 및 CYP716A52v2 의 동시발현 및 GC-MS 분석

CYP716A52v2의 전체 길이 cDNA 클론은 1,779bp이며, 예상분자량 54.0kDa을 가지는 481 아미노산 단백질을 코드하는 1,446bp의 오픈 리딩프레임(ORF)을 가진다. 올레아난계 사포닌(일반적으로 진세노사이드 Ro)는 β-아미린으로부터 유래된 올레아놀릭산으로부터 합성되는 것으로 생각된다. PNY1 및 CYP716A52v2 모두 CYP716A52v2의 기능적으로 산화시키는 활성을 조사하기 위하여 효모에서 동시발현되었다. 두 개의 PNY1 및 CYP716A52v2 유전자들이 구성 프로모터(GAL1)의 조절하에 Arabidopsis thaliana NADPH-CYP 환원효소(reductase)를 발현시키는 WAT21 효모에서 동시 발현시켰다(Urban et al. 1997).

P.ginseng β-아미린 합성효소 유전자(PNY1, GenBank accession No. AB009030)에 대한 코딩부위 단편은 5말단에 제한효소 자리를 가지도록 한 프라이머(NotI-PNY1-Fw, 5'-GCGGCCGC ATG TGG AAG CTT AAG ATA GCG G-3' (서열번호 3) 및 PacI-PNY1-Rv, 5'-TTAATTAA TTA GGT GCC TAG GGA CGG TAAT-3'(서열번호 4))를 사용하여 PCR로 증폭되었고 pGEM-Teasy 벡터로 클론되었으며 서열분석되었다. ORF 단편은 Notl 및 Pacl을 사용하여 절단되었으며 pESC-URA 벡터에서 Notl 및 Pacl 자리에 삽입되었다(Stratagene). 유사하게, CYP716A52v2 유전자 (GenBank accession No. JX036032)의 코딩 부위단편은 증폭되고 프라이머 쌍 XhoI-CYP716A52v2 (5'-CTCGAG ATG GAA CTC TTC TAT GTC CCT CTC-3'(서열번호 5)) 및 KpnI-CYP716A52v2 (5'-GGTACC TTA GGC TTT GTG TGG AAA TAG GCG-3'(서열번호 6))을 사용하여 XhoIKpnI 단편으로 pGEM-TEasy 벡터로 서브클론되었다. 플라스미드 DNA는 XhoIKpnI 에 의하여 분해되었고 그후 β-아미린 유전자를 포함하는 pESC-URA 벡터의 XhoI 및 KpnI 부위로 연결되었다. 제조된 플라스미드는 각각 pESC-PNY1-CYP716A52v2-URA 및 pESC-PNY1-URA로 지정되었다.

구성 프로모터 GAL1의 조절하에 A. thaliana NADPH-CYP 환원효소를 발현하는 Saccharomyces cerevisiae strain WAT21 효모 세포들(Urban et al. 1997)은 Gietz et al. 1992에 기술된 바와 같이 변형된 리튬 아세테이트 과정을 사용하여 형질전환되었다. 형질전환된 세포는 SC-U(우라실이 부족한 SC 최소배지)를 사용하여 선별되고, 성장 3일 후 YPG 배지에서 계대배양되었다. 배양조건, 갈락토오스 도입의 방법 및 트리터펜 모노알콜 단편의 제조는 Han et al. 2011에 기술된바 있다. 하루동안 갈락토오스 도입후 세포들은 5분동안 500 X g 원심분리하여 세포를 분리하여 5분 동안 20% KOH/50% EtOH의 2ml로 환류시켰다. 같은 양의 헥산으로 추출하고, 1분 동안 보텍싱(vortexing) 후 30분 동안 초음파(70% 강도; Sharp Co.), 상등액(에틸 아세테이트 상층)이 원심분리로 얻어졌다. 완전히 건조된 후 30분 동안 80℃에서 NO-bis (trimethylsilylamide)(Sigma-Aldrich Co.) 50㎕로 트리메틸실릴레이트화되었다. 헥산추출물은 GC-MS로 분석되었다.

헥산 추출물은 증발된후 에틸 아세테이트(1 ml)에 용해되었다. 용액의 10㎕표본은 HP-5MS capillary column (30m0.25 mm, film thickness 0.25 mm)갖추고 Triple-Axis detector를 가진 불활성 MSD 시스템(Agilent 5975C)에 연결된 가스 크로마토그래프(Agilent 7890A)를 사용하여 분석되었다. 주입온도는 250℃였으며 컬럼 온도 프로그램은 다음과 같다; 5분 동안 150℃, 분당 5℃의 속도로 증가시켜 300℃까지 증가하며 20분 동안 300℃로 유지하였다. 캐리어 가스는 헬림을 사용하였으며 유동속도는 분당 1.2ml를 유지하였다. 접속 온도(interface temperature)는 분열주입(split injection)(10:1)으로 300℃로 이루어졌다. 이온화 챔버의 온도는 250℃였으며 이온화는 70eV에서 전기자극으로 수행되었다. 피크들은 보유시간(retention time)을 고유 기준물(authentic standards)들의 보유시간들과 비교함으로써 확인되었다. GC-MS 분석을 위한 기준물로는 Sigma-Aldrich Co.에서 구입된 β-아미린, 에리스로디올 및 올레아놀릭산이 사용되었다.

가스 크로마토그래피-질량 분광분석법(GC-MS)로부터 전체적인 이온 크로마토그래피 분석결과는 효모에서 PNY1 및 CYP716A52v2의 동시발현이 분명하게 보유시간(retention time)에서 38.7 및 40.2 분의 두 개의 피크들을 만든다는 것을 보여주었으며(도 3C), 이 피크들은 에리스로디올(erythrodiol)및 올레아놀릭산의 보유시간(retention time)들과 각각 동일한 시간이었다(도 3D). 이들 두 개 시그널들은 두 개의 빈 벡터를 가지는 대조군 효소에서는 감지되지 않았다.(도 3A). PNY1 단독에서는 36.45 분에서 β-아미린에 대한 피크를 만들었다(도 3B). 38.7 및 40.2 분에서 두 개의 신호들은 GC-MS를 사용하여 추가로 분석되었다(도 4). 40.2분에서 그 신호의 질량 분광분석법 분열 패턴(fragmentation pattern)은 원래 올레아놀릭산의 패턴과 동일한 것으로 확인되었다(도 4A). 38.7분에서의 신호의 질량 분광분석법 분열 패턴은 에리스로디올 기준에 대한 패턴과 동일하였다(도 4B). 이들 결과는 Fukushima et al.(2011)에서 제시된 것처럼 에리스로디올 및 올레아놀릭산 알데히드를 거쳐 β-아미린을 올레아놀릭산으로 전환시키는 β-아미린 28-옥시다제라는 것을 시사한다.

<실시예 3> In vitro 효소활성 어세이 및 GC-MS 분석

CYP716A52v2의 cDNA들은 분리하기 위하여 사용된 프라이머들은 5'-ATG GAA CTC TTC TAT GTC CCT CT-3'(서열번호 7) 및 5'-TTA GGC TTT GTG TGG AAA TAG GC-3'(서열번호 8)이다. 클론된 pYES2.1/V5-His-TOPO 벡터는 Escherichia coli로 형질전환되었다. ORF들은 그 후 센스가닥(sense) 기원으로 GAL1 프로모터로 연결되었으며 삽입된 뉴클레오타이드 서열은 시퀸싱에 의하여 확인되었다. CYP716A52v2발현 벡터 및 빈 벡터는 WAT21를 형질전환시키기 위하여 사용되었다.

CYP716A52v2를 발현하는 효모세포들로부터 단백질의 추출은 조금 변형된 방법으로 Olsen et al.(2010)에 따라 수행되었다. 마이크로좀 분획물은 60분 동안 100,000 X g에서 초원심분리에 의하여 수집되었다. CYP716A52v2의 효소활성은 1mM NADPH 및 20㎍ 기질 및 1mg의 마이크로좀 분획 단백질을 함유하는 100mM 인산칼륨(potassium phosphate) 완충제(pH 7.4)의 500㎕의 전체 양에서 테스트되었다. CYP716A52v2을 발현시키는 WAT21 효모로부터 마이크로솜 분획(microsomal fraction)들은 30에서 2시간동안 NADPH의 존재하에 β-아미린과 함께 배양되었다. 같은 양의 헥산으로 두 번 추출되었다. 상등액(에틸 아세테이트 상층)은 원심분리 후 수집되었으며 완전히 건조된 후 30분 동안 80에서 NO-bis (trimethylsilylamide)(Sigma-Aldrich Co.)의 50㎕로 트리메틸실릴레이트화되었다. 헥산추출물은 GC-MS로 분석되었다.

반응혼합물의 GC-MS 분석은 CYP716A52v2은 β-아미린(36.45분의 보유시간)을 새로운 생성물(40.2분의 보유시간)로 변환시킨다는 것으로 보여주었으며(도 5, 라인 a), 이것은 순수한 올레아놀릭산 기준과 같은 것이었다(도 5B). β-아미린과 함께 CYP716A52v2를 발현시키는 효모의 가열된 효소 제조에서는 전혀 활성을 보이지 않았으며(도 5, 라인 b), 또한 빈 벡터로 형질전환된 효모에서도 전혀 활성을 보이지 않았다(도 5, 라인 c). 질량 분광분석법 분열패턴의 결과도 또한 분명하게 CYP716A52v2이 β-아미린의 올레아놀릭산으로의 전환을 촉매한다는 것을 증명하였다(도 5C).

<실시예 4> 과발현과 RNAi 사일런싱(silencing) 벡터의 구축

CYP716A52v2 과발현 벡터를 구축하기 위하여, ORF 부위는 pCR 8.0 vector (Invitrogen)로 클론된 후 destination 벡터인 pH2WG로 전달되었다. CYP716A52v2-RNAi벡터를 구축하기 위하여, Gateway adaptors (Invitrogen Life Technologies)를 포함한 두 개의 프라이머들이 CYP716A52v2의 1,259 bp부터 1,498 bp까지의 부위를 증폭시키기 위하여 디자인되었다. 증폭된 PCR 생성물은 pSB1 벡터로 클론되었으며 그후 E. coli DH5a에 있는 RNAi destination 벡터인 pB7GWIWG2(II)(이 벡터는 식물에 대하여 Basta 저항성을 보이는 BAR 유전자를 포함한다)로 전달되었다. 구축물은 시퀀싱되었고 연속적으로 표준적인 분자생물학 기술을 사용하여 플라스미드 pM90을 함유하는 A. tumefaciens GV3101 세포들로 전달되었다.

<실시예 5> 형질전환 P. ginseng 의 구축

P. ginseng의 유전적 형질전환은 Choi et al. (2011)에 기술된 방법으로 수행되었다. 과발현 CYP716A52v2 및 CYP716A52v2-RNAi 모두의 형질전환된 것으로 가정되는 체세포배(somatic embryo)는 배아 발아(germination)를 유도하기 위하여 추가 보충물인 20μM GA3와 함께 동일한 선별배지로 옮겨졌다. 묘목(plantlets)들은 2% sucrose 함유 1/2-strength Murashige and Skoog (MS)배지에서 유지되었다.

각 형질전환된 라인들로부터 충분한 물질을 확인하기 위하여 0.27% Gelrite로 응고되고 NH4NO3가 부족하면서 3.0mgL^-1 indole-3-butyric acid(IBA)와 3%(w/v) 수크로오스를 함유한 1/2 MS 배지에 배양한 후 각 형질전환식물의 뿌리 세절부(segments)로부터 부정근(adventitious root)의 성장을 유도하였다. 비형질전환 대조군으로 형질전환 식물들의 원래 상태(original sources)에 있는 in vitro에서 유지된 비형질전환 식물들로부터 부정근이 유도되었다. 부정근은 모세포 이식(maternal explants)로부터 분리되었으며 초기 뿌리 발아시와 같은 조성의 배지에서 계대배양되었다. 디쉬들은 22±1℃의 어두운 장소에서 5주 동안 배양되었다.

<실시예 6> 형질전환 뿌리의 RT-PCR

비형질전환 및 형질전환 뿌리에서 분리된 전체적인 RNA들은 ImProm-II Reverse Transcription System (Promega)를 사용하여 역전사되었다. 첫 가닥 cDNA는 RT-PCR의 주형(template)로 사용되었으며 이후에는 96℃에서 5분 동안; 30초동안 96℃, 30초 동안 60℃, 1분 동안 72℃에서 30사이클; 10분 동안 72℃에서 마지막 연장(extension)과정으로 수행되었다. β-actin cDNA 프라이머로는 5'-CGT GAT CTT ACA GAT AGC TTC ATG A-3'(서열번호 9) 및 5'-AGA GAA GCT AAG ATT GAT CCT CC-3'(서열번호 10)가 RNA 완전성(integrity) 및 로딩 정확성을 위하여 대조군으로 사용되었다.

RT-PCR 분석은 두 번 반복되었으며 그 결과는 도6의 A 및 B에 보여주었다. P. ginseng CYP716A52v2의 증폭을 위하여 사용된 프라이머들은 5'-ATG GAA CTC TTC TAT GTC CCT CT-3'(서열번호 7) 및 5'-TTA GGC TTT GTG TGG AAA TAG GC-3'(서열번호 8)이다. hygromycin phosphotransferase gene (HPT)에 대하여는 5'-GCG TGA CCT ATT GCA TCT CC-3'(서열번호 11) 및 5'-TTC TAC ACA GCC ATC GGT CC-3'(서열번호 12)가 사용되었으며, phosphinothricin acetyl transferase gene (BAR)에 대하여는 5'-AGG ACA GAG CCA CAA ACA CC-3'(서열번호 13) 및 5'-ATG CTT GTA TCC AGC TGC G-3'(서열번호 14) 가 사용되었다.

<실시예 7> 형질전환 뿌리의 qRT-PCR

Quantitative RT-PCR(qRT-PCR)은 Qiagen Rotor Gene Q Real-time PCR detector system(Qiagen, Hilden, Germany)를 가지고 SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Valencia, CA) 사용하여 수행되었다. 모든 qRT-PCR의 사이클링 파라미터는 5분 동안 95℃이었고 그 후 10초동안 60℃, 5초 동안 95℃에서 35 사이클로 정해졌다. 적어도 세 복제물로부터 보여준 qRT-PCR 데이터는 평균 상대적인 양들(average relative quantities)±SE이다. 각 유전자에 대한 상대적인 발현값은 △△Ct method (Livak and Schmittgen 2001)를 사용하여 계산되었다. P. ginseng β-actin 유전자는 표준화(normalization)을 위하여 사용되었다. P. ginseng CYP716A52v2 의 증폭을 위하여 사용된 프라이머들은 5'-CCT TCA TCA ACC CAA ACC TCT TCG AAA-3'(서열번호 15) 및 5'-AAC CGG ATT CAA AGT GAT TTG CAG CGA-3'(서열번호 16)이며, P. ginseng β-actin 의 증폭을 위하여 사용된 프라이머들은 5'-ATG GTC AAG GCT GGA TTT GCA-3'(서열번호 17) 및 5'-GAG CCT CAT ATC CAA CAT ATG C-3'(서열번호 18)이다.

상기 실시예 6 및 7의 과발현 CYP716A52v2(A) 및 CYP716A52v2-RNAi(B)형질전환 인삼 뿌리에서의 RT-PCR 및 qRT-PCR의 결과는 도6에 나타내었다.

도 6의 (A) 윗 패널은 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터(cauliflower mosaic virus 35S promoter) 조절하에 CYP716A52v2 유전자 과발현을 위한 플라스미드의 T-DNA 부위의 도식화 도면이다. T35S, CaMV 35S terminator; HPT, hygromycin phosphotransferase 유전자. T-DNA에서 RB은 오른쪽 경계선을 나타내는 것이며, LB는 왼쪽 경계선을 나타내는 것이다.

중간 패널은 genomic RT-PCR에 의한 도입된 유전자들(HPT 및 CYP716A52v2)의 전사 확인을 보여주는 것이다. β-actin은 로딩 대조군으로 사용되었다.

하부 패널은 qRT-PCR에 근거하여 비 형질전환(Nt) 및 과발현 CYP716A52v2의 형질전환된 라인들(1-7)에서 의 CYP716A52v2 전사를 보여준다.

데이터는 세가지 개별적인 식물들에서 얻어진 표준 오차(standard error)들의 평균값이다. 별표는 비-형질전환된 식물과 형질전환된 식물사이의 유의적인 차이를 나타낸다(Student's t-test P≤0.05).

(B) 상부 패널은 CaMV35S 프로모터의 조절하에 CYP71652v2 유전자의 RNA 인터퍼런스를 위하여 플라스미드의 T-DNA 부위를 도식화한 도면이다. BAR, phosphinothricin acetyl transferase

중간 패널은 genomic RT-PCR에 의한 도입된 유전자들(PPT 및 CYP716A52v2)의 전사 확인을 보여준다. β-actin은 로딩 대조군으로 사용되었다.

하부 패널은 qRT-PCR에 근거하여 비 형질전환(Nt) 및 CYP716A52v2-RNAi 의 형질전환된 라인들(1-7)에서의 CYP716A52v2 전사를 보여준다.

데이터는 세가지 개별적인 식물들에서 얻어진 표준 오차(standard error)들의 평균값이다. 별표는 비-형질전환된 식물과 형질전환된 식물사이의 유의적인 차이를 나타낸다(Student's t-test P≤0.05).

과발현 라인들과 RNAi라인들의 모든 형질전환 라인들은 모두 선별 마커유전자들, 과발현에서는 hygromycin phosphotrasferase유전자(HPT)이며, RNAi에서는 phosphinothricin acetyl trasferase 유전자(BAR)의 전사를 보여주었다(도 6A,B). 과발현 라인들에서 RT-PCR 및 qRT-PCR 분석은 CYP716A52v2의 전사수준은 비형질전환된 뿌리에 비하여 6개 과발현 라인들에서 증가하였다(도 6A). 그리고 모든 CYP716A52v2-RNAi라인들에서는 비형질전환된 뿌리에 비하여 분명하게 감소하였다(도 6B).

<실시예 8> HPLC에 의한 진세노사이드 분석

진세노사이드들은 Samukawa et al. (1995)에 기재된 방법에 따라 추출되었다. 간단히는 동결건조된 뿌리들로부터 제분된 가루 1g을 60℃에서 80% MeOH에 담지된다. 증발 후 잔여물은 H₂O에 용해되고 두 번 세척된 후 H₂O-포화 n-부탄올로 추출된다. 부탄올층은 사포닌 부분을 얻기 위하여 증발된다. 각 샘플은 EtOH에 용해되고 SepPak C-18 Cartridge (Waters, USA)로 여과된다. HPLC 분리는 Cosmosil C18 column (5μm, 4.6 X 250 mm; Agilent, USA)를 사용하여 수행되었다. 진세노사이드들의 분리는 아세토니트릴(acetonitrile)과 용출액으로 0.05M KH₂PO₄를 사용하여 얻어졌다. 물과 아세토니트릴의 시간 및 비율은 Han et al., (2012)에 기재된 프로토콜을 따랐다. 이동상의 속도는 1.0 ml/min이었으며, 202nm 파장에서 진세노사이드들이 모니터링되었다. 각 진세노사이드들은 ChromaDex Inc (CA, USA)에서 구입한 진세노사이드들의 샘플들과 비교되었다.

그 결과는 도7에 나타내었으며 도7은 비-형질전환 및 형질전환 인삼뿌리 라인들에서 진세노사이드들의 HPLC 분석결과를 보여준 것으로, A는 과발현 CYP716A52v2 형질전환된 라인들의 뿌리에서 진세노사이드 Ro 함량을 보여주며, B는 CYP716A52v2-RNAi의 뿌리에서의 진세노사이드 Ro의 함량을 보여준다. Nt는 비-형질전환 뿌리를 의미한다. 분석 실험은 세 번 반복하여 수행되었다. 별표는 비-형질전환된 식물과 형질전환된 식물사이의 유의적인 차이를 나타낸다(Student's t-test P≤0.05). C는 과발현 CYP716A52v2 형질전환된 P. ginseng(라인 4) 뿌리에서 추출물의 HPLC 크로마토그램이며, D는 CYP716A52v2-RNAi로 형질전환된(라인 3) 뿌리 추출물의 HPLC 크로마토그램이며, F는 원래(authentic) 진세노사이드들의 HPLC 크로마토그램을 나타내는 것이다.

HPLC분석한 결과 상기 언급된 6개 과발현 라인들에서 진세노사이드 Ro의 함량은 비형질전환 라인들에 비하여 크게 증가하였지만, 형질전환 라인 1에서는 전사가 증가하지 않았다(도 7A). 모든 RNAi 라인들에서 진세노사이드 Ro의 함량은 크게 감소하였다(도 7B). 크로마토그램 프로파일에서는 다른 다마렌계 진세노사이드(Rg1, Re, Rf, Rc, Rd, Rb1 및 Rb2)의 발현수준은 비형질전환 뿌리에서는 변화하지 않는 반면에, 유일하게 Ro의 함량만이 변한다는 것을 보여주었다(도 7C 및 D). P. ginseng에서 CYP716A52v2의 과발현은 약학적으로 중요한 진세노사이드 Ro의 생산을 증가시킨다는 점에서 매우 유용하다.

과발현 및 RNAi의 유전적 형질전환은 유전자의 기능을 확인하기 위한 유용한 도구이다. 우리는 CYP716A52v2로 과발현시키거나 간섭에 의하여 형질전환된 P. ginseng 뿌리를 구축하였으며 과발현 형질전환 식물에서 명확한 진세노사이드 Ro의 함량이 증가되었다는 것을 확인하였다. 반면, RNAi 형질전환 식물에서는 Ro의 함량은 분명하게 감소하였다. 그러나, 다른 다마렌계 진세노사이드들의 함량은 대조군에 비교하였을 때 유사하였다. 이들 결과는 CYP716A52v2는 단지 올레아난계 진세노사이드 생합성 단계에만 관여한다는 것을 보여주는 것이다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 속하는 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> KANGWON UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for Promoting Biosysthesis of Oleanane-Type Ginsenoside <130> PN1407-189 <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1779 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Panax ginseng cytochrome P450 CYP716A52v2 mRNA <400> 1 ttatcttcag tcccaaaaat caaacatttc ttgtatttgt cccctaacta cctagaaagc 60 aaaagggcgc catcaagaaa tggaactctt ctatgtccct ctcctctcac tctttgttct 120 cttcatctct ttatcattcc acttcctctt ctacaagtcc aaacccagct cctccggcgg 180 gtttcctctc ccgccgggca agactgggtg gcccattatt ggagagagct acgagtttct 240 ctccacggga tggaaaggct acccggagaa gttcatattt gaccgtatga ccaagtactc 300 ctcaaatgtc tttaaaacct ctattttcgg agagcccgcc gcagtattct gcggcgcggc 360 ttgtaacaag ttcttgttct cgaacgagaa taagcttgtt caggcctggt ggcctgactc 420 cgtgaacaaa gtttttcctt catcaaccca aacctcttcg aaagaagagg cgattaagat 480 gcgaaaaatg ctgccaaact tctttaaacc ggaggctttg cagcgctaca tcggcctcat 540 ggaccaaatc gctgcaaatc actttgaatc cggttgggaa aataaaaacg 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1440 tattcctgat gagaaaattg ttgttaatcc catgccaatt cctgccaacg gacttcctgt 1500 tcgcctattt ccacacaaag cctaagatta tgacttaatt aaatgtttaa tttcaaacta 1560 ttttaattaa tttacttata ctttatgtat aaacgttgaa ctagtaattg cttggccaat 1620 ttgttagata ctactactat gcggtaataa tgacaattac taaagattat gttactgttt 1680 gactcacttg agatcatttt catccctagt tagatctcgt attggacggt gagagatgtc 1740 tttgttaaaa tagtattcat agtaactatt tgctatgta 1779 <210> 2 <211> 481 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Panax ginseng cytochrome P450 CYP716A52v2 <400> 2 Met Glu Leu Phe Tyr Val Pro Leu Leu Ser Leu Phe Val Leu Phe Ile 1 5 10 15 Ser Leu Ser Phe His Phe Leu Phe Tyr Lys Ser Lys Pro Ser Ser Ser 20 25 30 Gly Gly Phe Pro Leu Pro Pro Gly Lys Thr Gly Trp Pro Ile Ile Gly 35 40 45 Glu Ser Tyr Glu Phe Leu Ser Thr Gly Trp Lys Gly Tyr Pro Glu Lys 50 55 60 Phe Ile Phe Asp Arg Met Thr Lys Tyr Ser Ser Asn Val Phe Lys Thr 65 70 75 80 Ser Ile Phe Gly Glu Pro Ala Ala Val Phe Cys Gly Ala Ala Cys Asn 85 90 95 Lys Phe Leu Phe Ser Asn Glu Asn Lys Leu Val Gln Ala Trp Trp Pro 100 105 110 Asp Ser Val Asn Lys Val Phe Pro Ser Ser Thr Gln Thr Ser Ser Lys 115 120 125 Glu Glu Ala Ile Lys Met Arg Lys Met Leu Pro Asn Phe Phe Lys Pro 130 135 140 Glu Ala Leu Gln Arg Tyr Ile Gly Leu Met Asp Gln Ile Ala Ala Asn 145 150 155 160 His Phe Glu Ser Gly Trp Glu Asn Lys Asn Glu Val Val Val Phe Pro 165 170 175 Leu Ala Lys Ser Tyr Thr Phe Trp Ile Ala Cys Lys Val Phe Val Ser 180 185 190 Val Glu Glu Pro Ala Gln Val Ala Glu Leu Leu Glu Pro Phe Ser Ala 195 200 205 Ile Ala Ser Gly Ile Ile Ser Val Pro Ile Asp Leu Pro Gly Thr Pro 210 215 220 Phe Asn Ser Ala Ile Lys Ser Ser Lys Ile Val Arg Arg Lys Leu Val 225 230 235 240 Gly Ile Ile Lys Gln Arg Lys Ile Asp Leu Gly Glu Gly Lys Ala Ser 245 250 255 Ala Thr Gln Asp Ile Leu Ser His Met Leu Leu Thr Ser Asp Glu Ser 260 265 270 Gly Lys Phe Met Gly Glu Gly Asp Ile Ala Asp Lys Ile Leu Gly Leu 275 280 285 Leu Ile Gly Gly His Asp Thr Ala Ser Ser Ala Cys Thr Phe Val Val 290 295 300 Lys Phe Leu Ala Glu Leu Pro Gln Ile Tyr Glu Gly Val Tyr Gln Glu 305 310 315 320 Gln Met Glu Ile Val Lys Ser Lys Lys Ala Gly Glu Leu Leu Lys Trp 325 330 335 Glu Asp Ile Gln Lys Met Lys Tyr Ser Trp Asn Val Ala Cys Glu Val 340 345 350 Leu Arg Leu Ala Pro Pro Leu Gln Gly Ala Phe Arg Glu Ala Leu Ser 355 360 365 Asp Phe Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Ile Pro Lys Gly Trp Lys Leu Tyr 370 375 380 Trp Ser Ala Asn Ser Thr His Ile Asn Ser Glu Val Phe Pro Glu Pro 385 390 395 400 Leu Lys Phe Asp Pro Ser Arg Phe Asp Gly Ala Gly Pro Pro Pro Phe 405 410 415 Ser Phe Val Pro Phe Gly Gly Gly Pro Arg Met Cys Pro Gly Lys Glu 420 425 430 Tyr Ala Arg Leu Glu Ile Leu Val Phe Met His His Leu Val Lys Arg 435 440 445 Phe Lys Trp Glu Lys Val Ile Pro Asp Glu Lys Ile Val Val Asn Pro 450 455 460 Met Pro Ile Pro Ala Asn Gly Leu Pro Val Arg Leu Phe Pro His Lys 465 470 475 480 Ala <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNY1 forward primer <400> 3 gcggccgcat gtggaagctt aagatagcgg 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNY1 backward primer <400> 4 ttaattaatt aggtgcctag ggacggtaat 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP716A52v2 forward primer <400> 5 ctcgagatgg aactcttcta tgtccctctc 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP716A52v2 backward primer <400> 6 ggtaccttag gctttgtgtg gaaataggcg 30 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP716A52v2 forward primer <400> 7 atggaactct tctatgtccc tct 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP716A52v2 backward primer <400> 8 ttaggctttg tgtggaaata ggc 23 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward primer <400> 9 cgtgatctta cagatagctt catga 25 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin backward primer <400> 10 agagaagcta agattgatcc tcc 23 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hygromycin phosphotransferase forward primer <400> 11 gcgtgaccta ttgcatctcc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hygromycin phosphotransferase backward primer <400> 12 ttctacacag ccatcggtcc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phosphinothricin acetyl transferase forward primer <400> 13 aggacagagc cacaaacacc 20 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phosphinothricin acetyl transferase backward primer <400> 14 atgcttgtat ccagctgcg 19 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP716A52v2 forward primer <400> 15 ccttcatcaa cccaaacctc ttcgaaa 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP716A52v2 backward primer <400> 16 aaccggattc aaagtgattt gcagcga 27 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward primer <400> 17 atggtcaagg ctggatttgc a 21 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin backward primer <400> 18 gagcctcata tccaacatat gc 22

Claims (11)

1. CYP716A52v2 단백질 또는 이를 코딩하는 CYP716A52v2 유전자를 포함하는 올레아난계 진세노사이드 생합성 촉진용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 CYP716A52v2 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 올레아난계 진세노사이드 생합성 촉진용 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 CYP716A52v2 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 올레아난계 진세노사이드 생합성 촉진용 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 CYP716A52v2 유전자를 포함하는 재조합 벡터 또는 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 올레아난계 진세노사이드 생합성 촉진용 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 CYP716A52v2 단백질은 β-아미린 28-옥시다제(β-amyrin 28-oxidase)인 것을 특징으로 하는 올레아난계 진세노사이드 생합성 촉진용 조성물.
6. 제4항의 재조합 벡터 또는 플라스미드로 형질전환된 숙주세포.
7. 제6항에 있어서,
   상기 숙주세포는 효모 또는 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주 세포.
8. 제4항의 재조합 벡터 또는 플라스미드로 형질전환된 형질전환 식물.
9. 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 CYP716A52v2 단백질 또는 이를 코딩하는 CYP716A52v2 유전자의 발현을 증가시켜 올레아난계 진세노사이드 생산을 증가시키는 방법.
10. 제9항에 있어서,
    상기 방법은 제4항의 재조합 벡터 또는 플라스미드로 숙주를 형질전환시켜 CYP716A52v2 유전자 또는 단백질을 과발현시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 올레아난계 진세노사이드 생산을 증가시키는 방법.
11. 제10항에 있어서,
    상기 숙주는 효모, 대장균 또는 식물인 것을 특징으로 하는 올레아난계 진세노사이드 생산을 증가시키는 방법.

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