CN110343678A

CN110343678A - 一种珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因及在制备人参皂苷Ro上的应用

Info

Publication number: CN110343678A
Application number: CN201910508188.3A
Authority: CN
Inventors: 杨生超; 唐军荣; 张广辉; 陈庚; 林�源; 闫静; 李莹
Original assignee: Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Agricultural University
Priority date: 2019-06-12
Filing date: 2019-06-12
Publication date: 2019-10-18
Anticipated expiration: 2039-06-12
Also published as: CN110343678B

Abstract

本发明公开了一种珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因及在制备人参皂苷Ro上的应用，珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。以竹节参皂苷IVa和糖基供体UDP‑葡萄糖为原料，在由珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因编码得到的珠子参糖基转移酶的催化下，在竹节参皂苷IVa的C3位上的葡萄糖醛酸基团上再一次糖基化，生成人参皂苷Ro。本发明中人参皂苷Ro的生物合成调控基因UGTPjm1，是首次鉴定并成功验证。通过体外合成人参皂苷Ro，管理更加方便，可控性强，可以减少对原料种植的需求，节约农业用地，生产产物单一，便于后期人参皂苷Ro的分离和纯化。珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因作为人参皂苷Ro生物合成的关键基因，还可用于珠子参等植物育种研究。

Description

一种珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因及在制备人参皂苷Ro上的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因及在制备人参皂苷Ro上的应用。

背景技术

珠子参(Panax japonicus var.major)为五加科(Araliaceae)人参属(Panax)药用植物，以根状茎入药。目前已从珠子参的根状茎中分离鉴定出多种三萜皂苷，其含量以齐墩果酸型皂苷为主。

齐墩果酸型皂苷，是植物界中广泛存在的一种五环三萜皂苷，具有多种显著的药理活性，如在抗肿瘤、降血糖、保肝活性等方面比游离的苷元齐墩果酸更为明显。人参皂苷Ro属齐墩果酸型皂苷，在珠子参根状茎中含量较高。人参皂苷Ro具有抗炎、调节免疫、保护心血管系统、抗病毒、保肝、护胃、抗肥胖、美容等多种药理作用，例如，人参皂苷Ro是藤珠胃康颗粒制剂、糖智宁胶囊等中药的重要活性成分。

人参皂苷Ro主要分布于珠子参、珠节参、姜状三七等人参属植物中，而这些植物对栽培环境要求较为苛刻，生长周期长，且产量低；此外，还具有提取工艺流程较为复杂、分离得率低等不足，使得人参皂苷Ro的产量低，导致市场价格高。如何有效获得大量高纯度的人参皂苷Ro，满足科学试验及市场应用需求，一直都是大家关注的焦点。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因，可作为人参皂苷Ro的生物合成调控基因。

本发明的技术方案为：一种珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因，所述珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了一种上述的珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因的编码蛋白。

作为优选，所述编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种含有上述的珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因的重组质粒。

作为优选，所述重组质粒通过将上述的珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因与pET28a载体同源重组获得，命名为pET28a-UGTPjm1。

本发明还提供了一种转基因工程菌，含有上所述的重组质粒，或，所述基因工程菌的基因组中整合有外源的上述的珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因。

作为优选，所述转基因工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

本发明还提供了一种上述的珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因在制备人参皂苷Ro上的应用。

本发明还提供了一种人参皂苷Ro的制备方法，包括：

以竹节参皂苷IVa和糖基供体UDP-葡萄糖为原料，在由上述的珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因编码得到的珠子参糖基转移酶的催化下，在竹节参皂苷IVa的C3位上的葡萄糖醛酸基团上再一次糖基化，生成人参皂苷Ro。

本发明通过异源表达与体外催化的方式来获得目标产物，采用体外生物合成，进行定向生产，具有得率高、副产物少等诸多优点。测序技术的快速发展，极大地推进了三萜皂苷生物合成路径关键酶基因的挖掘，开辟了一种生产稀有人参皂苷的新方法。

本发明还提供了一种克隆上述的珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因的引物，所述引物的序列为：

F：SEQ ID NO：3；

R：SEQ ID NO：4。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)本发明首次克隆并验证了形成人参皂苷Ro的珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因的功能，人参皂苷Ro的生物合成调控基因UGTPjm1，是首次鉴定并成功验证。

(2)通过体外合成人参皂苷Ro，管理更加方便，可控性强。

(3)本发明可以减少对原料种植的需求，节约农业用地。

(4)本发明生产产物单一，便于后期人参皂苷Ro的分离和纯化。

(5)本发明中珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因作为人参皂苷Ro生物合成的关键基因，可用于珠子参等植物育种研究。

(6)本发明还提供了含有该UGTPjm1基因的重组质粒、基因工程菌和重组蛋白，为通过生物工程方法大量合成人参皂苷Ro，进一步开展齐墩果酸型皂苷生物合成调控研究奠定基础。

附图说明

图1为人参皂苷Ro生物合成路径示意图(其中虚线圆圈处是指葡萄糖苷所连接位置)。

图2为质粒pet28a-UGTPjm1的图谱(用于表达糖基转移酶UGTPjm1)。

图3为珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因酶促反应的HPLC图谱(A为UGTPjm1+竹节参皂苷IVa+UDP-葡萄糖；B为对照+竹节参皂苷IVa+UDP-葡萄糖；C为标准品)。

图4为酶活性验证反应产物的质谱分析(LC/MS)(其中，A为总离子流图；B为底物竹节参皂苷IVa的保留时间；C为反应产物的保留时间)。

图5为标准品人参皂苷Ro的质谱分析(LC/MS)(其中，A为总离子流图；B为标准品Ro的保留时间)。

图6为反应产物的碎离子图(LC/MS)。

图7为标准品人参皂苷Ro的碎离子图(LC/MS)。

具体实施方式

实施例1

UGT候选基因UGTPjm1的挖掘及体外验证

以珠子参的膨大根状茎、细长茎为材料，分别取样后送广州基迪奥生物科技有限公司进行转录组测序。首先，根据转录组数据的注释结果，筛选出全部候选的糖基转移酶136个。其次，结合已知功能的糖基转移酶基因，包括马铃薯StSGT、喀西茄SaGT4A、大豆UGT73P2、甘草GuUGAT等的特点。然后再结合人参皂苷Ro在珠子参根状茎中的含量分布特点，以及基因表达量进行综合分析，初步筛选出12个可能的候选基因。对候选基因经过克隆、同源重组、原核表达、体外酶促反应、高效液相检测及LC/MC鉴定等一系列工作后，最终鉴定出可以与竹节参皂苷IVa的C3位上的葡萄糖醛酸基团进行催化反应(图1)，生成稀有人参皂苷Ro的目标候选基因UGTPjm1，序列为SEQ ID NO：1。

通过UGTPjm1催化竹节参皂苷Iva的C3位上的葡萄糖醛酸基团生成稀有人参皂苷Ro，此过程中所有试剂或仪器未详细标注生产厂家的，均为正常市场购买所能获得。各阶段的具体操作如下：

(1)cDNA模板的制备

以珠子参根状茎为材料，取鲜样，液氮速冻后，进行RNA提取。RNA提取采用Magen(美基生物)的HiPure Plant RNA Mini Kit试剂盒，按试剂盒的操作步骤提取获得RNA，经检测合格后，使用TAKARA反转录试剂盒，根据其说明书，将RNA反转录成cDNA，-80℃保存备用。

(2)目标基因的克隆

基于珠子参根状茎的转录组数据，获得候选基因UGTPjm1的核酸序列，同时结合基因UGTPjm1在大肠杆菌pET28a中的插入位置，使用CE Design软件设计带同源壁的引物。所用带同源壁的引物信息如下：

F：SEQ ID NO：3

R：SEQ ID NO：4

采用高保真KOD酶进行UGTPjm1基因克隆，克隆后的基因采用EasyPureQuick GelExtraction Kit试剂盒进行回收。

(3)同源重组

采用KOD酶对大肠杆菌pET28a进行线性化，基因回收使用EasyPure Quick GelExtraction Kit试剂盒。同源重组时，采用Gibson assembly(NEB)进行组装，将重组表达质粒转化到宿主菌株E.coli BL21(DE3)感受态细胞。组装完毕后，进行涂板，所用平板为添加了含卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养箱内暗培养12-15小时。之后挑选平板上的单菌落，进行菌水PCR扩增、跑胶等，检测为阳性克隆后，送测序公司检测，作进一步最终确认。组装成功后进行保种，得到珠子参糖基转移酶的重组表达菌株(图2)。

(4)蛋白表达及纯化

取重组表达菌株进行大摇，待OD值在0.6-0.8之间时，加入0.1mM的IPTG，混匀后在16℃摇床中进行培养，转速为220转/分，诱导12小时；之后在4℃，5000转的条件下，进行离心收菌。采用Tris-Hcl缓冲液对离心后菌体进行充分重悬，重悬结束后采用细胞破碎仪进行破碎；对破碎菌液在4℃条件下进行高速离心，留上清；采用镍柱(Ni NTA beads)对上清进行纯化，纯化结束后采用Millipore超滤管进行浓缩。

(5)酶活性验证

体外验证的酶促反应体系(表1)，进行糖基转移酶实验

表1

组分	用量(微升)	备注
			Phosphate buffer	50	pH 8.0
吐温-20	2	/
			竹节参皂苷IVa	8	10mM
UDP-Glc	4	100mM
			纯化蛋白	36	/
总体系	100	/

在35℃温度条件下培养反应12小时，之后用100微升正丁醇终止反应。

(6)产物检测

对反应后的产物采用正丁醇进行萃取，真空干燥后，再用甲醇溶解，对产物分别进行HPLC、LC/MS检测。

HPLC检测方法如下：

液相色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱子(250mm×4.6mm，5.0μm)。流动相为：0.2％磷酸溶液(A)和乙腈(B).梯度洗脱程序如下：0～22min，95％A～35％A；22～24min，35％A～30％A；24～28min 30％A。流速1.0mL/min。柱温30℃。进样量10μL。高效液相检测结果见(图3)，在对照组中没有产物的出现，而在添加了糖基转移酶UGTPjm1蛋白的反应产物中，在15.351分钟出现了产物，并与标准品人参皂苷Ro的出峰时间基本对应。

LC/MS检测方法如下：

为了进一步确认所得到的产物为人参皂苷Ro，采用Agilent Q-TOF 6540液相色谱质谱联用仪(LC/MS)进行检测，检测方法如下：

质谱条件：离子源采用的是负离子模式，电压3500V；碎裂电压:175V；锥孔电压:65V；射频电压:750V，扫描范围：50-1700m/z。

色谱条件：使用的柱子是Agilent ZORBAX SB-C18柱子(250mm×4.6mm，5.0μm)，流速1ml/min。流动相是0.1％甲酸(A)和乙腈(B)，梯度是0分钟A：B＝95：5，22分钟是A：B＝35：65，24分钟是A：B＝30：70，28分钟是A：B＝30：70。

由检测结果图4～图7，可以看出，产物的出峰时间、及特征碎离子均与标准品人参皂苷Ro相吻合，确认反应产物为人参皂苷Ro。最终得出糖基转移酶UGTPjm1具有催化竹节参皂苷IVa的C3位上的葡萄糖醛酸基团上再一次糖基化的能力，生成稀有人参皂苷Ro。

序列表

<110> 云南农业大学

<120> 一种珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因及在制备人参皂苷Ro上的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1482

<212> DNA

<213> 珠子参(Rhizoma Panacis Majoris)

<400> 1

atggcaactg aagatcctaa actccacgtt ctcatcctac cctacctcac cccaagccac 60

atgatgccat tggtagaaat tggtaggcta atcgccgccc gtggcgttaa catcactata 120

atagccaccc cacacaacgc taacctcttt cgatcctccg tcgatcaaga catcaattcc 180

ggccaccaga tctccatcca cgagctcaag ttcccttccg cagaagttgg cttgccggaa 240

ggaattgaga acttgagcgc catcacatca accgacatgt ccgccaaggt ctttgaggga 300

ataatgcgcc tccgaaaacc catggaagat ttgatccgca atctctctcc ggactgcatc 360

ttttccgaca tgttttatcc ttggacagtt gagcttgccg aggaacttaa gattccgagg 420

ctcatgtttt atccatcgag ctttttctat tactgcctat cgcatagttt gaaactttat 480

gcgcctcatg atcagaaggt gcagtccaat acagagagtt tcttgatccc tcatctccca 540

gacactatag agatgaaaag gagtcaatta caagatcacg ttaaggggaa atcaaggctt 600

ggagtgttca tggatgcaat caaagattcg gagcttaaaa cctatggtat agttcatatg 660

actttctacg aacttgagcc tgcttatgca gatcattaca taaaaataaa gccagcgaaa 720

ttctggggca ttctcccttt gtttcagttc ttcaagggat taaaagctcc gaggtcaaat 780

gattcgcagc acaactgtct gagttggctg gatactcaaa agcccaactc tgttgttctt 840

ttaagttttg gaagtctagt gagatttcct gatgctcaac tcactgagat tgctttagct 900

ctagaagctt ctacccattc attcatttgg gtggtgagga agagtgaggc aagtcgagaa 960

aaccaagagg aaagttggct gccagccggt tttgaagaaa gaatgatgga aggtaacaag 1020

ggtatgatgg tcagaggttg ggctcctcag gtgaagatct tagctcaccc ggcaactgga 1080

gcgtttatga ctcactgcgg ctggaactca gtgctagaag cggttgcagc cggtgtgccc 1140

ctcatcacat ggccattatt tgcggagcag ttctacaatg agaaggctat taatgaggtc 1200

ctaaagattg gagtaggagt tggggcggag gtgtggaatc caacgtttga gatcacttgt 1260

ccgccggtgg ggagagataa gatagagaag gcattatcca aattgatggg tggttcggag 1320

gaatctcaga agatcagaca gaaagcaaag gaaatggcag ccatggctga aggggctgtt 1380

gcggtaggtg ggtcgtctta taataatatt acggctctga tcgaagagtt gaaagcttgt 1440

gcttttgaga aatcaaaaaa tggatatata atttgtaaat aa 1482

<210> 2

<211> 493

<212> PRT

<213> 珠子参(Rhizoma Panacis Majoris)

<400> 2

Met Ala Thr Glu Asp Pro Lys Leu His Val Leu Ile Leu Pro Tyr Leu

1 5 10 15

Thr Pro Ser His Met Met Pro Leu Val Glu Ile Gly Arg Leu Ile Ala

20 25 30

Ala Arg Gly Val Asn Ile Thr Ile Ile Ala Thr Pro His Asn Ala Asn

35 40 45

Leu Phe Arg Ser Ser Val Asp Gln Asp Ile Asn Ser Gly His Gln Ile

50 55 60

Ser Ile His Glu Leu Lys Phe Pro Ser Ala Glu Val Gly Leu Pro Glu

65 70 75 80

Gly Ile Glu Asn Leu Ser Ala Ile Thr Ser Thr Asp Met Ser Ala Lys

85 90 95

Val Phe Glu Gly Ile Met Arg Leu Arg Lys Pro Met Glu Asp Leu Ile

100 105 110

Arg Asn Leu Ser Pro Asp Cys Ile Phe Ser Asp Met Phe Tyr Pro Trp

115 120 125

Thr Val Glu Leu Ala Glu Glu Leu Lys Ile Pro Arg Leu Met Phe Tyr

130 135 140

Pro Ser Ser Phe Phe Tyr Tyr Cys Leu Ser His Ser Leu Lys Leu Tyr

145 150 155 160

Ala Pro His Asp Gln Lys Val Gln Ser Asn Thr Glu Ser Phe Leu Ile

165 170 175

Pro His Leu Pro Asp Thr Ile Glu Met Lys Arg Ser Gln Leu Gln Asp

180 185 190

His Val Lys Gly Lys Ser Arg Leu Gly Val Phe Met Asp Ala Ile Lys

195 200 205

Asp Ser Glu Leu Lys Thr Tyr Gly Ile Val His Met Thr Phe Tyr Glu

210 215 220

Leu Glu Pro Ala Tyr Ala Asp His Tyr Ile Lys Ile Lys Pro Ala Lys

225 230 235 240

Phe Trp Gly Ile Leu Pro Leu Phe Gln Phe Phe Lys Gly Leu Lys Ala

245 250 255

Pro Arg Ser Asn Asp Ser Gln His Asn Cys Leu Ser Trp Leu Asp Thr

260 265 270

Gln Lys Pro Asn Ser Val Val Leu Leu Ser Phe Gly Ser Leu Val Arg

275 280 285

Phe Pro Asp Ala Gln Leu Thr Glu Ile Ala Leu Ala Leu Glu Ala Ser

290 295 300

Thr His Ser Phe Ile Trp Val Val Arg Lys Ser Glu Ala Ser Arg Glu

305 310 315 320

Asn Gln Glu Glu Ser Trp Leu Pro Ala Gly Phe Glu Glu Arg Met Met

325 330 335

Glu Gly Asn Lys Gly Met Met Val Arg Gly Trp Ala Pro Gln Val Lys

340 345 350

Ile Leu Ala His Pro Ala Thr Gly Ala Phe Met Thr His Cys Gly Trp

355 360 365

Asn Ser Val Leu Glu Ala Val Ala Ala Gly Val Pro Leu Ile Thr Trp

370 375 380

Pro Leu Phe Ala Glu Gln Phe Tyr Asn Glu Lys Ala Ile Asn Glu Val

385 390 395 400

Leu Lys Ile Gly Val Gly Val Gly Ala Glu Val Trp Asn Pro Thr Phe

405 410 415

Glu Ile Thr Cys Pro Pro Val Gly Arg Asp Lys Ile Glu Lys Ala Leu

420 425 430

Ser Lys Leu Met Gly Gly Ser Glu Glu Ser Gln Lys Ile Arg Gln Lys

435 440 445

Ala Lys Glu Met Ala Ala Met Ala Glu Gly Ala Val Ala Val Gly Gly

450 455 460

Ser Ser Tyr Asn Asn Ile Thr Ala Leu Ile Glu Glu Leu Lys Ala Cys

465 470 475 480

Ala Phe Glu Lys Ser Lys Asn Gly Tyr Ile Ile Cys Lys

485 490

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成序列(unknow)

<400> 3

tggtgccgcg cggcagccat atggcaactg aagatcctaa actcc 45

<210> 4

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工合成序列(unknow)

<400> 4

tggtggtggt ggtgctcgat tatttacaaa ttatatatcc attttttgat tt 52

Claims

1.一种珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因，其特征在于，所述珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

2.一种权利要求1所述的珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因的编码蛋白。

3.如权利要求2所述的珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因的编码蛋白，其特征在于，所述编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。

4.一种含有如权利要求1所述的珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因的重组质粒。

5.如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒通过将如权利要求1所述的珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因与pET28a载体同源重组获得，命名为pET28a-UGTPjm1。

6.一种转基因工程菌，其特征在于，含有如权利要求4或5所述的重组质粒，或，所述基因工程菌的基因组中整合有外源的如权利要求1所述的珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因。

7.如权利要求6所述的转基因工程菌，其特征在于，所述转基因工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

8.一种如权利要求1所述的珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因在制备人参皂苷Ro上的应用。

9.一种人参皂苷Ro的制备方法，其特征在于，包括：

以竹节参皂苷IVa和糖基供体UDP-葡萄糖为原料，在由权利要求1所述的珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因编码得到的珠子参糖基转移酶的催化下，在竹节参皂苷IVa的C3位上的葡萄糖醛酸基团上再一次糖基化，生成人参皂苷Ro。

10.一种克隆如权利要求1所述的珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因的引物，其特征在于，所述引物的序列为：

F：SEQ ID NO：3；

R：SEQ ID NO：4。