CN105087739A - 一种新的制备稀有人参皂苷的催化体系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备稀有人参皂苷的共催化反应体系。具体地，所述的共催化反应体系包括：(a)糖基转移酶(glycosyltransferase？GT)；(b)蔗糖合酶(sucrose？synthase？SUS)；(c)核苷二磷酸(UDP)；和(d)蔗糖。实验发现，由糖基转移酶和蔗糖合酶构成的酶组合，在蔗糖和少量UDP存在的条件下，能够替代体外反应体系合成稀有人参皂苷的昂贵原料之一UDP-糖，高效、经济地将原人参二醇或原人参三醇等底物转化为稀有人参皂苷，其中，UDP的价格仅约为UDP-糖的1/4，且其用量也为原先的1％，从而很大程度上地节省了稀有人参皂苷的制备成本，更有利于人参皂苷的大规模商业制备。

Description

一种新的制备稀有人参皂苷的催化体系及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物生物学领域；更具体地，本发明涉及糖基转移酶和蔗糖合酶的共催化反应体系及其应用。

背景技术

糖基化修饰是许多天然产物合成的重要步骤，糖基组成影响天然产物的理化性质，稳定性和选择性，因而对其生理活性具有重要作用。此外，糖基化修饰还大大增加了天然产物的多样性，许多天然产物具有相同的苷元结构，但是通过不同的糖基化修饰可以衍生出多种多样的具有不同生物活性的糖苷化合物。天然产物的糖基化修饰研究在合成生物学，新药开发等领域具有重要前景。

自然界中，糖基化修饰通过糖基转移酶(glycosyltransferaseGT)(EC2.4.1.X)完成，根据CAZy数据库GT可以划分为94个家族，一般来说催化小分子化合物糖基化的GT都属于GT1家族，这是CAZy数据库中最大的一个糖基转移酶家族。GT的功能是把活化的糖基供体上的糖基转到糖基受体的羟基或者羧基上(也可能是巯基或者氨基)。GT催化的糖基化反应所能利用的糖基供体是核苷二磷酸-糖，例如尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖、UDP-半乳糖，和UDP-葡萄糖醛酸等。利用GT对天然产物进行特异性糖基化修饰一方面可以合成某些重要糖苷类化合物，另一方面可以对药物进行改造提高其药效或者用于开发新药。例如ThorsonJS研究组研究人员通过体外/体内糖基化修饰改造万古霉素，获得了一系列具有更高抗菌活性的万古霉素糖苷化合物，这些新的化合物可作为更好的抗菌新药(Naturebiotechnology2003；21:1467-1469)。

人参皂苷是从人参及其同属植物(如三七、西洋参等)中分离到的皂苷的总称，是人参中的主要有效成份。人参皂苷为三萜类化合物，是由四环三萜型苷元(原人参二醇或原人参三醇)或五环三萜型苷元(齐墩果酸)经不同的糖基化修饰的衍生物。稀有人参皂苷的糖修饰程度一般都比较低(只含有1-2个糖基)，而丰富皂苷的糖基化修饰程度较高(含有由各个糖基组成的糖链)。所以传统的生产稀有人参皂苷的方法是以人参或者三七总皂苷或者丰富皂苷为原料，通过化学水解法、酶水解法和微生物发酵水解法来生产稀有人参皂苷。化学水解法由于反应条件剧烈，难于控制，专一性差，副产物多，近年来已经很少使用。酶水解和微生物发酵水解都是基于糖苷酶作用水解人参皂苷糖基，虽然相比于化学方法，其专一性提高，但是对于人参皂苷C3，C6，C20糖链水解特异性并不是很高，水解程度也需要控制，水解产物可能为多种皂苷的混合物。

此外，在体外利用GT催化小分子化合物糖基化修饰所面临的最主要问题是GT所能利用的糖基供体为核苷二磷酸(UDP)-糖，而这类化合物通常没有商业化，某些有商业化的化合物如UDP-葡萄糖，价格又非常昂贵(1g约需4000RMB)。这一点极大的限制了利用GT合成糖苷的应用。

因此，本领域迫切需要开发一种能够经济、高效合成稀有人参皂苷的产业化反应体系制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用糖基转移酶与蔗糖合酶的体外共催化反应体系制备多种稀有人参皂苷的方法及其应用，特别是高效低成本的人参皂苷CompoundK、人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rh1和人参皂苷F1的体外反应制备方法。

在本发明的第一方面，提供了一种制备稀有人参皂苷的共催化反应体系，所述的共催化反应体系包括：

(a)糖基转移酶(glycosyltransferaseGT)；

(b)蔗糖合酶(sucrosesynthaseSUS)；

(c)核苷二磷酸(UDP)；和

(d)蔗糖。

在另一优选例中，所述的糖基转移酶可以为一个或多个。

在另一优选例中，所述的蔗糖合酶可以为一个或多个。

在另一优选例中，所述的共催化反应体系还包括：

(e)任选的人参的次生代谢产物，较佳地，为原人参二醇或原人参三醇。

在另一优选例中，所述的共催化反应体系不含添加的UDP-葡萄糖。

在另一优选例中，所述(a)-(d)中的1个、2个、3个、或4个可为独立未混合形式或任意组合的混合形式。

在另一优选例中，所述的共催化反应体系含有两种糖基转移酶和一种蔗糖合酶。

在另一优选例中，所述的糖基转移酶来源于人参、三七、西洋参、苜蓿；和/或

所述的蔗糖合酶来源于马铃薯、拟南芥、甘薯、木薯、或大豆，较佳地，为马铃薯、大豆。

在另一优选例中，所述的糖基转移酶来源于人参。

在另一优选例中，所述的蔗糖合酶来源于马铃薯。

在另一优选例中，所述的原人参二醇的结构式如式I所示。

在另一优选例中，所述的原人参三醇的结构式如式II所示。

在另一优选例中，所述糖基转移酶和蔗糖合酶的比例为1-5：0.5-2(wt)；和/或

所述UDP:蔗糖的比例为1-10:10(wt)。

在另一优选例中，所述的UDP浓度为0.05-0.5mM；和/或所述的蔗糖浓度为300-500mM。

在另一优选例中，所述的糖基转移酶包括一种或多种选自SEQIDNO.:31-35所示的多肽；和/或

所述的蔗糖合酶选自SEQIDNO.:36-38的多肽。

在另一优选例中，所述的稀有人参皂苷包括人参皂苷compoundK、人参皂苷Rh2、人参皂苷F1、人参皂苷Rh1和人参皂苷Rg3。

本发明第二方面，提供了一种酶组合或其编码基因的用途，用于制备产生稀有人参皂苷的(i)试剂；(ii)本发明第一方面所述的共催化反应体系；(iii)工程菌株，其中，所述的酶组合由糖基转移酶和蔗糖合酶构成，

本发明第三方面，提供了一种分离的多核苷酸组合，所述的多核苷酸组合中的多核苷酸分别编码(i)人参来源的糖基转移酶，和(ii)蔗糖合酶。

在另一优选例中，所述的多核苷酸如SEQIDNO.:1-6，和SEQIDNO.:39-40所示，其中，SEQIDNO.:1-6所示的序列分别编码SEQIDNO.:31-36所示的蛋白，SEQIDNO.:39-40所示的序列分别编码SEQIDNO.:37-38所示的蛋白。

在另一优选例中，所示的多核苷酸组合用于制备生产稀有人参皂苷的工程菌株或试剂盒。

本发明第四方面，提供了一种载体，所述的载体用于表达(i)人参来源的糖基转移酶，和/或(ii)蔗糖合酶；

其中，所述的载体含有本发明第三方面所述的多核苷酸组合，和/或

所述的载体分别含有本发明第三方面所述多核苷酸组合中的一种或多种多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体分别含有SEQIDNO.:1-6，39-40所示的核苷酸序列。

本发明第五方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第四方面所述的载体，或所述的宿主细胞的染色体整合有本发明第三方面所述的多核苷酸组合。

本发明第六方面，提供了本发明第一方面所述的共催化反应体系的用途，用于催化原人参二醇或原人参三醇转化为稀有人参皂苷。

本发明第七方面，提供了一种制备稀有人参皂苷的方法，在本发明第一方面所述共催化反应体系的存在下，将原人参二醇或原人参三醇转化为稀有人参皂苷；或

本发明第一方面中(a)、(b)、(c)、和(d)的共同存在下，将原人参二醇或原人参三醇转化为稀有人参皂苷。

在另一优选例中，所述的(a)、(b)存在于发酵体系中，和/或所述的(a)、(b)以固定化酶形式存在。

本发明第七方面，提供了一种制备人参稀有皂苷的方法，所述的方法包括如下反应：

当X为原人参二醇；Y为原人参二醇型皂苷，例如人参皂苷CK，Rh2，Rg3；

当X为原人参三醇；Y为原人参三醇型皂苷，例如人参皂苷F1，Rh1，Rg1；

其中，X：UDP＝1:0.05-5，较佳地，为1:0.5-2；

X：蔗糖＝1：600-1000，较佳地，为1：800：900。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1、A-F分别为六对引物SEQIDNO:7/8、SEQIDNO:9/10、SEQIDNO:10/11、SEQIDNO:12/13、SEQIDNO:14/15和SEQIDNO:16/17的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图2A1-A5为大肠杆菌中表达UGTPg1、UGTPg5、UGTPg29、UGTPg50和BC10的SDS-PAGE和westernbolt图(左SDS-PAGE，右westernbolt，第1泳道上清，第2泳道沉淀，第1泳道总蛋白)；图2B为蔗糖合酶SUS1在酿酒酵母中表达SDS-PAGE(左：第1泳道marker，第2泳道SUS1粗酶液，第3泳道SUS初步纯化酶液)和westernbolt(右)图。

图3、蔗糖合酶SUS1与糖基转移酶UGTPg1联合催化原人参二醇薄层层析检测结果(A)和HPLC结果(B)。

图4、蔗糖合酶SUS1与糖基转移酶UGTPg1联合催化原人参三醇薄层层析检测结果(A)和HPLC结果(B)。

图5、蔗糖合酶SUS1与糖基转移酶UGTPg5联合催化原人参三醇薄层层析检测结果(A)和HPLC结果(B)。

图6、蔗糖合酶SUS1与糖基转移酶UGTPg50联合催化原人参二醇薄层层析检测结果(A)和HPLC结果(B)。

图7、蔗糖合酶SUS1与糖基转移酶UGTPg50和UGTPg29化原人参二醇薄层层析检测结果(A)和HPLC结果(B)。

图8、蔗糖合酶SUS1与糖基转移酶BC10催化原人参二醇薄层层析检测结果。(A)和HPLC结果(B)。

图9、蔗糖合酶AtSUS/GmSUS与糖基转移酶UGTPg1催化原人参三醇的TLC和HPLC结果；图9A和B分别为AtSUS/GmSUS。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现了，由糖基转移酶和蔗糖合酶构成的酶组合，在蔗糖和少量UDP存在的条件下，能够取代现有技术中水解去糖基的稀有人参皂苷，并替代体外反应体系合成稀有人参皂苷的昂贵原料之一UDP-糖，高效、经济地将原人参二醇或原人参三醇等底物转化为稀有人参皂苷，其中，UDP的价格仅约为UDP-糖的1/4，且其用量也为原先的1％，从而很大程度上地节省了稀有人参皂苷的制备成本，更有利于人参皂苷的大规模商业制备。此外，实验还进一步证明，多种植物来源的糖基转移酶和蔗糖合酶均能够产生该有益效果。在此基础上，完成了本发明。

糖基转移酶(GT)

自然界中，糖基化修饰通过糖基转移酶(glycosyltransferaseGT)(EC2.4.1.X)完成，根据CAZy数据库GT可以划分为94个家族，一般来说催化小分子化合物糖基化的GT都属于GT1家族，这是CAZy数据库中最大的一个糖基转移酶家族。GT的功能是把活化的糖基供体上的糖基转到糖基受体的羟基或者羧基上(也可能是巯基或者氨基)。GT催化的糖基化反应所能利用的糖基供体是核苷二磷酸-糖，例如尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖、UDP-半乳糖，和UDP-葡萄糖醛酸等。利用GT对天然产物进行特异性糖基化修饰一方面可以合成某些重要糖苷类化合物，另一方面可以对药物进行改造提高其药效或者用于开发新药。例如ThorsonJS研究组研究人员通过体外/体内糖基化修饰改造万古霉素，获得了一系列具有更高抗菌活性的万古霉素糖苷化合物，这些新的化合物可作为更好的抗菌新药(Naturebiotechnology2003；21:1467-1469)。

可用于本发明的糖基转移酶没有特别限制，可以为各种植物来源的具有利用糖基供体将其糖基转移到底物的羟基或羧基等基团上合成糖苷类化合物功能的糖基转移酶。例如，本发明糖基转移酶可对植物的小分子代谢产物进行糖基化进行修饰，优选地，所述的小分子代谢产物可以是原人参二醇、原人参三醇或其衍生的人参皂苷。

优选地，可用于本发明的糖基转移酶的例子有如SEQIDNO.:31-35(分别为糖基转移酶UGTPg1、UGTPg5、UGTPg29、UGTPg50、BC10)任一所示的序列。

蔗糖合酶(SUS)

蔗糖合酶(sucrosesynthaseSUS)(EC2.4.1.13)是植物中糖类代谢的关键酶，植物光合作用产生的糖通常以淀粉的形式储存，SUS在这个过程中发挥关键作用，SUS通过催化一分子UDP-葡萄糖和一分子果糖合成一分子蔗糖和一分子UDP，继而合成淀粉。

可用于本发明的蔗糖合酶没有特别限制，可以为各种来源于植物的、具有催化蔗糖原位合成UDP-葡萄糖功能的蔗糖合酶。通常，可采用来源于马铃薯、拟南芥、甘薯、木薯、大豆的蔗糖合酶，较佳地，为来源于马铃薯的蔗糖合酶。

不同植物来源的蔗糖合酶的同源性一般在80％左右，较佳地为90％以上。

一种优选的可用于本发明的蔗糖合酶为马铃薯蔗糖合酶SUS1，拟南芥蔗糖合酶AtSUS1，大豆蔗糖合酶GmSuSy，其蛋白序列分别如SEQIDNO.:36-38所示，其编码的核苷酸序列分别如SEQIDNO.:6、39-40所示。

酶组合或其编码序列

如本文所用，术语“本发明酶或其组合”、“本发明多肽”均泛指糖基转移酶、蔗糖合酶或其酶组合，通常用来指本发明酶组合中的任意一种或多种。

如本文所用，术语“酶组合”、“组合酶”、“糖基转移酶和蔗糖合酶的组合”可以互换使用，均指将糖基转移酶和蔗糖合酶联合使用，并用于制备产生稀有人参皂苷的(i)试剂；(ii)本发明所述的共催化反应体系；(iii)工程菌株。应理解，该术语不仅包括了选自SEQIDNO.:31-35的糖基转移酶和选自SEQIDNO.:36-38的蔗糖合酶，还包括了所述糖基转移酶和蔗糖合酶的衍生多肽，此外，所述糖基转移酶还包括：

(a1)将SEQIDNO:31-35氨基酸序列经过一个或几个(如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有糖基转移酶活性的由(a)衍生的多肽；或

(b1)与SEQIDNO:31-35氨基酸序列有至少85％(较佳地至少90％；更佳地至少95％)序列相同性，且具有糖基转移酶活性的由(a)衍生的多肽。

此外，所述的衍生多肽还包括将SEQIDNO.:31-35或(a1)或(b1)的序列添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。

所述蔗糖合酶还包括：

(a2)将SEQIDNO:36-38氨基酸序列经过一个或几个(如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有糖基转移酶活性的由(a)衍生的多肽；或

(b2)与SEQIDNO:36-38氨基酸序列有至少85％(较佳地至少90％；更佳地至少95％)序列相同性，且具有糖基转移酶活性的由(a)衍生的多肽。

此外，所述的衍生多肽还包括将SEQIDNO.:36-38或(a2)或(b2)的序列添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。

在本发明中，酶组合中的糖基转移酶或蔗糖合酶分别可以为一个或多个。优选地，可采用糖基转移酶UGTPg50和UGTPg29与蔗糖合酶SUS1进行组合，用于联合催化生成稀有人参皂苷。

在本发明的酶组合中，糖基转移酶和蔗糖合酶的使用比例没有特殊限制，可根据所需要生成的产物的种类和量来进行决定，通常，可用于本发明制备稀有人参皂苷的糖基转移酶和蔗糖合酶的比例符合下式：

比例为1-5：0.5-2(wt)；优选地，为2-3:1。

可通过本领域常规技术手段对糖基转移酶、蔗糖合酶或其组合进行制备。

具有活性的糖基转移酶、蔗糖合酶或其组合可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括所述多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述多肽相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明酶组合的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟酶与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

所述的多肽优选序列为SEQIDNOs.:31-38所示的多肽，该术语还包括具有与所示多肽具有相同功能的、SEQIDNOs.:SEQIDNOs.:31-38所示序列的变异形式及衍生多肽。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人EGFRvA蛋白的活性片段和活性衍生物。本发明还提供所述多肽的类似物。这些类似物与天然人EGFRvA多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在所述糖基转移酶、蔗糖合酶或其酶组合的氨基酸氨基末端添加上信号肽序列，如pelB信号肽等。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟酶的编码区序列可以与SEQIDNO.:1-6，或SEQIDNO.:39-40所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQIDNOs.:31-38任一所示序列代表的蛋白质，但与SEQIDNO.:1-6，或SEQIDNO.:39-40所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQIDNOs.:31-38的成熟酶的多核苷酸包括：只编码成熟酶的编码序列；成熟酶的编码序列和各种附加编码序列；成熟酶的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码酶或其组合的多核苷酸”可以是包括编码此酶或酶组合的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQIDNOs.:31-38所示的成熟酶有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码本发明酶或其酶组合的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

编码本发明酶或其组合的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明酶或其组合的编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的本发明酶或其组合。一般来说有以下步骤：

(1).用编码本发明酶或其组合的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，编码本发明酶或其组合的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明酶或其组合的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组酶可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

此外本发明的酶组合还可以以固定化酶的形式用于制备稀有人参皂苷。

共催化反应体系

糖基转移酶与蔗糖合酶的体外共催化反应体系中，糖基转移酶与蔗糖合酶可以分别在不同的宿主细胞中表达，再将表达产物进行混合调配，也可以是在同一宿主细胞中共表达，直接利用共表达产物。

本发明的共催化反应体系指的是含有将以下组分进行独立包装或混合后的催化-反应体系：

(a)糖基转移酶(glycosyltransferaseGT)；

(b)蔗糖合酶(sucrosesynthase，SUS)；

(c)核苷二磷酸(UDP)；和

(d)蔗糖。

此外，本发明共催化反应体系可以通过后添加其他反应底物已完成稀有人参皂苷的反应，当然，本发明共催化反应体系也可直接混入(e)任选的人参的次生代谢产物，较佳地，为原人参二醇或原人参三醇。

在本发明的共催化反应体系中，比例为1-5：0.5-2(wt)，优选为2-3:1；和/或

所述UDP:蔗糖的比例为1-10:10(wt)。

在另一优选例中，所述的UDP浓度为0.05-0.5mM；和/或所述的蔗糖浓度为300-500mM。

本发明的共催化反应体系催化如下的反应：

当X为原人参二醇；Y为原人参二醇型皂苷，例如人参皂苷CK，Rh2，Rg3；

当X为原人参三醇；Y为原人参三醇型皂苷，例如人参皂苷F1，Rh1，Rg1；

其中，X：UDP＝1:0.05-5，较佳地，为1:0.5-1；

X：蔗糖＝1：600-1000，较佳地，为1：1000。

人参皂苷

人参皂苷是从人参及其同属植物(如三七、西洋参等)中分离到的皂苷的总称，属于三萜类皂苷，是人参中的主要有效成份。目前，已经从人参中分离出了至少60种皂苷，其中一些人参皂苷被证实具有广泛的生理功能和药用价值：包括抗肿瘤、免疫调节、抗疲劳、护心、护肝等功能。

从结构上来看，人参皂苷是皂苷元经过糖基化后形成的生物活性小分子。人参皂苷的皂苷元只有有限的几种，主要是达玛烷型的原人参二醇和原人参三醇，以及齐墩果烷型的香树脂。人参皂苷之间结构上的差异主要体现在皂苷元不同的糖基化修饰上。

可用于本发明的人参皂苷元即可以是从植物如人参、三七和西洋参等中提取的(中国专利：CN1569882A，2005年)，也可以是利用人工构建的基因工程酵母生产的(中国专利：CN102925376A，2013年)。

人参皂苷CompoundK(20-O-β(D-glucopyranosyl)-20(S)–protopanaxa-diol)属于原人参二醇型的皂苷，在皂苷元的C-20位羟基上连有一个葡萄糖基。人参皂苷CompoundK(CK)在人参中尚没有检测到，它是原人参二醇型皂苷在人体肠道中被微生物水解后产生的主要代谢产物。研究表明，多数原人参二醇型皂苷只有被代谢为CK后才能被人体吸收，所以人参皂苷CK是直接被体内吸收和发挥作用的真正实体，而许多皂苷只是药物前体。人参皂苷CK可以诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞转移。它与放疗和化疗结合试验，可以增强放疗和化疗的效果。除此之外，人参皂苷CK还有具有抗过敏活性，抗炎活性，并且可以起到神经保护作用，抗糖尿病作用和抗皮肤衰老作用。

人参皂苷Rh2(3-O-β-(D-glucopyranosyl)-20(S)-protopanaxadiol)和人参皂苷Rg3(3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)-D-glucopyranosyl]-20(S)–protopanaxadiol)也属于原人参二醇类的皂苷，人参皂苷Rh2在皂苷元的C3位羟基上连有一个葡萄糖基,人参皂苷Rg3在皂苷元的C3位羟基上连有两个葡萄糖基。人参皂苷Rh2和Rg3在人参中含量极低，属于稀有人参皂苷。人参皂苷Rh2具有良好的抗肿瘤活性，是人参中最主要的抗肿瘤活性成分之一，能够抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡、抗肿瘤转移，与放疗和化疗结合试验，可以增强放疗和化疗的效果。此外，人参皂苷Rh2还具有抗过敏，提高机体免疫力的功能，抑制NO和PGE产生的炎症作用。人参皂苷Rg3也具有良好的抗肿瘤活性，以Rg3为主要活性成分的参一胶囊是一种辅助化疗的抗肿瘤药物。

人参皂苷F1(20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol)和人参皂苷Rh1(6-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol)属于原人参三醇类的皂苷，人参皂苷F1在皂苷元的C20位羟基上连有一个葡萄糖基,人参皂苷Rh1在皂苷元的C6位羟基上连有一个葡萄糖基。此两种人参皂苷在人参中含量也非常低，属于稀有人参皂苷。人参皂苷Rh1具有抗炎，抗肿瘤，提高认知功能等活性。人参皂苷F1具有抗皮肤癌和保护皮肤免受紫外损伤的功能。

本发明有益效果：

本发明在稀有人参皂苷反应体系中添加蔗糖和UDP，利用SUS与GT联合催化糖基化反应。SUS可以催化蔗糖和UDP合成UDP-葡萄糖，而GT利用UDP-葡萄糖催化糖基化反应又可以游离出UDP，可进一步用于UDPG的合成。这样通过UDP-UDP-葡萄糖的循环利用，大大减少了成本。另一方面，由于反应体系中UDP和UDP-葡萄糖不断循环，两者都不会过量积累，提高了SUS和GT的催化效率。相比于传统的利用物理或化学水解制备稀有人参皂苷的方法，本方法使用酶法转化，具有更高的效率，酶催化反应专一性高，条件温和易控制，结合蔗糖合酶的使用成本更低。

相比传统方法而言，利用本方法采用糖基转移酶催化苷元糖基化合成各种稀有人参皂苷，其专一性高，产物单一，不会有非特异性产物形成，反应时间少，一般只需要4h即可完成。同时由于人参皂苷元(原人参二醇，原人参三醇和齐墩果酸)的合成途径已经解析，利用微生物合成人参皂苷元也有成功报道。(MetabolicEngineering20(2013)146–156)结合本方法，未来有潜力使稀有人参皂苷的制备摆脱植物依赖，为工业生产提供可靠，稳定的来源，传统的化学水解的方法则不具有这一可能。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1.糖基转移酶UGTPg1、UGTPg5、UGTPg29、UGTPg50、BC10和蔗糖合酶SUS1的克隆

(1)糖基转移酶UGTPg1、UGTPg5、UGTPg29、UGTPg50和BC10的克隆

合成分别具有序列表中SEQIDNO:7和SEQIDNO:8核苷酸序列的两条引物。以从人参中提取的RNA反转录获得的cDNA为模板，利用引物SEQIDNO:7和SEQIDNO:8进行PCR。DNA聚合酶选用宝生物工程有限公司的高保真的KODDNA聚合酶。PCR扩增程序为：94℃2min；94℃15s，58℃30s，68℃2min，共35个循环；68℃10min，降至10℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1A。在紫外下照射，切下目标DNA条带。然后采用AxygenGelExtractionKit(AXYGEN公司)从琼脂糖凝胶中回收DNA即为扩增出的糖基转移酶基因的DNA片段。利用宝生物工程(大连)有限公司(Takara)的pMD18-T克隆试剂盒，将回收的PCR产物克隆到pMD18-T载体，所构建的载体命名为pMDT-UGTPg1。经测序获得UGTPg1的基因序列。

UGTPg1基因具有序列表中SEQIDNO:1的核苷酸序列。自SEQIDNO:1的5’端第1-1428位核苷酸为UGTPg1的开放阅读框(OpenReadingFrame,ORF)，自SEQIDNO:1的5’端的第1-3位核苷酸为UGTPg1基因的起始密码子ATG，自SEQIDNO:1的5’端的第1426-1428位核苷酸为UGTPg1基因的终止密码子TAA。糖基转移酶基因UGTPg1编码一个含有475个氨基酸的蛋白质UGTPg1，具有SEQIDNO:31的氨基酸残基序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为53.4kDa，等电点pI为5.05。自SEQIDNO:31的氨基端的第344位氨基酸至第387位氨基酸为为植物小分子糖基化修饰的糖基转移酶的保守PSPG(PlantSecondaryProductGlycosyltransferase)基序。

合成分别具有序列表中SEQIDNO:9和SEQIDNO:10核苷酸序列的两条引物。以从人参中提取的RNA反转录获得的cDNA为模板，利用引物SEQIDNO:9和SEQIDNO:10进行PCR。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1B。按上述方法将回收的PCR产物克隆到pMD18-T载体，所构建的载体命名为pMDT-UGTPg5。经测序获得UGTPg5的基因序列。

UGTPg5基因具有序列表中SEQIDNO:2的核苷酸序列。自SEQIDNO:2的5’端第1-1419位核苷酸为UGTPg5的开放阅读框(OpenReadingFrame,ORF)，自SEQIDNO:2的5’端的第1-3位核苷酸为UGTPg5基因的起始密码子ATG，自SEQIDNO:2的5’端的第1417-1419位核苷酸为UGTPg5基因的终止密码子TAA。糖基转移酶基因UGTPg5编码一个含有472个氨基酸的蛋白质UGTPg5，具有SEQIDNO:32的氨基酸残基序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为53.1kDa，等电点pI为4.98。自SEQIDNO:32的氨基端的第343位氨基酸至第386位氨基酸为为植物小分子糖基化修饰的糖基转移酶的保守PSPG基序。

合成分别具有序列表中SEQIDNO:11和SEQIDNO:12核苷酸序列的两条引物。以从人参中提取的RNA反转录获得的cDNA为模板，利用引物SEQIDNO:11和SEQIDNO:12进行PCR。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1C。按上述方法将回收的PCR产物克隆到pMD18-T载体，所构建的载体命名为pMDT-UGTPg29。经测序获得UGTPg29的基因序列。

UGTPg29基因具有序列表中SEQIDNO:3的核苷酸序列。自SEQIDNO:3的5’端第1-1329位核苷酸为UGTPg29的开放阅读框(OpenReadingFrame,ORF)，自SEQIDNO:3的5’端的第1-3位核苷酸为UGTPg29基因的起始密码子ATG，自SEQIDNO:3的5’端的第1327-1329位核苷酸为UGTPg29基因的终止密码子TAA。糖基转移酶基因UGTPg29编码一个含有442个氨基酸的蛋白质UGTPg29，具有SEQIDNO:33的氨基酸残基序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为49.1kDa，等电点pI为5.93。自SEQIDNO:33的氨基端的第317位氨基酸至第360位氨基酸为为植物小分子糖基化修饰的糖基转移酶的保守PSPG基序。

合成分别具有序列表中SEQIDNO:13和SEQIDNO:14核苷酸序列的两条引物。以从人参中提取的RNA反转录获得的cDNA为模板，利用如上引物SEQIDNO:13和SEQIDNO:14进行PCR。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1D。按上述方法将回收的PCR产物克隆到pMD18-T载体，所构建的载体命名为pMDT-UGTPg50。经测序获得UGTPg50的基因序列。

UGTPg50基因具有序列表中SEQIDNO:4的核苷酸序列。自SEQIDNO:4的5’端第1-1374位核苷酸为UGTPg50的开放阅读框(OpenReadingFrame,ORF)，自SEQIDNO:4的5’端的第1-3位核苷酸为UGTPg50基因的起始密码子ATG，自SEQIDNO:4的5’端的第1372-1374位核苷酸为UGTPg50基因的终止密码子TGA。糖基转移酶基因UGTPg50编码一个含有457个氨基酸的蛋白质UGTPg50，具有SEQIDNO:34的氨基酸残基序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为51.2kDa，等电点pI为5.10。自SEQIDNO:34的氨基端的第333位氨基酸至第376位氨基酸为为植物小分子糖基化修饰的糖基转移酶的保守PSPG基序。

合成分别具有序列表中SEQIDNO:17和SEQIDNO:18核苷酸序列的两条引物。以从其他植物中提取的RNA反转录获得的cDNA为模板，利用如上引物SEQIDNO:17和SEQIDNO:18进行PCR。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1F。按上述方法将回收的PCR产物克隆到pMD18-T载体，所构建的载体命名为pMDT-BC10。经测序获得BC10的基因序列。

BC10基因具有序列表中SEQIDNO:5的核苷酸序列。自SEQIDNO:5的5’端第1-1488位核苷酸为BC10的开放阅读框(OpenReadingFrame,ORF)，自SEQIDNO:5的5’端的第1-3位核苷酸为BC10基因的起始密码子ATG，自SEQIDNO:5的5’端的第1486-1488位核苷酸为BC10基因的终止密码子TAA。糖基转移酶基因BC10编码一个含有495个氨基酸的蛋白质BC10，具有SEQIDNO:35的氨基酸残基序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为55.5kDa，等电点pI为5.52。自SEQIDNO:35的氨基端的第355位氨基酸至第398位氨基酸为为植物小分子糖基化修饰的糖基转移酶的保守PSPG基序。

(2)蔗糖合酶SUS1的克隆

合成分别具有序列表中SEQIDNO:15和SEQIDNO:16核苷酸序列的两条引物。

以从马铃薯中提取的RNA反转录获得的cDNA为模板，利用如上引物SEQIDNO:15和SEQIDNO:16进行PCR扩增马铃薯中的蔗糖合酶基因SUS1，Genbank:M18745.1。DNA聚合酶选用宝生物工程有限公司的高保真的KODDNA聚合酶。PCR扩增程序同(1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1E。将回收的PCR产物克隆到pMD18-T载体，所构建的载体命名为pMDT-SUS1。经测序获得SUS1的基因序列。

SUS1基因具有序列表中SEQIDNO:6的核苷酸序列。自SEQIDNO:6的5’端第1-2418位核苷酸为SUS1的开放阅读框(OpenReadingFrame,ORF)，自SEQIDNO:6的5’端的第1-3位核苷酸为SUS1基因的起始密码子ATG，自SEQIDNO:6的5’端的第2416-2418位核苷酸为SUS1基因的终止密码子TGA。蔗糖合酶基因SUS1编码一个含有805个氨基酸的蛋白质SUS1，具有SEQIDNO:36的氨基酸残基序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为92.5kDa，等电点pI为6.22。

同样方法合成了拟南芥和大豆来源的蔗糖合酶，其序列分别如SEQIDNO.:37-38所示。

实施例2.糖基转移酶和蔗糖合酶SUS1表达

(1)大肠杆菌中表达UGTPg1、UGTPg5、UGTPg29、UGTPg50和BC10

合成分别具有序列表中SEQIDNO:19和SEQIDNO:20核苷酸序列的两条引物。在合成的引物SEQIDNO:19和SEQIDNO:20两端分别设置BamHI和XhoI两个酶切位点，以pMDT-UGTPg1为模板进行PCR。PCR扩增程序同实施例2。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收后经BamHI和XhoI双酶切，利用NEB公司的T4DNA连接酶连入同样经BamHI和XhoI双酶切的pET28a载体(Novagen公司)中。所获得的重组质粒命名为pET28a-UGTPg1。将重组质粒pET28a-UGTPg1转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)中构建重组菌pET28a-UGTPg1-BL21。

合成分别具有序列表中SEQIDNO:21和SEQIDNO:22核苷酸序列的两条引物。在合成的引物SEQIDNO:21和SEQIDNO:22两端分别设置BamHI和XhoI两个酶切位点，以pMDT-UGTPg5为模板进行PCR。按上述方法将PCR产物导入pET28a载体中。所获得的重组质粒命名为pET28a-UGTPg5。将重组质粒pET28a-UGTPg5转化大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组菌pET28a-UGTPg5-BL21。

合成分别具有序列表中SEQIDNO:23和SEQIDNO:24核苷酸序列的两条引物。在合成的引物SEQIDNO:23和SEQIDNO:24两端分别设置BamHI和XhoI两个酶切位点，以pMDT-UGTPg29为模板进行PCR。按上述方法将PCR产物导入pET28a载体中。所获得的重组质粒命名为pET28a-UGTPg29。将重组质粒pET28a-UGTPg29转化大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组菌pET28a-UGTPg29-BL21。

合成分别具有序列表中SEQIDNO:25和SEQIDNO:26核苷酸序列的两条引物。在合成的引物SEQIDNO:25和SEQIDNO:26两端分别设置BamHI和NotI两个酶切位点，以pMDT-UGTPg50为模板进行PCR。按上述方法将PCR产物导入pET28a载体中。所获得的重组质粒命名为pET28a-UGTPg50。将重组质粒pET28a-UGTPg50转化大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组菌pET28a-UGTPg50-BL21。

合成分别具有序列表中SEQIDNO:27和SEQIDNO:28核苷酸序列的两条引物。在合成的引物SEQIDNO:27和SEQIDNO:28两端分别设置BamHI和NotI两个酶切位点，以pMDT-BC10为模板进行PCR。按上述方法将PCR产物导入pET28a载体中。所获得的重组质粒命名为pET28a-BC10。将重组质粒pET28a-BC10转化大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组菌pET28a-BC10-BL21。

糖基转移酶诱导表达方法为：从平板挑取pET28a-UGTPg1-BL21、pET28a-UGTPg5-BL21、pET28a-UGTPg29-BL21、pET28a-UGTPg50-BL21和pET28a-BC10-BL21单克隆分别接种至含有50ug/mL卡那霉素的LB试管中过夜，取1％接种至50ml三角瓶中37℃震荡培养至至OD600为0.6-0.7加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导,在18℃下诱导16h。12000g，3min离心收集菌体每克湿重菌体加入10mlPBSbuffer重悬后裂解菌体，离心取上清作为粗酶液。同时诱导含有pET28a空载体的BL21菌株pET28a-BL21制备粗酶液作为后续实施例的对照。

(2)酿酒酵母中表达蔗糖合酶SUS1

合成分别具有序列表中SEQIDNO:29和SEQIDNO:30核苷酸序列的两条引物。在合成的引物SEQIDNO:29和SEQIDNO:30两端分别添加pESC-HIS载体(安捷伦公司AgilentTechnologies)SmaI酶切位点20bp同源的序列，以pMDT-SUS1为模板进行PCR。PCR扩增程序同实施例2。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收后用GBclonart公司无缝克隆试剂盒将其导入到pESC-HIS载体构建重组质粒pESC-HIS-SUS1。所用反应体系为：在10uL的反应体系中加入SUS1的PCR产物片段1.25uL，经SmaI酶切线性化的载体pESC-HIS1.25uL，GBclonart反应液7.5uL在45℃水浴中反应30min。反应产物转化E.coliEPI300(购自Epicenter)感受态细胞，并涂布于添加100μg/mL氨苄霉素的LB平板上。通过菌落PCR验证阳性转化子，并测序进一步验证重组质粒pESC-HIS-SUS1构建成功。

将重组质粒pESC-HIS-SUS1利用ZYMOResearch公司的Frozen-EZYeastTransformationII转化试剂盒导入酿酒酵母BY4742(购自Euroscarf)中构建重组酿酒酵母BY-SUS1。配制液体种子培养基：0.67％(w/v)酵母氮源(无氨基酸)，2％(w/v)葡萄糖，0.01％(w/v)亮氨酸，0.01％(w/v)赖氨酸，0.01％(w/v)尿嘧啶。配制液体诱导培养基：0.67％(w/v)酵母氮源(无氨基酸)，2％(w/v)半乳糖，0.01％(w/v)亮氨酸，0.01％(w/v)赖氨酸，0.01％(w/v)尿嘧啶。

诱导培养方法：接种重组酿酒酵母菌株BY-SUS1于含有50mL液体种子培养基的试管震荡培养过夜(30℃，250rpm，16h)；离心收集菌体，转移至含1L液体诱导培养基的5L三角瓶中，调OD600至0.5，30℃，250rpm震荡培养2天收集诱导菌体。加入20mLbufferA(50mMTris-HCl、1mMEDTA、1mMPMSF、5％甘油、5mM咪唑，pH7.5)重悬后，用高压匀浆机裂解细胞，12000g，3min离心取上清。上样于Ni-NTA琼脂糖树脂柱(Rocha公司cOmpleteHis-TagPurificationResin)，20mLbufferA洗脱杂蛋白后用10mLbufferB(50mMTris-HCl、1mMEDTA、1mMPMSF、5％甘油、200mM咪唑，pH7.5)洗脱目的蛋白，超滤除盐并浓缩至2mL。SDS-PAGE和AntiHis-tagwestern检测SUS1在酿酒酵母中表达成功蛋白大小与预计相符，如图2B。

实施例3.蔗糖合酶与糖基转移酶联合催化人参皂苷元合成稀有人参皂苷

糖基转移酶催化人参皂苷元合成人参皂苷的反应需要添加UDP-葡萄糖为糖基供体，目前商业化的UDP-葡萄糖价格约在4000RMB每克(Sigma公司)。在反应体系中UDP-葡萄糖需要过量添加(转化1mM人参皂苷元的反应体系约需添加10mMUDP-葡萄糖)以保证反应进行。且UDP-葡萄糖在反应过程中处于持续消耗状态，不能循环利用，这些综合因素导致直接使用UDP-葡萄糖作为糖基供体进行糖基化制备糖苷类化合物成本极其昂贵。本发明通过使用植物来源的蔗糖合酶，通过在反应体系中加入UDP和蔗糖，由蔗糖合酶催化UDP和蔗糖原位合成UDP-葡萄糖作为糖基供体，供糖基转移酶作用后，又继续游离出UDP进一步合成UDP-葡萄糖使整个反应循环往复。相比与UDP-葡萄糖，商业化的UDP价格要便宜许多，只需约1000RMB每克(上海生工生物工程有限公司)，并且由于UDP在反应体系中可以多次循环使用，UDP的添加量非常少(转化1mM人参皂苷元的反应体系只需添加0.1mMUDP)。相比于UDP-葡萄糖和UDP，蔗糖的成本则几乎可以忽略不计。综合起来使用UDP代替UDP-葡萄糖一方面单价只需原来的1/4，另一方面使用量只需原来的1％，大大减少了成本。

本发明使用蔗糖合酶SUS1与糖基转移酶联合催化人参皂苷元合成稀有人参皂苷的反应体系(以下简称反应组)为：在200μL反应体系中添加500mM蔗糖、0.05mMUDP、0.5mM底物(原人参二醇或原人参三醇)、DMSO40μL、SUS1酶液70μL以及糖基转移酶粗酶液70μL。

为了进一步验证本发明并与直接使用UDP-葡萄糖的反应体系做比较，设置以下三组对照。

对照组一，直接使用UDP-葡萄糖为糖基供体的反应体系为：在200μL反应体系中添加5mMUDP-葡萄糖、0.5mM底物(原人参二醇或原人参三醇)、DMSO40μL和糖基转移酶粗酶液70μL。

对照组二，不使用蔗糖合酶的联合反应体系为：在200μL反应体系中添加500mM蔗糖、0.05mMUDP、0.5mM底物(原人参二醇或原人参三醇)、DMSO40μL、bufferB70μL以及糖基转移酶粗酶液70μL。

对照组三，不使用糖基转移酶的联合反应体系为：在200μL反应体系中添加500mM蔗糖、0.05mMUDP、0.5mM底物(原人参二醇或原人参三醇)、DMSO40μL、SUS1酶液70μL以及pET28a-BL21粗酶液70μL。

(1)蔗糖合酶SUS1与糖基转移酶UGTPg1联合催化原人参二醇合成稀有人参皂苷CK

按照上述反应体系，糖基转移酶使用UGTPg1，人参皂苷元使用原人参二醇。反应组和三个对照组，在30℃水浴下反应4h。反应结束后加入等体积的正丁醇抽提，取正丁醇相，经真空浓缩后，反应产物溶解于甲醇中，薄层层析(TLC)检测结果如图3A,HPLC结果如图3B。

图3结果显示，反应组和对照组一均有人参皂苷CK形成，而对照组二和对照组三均没有新产物形成。表明本发明在反应体系中添加UDP和蔗糖，通过蔗糖合酶与糖基转移酶UGTPg1联合催化与直接使用UDP-葡萄糖一样，都能够催化原人参二醇合成稀有人参皂苷CK。

(2)蔗糖合酶SUS1与糖基转移酶UGTPg1联合催化原人参三醇合成稀有人参皂苷F1

按照上述反应体系，糖基转移酶使用UGTPg1，人参皂苷元使用原人参三醇。反应组和三个对照组，在30℃水浴下反应4h。反应结束后加入等体积的正丁醇抽提，取正丁醇相，经真空浓缩后，反应产物溶解于甲醇中，TLC检测结果如图4A,HPLC结果如图4B。

图4结果显示，反应组和对照组一均有人参皂苷F1形成，而对照组二和对照组三均没有新产物形成。表明本发明在反应体系中添加UDP和蔗糖，通过蔗糖合酶与糖基转移酶UGTPg1联合催化与直接使用UDP-葡萄糖一样，都能够催化原人参三醇合成稀有人参皂苷F1。

(3)蔗糖合酶SUS1与糖基转移酶UGTPg5联合催化原人参三醇合成稀有人参皂苷Rh1

按照上述反应体系，糖基转移酶使用UGTPg5，人参皂苷元使用原人参三醇。反应组和三个对照组，在30℃水浴下反应4h。反应结束后加入等体积的正丁醇抽提，取正丁醇相，经真空浓缩后，反应产物溶解于甲醇中，TLC检测结果如图5A,HPLC结果如图5B。

图5结果显示，反应组和对照组一均有人参皂苷Rh1形成，而对照组二和对照组三均没有新产物形成。表明本发明在反应体系中添加UDP和蔗糖，通过蔗糖合酶与糖基转移酶UGTPg5联合催化与直接使用UDP-葡萄糖一样，都能够催化原人参三醇合成稀有人参皂苷Rh1。

(4)蔗糖合酶SUS1与糖基转移酶UGTPg50联合催化原人参二醇合成稀有人参皂苷Rh2

按照上述反应体系，糖基转移酶使用UGTPg50，人参皂苷元使用原人参二醇。反应组和三个对照组，在在30℃水浴下反应4h。反应结束后加入等体积的正丁醇抽提，取正丁醇相，经真空浓缩后，反应产物溶解于甲醇中，TLC检测结果如图6A,HPLC结果如图6B。

图6结果显示，反应组和对照组一均有人参皂苷Rh2形成，而对照组二和对照组三均没有新产物形成。表明本发明在反应体系中添加UDP和蔗糖，通过蔗糖合酶与糖基转移酶UGTPg50联合催化与直接使用UDP-葡萄糖一样，都能够催化原人参二醇合成稀有人参皂苷Rh2。

(5)蔗糖合酶SUS1与糖基转移酶UGTPg50和UGTPg29联合催化原人参二醇合成稀有人参皂苷Rg3

按照上述反应体系，糖基转移酶使用UGTPg50和UGTPg29(各35μL)，人参皂苷元使用原人参二醇。反应组和三个对照组，在30℃水浴下反应4h。反应结束后加入等体积的正丁醇抽提，取正丁醇相，经真空浓缩后，反应产物溶解于甲醇中，TLC检测结果如图7A,HPLC结果如图7B。

图7结果显示，反应组和对照组一均有人参皂苷Rg3形成，而对照组二和对照组三均没有新产物形成。表明本发明在反应体系中添加UDP和蔗糖，通过蔗糖合酶与糖基转移酶UGTPg50和UGTPg29联合催化与直接使用UDP-葡萄糖一样，都能够催化原人参二醇合成稀有人参皂苷Rg3。

(6)蔗糖合酶SUS1与糖基转移酶BC10联合催化原人参二醇合成稀有人参皂苷Rh2

按照上述反应体系，糖基转移酶使用BC10，人参皂苷元使用原人参二醇。反应组和三个对照组，在在30℃水浴下反应4h。反应结束后加入等体积的正丁醇抽提，取正丁醇相，经真空浓缩后，反应产物溶解于甲醇中，TLC检测结果如图8A,HPLC结果如图8B。

图8结果显示，反应组和对照组一均有人参皂苷Rh2形成，而对照组二和对照组三均没有新产物形成。表明本发明在反应体系中添加UDP和蔗糖，通过蔗糖合酶与糖基转移酶BC10联合催化与直接使用UDP-葡萄糖一样，都能够催化原人参二醇合成稀有人参皂苷Rh2。

(7)利用其他植物来源的蔗糖合酶与糖基转移酶联合催化人参皂苷元合成稀有人参皂苷

按照上述反应体系，糖基转移酶使用UGTPg1，人参皂苷元使用原人参三醇，使用拟南芥来源的蔗糖合酶(AtSUS，Genbank：NP_197583.1)。反应组和两个对照组，在30℃水浴下反应4h。反应结束后加入等体积的正丁醇抽提，取正丁醇相，经真空浓缩后，反应产物溶解于甲醇中，TLC和HPLC检测结果如图9A。

图9A结果显示，反应组和对照组一均有人参皂苷F1形成，而对照组二没有新产物形成。表明本发明在反应体系中添加UDP和蔗糖，通过使用拟南芥来源的蔗糖合酶与糖基转移酶UGTPg1联合催化与直接使用UDP-葡萄糖一样，都能够催化原人参三醇合成稀有人参皂苷F1。

按照上述反应体系，糖基转移酶使用UGTPg1，人参皂苷元使用原人参三醇，使用大豆来源的蔗糖合酶(GmSUS，Genbank：AAC39323.1)。反应组和两个对照组，在30℃水浴下反应4h。反应结束后加入等体积的正丁醇抽提，取正丁醇相，经真空浓缩后，反应产物溶解于甲醇中，TLC和HPLC检测结果如图9B。

图9B结果显示，反应组和对照组一均有人参皂苷F1形成，而对照组二没有新产物形成。表明本发明在反应体系中添加UDP和蔗糖，通过使用大豆来源的蔗糖合酶与糖基转移酶UGTPg1联合催化与直接使用UDP-葡萄糖一样，都能够催化原人参三醇合成稀有人参皂苷F1。

上述结果表明，本发明所使用的蔗糖合酶与不同糖基转移酶联合催化方法能有效的催化人参皂苷元合成各种人参皂苷。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.一种制备稀有人参皂苷的共催化反应体系，其特征在于，所述的共催化反应体系包括：

(a)糖基转移酶(glycosyltransferaseGT)；

(b)蔗糖合酶(sucrosesynthaseSUS)；

(c)核苷二磷酸(UDP)；和

(d)蔗糖。

2.如权利要求1所述的共催化反应体系，其特征在于，所述的糖基转移酶来源于人参、三七、西洋参、苜蓿；和/或

所述的蔗糖合酶来源于马铃薯、拟南芥、甘薯、木薯、或大豆，较佳地，为马铃薯、大豆。

3.如权利要求1所述的共催化反应体系，其特征在于，所述糖基转移酶和蔗糖合酶的比例为1-5：0.5-2(wt)；和/或

所述UDP:蔗糖的比例为1-10:10(wt)。

4.如权利要求1所述的共催化反应体系，其特征在于，所述的糖基转移酶包括一种或多种选自SEQIDNO.:31-35所示的多肽；和/或

所述的蔗糖合酶选自SEQIDNO.:36-38的多肽。

5.一种酶组合或其编码基因的用途，其特征在于，用于制备产生稀有人参皂苷的(i)试剂；(ii)权利要求1所述的共催化反应体系；或(iii)工程菌株，其中，所述的酶组合由糖基转移酶和蔗糖合酶构成。

6.一种分离的多核苷酸组合，其特征在于，所述的多核苷酸组合中的多核苷酸分别编码(i)人参来源的糖基转移酶，和(ii)蔗糖合酶。

7.一种载体，其特征在于，所述的载体用于表达(i)人参来源的糖基转移酶，和/或(ii)蔗糖合酶；

其中，所述的载体含有权利要求6中的多核苷酸组合，和/或

所述的载体分别含有权利要求6所述多核苷酸组合中的一种或多种多核苷酸。

8.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求7所述的载体，或所述的宿主细胞的染色体整合有权利要求6所述的多核苷酸组合。

9.权利要求1所述的共催化反应体系的用途，其特征在于，用于催化原人参二醇或原人参三醇转化为稀有人参皂苷。

10.一种制备稀有人参皂苷的方法，其特征在于，在权利要求1所述共催化反应体系的存在下，将原人参二醇或原人参三醇转化为稀有人参皂苷；或

在权利要求1中(a)、(b)、(c)、和(d)的共同存在下，将原人参二醇或原人参三醇转化为稀有人参皂苷。

11.一种制备人参稀有皂苷的方法，其特征在于，所述的方法包括如下反应：

当X为原人参二醇；Y为原人参二醇型皂苷，例如人参皂苷CK，Rh2，Rg3；

当X为原人参三醇；Y为原人参三醇型皂苷，例如人参皂苷F1，Rh1，Rg1；

其中，X：UDP＝1:0.05-5，较佳地，为1:0.5-2；

X：蔗糖＝1：600-1000，较佳地，为1：800：900。