CN106047978B - 一种利用天然皂苷生物转化合成稀有人参皂苷ck的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用天然皂苷生物转化合成稀有人参皂苷CK的方法，该方法以紫芝为发酵菌，进行发酵培养，发酵至少3天后，添加天然皂苷至发酵液中，持续发酵，得到稀有人参皂苷CK。本发明以紫芝作为发酵菌株、以天然皂苷为底物进行发酵获得的稀有人参皂苷CK，不仅转化率高、而且安全无毒，与其他微生物相比，药食兼用真菌在生物转化合成过程中的安全性更高、生物活性物质产量更大，易于产品的推广。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程和微生物发酵技术领域，尤其涉及一种利用天然皂苷生物转化合成稀有人参皂苷CK的方法。
背景技术
利用药食兼用真菌生物合成、转化生成的食品功能性分子不仅具有化学合成或其他微生物生物合成的功能性分子的各类功效，而且还拥有下列优点：(1)相较于化学合成，使用原料安全无毒，且反应过程副产物安全无毒，产品安全性高；(2)能够较大量的合成化学方法难以合成的产物；(3)使用菌种安全、可使用，且菌种本身就拥有一定的保健功效；(4)原料在自然界广泛存在且价廉；(5)发酵生产是典型的“绿色”工艺等。
稀有人参皂苷compound K(Ginsenoside compound K)(下称CK)是哺乳类动物在服用人参或者天然人参皂苷后通过肠道的降解作用之后，在血液中检测到的有效物质；其在天然人参属植物中并不存在，并拥有下列生理活性：(1)对肺癌白血病、肺腺癌、胃癌、肝癌、前列腺癌、结肠癌、鼻咽癌和脑瘤等多种癌症起到促进癌细胞凋亡、抑制癌细胞转移和抑制肿瘤生长等作用；(2)具有恢复受损的学习和记忆、神经保护作用，并且在神经传递调节中发挥重要作用；(3)有抗炎症作用，能够抑制炎症因子的释放和调节炎症相关代谢通路；(4)有抗过敏作用；(5)有保肝作用，能够提高肝细胞损伤模型中肝细胞的存活率。(6)具有抗关节炎作用；(7)有抗糖尿病、抗血管形成以及一定的抗衰老作用。
目前，报道过的，可以转化产生人参皂苷的多种微生物的转化率不尽相同，最高可达99％，其产业化前景备受关注。
紫芝(Ganoderma sinense)又称黑芝、玄芝、木芝、中国灵芝，是中国特有的珍稀食药用真菌品种之一。富含多糖、灵芝酸等三萜类物质成分，具有抗衰老、提高机体免疫功能、保肝护肝、抑制肿瘤等功效。由于其本身含有多糖以及三萜类化合物，其能够产生较多种类的糖苷酶，故可转化天然皂苷为稀有人参皂苷CK。
公开号为CN104140931A的发明专利申请文献公开了一种甘人参皂苷CK的转化合成方法，包括：将固体培养活化的阿达青霉(Penicillium adametzii)3.3203接入液体土豆培养基中，培养36～72h后加入原人参二醇，于24～32℃条件下发酵培养48～120h，得到发酵液；从发酵液中分离纯化得到人参皂苷。
然而，使用青霉等不可食用或对人体有一定危害的微生物来转化产生人参皂苷CK，造成产品安全性不能得到完全保障，且分离纯化成本较高，影响产品作为保健功能性成分在市场中的竞争力。
发明内容
本发明提供了一种利用天然皂苷进行生物转化合成稀有人参皂苷CK的方法，该方法不仅能够转化得到生物活性较高的人参皂苷，而且利用食药同源真菌紫芝进行转化，保证了产物的安全性，发酵产物中的多种生物活性物质增强发酵产物的保健功能、提高了人参皂苷的市场价值。
一种利用天然皂苷生物转化合成稀有人参皂苷CK的方法，以紫芝为发酵菌，进行发酵培养，发酵至少3天后，添加天然皂苷至发酵液中，持续发酵，得到稀有人参皂苷CK。
具体地，所述紫芝为紫芝(Ganoderma sinense)CGMCC 5.69。
具体地，所述天然皂苷为绞股蓝总皂苷、三七总皂苷、人参总皂苷中的至少一种；三者都含有多种相同皂苷单体，其主要成分较为相似。更优选，所述天然皂苷为绞股蓝总皂苷。
作为优选，以质量百分数计，所述发酵培养的培养基包括以下组分：葡萄糖1.5～2.5％，蛋白胨1.5～2％，磷酸二氢钾0.03～0.3％，硫酸镁0.1～0.2％，维生素B1 0～0.005％，pH 3.0～5.5。
作为优选，以每升发酵培养基计，所述天然皂苷的添加量为0.3～5.0g；更优选，所述天然皂苷的添加量为0.5～2.0g。
经试验发现，天然皂苷在发酵过程中的添加时间会对产物的转化率有很大影响。作为优选，发酵培养4～7天后，添加天然皂苷至发酵液中。更优选，发酵培养6天后。
作为优选，所述发酵培养的温度为10℃～28℃，总发酵天数为8～14天；更优选，温度为25℃，总发酵天数为12天
所述紫芝依次经活化、种子培养后，获得种子液，再将种子液接种至发酵培养基中，进行发酵培养；其中，种子培养基包括以下组分：葡萄糖1.5～2.5％，蛋白胨1.5～2％，磷酸二氢钾0.03～0.3％，硫酸镁0.1～0.2％，维生素B1 0～0.005％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以紫芝作为发酵菌株、以天然皂苷为底物进行发酵获得的稀有人参皂苷CK，不仅转化率高、而且安全无毒，与其他微生物相比，药食兼用真菌在生物转化合成过程中的安全性更高、生物活性物质产量更大，易于产品的推广。
附图说明
图1为本发明利用天然皂苷生物转化合成稀有人参皂苷CK的方法流程图。
图2为HPLC检测中标准品的HPLC图谱。
图3为实施例1中获得的产物样品的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例中所使用的菌种为紫芝(Ganoderma sinense)CGMCC 5.69，购买于中国普通微生物保藏管理中心，本发明不涉及菌种的保藏。
实施例1
(1)菌种活化：将配置好的活化培养基进行高温高压灭菌，冷却并倒好平板，将冷冻保存的紫芝(Ganoderma sinense)CGMCC 5.69菌株接种至灭菌后的活化培养基平板上，在25℃培养箱中，培养7d，至平板布满菌丝为止，平板备用。
其中，活化培养基的成分为：马铃薯浸粉10g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，水。
(2)种子培养：取500mL的锥形瓶，每瓶装入100mL的种子培养基，高温高压灭菌冷却，挖取1.5cm×1.5cm的活化后的菌块，接种到装有100mL种子培养基的锥形瓶中，在25℃、旋转式摇床转速为180rmp的条件下，培养5d。
其中，种子培养基由以下组分构成：葡萄糖20g/L，蛋白胨18g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1.5g/L，维生素B1 0.05g/L，水。
(3)发酵培养：在5L气升罐中加入4.5升发酵培养基，高温高压灭菌，取上述种子液，按照500mL种子液/4.5L发酵培养基接种到发酵培养基内，在25℃、通气量为4的条件下发酵培养6d，加入天然皂苷后，转化发酵6d。
其中，发酵培养基由以下组分构成：葡萄糖20g/L，蛋白胨18g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1.5g/L，维生素B1 0.05g/L，水，pH值未做调节。
其中，天然皂苷采用绞股蓝总皂苷，添加前，先将绞股蓝总皂苷溶解于500ml乙醇，无菌滤膜过滤除菌，以蠕动泵添加入气升罐，添加量为1mg/ml发酵培养基，如表1所示。
(4)萃取分离：发酵培养后，取与发酵液等体积的水饱和正丁醇，对发酵液进行萃取2～3次，合并有机相，减压旋蒸，得到稀有人参皂苷CK粗产品；再以适量色谱纯甲醇溶解，使用HPLC测定CK浓度，实施例1的产量为1.478mg/L，如表1所示。
表1实施例1发酵培养基中天然皂苷添加情况、CK产量及转化率
注：转化率(mg/g)＝CK产量(mg)/绞股蓝皂苷添加量(g)
实施例2～8
(1)菌种活化：将配置好的活化培养基高温高压灭菌冷却，并倒好平板，将冷冻保存的紫芝(Ganoderma sinense)CGMCC 5.69菌株接种至灭菌后的活化培养基平板上，在25℃培养箱中，培养7d，至平板布满菌丝为止，平板备用。
其中，活化培养基的成分为：马铃薯浸粉10g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。
(2)发酵培养：取250mL的锥形瓶，每瓶装入50mL的发酵培养基，高温高压灭菌冷却，挖取1cm×1cm的活化后的菌块接种到装有50mL种子培养基的锥形瓶中，在25℃、旋转式摇床转速为180rmp的条件下，培养4d、5d、6d、7d，后加入天然皂苷至0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml，再转化发酵至总时长为12d。
其中，发酵培养基由以下组分构成：葡萄糖20g/L，蛋白胨18g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1.5g/L，维生素B1 0.05g/L，水，pH值未做调节。
其中，实施例2～8中的天然皂苷采用绞股蓝总皂苷，添加前，将绞股蓝总皂苷溶解于5ml50％乙醇水溶液，无菌滤膜过滤后添加入培养基，添加量为0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml发酵培养基，如表2所示。
(3)萃取分离测定：发酵培养后，取与发酵液等体积的水饱和正丁醇，对发酵液进行萃取2～3次，合并有机相，减压旋蒸，得到稀有人参皂苷CK粗产品；再以适量色谱纯甲醇溶解，使用HPLC测定CK浓度，实施例2～8的产量，如表2所示。
表2实施例2～8发酵培养基中天然皂苷添加情况、CK产量及转化率
注：转化率(mg/g)＝CK产量(mg)/绞股蓝皂苷添加量(g)
由表2的实施例2～8发酵结果可以看出，绞股蓝总皂苷添加量为1.5mg/mL发酵培养基、在发酵温度为25℃、摇床转速为180rpm的条件下，发酵6天后加入皂苷的平均转化率最高，最平均转化率为6.448mg/L；当绞股蓝总皂苷添加量为2mg/mL发酵培养基，发酵6天后加入皂苷的稀有人参皂苷CK产量最高，平均产量为11.415mg/L。
Claims (1)
1.一种利用天然皂苷生物转化合成稀有人参皂苷CK的方法，其特征在于，以紫芝(Ganoderma sinense) 为发酵菌，进行发酵培养，发酵培养4～7天后，添加天然皂苷至发酵液中，持续发酵，得到稀有人参皂苷CK；
所述紫芝为紫芝(Ganoderma sinense)CGMCC 5.69；所述天然皂苷为绞股蓝总皂苷；
以质量百分数计，所述发酵培养的培养基，包括以下组分：葡萄糖1.5～2.5％，蛋白胨1.5～2％，磷酸二氢钾0.03～0.3％，硫酸镁0.1～0.2％，维生素B1 0～0.005％，pH 3.0～5.5；
以每升发酵培养基计，所述天然皂苷的添加量为0.1～5.0g；所述发酵培养的温度为10℃～28℃，总发酵天数为8～14天；
所述紫芝依次经活化、种子培养后，获得种子液，再将种子液接种至发酵培养基中，进行发酵培养；其中，以质量体积百分比计，种子培养基包括以下组分：葡萄糖1.5～2.5％，蛋白胨1.5～2％，磷酸二氢钾0.03～0.3％，硫酸镁0.1～0.2％，维生素B1 0～0.005％。
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