CN110028500A - 表观修饰土曲霉次级代谢物及其在制备抗肿瘤药物中的用途 - Google Patents

表观修饰土曲霉次级代谢物及其在制备抗肿瘤药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种表观修饰土曲霉次级代谢物及其在制备抗肿瘤药物中的用途，属于微生物药物技术领域，包括式I所示化合物I、式II所示化合物II和式III所示化合物III。上述次级代谢物按照以下方法提取而得：将土曲霉种子液接种到经脉冲电场和紫外线进行灭菌处理的发酵液中进行发酵，得到经表观修饰的海洋真菌；将发酵结束后的发酵液用乙酸乙酯萃取，浓缩，然后进一步纯化，得到次级代谢物。上述抗肿瘤药物包括化合物I和/或化合物II和/或化合物III。本发明表观修饰土曲霉次级代谢物的产量高，获得的次级代谢物具有抗肿瘤活性，可以降低耐药细胞对药物的耐受性，并恢复对药物的敏感性，制备的抗肿瘤药物的治疗效果好。

Description

表观修饰土曲霉次级代谢物及其在制备抗肿瘤药物中的用途
技术领域
本发明属于微生物药物技术领域，具体涉及表观修饰土曲霉次级代谢物及其在制备抗肿瘤药物中的用途。
背景技术
对陆生微生物近百年的研究历史，发现了大量的化学结构多样性和生物活性显著的天然产物，极大的推动了生物素药物的发展，如：青霉素、万古霉素、链霉素等。对微生物越来越多的关注，自然导致微生物的重复研究和已知化合物重复开发、新化合物发现的机率降低。因此人们开始关注微生物蕴藏量更大、种类多样性更多的海洋来源微生物。海洋微生物由于其独特的生存环境(高压、高盐、低温、寡营养)导致其具有与陆生微生物截然不同的代谢途径，因而更易产生不同于陆生微生物的次生代谢产物，进而表现出良好的生物活性如：抑制群体感应活性、抑菌活性、抗病毒活性、蛋白激酶抑制活性、细胞毒活性、肿瘤细胞周期抑制活性等，因而日渐成为海洋药物研究工作者青睐的重要天然产物化学资源。海水中微生物的丰度达到106/mL，海底沉积物微生物丰度更是达到了109/mL。然而海洋样品采集难度高，常规实验室条件下仅有低于5％的海洋微生物被分离得到，即便获得的微生物在实验室培养条件下也不能完全表达其在海洋环境下的所有生物合成途径的代谢产物。因此如何最大程度的开发这些来之不易的海洋微生物资源，使其能最大限度的被人类利用，成为科学工作者的一个重要任务和课题。曲霉属真菌一直以来都是天然产物界研究的重要菌种，其次级代谢产物结构新颖骨架多变，除了常规的甾体、倍半萜、蒽醌等常见结构类型以外，往往还含有：生物碱类、肽类、聚酮类、二倍半萜等多种的骨架。这些结构新颖的化合物往往还含有细胞毒，抗菌，抗病毒等多种活性，成为海洋药物先导化合物的重要来源之一，引起了业内学者的广泛关注。
表观遗传修饰学是研究DNA序列没有发生变化的可遗传的基因表达的改变。主要内容是通过组蛋白修饰、非编码RNA调控、DNA的甲基化和染色质重塑等方式达到调控基因表达的目的。在微生物中很多调控转录和翻译过程，与初级代谢产物和细胞成熟相关的机制已经被系统深入的研究。相反的，关于分子水平调节次生代谢产物生物合成机制的研究却知之甚少。已经有证据证明：表观遗传修饰过程被细胞广泛的应用于控制遗传信息的传递过程，包括调控次生代谢产物产生的基因。表观遗传修饰调控抑制的现象在那些仅仅一小部分生物合成机制被发现的真菌中表现的尤其明显。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表观修饰土曲霉次级代谢物及其在制备抗肿瘤药物中的用途，该表观修饰土曲霉次级代谢物的产量高，获得的次级代谢物具有抗肿瘤活性，可以降低耐药细胞对药物的耐受性，并恢复对药物的敏感性，制备的抗肿瘤药物的治疗效果好。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
表观修饰土曲霉次级代谢物，包括式I所示化合物I、式II所示化合物II和式III所示化合物III，
上述化合物I对细胞K562的IC50值为9.5μM；化合物II对细胞K562的IC50值为13.0μM，对细胞MCF-7的IC50值为10.1μM；化合物III对细胞MCF-7的IC50值为8.5μM。
上述次级代谢物按照以下方法提取而得：
1)将土曲霉种子液接种到经脉冲电场和紫外线进行灭菌处理的发酵液中进行发酵，得到经表观修饰的海洋真菌；
2)将发酵结束后的发酵液通过粗棉布过滤以分离滤液和菌丝，分别用乙酸乙酯萃取，将所得乙酸乙酯萃取液合并，浓缩，得到乙酸乙酯溶液提取物；
3)将所述乙酸乙酯提取物利用减压硅胶柱色谱、Sephadex LH-20、HPLC进一步纯化，得到次级代谢物。土曲霉的发酵需要一个无杂菌生长的环境，因此，接种前培养基的灭菌对发酵效率及产品的技术经济指标至关重要。脉冲电场能够将部分水分子分解成OH-和H+，其中水中氧分子俘获由电场催化OH-时产生的电子后就会生成超氧阴离子自由基、过氧化氢和自由质子等，它与OH-结合后会导致细胞DNA发生氧化损伤。在微生物细胞体内，适量的超氧阴离子自由基发挥着代谢贮能转化排废及防御消毒的作用，但随着电场强度和脉冲作用时间的不断累积，过量的超氧阴离子自由基会在细胞体内积累，从而破坏脂质、损害核酸、破坏碳水化合物及蛋白质，最终对微生物细胞产生氧化损伤并危及其正常的生命活动，甚至引起死亡。而紫外线在脉冲电场的增益作用下，减弱了发酵液中很容易被介质吸收的缺陷，能够强化脉冲电场的杀菌效果，避免发酵液中亚致死损伤细菌的产生，彻底杀菌，提高杀菌效果。同时脉冲电场和紫外线的共同作用，能够软化酵母抽提物中残留的酵母细胞壁碎片，破坏细胞壁组分葡聚糖的β-1,3键而使其分解为单糖或者多糖，更易于被土曲霉吸收消化，且该灭菌是在低温条件下进行的，能够保护发酵液的蛋白质不被破坏，为土曲霉的发酵提供充足的营养物质，提高土曲霉的生长速率，延长其对数期，确保土曲霉的表观遗传修饰顺利进行，提高其次级代谢产物的产量。
其中，脉冲电场的场强为15-20kV/cm，脉冲频率为1.5-2.0kHz，脉冲宽度为1.3-1.5μs，流速为20-40mL/min；紫外线的波长为150-200nm。该条件下的脉冲电场和紫外线的增益共同作用最强，杀菌效果较好，土曲霉的次级代谢产物的产量较高。
本发明还公开表观修饰土曲霉次级代谢物在制备抗肿瘤药物中的用途。
上述抗肿瘤药物包括化合物I和/或化合物II和/或化合物III。化合物I、II对细胞K562有抑制作用，IC50值分别为9.5和13.0μM。化合物II、III对细胞MCF-7有抑制作用，IC50值分别为10.1和8.5μM。表明：化合物I、II对人慢性髓性白血病K562细胞表现出一定的抑制活性，化合物II、III对人乳腺癌细胞MCF-7表现出一定的抑制活性，具有抗肿瘤活性，可以降低耐药细胞对药物的耐受性，并恢复对药物的敏感性，最终改善治疗的结果；同时上述化合物来自于微生物的次级代谢产物，易于被机体吸收，毒性非常小，副作用和不良反应率低。
上述抗肿瘤药物还包括药学上可接受的辅料。
上述治疗糖尿病药物为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂或糖浆剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明表观修饰土曲霉次级代谢物具有抗肿瘤活性，可以降低耐药细胞对药物的耐受性，并恢复对药物的敏感性，最终改善治疗的结果；同时上述表观修饰土曲霉次级代谢物来自于微生物的次级代谢产物，易于被机体吸收，毒性非常小，副作用和不良反应率低；本发明表观修饰土曲霉次级代谢物的制备方法简单，能够完全灭杀发酵液中的细菌，软化酵母抽提物中残留的酵母细胞壁碎片，保护发酵液的蛋白质不被破坏，为土曲霉的发酵提供充足的营养物质，提高土曲霉的生长速率，延长其对数期，确保土曲霉的表观遗传修饰顺利进行，提高其次级代谢产物的产量。
本发明采用了上述技术方案提供表观修饰土曲霉次级代谢物及其在制备抗肿瘤药物中的用途，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
具体实施方式
下面，结合具体实施例对本发明实施方式作进一步说明。
本申请公开一种表观修饰土曲霉次级代谢物，包括式I所示化合物I、式II所示化合物II和式III所示化合物III，
上述化合物I对细胞K562的IC50值为9.5μM；化合物II对细胞K562的IC50值为13.0μM，对细胞MCF-7的IC50值为10.1μM；化合物III对细胞MCF-7的IC50值为8.5μM。
上述次级代谢物按照以下方法提取而得：
1)真菌材料：从来自青岛石老人海水浴场浒苔样品中分离出真菌菌株土曲霉OUCMDZ-2739，浒苔样品依次用无菌海水、75％乙醇和无菌水洗涤。然后，用研钵捣碎样品，然后存放于含有100mg/mL氯霉素的PDA培养基(每升含马铃薯提取物200克，葡萄糖20克，琼脂15克，和海水1L)中，在28℃下培养至出现单一菌种，将该菌种转移到另一PDA培养基并储存于4℃，通过多相分类学研究、菌落形态及18S rRNA序列分析、菌株发育树的建立，鉴定其为土曲霉OUCMDZ-2739；
2)扩大培养：将土曲霉Aspergillus terreus OUCMDZ-2739接种在培养基中扩大培养，得真菌种子液；
3)表观遗传修饰调控：将上述真菌种子液按接种量为3-5％接种到经脉冲电场和紫外线进行灭菌处理的发酵液中，在温度为22-28℃的条件下进行发酵，时间为25-35天，得到经表观修饰的海洋真菌。土曲霉的发酵需要一个无杂菌生长的环境，因此，接种前培养基的灭菌对发酵效率及产品的技术经济指标至关重要。脉冲电场能够将部分水分子分解成OH-和H+，其中水中氧分子俘获由电场催化OH-时产生的电子后就会生成超氧阴离子自由基、过氧化氢和自由质子等，它与OH-结合后会导致细胞DNA发生氧化损伤。在微生物细胞体内，适量的超氧阴离子自由基发挥着代谢贮能转化排废及防御消毒的作用，但随着电场强度和脉冲作用时间的不断累积，过量的超氧阴离子自由基会在细胞体内积累，从而破坏脂质、损害核酸、破坏碳水化合物及蛋白质，最终对微生物细胞产生氧化损伤并危及其正常的生命活动，甚至引起死亡。而紫外线在脉冲电场的增益作用下，减弱了发酵液中很容易被介质吸收的缺陷，能够强化脉冲电场的杀菌效果，避免发酵液中亚致死损伤细菌的产生，彻底杀菌，提高杀菌效果。同时脉冲电场和紫外线的共同作用，能够软化酵母抽提物中残留的酵母细胞壁碎片，破坏细胞壁组分葡聚糖的β-1,3键而使其分解为单糖或者多糖，更易于被土曲霉吸收消化，且该灭菌是在低温条件下进行的，能够保护发酵液的蛋白质不被破坏，为土曲霉的发酵提供充足的营养物质，提高土曲霉的生长速率，延长其对数期，确保土曲霉的表观遗传修饰顺利进行，提高其次级代谢产物的产量；
4)提取：将30L发酵液通过粗棉布过滤以分离滤液和菌丝，滤液用等效体积的乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液。菌丝用80％丙酮萃取三次，丙酮溶液经减压浓缩，然后以乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液，两个乙酸乙酯溶液组合在一起。并在减压下浓缩，得到31.2g乙酸乙酯溶液提取物；
5)分离纯化：将乙酸乙酯提取物利用减压硅胶柱色谱进行逐步洗脱，洗脱液为石油醚-CH2Cl2(1:1和0:1)和CH2Cl2-MeOH(100％～0％)的屈服梯度6个主要馏分(馏分1～6)，4.8g的馏分2通过Sephadex LH-20(1:1CH2Cl2-MeOH)进一步纯化，得到200mg馏分2.3，馏分2.3继续用HPLC纯化，洗脱液为75％MeOH-H2O，获得12.5mg化合物I(tR＝9.4min)；6.7g的馏分3通过Sephadex LH-20(1:1CH2Cl2-MeOH)进一步纯化，得到1.4g馏分3.3和1.1g馏分3.4，其中馏分3.3继续用HPLC纯化，洗脱液为70％MeOH-H2O，获得40.3mg化合物II(tR＝11.5min)和13.6mg化合物III(tR＝16.4min)。
其中，脉冲电场的场强为15-20kV/cm，脉冲频率为1.5-2.0kHz，脉冲宽度为1.3-1.5μs，流速为20-40mL/min；紫外线的波长为150-200nm。该条件下的脉冲电场和紫外线的增益共同作用最强，杀菌效果较好，土曲霉的次级代谢产物的产量较高。
其中，发酵液包括如下成分：8-15g/L葡萄糖、17-22g/L麦芽糖、18-23g/L甘露醇、9-12g/L谷氨酸单钠、0.4-0.6g/L KH2PO4、0.2-0.5g/L MgSO4·7H2O、2-4g/L酵母抽提物、30-35g/L SEA盐、9-11μM TSA和1L自来水。该发酵液中添加表观遗传修饰调控剂组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA能有效激活Aspergillus terreus OUCMDZ-2739菌株体内不同生合成途径基因水平的表达，进而代谢产生不同于不添加抑制剂条件下的化合物类型，是激活真菌沉默基因表达的有效手段，得到新的化合物，为微生物医药领域提供新的途径。
本申请还公开一种表观修饰土曲霉次级代谢物在制备抗肿瘤药物中的用途。
上述抗肿瘤药物包括化合物I和/或化合物II和/或化合物III。化合物I、II对细胞K562有抑制作用，IC50值分别为9.5和13.0μM。化合物II、III对细胞MCF-7有抑制作用，IC50值分别为10.1和8.5μM。表明：化合物I、II对人慢性髓性白血病K562细胞表现出一定的抑制活性，化合物II、III对人乳腺癌细胞MCF-7表现出一定的抑制活性，具有抗肿瘤活性，可以降低耐药细胞对药物的耐受性，并恢复对药物的敏感性，最终改善治疗的结果；同时上述化合物来自于微生物的次级代谢产物，易于被机体吸收，毒性非常小，副作用和不良反应率低。其中，肿瘤药物进一步包括化合物I、化合物II和化合物III，其中化合物I、化合物II和化合物III的重量比为1:2.4-2.8:0.7-0.9。白血病癌细胞和女性乳腺癌细胞分属于非实体瘤细胞和实体瘤细胞，致病机制很复杂，目前也只有通过化疗来减少病痛，由于患者长期接触化疗药物，不可避免会对某一种化疗药物产生耐受性，要加大药物剂量才能恢复细胞对药物敏感性，化疗药物加大剂量势必会对人机体产生损害，而且一旦对一种药物产生耐受性，同时可能会对其他化疗药物产生交叉耐受，这就形成了肿瘤细胞的多药耐，是阻碍化疗方法成功的绊脚石。而药物的这种组合不仅对免疫应答激活具有协同效应，对人慢性髓性白血病K562细胞和人乳腺癌细胞MCF-7的抑制效果达到最佳，抗肿瘤活性较高，且还可以提高肿瘤患者自身免疫力；而且能降低ATP结合盒蛋白在细胞上的表达，可以降低耐药细胞对药物的耐受性，并恢复对药物的敏感性，最终改善治疗的结果。
上述抗肿瘤药物还包括药学上可接受的辅料。该辅料中包含纳米颗粒，纳米颗粒通常包含糖，葡聚糖，磷酸钙，壳聚糖，肽和/或塑料聚合物。上述纳米颗粒具有100nm以下的尺寸，能够包裹化合物I、化合物II和化合物III，以受控的和可调谐的动力学释放药物，导致治疗反应，然后该纳米可以可降解为无毒组分，以使得能够从机体清除而没有不利的毒性。尤其是ELP纳米颗粒，先天免疫系统仅在肿瘤内激活，并且防止了先天性免疫系统的系统性激活。该辅料中还包含鸟嘌呤、连翘苷和P-糖蛋白抑制剂(如维拉帕米、环孢菌素A、VX-710和PSC833)，辅料中的鸟嘌呤和连翘苷能够克服P-糖蛋白抑制剂存在的亲和力特异性不足的缺点，然后鸟嘌呤、连翘苷和P-糖蛋白抑制剂共同通过竞争性结合P-糖蛋白底物位点，对抗肿瘤药物中的化合物I、化合物II和化合物III起作用并恢复对药物的敏感性，最终改善治疗的结果，同时可以引起药物相互作用，有效抑制肿瘤细胞的增殖。
上述治疗糖尿病药物为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂或糖浆剂。
下面，结合具体实施例对本发明实施方式作进一步说明。
实施例1：
次级代谢物按照以下方法提取而得：
1)真菌材料：从来自青岛石老人海水浴场浒苔样品中分离出真菌菌株土曲霉OUCMDZ-2739，浒苔样品依次用无菌海水、75％乙醇和无菌水洗涤。然后，用研钵捣碎样品，然后存放于含有100mg/mL氯霉素的PDA培养基(每升含马铃薯提取物200克，葡萄糖20克，琼脂15克，和海水1L)中，在28℃下培养至出现单一菌种，将该菌种转移到另一PDA培养基并储存于4℃，通过多相分类学研究、菌落形态及18S rRNA序列分析、菌株发育树的建立，鉴定其为土曲霉OUCMDZ-2739；
2)扩大培养：将土曲霉Aspergillus terreus OUCMDZ-2739接种在培养基中扩大培养，得真菌种子液；
3)表观遗传修饰调控：将上述真菌种子液按接种量为3％接种到经脉冲电场和紫外线进行灭菌处理的发酵液中，在温度为22℃的条件下进行发酵，时间为25天，得到经表观修饰的海洋真菌；
4)提取：将30L发酵液通过粗棉布过滤以分离滤液和菌丝，滤液用等效体积的乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液，菌丝用80％丙酮萃取三次，丙酮溶液经减压浓缩，然后以乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液，两个乙酸乙酯溶液组合在一起。并在减压下浓缩，得到38.3g乙酸乙酯溶液提取物；
5)分离纯化：将乙酸乙酯提取物利用减压硅胶柱色谱进行逐步洗脱，洗脱液为石油醚-CH2Cl2(1:1和0:1)和CH2Cl2-MeOH(100％～0％)的屈服梯度6个主要馏分(馏分1～6)，5.9g的馏分2通过Sephadex LH-20(1:1CH2Cl2-MeOH)进一步纯化，得到245.5mg馏分2.3，馏分2.3继续用HPLC纯化，洗脱液为75％MeOH-H2O，获得15.3mg化合物I(tR＝9.4min)；8.2g的馏分3通过Sephadex LH-20(1:1CH2Cl2-MeOH)进一步纯化，得到1.7g馏分3.3和1.4g馏分3.4，其中馏分3.3继续用HPLC纯化，洗脱液为70％MeOH-H2O，获得49.5mg化合物II(tR＝11.5min)和16.7mg化合物III(tR＝16.4min)。
其中，脉冲电场的场强为15kV/cm，脉冲频率为1.5kHz，脉冲宽度为1.3μs，流速为20mL/min；紫外线的波长为150nm。发酵液按照如下成分配制：8g/L葡萄糖、17g/L麦芽糖、18g/L甘露醇、9g/L谷氨酸单钠、0.4g/L KH2PO4、0.2g/L MgSO4·7H2O、2g/L酵母抽提物、30g/L SEA盐、9μM TSA和1L自来水。
实施例2：
次级代谢物按照以下方法提取而得：
1)真菌材料：从来自青岛石老人海水浴场浒苔样品中分离出真菌菌株土曲霉OUCMDZ-2739，浒苔样品依次用无菌海水、75％乙醇和无菌水洗涤。然后，用研钵捣碎样品，然后存放于含有100mg/mL氯霉素的PDA培养基(每升含马铃薯提取物200克，葡萄糖20克，琼脂15克，和海水1L)中，在28℃下培养至出现单一菌种，将该菌种转移到另一PDA培养基并储存于4℃，通过多相分类学研究、菌落形态及18S rRNA序列分析、菌株发育树的建立，鉴定其为土曲霉OUCMDZ-2739；
2)扩大培养：将土曲霉Aspergillus terreus OUCMDZ-2739接种在培养基中扩大培养，得真菌种子液；
3)表观遗传修饰调控：将上述真菌种子液按接种量为4％接种到经脉冲电场和紫外线进行灭菌处理的发酵液中，在温度为25℃的条件下进行发酵，时间为30天，得到经表观修饰的海洋真菌；
4)提取：将30L发酵液通过粗棉布过滤以分离滤液和菌丝，滤液用等效体积的乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液，菌丝用80％丙酮萃取三次，丙酮溶液经减压浓缩，然后以乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液，两个乙酸乙酯溶液组合在一起。并在减压下浓缩，得到41.9g乙酸乙酯溶液提取物；
5)分离纯化：将乙酸乙酯提取物利用减压硅胶柱色谱进行逐步洗脱，洗脱液为石油醚-CH2Cl2(1:1和0:1)和CH2Cl2-MeOH(100％～0％)的屈服梯度6个主要馏分(馏分1～6)，6.4g的馏分2通过Sephadex LH-20(1:1CH2Cl2-MeOH)进一步纯化，得到268mg馏分2.3，馏分2.3继续用HPLC纯化，洗脱液为75％MeOH-H2O，获得16.7mg化合物I(tR＝9.4min)；9.0g的馏分3通过Sephadex LH-20(1:1CH2Cl2-MeOH)进一步纯化，得到1.9g馏分3.3和1.5g馏分3.4，其中馏分3.3继续用HPLC纯化，洗脱液为70％MeOH-H2O，获得54.1mg化合物II(tR＝11.5min)和18.2mg化合物III(tR＝16.4min)。
其中，脉冲电场的场强为18kV/cm，脉冲频率为1.8kHz，脉冲宽度为1.4μs，流速为30mL/min；紫外线的波长为180nm。发酵液按照如下成分配制：10g/L葡萄糖、20g/L麦芽糖、20g/L甘露醇、10g/L谷氨酸单钠、0.5g/L KH2PO4、0.3g/L MgSO4·7H2O、3g/L酵母抽提物、33g/L SEA盐、10μM TSA和1L自来水。
实施例3：
次级代谢物按照以下方法提取而得：
1)真菌材料：从来自青岛石老人海水浴场浒苔样品中分离出真菌菌株土曲霉OUCMDZ-2739，浒苔样品依次用无菌海水、75％乙醇和无菌水洗涤。然后，用研钵捣碎样品，然后存放于含有100mg/mL氯霉素的PDA培养基(每升含马铃薯提取物200克，葡萄糖20克，琼脂15克，和海水1L)中，在28℃下培养至出现单一菌种，将该菌种转移到另一PDA培养基并储存于4℃，通过多相分类学研究、菌落形态及18S rRNA序列分析、菌株发育树的建立，鉴定其为土曲霉OUCMDZ-2739；
2)扩大培养：将土曲霉Aspergillus terreus OUCMDZ-2739接种在培养基中扩大培养，得真菌种子液；
3)表观遗传修饰调控：将上述真菌种子液按接种量为5％接种到经脉冲电场和紫外线进行灭菌处理的发酵液中，在温度为28℃的条件下进行发酵，时间为35天，得到经表观修饰的海洋真菌；
4)提取：将30L发酵液通过粗棉布过滤以分离滤液和菌丝，滤液用等效体积的乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液，菌丝用80％丙酮萃取三次，丙酮溶液经减压浓缩，然后以乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液，两个乙酸乙酯溶液组合在一起。并在减压下浓缩，得到39.6g乙酸乙酯溶液提取物；
5)分离纯化：将乙酸乙酯提取物利用减压硅胶柱色谱进行逐步洗脱，洗脱液为石油醚-CH2Cl2(1:1和0:1)和CH2Cl2-MeOH(100％～0％)的屈服梯度6个主要馏分(馏分1～6)，6.1g的馏分2通过Sephadex LH-20(1:1CH2Cl2-MeOH)进一步纯化，得到253.8mg馏分2.3，馏分2.3继续用HPLC纯化，洗脱液为75％MeOH-H2O，获得15.9mg化合物I(tR＝9.4min)；8.5g的馏分3通过Sephadex LH-20(1:1CH2Cl2-MeOH)进一步纯化，得到1.8g馏分3.3和1.4g馏分3.4，其中馏分3.3继续用HPLC纯化，洗脱液为70％MeOH-H2O，获得51.2mg化合物II(tR＝11.5min)和17.3mg化合物III(tR＝16.4min)。
其中，脉冲电场的场强为20kV/cm，脉冲频率为2.0kHz，脉冲宽度为1.5μs，流速为40mL/min；紫外线的波长为200nm。发酵液按照如下成分配制：15g/L葡萄糖、22g/L麦芽糖、23g/L甘露醇、12g/L谷氨酸单钠、0.6g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、4g/L酵母抽提物、35g/L SEA盐、11μM TSA和1L自来水。
实施例4：
表观修饰土曲霉次级代谢物在制备抗肿瘤药物中的用途，取化合物I添加散剂的常规辅料，按照常规方法制成散剂。
实施例5：
表观修饰土曲霉次级代谢物在制备抗肿瘤药物中的用途，取化合物II添加片剂的常规辅料，按照常规方法制成片剂。
实施例6：
表观修饰土曲霉次级代谢物在制备抗肿瘤药物中的用途，取化合物III添加颗粒剂的常规辅料，按照常规方法制成颗粒剂。
实施例7：
表观修饰土曲霉次级代谢物在制备抗肿瘤药物中的用途，按照重量比为1:2.4:0.7取化合物I、化合物II和化合物III，添加胶囊剂的常规辅料，按照常规方法制成胶囊剂。
实施例8：
表观修饰土曲霉次级代谢物在制备抗肿瘤药物中的用途，按照重量比为1:2.8:0.9取化合物I、化合物II和化合物III，添加胶囊剂的常规辅料，按照常规方法制成胶囊剂。
实施例9：
表观修饰土曲霉次级代谢物在制备抗肿瘤药物中的用途，片剂的制备：按照重量比为1:2.5:0.76取化合物I、化合物II和化合物III，添加胶囊剂的常规辅料，按照常规方法制成胶囊剂。
实施例10：
表观修饰土曲霉次级代谢物在制备抗肿瘤药物中的用途，片剂的制备：按照重量比为1:2.5:0.76取化合物I、化合物II和化合物III，添加胶囊剂的常规辅料(其中辅料中包含鸟嘌呤、连翘苷和P-糖蛋白抑制剂)，按照常规方法制成胶囊剂。
实施例11：
表观修饰土曲霉次级代谢物在制备抗肿瘤药物中的用途，片剂的制备：按照重量比为1:2.5:0.76取化合物I、化合物II和化合物III，添加胶囊剂的常规辅料(其中辅料中包含ELP纳米颗粒、鸟嘌呤、连翘苷和P-糖蛋白抑制剂)，按照常规方法制成胶囊剂。
对比例1：
本实施例与实施例2的技术方案的区别在于：本实施例用发酵液高温杀菌，得到31.2g乙酸乙酯溶液提取物；将乙酸乙酯提取物利用减压硅胶柱色谱进行逐步洗脱，洗脱液为石油醚-CH2Cl2(1:1和0:1)和CH2Cl2-MeOH(100％～0％)的屈服梯度6个主要馏分(馏分1～6)，4.8g的馏分2通过Sephadex LH-20(1:1CH2Cl2-MeOH)进一步纯化，得到200mg馏分2.3，馏分2.3继续用HPLC纯化，洗脱液为75％MeOH-H2O，获得12.5mg化合物I(tR＝9.4min)；6.7g的馏分3通过Sephadex LH-20(1:1CH2Cl2-MeOH)进一步纯化，得到1.4g馏分3.3和1.1g馏分3.4，其中馏分3.3继续用HPLC纯化，洗脱液为70％MeOH-H2O，获得40.3mg化合物II(tR＝11.5min)和13.6mg化合物III(tR＝16.4min)。对比实施例2和对比例1可知，实施例2获得的乙酸乙酯溶液提取物远多于对比例1，这说明，脉冲电场和紫外线的共同作用，能够确保浒苔来源真菌的表观遗传修饰顺利进行，提高其次级代谢产物的产量。
试验例1：
化合物I、化合物II和化合物III的细胞毒活性测试：
分别以人慢性髓性白血病K562细胞和MCF-7细胞为模型，阿霉素为阳性对照药，采用MTT比色法对目标次级代谢物的细胞毒活性测试。
MTT溶液的配制方法：称取MTT0.5g，溶于100mL的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃冰箱避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器要用铝箔纸包住，实验的时候关闭超净台上的日光灯以避光。
方法：取对数生长期的肿瘤细胞，将细胞密度调至每毫升2×105个/mL，按每孔200μL加到96孔细胞培养板中，于37℃通入5％CO2的培养箱中培养4h。样品分别设定5个浓度梯度，每个浓度设3个平行样，同时设阳性、阴性对照，每孔加样品液或空白液各2μL，培养72h，然后每孔加MTT液10μL，继续培养4h，37℃、2000r/min离心8min，吸去上清。每孔加入二甲基亚砜各100μL，在微量振荡器上振荡15min，至结晶完全溶解后，酶标仪测定每孔570nm处的吸光值(OD值)。取三孔的平均吸光值，并按IR％＝(OD空白对照-OD样品)/OD空白对照×100％公式计算样品对细胞增殖的抑制率，并采用bliss法计算出半数抑制率IC50。测得化合物I、II对细胞K562有抑制作用，IC50值分别为9.5和13.0μM。化合物II、III对细胞MCF-7有抑制作用，IC50值分别为10.1和8.5μM。表明：化合物I、II对人慢性髓性白血病K562细胞表现出一定的抑制活性，化合物II、III对人乳腺癌细胞MCF-7表现出一定的抑制活性，具有抗肿瘤活性。
试验例2：
抗肿瘤药物对细胞增殖的抑制率
细胞相对活力：按照试验例1中的方法进行测试，计算抗肿瘤药物对K562、K562/ADR、MCF-7、MCF-7/ADR细胞增殖的抑制率，结果如表1所示。
表1抗肿瘤药物对细胞增殖的抑制率
项目 K562 K562/ADR MCF-7 MCF-7/ADR
实施例4 9.6 299.3 0 0
实施例5 13.1 352.6 10.3 315.7
实施例6 0 0 8.6 266.1
实施例7 7.8 278.7 6.8 230.1
实施例8 7.7 275.3 7.0 256.7
实施例9 7.2 221.4 6.5 220.7
实施例10 6.4 196.2 6.0 169.4
由表1可知，实施例11对K562、K562/ADR、MCF-7、MCF-7/ADR细胞增殖的抑制率最大。对比实施例4、5、6、7、8和9可知，抗肿瘤药物中化合物I、化合物II和化合物III的重量比为1:2.4-2.8:0.7-0.9时，对人慢性髓性白血病K562细胞和人乳腺癌细胞MCF-7的抑制效果达到最佳，抗肿瘤活性较高，可以降低耐药细胞对药物的耐受性，并恢复对药物的敏感性，最终改善治疗的结果。对比实施例9和10可知，辅料中鸟嘌呤、连翘苷和P-糖蛋白抑制剂的存在可以引起药物相互作用，有效抑制肿瘤细胞的增殖。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (10)

1.表观修饰土曲霉次级代谢物，其特征在于，包括式I所示化合物I、式II所示化合物II和式III所示化合物III，
2.根据权利要求1所述的表观修饰土曲霉次级代谢物，其特征在于：所述化合物I对细胞K562的IC50值为9.5μM。
3.根据权利要求1所述的表观修饰土曲霉次级代谢物，其特征在于：所述化合物II对细胞K562的IC50值为13.0μM，对细胞MCF-7的IC50值为10.1μM。
4.根据权利要求1所述的表观修饰土曲霉次级代谢物，其特征在于：所述化合物III对细胞MCF-7的IC50值为8.5μM。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的表观修饰土曲霉次级代谢物，其特征在于：所述次级代谢物按照以下方法提取而得：
1)将土曲霉种子液接种到经脉冲电场和紫外线进行灭菌处理的发酵液中进行发酵，得到经表观修饰的海洋真菌；
2)将发酵结束后的发酵液通过粗棉布过滤以分离滤液和菌丝，分别用乙酸乙酯萃取，将所得乙酸乙酯萃取液合并，浓缩，得到乙酸乙酯溶液提取物；
3)将所述乙酸乙酯提取物利用减压硅胶柱色谱、Sephadex LH-20、HPLC进一步纯化，得到次级代谢物。
6.根据权利要求5所述的表观修饰土曲霉次级代谢物，其特征在于：所述脉冲电场的场强为15-20kV/cm，脉冲频率为1.5-2.0kHz，脉冲宽度为1.3-1.5μs，流速为20-40mL/min；所述紫外线的波长为150-200nm。
7.权利要求1-6任一项所述的表观修饰土曲霉次级代谢物在制备抗肿瘤药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的表观修饰土曲霉次级代谢物在制备抗肿瘤药物中的用途，其特征在于，所述抗肿瘤药物包括化合物I和/或化合物II和/或化合物III。
9.根据权利要求7或8所述的表观修饰土曲霉次级代谢物在制备抗肿瘤药物中的用途，其特征在于：所述抗肿瘤药物还包括药学上可接受的辅料。
10.根据权利要求7或8所述的表观修饰土曲霉次级代谢物在制备抗肿瘤药物中的用途，其特征在于，所述治疗糖尿病药物为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂或糖浆剂。
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