CN108165500A - 一株海洋真菌土曲霉c23-3、发酵液活性提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株海洋真菌土曲霉C23‑3、发酵液活性提取物及其制备方法和应用。所述海洋真菌土曲霉C23‑3于2018年1月22日保存于广东微生物菌种中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC No.60316。本发明对海洋真菌土曲霉Aspergillus terreus C23‑3的静置发酵液进行了活性物质的提取纯化，该菌株的发酵液总提取物能很好的抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶的活性，该菌株发酵液经过提纯后的活性提取物具有很好的抗氧化和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性，在制备抗老年痴呆药物方面，以及在制备抗氧化和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物方面具有很好的应用前景。

Description

一株海洋真菌土曲霉C23-3、发酵液活性提取物及其制备方法 和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地，涉及一株海洋真菌土曲霉C23-3、发酵液活性提取物及其制备方法和应用。

背景技术

目前的研究结果表明，阿尔茨海默症的发生与神经损伤和乙酰胆碱的缺失有着密切关系， AD 的标志性病变 β-淀粉样蛋白（Aβ）和磷酸化微管蛋白（Tau）等，能刺激活性氧簇（ROS）的生成，引起氧化应激，损伤神经元，引起认知功能障碍。氧化应激状态的持续激活能够进一步促进 Aβ 和磷酸化 Tau 的聚集和沉积、线粒体损伤，导致 AD 的发生并加速其病理进程。抗氧化剂可以清除大脑中的氧化物并防止氧化物的形成，抑制促氧化酶活性，中和自由基，或通过螯合促进自由基生成的过渡金属离子，从而缓解患者淀粉样蛋白(A β）的非正常聚集导致的老年斑的形成和微管相关蛋白（Tau）的过度磷酸化而导致的神经纤维缠结，进而起到保护神经的作用，改善患者认知能力；乙酰胆碱酯酶抑制剂则通过抑制乙酰胆碱酯酶活性，提高突触间隙乙酰胆碱水平，从而改善患者认知障碍，缓解老年痴呆患者症状。

现有的应用于临床的老年痴呆治疗药物主要是AChE抑制剂，包括毒扁豆碱、加兰他敏、石杉碱甲、利斯的明、安吖啶他克林及哌啶多奈哌齐等，这些药物价格昂贵，并且除了石杉碱甲外均具有一定的毒副作用，因此，筛选毒性低、活性好、产量高的天然来源的抗氧化剂和乙酰胆碱酯酶抑制剂对于阿尔茨海默症的预防和治疗具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于是克服现有老年痴呆治疗药物毒副作用大、价格昂贵的缺陷与不足，提供一种海洋真菌土曲霉Aspergillus terreus C23-3。本发明提供的海洋真菌土曲霉Aspergillus terreus C23-3的发酵液中含有具有较好抗氧化活性和抑制乙酰胆碱酯酶活性的活性特征组分，在制备抗老年痴呆药物方面具有很好的应用前景。

本发明的另一目的在于提供一种具有抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶活性的海洋真菌土曲霉C23-3的发酵液活性提取物。

本发明的另一目的在于提供上述海洋真菌土曲霉C23-3的发酵液活性提取物的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述海洋真菌土曲霉C23-3或海洋真菌土曲霉C23-3的发酵液活性提取物在制备抗老年痴呆药物方面的应用。

本发明的另一目的在于提供上述海洋真菌土曲霉C23-3或权利要求2所述发酵液活性提取物在制备抗氧化和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物方面的应用

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一株海洋真菌土曲霉Aspergillus terreus C23-3，所述海洋真菌土曲霉C23-3于2018年1月22日保存于广东微生物菌种中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC No.60316。

本发明提供的海洋真菌土曲霉的株号为C23-3，分类命名号为：Aspergillus terreus C23-3；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。

所述海洋真菌土曲霉（Aspergillus terreus）C23-3是从中国南海海域的牡丹珊瑚组织内分离获得，具有抗氧化活性和抑制乙酰胆碱酯酶活性，依据《真菌鉴定手册》（魏景超，1979）鉴定为Aspergillus terreus菌株。

通过进一步的分子生物学鉴定，确认该菌株为土曲霉。

具体地，所述海洋真菌土曲霉C23-316S rDNA的Genbank 登录号为MG707631。

优选地，所述菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

该菌株具有下述性质：接种到马铃薯海盐培养基（PSP）平板上，22～30℃培养，菌落开始时为浅黄色，致密毛绒状，圆形，向四周扩展，后从菌落中央产生褐色孢子，中央变成褐色，菌落周围有浅黄色菌丝的生长带，最后整个菌落全部变成褐色。

该菌株在温度为22～30 ℃，pH为6～7，盐浓度范围为2.0%～4.0%，在马铃薯海盐液体培养基中静置发酵可产生抗氧化和/或乙酰胆碱酯酶抑制剂活性物质。

从上述菌株的发酵液中可提取的到具有抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶活性的活性物质。

一种具有抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶活性的海洋真菌土曲霉C23-3的发酵液活性提取物，是由权利要求1所述的海洋真菌土曲霉C23-3的发酵液提取得到。

当然，也可从该菌株的发酵液中单独提取具有抗氧化或抑制乙酰胆碱酯酶活性的活性物质。

一种具有抗氧化活性的海洋真菌土曲霉C23-3的发酵液活性提取物，是由上述海洋真菌土曲霉C23-3的发酵液经过提取得到。

一种具有抑制乙酰胆碱酯酶活性的海洋真菌土曲霉C23-3的发酵液活性提取物，是由上述海洋真菌土曲霉C23-3的发酵液经过提取得到。

优选地，所述发酵液活性提取物包括活性特征组分1：丁内酯-Ⅰ和活性特征组分2：土震素B。

丁内酯-Ⅰ具有抗氧化作用，土震素B具有抑制乙酰胆碱酯酶作用。

优选地，所述活性特征组分1和2在以下液相色谱分析条件下的色谱峰保留时间分别为5.485 min和1.840min：色谱柱为Agilent反相分析柱，4.6 mm * 250 mm，填料粒径4µm，流动相分别为60 %甲醇和纯甲醇，流速1 mL/min。进样量5μL，浓度1 mg/mL。

优选地，所述活性特征组分的薄层色谱的比移值及化学显色特征如下：

活性特征组分1：层析展开剂为氯仿：甲醇=5:1时，活性特征组分在GF254薄层硅胶板上R_f值为0.5，254nm紫外线照射下呈单个、均匀的黑色斑点，310 nm下呈均匀的蓝色荧光斑点，在254nm和310 nm下呈暗蓝色斑点，365 nm下无吸收。茴香醛硫酸显色为紫色；

活性特征组分2：层析展开剂为氯仿：甲醇=10:1时，活性特征组分在GF254薄层硅胶板上R_f值为0.5，254nm紫外线照射下呈单个、均匀的暗蓝色斑点，365 nm下呈均匀的蓝色荧光斑点，茴香醛硫酸显色为黄色。

上述海洋真菌土曲霉C23-3的发酵液活性提取物的制备方法，所述制备方法包括如下制备步骤：

S1：培养发酵液：将海洋真菌土曲霉C23-3接种于灭菌的液体培养基中培养21～30天；

S2：提取发酵产物：将步骤S1所得发酵液经杀菌，破壁处理后，加入硅藻土得混合液，然后将混合液抽滤萃取、减压浓缩蒸干，得到的活性粗提物即为所述发酵液活性提取物。

本发明提供的海洋真菌土曲霉C23-3的发酵液活性提取物的制备方法可制备得到较好的具有抗氧化性和抑制乙酰胆碱酯酶活性的活性特征组分。

将本发明制备得到的发酵液活性提取物进行进一步的纯化，可进一步得到高纯度的活性特征组分1：丁内酯-Ⅰ和活性特征组分2：土震素B。

优选地，所述制备方法还包括对S2所得活性粗提物进行纯化的S3步骤：

S3：将步骤S2所得粗提物溶解，加入硅胶，减压浓缩至干燥，然后利用硅胶层析柱洗脱，薄层色谱生物活性自显影法追踪活性物质，并用反相制备液相进一步分离，收集活性峰，浓缩干燥即可得到纯化的活性提取物。

优选地，步骤S1所述培养发酵液的具体方法为：

（1）种子培养：将菌种接种到无菌的种子固体培养基上，将培养基置于22～30℃、中等湿度条件下培养3～5天；

（2）扩大培养：按照每1000 mL液体培养基接种上述步骤（1）培养后的带菌培养基块30～60 cm²的比例接种，培养18～25天，即得发酵液。

更具体的，所述培养基配方如下：

种子固体培养基为：每400～600mL新鲜土豆汁中加入，海盐15～25g，蔗糖15～25g，蛋白胨3～8 g，琼脂15～20g，蒸馏水400～600mL，pH值6～8；

液体培养基为：每400～600mL新鲜土豆汁中加入，海盐15～25g，蔗糖15～25g，蛋白胨3～8 g，蒸馏水400～600mL，pH值6～8；

其中，马铃薯煮汁：取新鲜马铃薯去皮切成1cm³大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500～800mL煮沸20～30min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500mL。

优选地，步骤S2所述提取发酵产物的具体方法为：

（1）提取：将步骤S1得到的发酵液，用乙酸乙酯过夜杀菌，然后超声破壁处理20～40min，加入硅藻土抽滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取2～5次，得到乙酸乙酯提取物；滤饼用甲醇浸泡12～24 h后，超声20～40 min，抽滤，得到甲醇提取物；如此重复2～5次；

（2）浓缩：将乙酸乙酯提取物和甲醇提取物分别减压浓缩，合并提取物并离心后，继续减压蒸干，得到干固体，即为活性粗提取物。

优选地，步骤S3所述纯化粗提物的具体方法为：

（1）将发酵提取物溶于甲醇，加入到相当于其干重1～4倍重量的100～200目硅胶，减压浓缩至干燥，上样于40～100倍样品干重的200～300目硅胶层析柱上，依次用100:0～0:100的石油醚-乙酸乙酯和2:1～0:1的氯仿-甲醇混合液进行梯度洗脱，收集其中石油醚：乙酸乙酯=5:5和3:7的洗脱部分，并采用薄层色谱生物活性自显影法追踪活性物质；

（2）将有活性物质的组份样品采用Sephadex LH-20凝胶柱层析，流动相为纯甲醇；之后将有活性物质的组份样品进行反相C18硅胶柱层析，流动相为40%～60 %的甲醇，最后用反相制备液相制备，液相条件分别为：活性特征组分1，流动相为体积比40%～60 %的甲醇，在硅胶柱填充10～15g反相硅胶，流速为4～8 mL/min，收集保留时间为5～20 min的主峰；活性特征组分2，流动相为体积比40%～60 %的甲醇，在硅胶柱填充10～15g反相硅胶，流速为4～8 mL/min，收集保留时间为5～15 min的主峰。

另外，以下所述的应用均应在本发明的保护范围之内：

海洋真菌土曲霉C23-3或其发酵液活性提取物在制备抗老年痴呆药物方面的应用。

海洋真菌土曲霉C23-3或其发酵液活性提取物在制备抗氧化和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物方面的应用。

本发明所筛选得到的海洋真菌土曲霉C23-3通过静置发酵后，其发酵液的乙酸乙酯提取物与菌丝体甲醇提取物合并得到的总粗提物具有抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶活性，将该粗提取物进一步经Sephadex LH-20凝胶柱层析、反相硅胶柱层析和反相制备液相纯化后得到的有效活性组分1和组分2，分别具有显著的抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶活性，在制备抗老年痴呆药物方面具有很好的应用前景。

本发明通过薄层色谱生物活性自显影显示组分1具有DPPH自由基清除活性。

本发明通过薄层色谱生物活性自显影显示组分2具有抑制乙酰胆碱酯酶活性。

本发明的海洋真菌土曲霉C23-3发酵液及其活性提取物，以及其中的有效组分，可以用于制备抗老年痴呆的药物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明筛选分离得到一株海洋真菌土曲霉（Aspergillus terreus）C23-3，该菌株及其培养物具有抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶的活性，在制备抗老年痴呆药物方面，以及在抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物方面具有很好的应用前景。

同时，本发明还对海洋真菌土曲霉C23-3的发酵液进行了活性物质的提取纯化，得到的总提取物和其中的活性组分具有很好的抗氧化活性和/或抑制乙酰胆碱酯酶的活性，在制备抗老年痴呆药物方面，以及在制备抗氧化和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物方面具有很好的应用前景。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1 海洋真菌土曲霉C23-3的分离与鉴定

1、菌株的分离方法

（1）样品：中国南海海域的牡丹珊瑚。

（2）分离方法

将珊瑚用无菌海水清洗3次，用灭过菌的研钵和研杵在室温无菌环境条件下将其研磨至泥浆状，用经灭菌的药匙取少许（1g左右）于9 mL无菌海水中，加玻璃珠振荡1 min，后静置20 min，取上清液制成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4倍稀释液，分别吸取10^-1、10^-2、10^-3、10^-4稀释度的100 µL样品稀释液到相应的分离培养基平板上，用无菌玻璃涂布棒在相应培养基表面轻轻地涂布均匀，于28℃恒温培养箱，培养3～5 d。再将初始呈浅黄色绒毛状扩展生长而后显褐色、中间呈絮状的菌落用无菌刀片切取菌丝尖端，转移到新的平板固体培养基上，继续在28℃下培养3天，如此重复三次，得到纯菌株。

另外，分离过程中所使用的平板固体培养基为马铃薯琼脂培养基（PDA），其成分为：每升中含500 mL马铃薯煮汁，20g葡萄糖，20g粗海盐，121℃下20 min高压灭菌后可用。

其中，马铃薯煮汁：取新鲜马铃薯去皮切成1cm³大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500 mL煮沸20 min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500mL。

2、菌株鉴定

（1）形态学鉴定：将得到的纯菌株接种到海水PSA平板上，28℃培养，观察菌落形体特征，包括菌落中心及边缘部分的质地与颜色，参照魏景超编著的《真菌鉴定手册》对其进行形态学鉴定。

（2）鉴定到一株属于土曲霉的菌株，进一步对其进行分子生物学验证：

将菌株接种到海水PSA平板上28℃下培养4天后，将其接种到PSA小斜面的冻存管中，继续培养3～5 d，送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，测序结果显示其Genbank序列号为MG707631与Genbank数据库中的序列进行BLAST比对，根据序列相似性，将该菌株鉴定为土曲霉。

3、经过上述分离鉴定，结果显示，筛选得到一株海洋真菌土曲霉。

接种到马铃薯海盐培养基（PSP）平板上，28 ℃培养，菌落开始时为浅黄色，致密毛绒状，圆形，向四周扩展，后从菌落中央产生褐色孢子，中央变成褐色，菌落周围有浅黄色菌丝的生长带，最后整个菌落全部变成褐色。

该菌株在温度为28 ℃，pH为7.4±0.2，盐浓度范围为2.0%～4.0%，在马铃薯海盐液体培养基中静置发酵可产生抗氧化和/或乙酰胆碱酯酶抑制剂活性物质。于2018年1月22日保存于广东微生物菌种中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC No.60316，株号为C23-3，Genbank号为：MG707631；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。

测序结果如下：GCTTCGGCGGGCCCGCCAGCGTTGCTGGCCGCCGGGGGGCGACTCGCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACATGAACCCTGTTCTGAAAGCTTGCAGTCTGAGTGTGATTCTTTGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCTCGTCCCCCGGCTCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCTTCCGCTCCGTAGGCCCGGCCGGCGCCCGCCGACGCATTTATTTGCAACTTGTTTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCCGGAGAAA。

实施例2 海洋真菌土曲霉C23-3发酵总提取物活性测试

1、土曲霉C23-3发酵总提取物的获得

（1）种子培养：将菌种从斜面上接种到无菌的种子固体培养基平板上，将培养皿平板置于恒温（28℃）恒湿（70%）培养箱中下倒置培养，培养时间为4～5天；

（2）扩大培养：将1L液体培养基灌装到3L三角瓶中，用透气封口膜封口后于高压灭菌锅中121℃、0.1 Mpa灭菌20min；冷却后按照每1000mL液体培养基接种上述步骤（1）培养后的种子平板带菌培养基块种子平板带菌培养基块30～40 cm²的比例接种，封口，置于恒温28℃室内培养，自然光照，培养时间为21～24天，得到发酵液。

其中，所用到的培养基如下：

种子固体培养基为：每500mL马铃薯煮汁中加入20.0g蔗糖、20.0g海盐、5 g蛋白胨和15.0g琼脂，pH为7.4±0.2；

液体培养基为：每500mL马铃薯煮汁中加入20.0g蔗糖、20.0g海盐和5 g蛋白胨，pH为7.4±0.2；

其中，马铃薯煮汁：取新鲜马铃薯去皮切成1cm³大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500 mL煮沸20 min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500mL。

（3）提取：步骤（2）得到的发酵液用500mL乙酸乙酯过夜杀菌，然后超声处理30min，加入硅藻土抽滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯提取物；滤饼用3倍体积甲醇浸泡12～24 h后，超声30min，抽滤，得到甲醇提取物；如此重复3次；

将乙酸乙酯提取物和甲醇提取物分别用旋转蒸发仪于45℃减压浓缩，最后合并减压蒸干，得到一份干固体，为总活性粗提物；

2、土曲霉C23-3发酵总提取物的活性测试

（1）测试方法

酶抑制活性测试：在96孔板中加入20μg的样品（在测试体系中最终质量浓度为200μg/mL），晾干后依次加入5μL DMSO，45μL 0.1 M的PBS（pH =7.4），10μL终浓度为0.02 U/mLAChE，20 μL 5 mM DTNB，37 ℃孵育10 min，加入20μL 10 mM ATCh，再37 ℃孵育10 min后，用酶标仪在405 nm处检测OD值，其值为 OD _样品。同时每个样品都设一对应的样品本底，用同体积用BSA代替酶液，同上检测，设为 OD _样品本底。空白对照组用5μLDMSO代替样品，同上检测，设为 OD _空白；空白本底为用BSA代替酶液，其他反应条件同 OD_空白，其它同上检测，设为OD_空白本底，平行测定2次。设 AChE 抑制率为 I(%)，如下公式计算：I%=[(OD_空白-OD_空白本底)-(OD _样品-OD _样品本底)]/(OD _空白-OD_空白本底)×100%。，计算200μg/ mL时样品对乙酰胆碱酯酶的抑制率，阳性对照为他克林（Tacrine）。

抗氧化活性实验：实验组在96孔板中加入20μg的样品（在测试体系中最终质量浓度为0.2 mg/ mL），挥发干溶剂后加入50μL DMSO溶解，加入50μL 0.16 mmol/L DPPH甲醇溶液，混匀；对照组用等体积甲醇代替DPPH溶液；空白组是在50μL DPPH的甲醇溶液中加入50μL DMSO混合，空白对照组用50μL甲醇溶液代替等体积的DPPH。室温暗处放置30 min，于517nm处测定吸光度，分别记为A₁、A₂、A₃、A₄。清除率% = 100-(A₁-A₂)×100/(A₃-A₄)。式中，A₁为实验组的吸光值；A₂为实验对照组的吸光值；A₃为空白组的吸光值；A₄为空白对照组的吸光值。平行测定2次，计算200μg/ mL时样品对DPPH自由基的清除率，阳性对照为抗坏血酸（Vc）。

（2）结果

200μg/ mL时，发酵总提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制率为100.0%，阳性对照他克林为89.8%；发酵总提取物对DPPH自由基的清除率为69.8%，阳性对照抗坏血酸为91.6%。

上述结果显示，海洋真菌土曲霉C23-3的发酵总提取物具有很好的抑制乙酰胆碱酯酶活性和较好的抗氧化活性。

实施例3 海洋真菌土曲霉C23-3发酵液活性物质的提取

1、培养基

（1）种子固体培养基为：每500mL马铃薯煮汁中加入20.0g蔗糖、20.0g海盐、5 g蛋白胨和15.0g琼脂，pH为7.4±0.2；

（2）液体培养基为：每500mL马铃薯煮汁中加入20.0g蔗糖、20.0g海盐和5 g蛋白胨，pH为7.4±0.2；

其中，马铃薯煮汁：取新鲜马铃薯去皮切成1cm³大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500 mL煮沸20 min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500mL。

2、提取方法

（1）种子培养：将菌种从斜面上接种到无菌的种子固体培养基平板上，将培养皿平板置于恒温（28℃）恒湿（70%）培养箱中下倒置培养，培养时间为4～5天；

（2）扩大培养：将1L液体培养基灌装到3L三角瓶中，用透气封口膜封口后于高压灭菌锅中121℃、0.1 Mpa灭菌20min；冷却后按照每1000mL液体培养基接种上述步骤（1）培养后的种子平板带菌培养基块种子平板带菌培养基块30～40 cm²的比例接种，封口，置于恒温28℃室内培养，自然光照，培养时间为21～24天，得到发酵液。

（3）提取：步骤（2）得到的发酵液用500mL乙酸乙酯过夜杀菌，然后超声处理30min，加入硅藻土抽滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯提取物；滤饼用3倍体积甲醇浸泡12～24 h后，超声30min，抽滤，得到甲醇提取物；如此重复3次；

将乙酸乙酯提取物和甲醇提取物分别用旋转蒸发仪于45℃减压浓缩，最后合并减压蒸干，得到一份干固体，为总活性粗提物；

（4）提纯：将发酵提取物溶于甲醇，加入到相当于其干重2倍重量的100～200目硅胶，减压浓缩至干燥，上样于40～100倍样品干重的200～300目硅胶层析柱上，依次用100:0～0:100的石油醚-乙酸乙酯和2:1～0:1的氯仿-甲醇混合液进行梯度洗脱，收集其中石油醚：乙酸乙酯=5:5和3:7的洗脱部分，并采用薄层色谱生物活性自显影法追踪活性物质；将有活性物质的组份样品采用Sephadex LH-20凝胶柱层析，流动相为纯甲醇；之后将有活性物质的组份样品进行反相C18硅胶柱层析，分别得到纯化的活性组分1和2。活性组分1呈现无色油状，活性组分2呈白色粉末状。

3、薄层分析显示，活性组分1：层析展开剂为氯仿：甲醇=5:1时，在GF254薄层硅胶板（国家药典指定产品）上R_f值为0.5，254nm紫外灯下具黑色吸收，茴香醛硫酸显色为紫色；活性组分2：层析展开剂为氯仿：甲醇=10:1时，在GF254薄层硅胶板上R_f值为0.5，254nm紫外灯下具暗蓝色吸收，365 nm下显蓝色荧光，茴香醛硫酸显色为黄色。

4、对这2个组分进行了HPLC分析，Agilent反相分析柱，填料：EC.C18 4µm，尺寸：4.6 mm * 250 mm，流动相为甲醇水溶液，0～5 min甲醇比例从10%线性升至60 %，5～20min，甲醇比例为60 %，20～35 min甲醇比例线性升至100%，35～45 min甲醇比例线性降至10%，流速1 mL/min。

5、结果表明：得到的活性特征组分1的主要色谱峰保留时间为19.476 min，活性特征组分1的主要色谱峰保留时间为27.783 min。

实施例4 海洋真菌土曲霉C23-3发酵液活性物质的活性测定

薄层色谱生物活性自显影测试实施例3提取的发酵液活性组分的活性

（1）取GF254硅胶板，用干净的甲醇将其预展干净后晾干。

组分1：用毛细管取5µL组分样品点样于层析板上，用氯仿：甲醇=5：1展开，挥发干溶剂后，均匀喷上1.28mM的DPPH溶液，避光放置5min，观察实验现象；

组分2：用毛细管取5µL组分样品点样于层析板上，用氯仿：甲醇=10：1展开。挥发干溶剂后，均匀喷上0.5 U/mL 乙酰胆碱酯酶(AChE)，晾干，使酶液固定，然后在37℃的恒温培养箱中保湿孵育20min，孵育结束后，将DTNB与ATCh以1：1混合，喷雾到板子上，再37℃孵育10min，观察实验现象。

（2）实验结果：薄层色谱生物活性自显影结果显示，组分1具有清除DPPH自由基活性，呈现明显的活性斑点；组分2具有抑制乙酰胆碱酯酶活性，呈现明显的活性斑点。

序列表

<110> 广东海洋大学深圳研究院

<120> 一株海洋真菌土曲霉C23-3、发酵液活性提取物及其制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 526

<212> DNA

<213> 海洋真菌土曲霉(Aspergillus terreus)

<400> 1

gcttcggcgg gcccgccagc gttgctggcc gccggggggc gactcgcccc cgggcccgtg 60

cccgccggag accccaacat gaaccctgtt ctgaaagctt gcagtctgag tgtgattctt 120

tgcaatcagt taaaactttc aacaatggat ctcttggttc cggcatcgat gaagaacgca 180

gcgaaatgcg ataactaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgagt ctttgaacgc 240

acattgcgcc ccctggtatt ccggggggca tgcctgtccg agcgtcattg ctgccctcaa 300

gcccggcttg tgtgttgggc cctcgtcccc cggctcccgg gggacgggcc cgaaaggcag 360

cggcggcacc gcgtccggtc ctcgagcgta tggggcttcg tcttccgctc cgtaggcccg 420

gccggcgccc gccgacgcat ttatttgcaa cttgtttttt tccaggttga cctcggatca 480

ggtagggata cccgctgaac ttaagcatat caataagccg gagaaa 526

Claims (10)

1.一株海洋真菌土曲霉Aspergillus terreus C23-3，其特征在于，所述海洋真菌土曲霉C23-3于2018年1月22日保存于广东微生物菌种中心，保藏编号为GDMCC No.60316。

2.根据权利要求1所述海洋真菌土曲霉C23-3，其特征在于，所述海洋真菌土曲霉C23-316S rDNA的Genbank 登录号为MG707631。

3.根据权利要求1所述海洋真菌土曲霉C23-3，其特征在于，所述海洋真菌土曲霉C23-3在马铃薯海盐培养基上22～30℃培养，菌落开始时为浅黄色，致密毛绒状，圆形，向四周扩展，后从菌落中央产生褐色孢子，中央变成褐色，菌落周围有浅黄色菌丝的生长带，最后整个菌落全部变成褐色。

4.一种具有抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶活性的海洋真菌土曲霉C23-3的发酵液活性提取物，其特征在于，是由权利要求1所述的海洋真菌土曲霉C23-3的发酵液提取得到。

5.根据权利要求4所述海洋真菌土曲霉C23-3的发酵液活性提取物，其特征在于，所述发酵液为所述海洋真菌土曲霉C23-3在温度为22～30℃，pH为6～7，盐浓度范围为2.0%～4.0%，在马铃薯海盐液体培养基中静置发酵得到。

6.根据权利要求4所述海洋真菌土曲霉C23-3的发酵液活性提取物，其特征在于，所述发酵液活性提取物包括活性特征组分1：丁内酯-Ⅰ和活性特征组分2：土震素B。

7.权利要求4~6任一所述海洋真菌土曲霉C23-3的发酵液活性提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下制备步骤：

S1：培养发酵液：将海洋真菌土曲霉C23-3接种于灭菌的液体培养基中培养21～30天；

S2：提取发酵产物：将步骤S1所得发酵液经杀菌，破壁处理后，加入硅藻土抽滤、萃取、减压浓缩蒸干，得到的活性粗提物即为所述发酵液活性提取物。

8.根据权利要求7所述海洋真菌土曲霉C23-3的发酵液活性提取物，其特征在于，所述制备方法还包括对S2所得活性粗提物进行纯化的S3步骤：

S3：将步骤S2所得粗提物溶解，加入硅胶，减压浓缩至干燥，然后利用硅胶层析柱洗脱，薄层色谱生物活性自显影法追踪活性物质，并用反相制备液相进一步分离，收集活性峰，浓缩干燥即可得到纯化的活性提取物。

9.权利要求1所述海洋真菌土曲霉C23-3或权利要求2所述发酵液活性提取物在制备抗老年痴呆药物方面的应用。

10.权利要求1所述海洋真菌土曲霉C23-3或权利要求2所述发酵液活性提取物在制备抗氧化和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物方面的应用。