CN109439705B - 一种柳珊瑚酸的微生物制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种柳珊瑚酸的微生物制备方法，属于微生物技术领域。本发明所用生物菌(Aspergillus sp.)的保藏号为GDMCC No.60476，通过本发明生物菌制备柳珊瑚酸的方法首次提供了柳珊瑚酸的微生物制备方法，首次证实柳珊瑚酸的真正来源是由共附生微生物所产生，真正解决其来源问题；首次从培养基入手，对其生长环境进行调控，观察富营养、生物转化对目标产物柳珊瑚酸产生的影响；首次从软珊瑚共附生真菌中分离得到柳珊瑚酸，证明了宿主所产生的次生代谢产物往往是其共附生、内生或其环境微生物产生的假说。

Description

一种柳珊瑚酸的微生物制备方法
技术领域
本发明涉及一种柳珊瑚酸的微生物制备方法，属于微生物技术领域。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’disease，AD)是一种神经退行性疾病，以进行性的记忆、认知损害及个性改变为主要特征。AD是老年痴呆症最常见的原因，占比60％～80％。目前我国AD患者已经达600万，随着我国人口老龄化的加剧，发病率将呈逐渐上升趋。据估计，目前世界上有5000万老年痴呆症患者，预计2030年将达到0.82亿，而2050年将达到1.52亿。从2000年到2013年，卒中、心脏病和前列腺肿瘤导致的死亡分别下降了23％、14％和11％，而AD导致的死亡增加了71％。同时，患者丧失个人生活和行为能力，给社会和家庭带来了巨大的负担。近年来认为老年性痴呆是由于大脑皮层Ach-E缺损而引起的。痴呆的严重程度与记忆的缺损和皮层的胆碱能传到有关。毒扁豆碱能改善老年性痴呆患者的记忆，但其缺点是治疗指数低，口服生物利用度极低，且化学性质不稳定。他克林(tacrine)1993年已获得美国FDA批准，但它也具有一定的肝毒性。因此，寻找新的可逆性胆碱酯酶抑制剂和乙酰胆碱促效剂来治疗老年性痴呆，是当今新药研究中很活跃的领域。
柳珊瑚酸为无色柱状晶体，m.p.178～180℃，分子式：C15H20O3，结构特征：三环倍半萜、且均为五元环，环张力大，A/B、B/C环均顺式骈并。柳珊瑚酸是目前为止首个具有三环十一烷(cyclopentapentalane)骨架的化合物，1979年从海洋侧扁软柳珊瑚Suberogoriaappressa中得到。1985年，中科院生物物理研究所和美国加州大学William Fenical教授通过XRD确定其结构，同时进行了系列类似物的合成研究。天然的柳珊瑚酸(1)及其类似物(2～8)的结构式如下所示：
Figure BDA0001893122230000021
文献药理活性研究表明柳珊瑚酸及其合成类似物具有强烈的神经毒性，当其高剂量为20mg/kg(LD50)时，具有强烈的心肌毒性；但在3mg/kg(LD50)时其又表现为抗神经毒活性，其已作为心肌毒解毒剂引起国防部门的极大关注。动物实验还表明柳珊瑚酸还具有抗心律失常，对心肌缺血在灌注损伤有明显的保护，并具有抗利尿的作用；同时表明柳珊瑚酸的药理作用与受体及离子流无关，而与酶系统有关。在研究柳珊瑚酸对离体心房肌和离体回肠的生理特性时，均发现柳珊瑚酸的作用于离子流无直接关系，而与Ach-E有关。但在柳珊瑚酸对记忆研究中发现其对记忆有改善作用，且其作用于抗乙酰胆碱酯酶(Ach-E)有关。柳珊瑚酸(suberogorgin)高剂量时表现为神经毒性，低剂量时表现为抗神经毒性，即其在高剂量时表现为拟胆碱作用，而在低剂量表现为Ach-E保护作用，属于药理学理论中的“可逆性胆碱酯酶抑制剂”。因此，柳珊瑚酸及其衍生物有望成为新的老年性痴呆症治疗药物，且该研究已经进入临床前试验阶段。
文献研究表明，柳珊瑚酸自1982年从海洋侧扁软柳珊瑚Suberogoria appressa中得到以来，已经从4种柳珊瑚(软柳珊瑚Subergorgia suberosa(中国南海、印度、中国台湾)、粗枝竹节柳珊瑚Isis hippuris、小月柳珊瑚Menella sp.和 Leptogorgia rigida)和一种短指软珊瑚Sinularia brassica中分离得到，而柳珊瑚酸类似物2β-羟基柳珊瑚酸(2-β-Hydroxysubergorgic acid)还来源于来源于小月柳珊瑚Menella kanisa。而2β-羟基柳珊瑚酸甲酯(2β-Hydroxy methyl ester of subergorgic acid)还曾经从陆生萝藦科须药藤属植物生藤Stelmatocrypton khasianum(Benth.)H.Bail.的干燥藤中得到。
由于其独特的结构和强烈的神经毒性，从发现至今经历了近40年的时间里，合成化学家对其进行不断探索，但关于柳珊瑚酸的全合成仅有10多个相关报道。其中五个小组直接研究了柳珊瑚酸的全合成，5个组成功的不对称全合成了柳珊瑚酸：其中两个组得到的是外消旋体(racemic)，而两个组则采用对映选择性合成策略(enantioselectivecategory)。而最近Gilbert采用Michael加成、Dreiding 方法等通过多步不对称的全合成了与文献报道的一致立体结构的柳珊瑚酸。其中，美国斯坦福大学Wender等以溴对二甲苯为原料，应用芳烃-链烯烃的光化学环合经过11步反应得到外消旋的柳珊瑚酸。此合成途径被称为经典的柳珊瑚酸合成的成功典型，但产率不高。纵观所有的全合成得到柳珊瑚酸步骤繁琐，且需要不对称合成，为其真正工业化生产带来了极为不利的因素。至今为止，未见有关柳珊瑚酸的微生物制备报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种柳珊瑚的微生物制备方法，首次提供了柳珊瑚的微生物制备方法，首次证实柳珊瑚酸的真正来源是由共附生微生物所产生，真正解决其来源问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：生物菌(Aspergillus sp.)在制备柳珊瑚酸中的应用，所述生物菌的保藏号为GDMCC No.60476。
第二方面，本发明提供了一种柳珊瑚酸的微生物制备方法，包括以下步骤：将保藏号为GDMCC No.60476的生物菌(Aspergillus sp.)接种于PDA液体培养基中培养，得种子培养液；将种子培养液移入至发酵培养基中培养，得到柳珊瑚酸。
作为本发明所述微生物制备方法的优选实施方式，所述发酵培养基为以下培养基中的一种：
PDA培养基：葡萄糖2.0％、土豆200g/L、余量为陈海水，盐度3.5％，pH 自然；
GPY+CaCO3培养基：葡萄糖1.0％、酵母膏0.2％、蛋白胨0.1％、海盐0.25％、 CaCO30.1％，pH＝7.5；
真1培养基：山梨醇5.0％、麦芽糖4.0％、味精1.0％、色氨酸0.05％、酵母膏1.3％、MgSO4·7H2O 0.03％、KH2PO4 0.05％、余量为陈海水，pH＝6.5；
固体培养基4：丝苗4g、陈海水80mL、蛋白胨0.3％。
作为本发明所述微生物制备方法的优选实施方式，具体操作为：将保藏号为GDMCCNo.60476的生物菌(Aspergillus sp.)接种于PDA液体培养基中，在 25～28℃的恒温摇床中以150～170转/分钟的转速培养2～3天，得种子培养液；将种子培养液以1.5％的接种量移入至发酵培养基中，于25～28℃下静置培养48～60 天，得到柳珊瑚酸；所述PDA液体培养基由以下成分组成：土豆200g/L、葡萄糖2.0％、余量为陈海水，自然pH。
作为本发明所述微生物制备方法的优选实施方式，发酵培养基为PDA培养基、GPY+CaCO3培养基、真1培养基时，产物后处理的方法为：发酵培养基用纱布过滤，得到菌丝体和发酵液；将发酵液先后用等体积的乙酸乙酯、正丁醇萃取三次，萃取液进行浓缩，得到发酵液乙酸乙酯相浸膏、发酵液正丁醇相浸膏；将菌丝体用甲醇提取3次，合并甲醇提取液，减压浓缩得到甲醇浸膏，用水涅溶后，先后用等体积的乙酸乙酯、正丁醇萃取三次，得到菌丝体乙酸乙酯相浸膏、菌丝体正丁醇相浸膏。
作为本发明所述微生物制备方法的优选实施方式，发酵培养基为固体培养基4时，产物后处理的方法为：发酵培养基加入等体积的乙酸乙酯振摇萃取3 次，萃取液进行浓缩，得到发酵液乙酸乙酯相浸膏。
作为本发明所述微生物制备方法的优选实施方式，所述柳珊瑚酸的分离方法为：取PDA培养基发酵的菌丝体乙酸乙酯相浸膏或发酵液乙酸乙酯相浸膏经硅胶柱分离，以石油醚-乙酸乙酯体系梯度洗脱，得到柳珊瑚酸。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明首次提供了柳珊瑚酸的微生物来源及其制备方法，首次证实柳珊瑚酸的真正来源是由共附生微生物所产生，真正解决其来源问题；首次从培养基入手，对其生长环境进行调控，观察富营养、生物转化对目标产物柳珊瑚酸产生的影响；首次从软珊瑚共附生真菌中分离得到柳珊瑚酸，证明了宿主所产生的次生代谢产物往往是其共附生、内生或其环境微生物产生的假说。
附图说明
图1为本发明液体和固体培养基中菌种的生长图。
图2为本发明生物转化培养基中菌种的生长图。
图3为本发明不同培养基次生代谢产物后处理的流程图。
图4为本发明柳珊瑚酸的分离流程示意图。
图5为柳珊瑚酸ESI-MS图谱。
图6为柳珊瑚酸1H-NMR(CD3OD)图谱。
图7为柳珊瑚酸13C-DEPT 90-NMR(CD3OD)图谱。
图8为柳珊瑚酸13C-DEPT 135-NMR(CD3OD)图谱。
图9为柳珊瑚酸13C-NMR(CD3OD)图谱。
图10为液体培养基菌丝体(S)和菌液(B)及单体对照品编号及相应Node颜色列表图。
图11为液体培养基中柳珊瑚酸的GNPS分析图；其中，左图为ST1，右图为不同培养基中ST1情况，Node颜色代表不同培养基中含有ST1情况，右图 Node中饼图的大小代表其对ST1的贡献多少。
图12为液体培养基中2β-羟基柳珊瑚酸的GNPS分析图；其中，左图为ST2，右图为不同培养基中ST2情况，Node颜色代表不同培养基中含有ST2情况，右图Node中饼图的大小代表其对ST2的贡献多少。
图13为生物转化培养基菌丝体(S)和菌液(B)、单体对照品编号及相应Node 颜色列表图。
图14为生物转化培养基中柳珊瑚酸的GNPS分析图；其中，左图为ST1，右图为不同培养基中ST1情况，Node颜色代表不同培养基中含有ST1情况，右图Node中饼图的大小代表其对ST1的贡献多少。
图15为生物转化培养基中2β-羟基柳珊瑚酸的GNPS分析图；其中，左图为ST2，右图为不同培养基中ST2情况，Node颜色代表不同培养基中含有ST2 情况，右图Node中饼图的大小代表其对ST2的贡献多少。
图16为固体培养基、单体对照品编号及相应Node颜色列表图。
图17为固体培养基中柳珊瑚酸的GNPS分析图；其中，左图为ST1，右图为不同培养基中ST1情况，Node颜色代表不同培养基中含有ST1情况，右图 Node中饼图的大小代表其对ST1的贡献多少。
图18为固体培养基中2β-羟基柳珊瑚酸的GNPS分析图；其中，左图为ST2，右图为不同培养基中ST2情况，Node颜色代表不同培养基中含有ST2情况，右图Node中饼图的大小代表其对ST2的贡献多少。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明使用的生物菌(Aspergillus sp.)于2018年11月26日在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC，广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)保藏，其保藏号为GDMCCNo.60476，该菌株的分类命名是Aspergillus sp.，名称为 EGF15-0-3。
实施例1
本发明柳珊瑚酸的微生物制备方法的一种实施例。
(1)菌株活化：用接种环从EGF15-0-3菌种保存管中取适量的种子，接种到装有50mL PDA液体培养基的100mL三角锥型瓶中，在25～28℃的恒温摇床中以150～170转/分钟的转速培养2～3天，获得EGF15-0-3的种子培养液；
(2)菌株发酵：将上述活化的种子培养液以1.5％的量分别移入至不同的发酵培养基中；发酵培养基分别为8种液体培养基、4种固体培养基及11种生物转化培养基；各培养基各配置2L，同时每种空白培养基也配置2L；各种培养基于25～28℃的环境下静置培养48～60天，培养期间观察并记录菌株的生长状况，液体和固体培养基中EGF15-0-3菌种的生长图如图3所示，生物转化培养基中 EGF15-0-3菌种的生长图如图4所示。
各培养基组成成分如下：
PDA培养基：葡萄糖2.0％、土豆200g/L、土豆汁用陈海水作溶剂配制，盐度3.5％，pH自然；
C培养基：蛋白胨1.0％、NaCl 0.5％、葡萄糖4.0％、陈海水作溶剂配制， pH自然；
E培养基：葡萄糖4.0％、土豆400g/L、土豆汁用陈海水作溶剂配制，盐度 15％，pH自然；
PDA和E培养基中的土豆去皮后切片，于热水中煮沸30min，四层纱布过滤，取滤液备用；
GPY培养基：葡萄糖1.0％、酵母膏0.2％、蛋白胨0.1％、海盐0.25％，pH＝7.2；
GPY+CaCO3培养基：葡萄糖1.0％、酵母膏0.2％、蛋白胨0.1％、海盐0.25％、 CaCO30.1％，pH＝7.5；
真1培养基：山梨醇5.0％、麦芽糖4.0％、味精1.0％、色氨酸0.05％、酵母膏1.3％、MgSO4·7H2O 0.03％、KH2PO4 0.05％、陈海水配制，pH＝6.5；
真3培养基：葡萄糖3.0％、酵母膏0.3％、甘露醇2.0％、麦芽糖2.0％、味精0.5％、蛋白胨1.5％、土豆汁用陈海水作溶剂配制，pH＝6.0；
真4培养基：葡萄糖3.0％、蛋白胨1.0％、甘露醇2.0％、玉米浆0.1％、酵母膏0.5％、MgSO4·7H2O 0.03％、KH2PO4 0.05％，陈海水配制，pH＝6.0；
固体培养基1(东北大米培养基/500mL)：东北大米55g、陈海水80mL、蛋白胨0.3％；
固体培养基2(玉米培养基/500mL)：东北大米50g、玉米渣5g、陈海水80mL、蛋白胨0.3％；
固体培养基3(糯米培养基/500mL)：糯米45g、陈海水80mL、蛋白胨0.3％；
固体培养基4(丝苗培养基/500mL)：丝苗4g、陈海水80mL、蛋白胨0.3％；
11种生物转化培养基配方：以GPY+CaCO3培养基作为基础培养基，添加不同含量的氨基酸种类，配制完成后用氨水调pH＝7.0～7.5，各生物转化培养基的组成成分如表1所示，其中，L-Phe为L-苯丙氨酸，Met为甲硫氨酸，L-Trp 为L-色氨酸，L-Lys为L-赖氨酸，L-Thr为L-苏氨酸，Cys为半胱氨酸，Arg为精氨酸，Val为缬氨酸，Leu为亮氨酸，Pro为脯氨酸，Ser为丝氨酸，Glu为谷氨酸。
表1
Figure BDA0001893122230000081
实施例2
本发明柳珊瑚酸的微生物制备方法的代谢产物后处理的一种实施例。
不同培养基次生代谢产物后处理的流程图如图3所示。将实施例1中各发酵培养基的菌株灭活后，液体培养基培养液用纱布过滤，将发酵液和菌丝体分开；将得到的发酵液分别先后用等体积的EtOAc(乙酸乙酯)、n-BuOH(正丁醇)萃取三次，得到的萃取液进行浓缩，最后得到发酵液EtOAc、n-BuOH相浸膏；将菌丝体用甲醇提取3次(1次/天)，合并甲醇提取液减压浓缩得到甲醇浸膏，用水涅溶后同法分别先后用等体积的EtOAc、n-BuOH萃取三次，得到菌丝体EtOAc和n-BuOH相浸膏。固体培养基分别加入等体积的EtOAc振摇萃取3 次(1次/天)，得到的萃取液进行浓缩，最后得到发酵液EtOAc相浸膏。不同培养基的空白对照也用上述方法获得EtOAc和n-BuOH相成分，最终得到40个 EtOAc样品用于后续测试。
实施例3柳珊瑚酸的分离及结构鉴定
1.柳珊瑚酸的分离
用接种环从EGF15-0-3菌种保存管中取适量的种液，接种到装有50mL PDA 培养基(土豆200g/L、葡萄糖2.0％、土豆汁用陈海水作溶剂配制，自然pH) 的100mL三角瓶中，在28℃的摇床中165r/min培养2天，获得EGF15-0-3的种子培养液。吸取该种子液1.5mL加入装有500mL D培养基(土豆200g/L、葡萄糖2.0％、土豆汁用陈海水作溶剂配制，自然pH)的1000mL三角烧瓶中，在 28℃下静置培养60天，与空白培养基对比观察是否有明显的菌株生长，成长完毕便停止发酵，分离实验共发酵菌液220L。
发酵菌液用纱布过滤，得到菌丝体和发酵液两部分。发酵液在85℃水浴条件下浓缩至12L，所得浓缩液依次用等体积的EtOAc和n-BuOH进行分配萃取，分别萃取3次，分别减压浓缩回收溶剂后得到发酵液的EtOAc浸膏65g及 n-BuOH浸膏160g。菌丝体用甲醇浸泡提取3次(1次/天)，所得提取液减压浓缩共得到甲醇浸膏80.8g；该浸膏用水涅溶，依次用等量的EtOAc和n-BuOH进行分配萃取，分别萃取3次，得到菌丝体的EtOAc浸膏110g和n-BuOH浸膏41.5g。经TLC分析结果显示，发酵液与菌丝体的EtOAc成分差异性很大，且各部分含量都较大，故分别进行粗分。
取菌丝体EtOAc浸膏经硅胶柱分离，以石油醚-乙酸乙酯体系梯度洗脱，TLC 薄层跟踪并合并流份得到15个不同极性的组分(标记为Fr1～15)。各组分经硅胶柱、SephadexLH-20、HPLC等多种分离手段进行反复柱色谱分离得到17个化合物，柳珊瑚酸的分离流程示意图如图4所示。按上述同样的操作，取菌液 EtOAc浸膏经硅胶柱分离，以石油醚-乙酸乙酯体系梯度洗脱，TLC薄层跟踪并合并流份得到12个不同极性的组分(标记为Fr1～12)，各组分经硅胶柱、Sephadex LH-20、HPLC等多种分离手段进行反复柱色谱分离得到10个化合物。
2.柳珊瑚酸的结构鉴定
经过分离得到化合物1，无色块状结晶(甲醇)，UVl254nm下有暗斑，其余显色剂均不显色。柳珊瑚酸ESI-MS图谱如图5所示，1H-NMR(CD3OD)图谱如图6所示，13C-DEPT 90-NMR(CD3OD)图谱如图7所示，13C-DEPT 135-NMR (CD3OD)图谱如图8所示，13C-NMR(CD3OD)图谱如图9所示。ESI-MS给出1准分子离子峰[M-H]+m/z 247，分子量为248。结合NMR信息(季碳5个，次甲基4个，亚甲基3个，甲基3个)确定其分子式C15H20O3，不饱和度为6。13C-NMR中给出了15个碳信号，同时1H-NMR在高场给出三个甲基信号：1个与季碳相连的甲基信号δH1.22(s,3H)和两个与次甲基相连的甲基信号δH1.16(d, 3H,6.8Hz)和δH1.13(d,3H,7.2Hz)，暗示该化合物可能为倍半萜类化合物。1H-NMR在低场区显示其含有1个双键氢信号δH 6.32(s,1H)，同时13C-NMR也给与证实δC150.6(d)、δC136.7(s)；13C-NMR中显示还含有一个酮羰基δC 220.2(s) 和一个酯羰基信号δC 167.7(s)。除此外无任何不饱和度信息，说明结构含有聚合的环状结构。将化合物1的NMR数据与柳珊瑚酸对照，二者基本一致。故确定化合物1为柳珊瑚酸subergorgia acid(SA)。
柳珊瑚酸(化合物1)分子式为C15H20O3，无色片状结晶(甲醇)，紫外灯 254nm下有暗斑，其余显色剂不显色。
1H NMR(400MHz,CDOD3)δH:6.32(1H,s),3.04(1H,q,J＝7.2,Hz),2.36(1H,dd, J＝6.8,10.0Hz),2.13(1H,d,J＝16.8Hz),2.08(1H,d,J＝16.8Hz),1.84(1H,m), 1.74(1H,m),1.69(1H,m),1.65(1H,m),1.22(3H,s),1.16(3H,d,J＝6.8Hz),1.13(3H,d, J＝7.2Hz)。
13C NMR(400MHz,CDOD3)δC:220.2(s),167.7(s),150.6(d),138.9(s),70.0(s),64.2(d),62.8(s),53.2(d),50.8(t),39.1(t),34.5(d),29.1(t),24.1(q),19.9(q),18.2(q)。
实施例4柳珊瑚酸及2β-羟基柳珊瑚酸GNPS分析
1.GNPS构建
样品配置：取40个EtOAc相不同培养基样品，配制成1.0mg/mL甲醇溶液，备用。
UPLC条件：洗脱条件(0～5min：90％→70％ACN/H2O，5～23min：70％→100％ ACN/H2O，23～28min：100％ACN)，流速为0.7mL/min，进样量为3μL，柱温 40℃，色谱柱(Phenomenex，5μm，4.6×100mm)。将配制好的样品于Triple TOF TM5600+质谱系统进行检测。
MS条件：离子喷雾电压(Ion Spray Voltage Floating，ISVF)：4500eV；离子源温度(Temperature，TMP)：550℃；碰撞能量(Collision Energy，CE)：45eV；扩散碰撞能量(Collision Energy spread，CES)：15eV；去簇电压(Declustering Dotential，DP)：100eV；雾化器压力(Ion Source Gas 1，GS1)：55psi；辅助气压力(Ion Source Gas 2，GS2)：55psi；气帘气压力(Curtain Gas，CUR)：35psi；飞行时间质谱(TOF-MS)分子量扫描范围：100～2000。
数据处理：将采集得到的不同分子大小的二级质谱信息通过MSConvert软件转换后导入GNPS分子网络平台，形成分子网络图谱，并与谱库中的数据进行匹配，生成的数据可在软件Cytoscape中查看。
2.液体培养基GNPS分析
液体培养基菌丝体(S)和菌液(B)及单体对照品编号及相应Node颜色列表图如图10所示，其中ST1表示柳珊瑚酸，ST2表示2β-羟基柳珊瑚酸。
含柳珊瑚酸的培养基：8种液体培养基中柳珊瑚酸的GNPS分析图如图11 所示，其中，左图为ST1，右图为不同培养基中ST1情况，Node颜色代表不同培养基中含有ST1情况，右图Node中饼图的大小代表其对ST1的贡献多少。由图11可知，PDA和GPY+CaCO3培养基的菌液和菌丝体中均检测到柳珊瑚酸，而只在真1培养基的菌液中检测到柳珊瑚酸。
含2β-羟基柳珊瑚酸的培养基：8种液体培养基中2β-羟基柳珊瑚酸的GNPS 分析图如图12所示，其中，左图为ST2，右图为不同培养基中ST2情况，Node 颜色代表不同培养基中含有ST2情况，右图Node中饼图的大小代表其对ST2 的贡献多少。由图12可知，PDA-S、真1-S、真3-S、真4-B、C-S、E-B、GPY-B、 GPY-S、GPY+CaCO3-B、GPY+CaCO3-S中均检测到2β-羟基柳珊瑚酸。
3.生物转化培养基GNPS分析
生物转化培养基菌丝体(S)和菌液(B)及单体对照品编号及相应Node颜色列表图如图13所示，其中ST1表示柳珊瑚酸，ST2表示2β-羟基柳珊瑚酸。
含柳珊瑚酸的生物转化培养基：8种生物转化培养基中柳珊瑚酸的GNPS分析图如图14所示；其中，左图为ST1，右图为不同培养基中ST1情况，Node 颜色代表不同培养基中含有ST1情况，右图Node中饼图的大小代表其对ST1 的贡献多少。由图14可知，生物转化培养基除了在生转7的菌丝体中存在以外，其他培养基中柳珊瑚酸均不存在，说明添加氨基酸不能增加柳珊瑚酸的产生，但是通过GNPS分析可以得知存在柳珊瑚酸的同系物存在。
含2β-羟基柳珊瑚酸的生物转化培养基：8种生物转化培养基中2β-羟基柳珊瑚酸的GNPS分析图如图15所示，其中，左图为ST2，右图为不同培养基中ST2 情况，Node颜色代表不同培养基中含有ST2情况，右图Node中饼图的大小代表其对ST2的贡献多少。由图15可知，从GNPS分析可以发现2β-羟基柳珊瑚酸在生转1的菌丝体和菌液均可检测到其存在；生转2、生转3、生转9和生转 11的菌丝体中可以检测到其存在；而在生转8的菌液中存在。说明生物转化培养基有利于2β-羟基柳珊瑚酸的存在。
4.固体培养基GNPS分析
固体培养基、单体对照品编号及相应Node颜色列表图如图16所示。
含柳珊瑚酸的固体培养基：4种固体培养基中柳珊瑚酸的GNPS分析图如图 17所示，其中，左图为ST1，右图为不同培养基中ST1情况，Node颜色代表不同培养基中含有ST1情况，右图Node中饼图的大小代表其对ST1的贡献多少。由图17可知，仅在丝苗米培养基中检测到柳珊瑚酸的存在，而糯米培养基、东北米培养基中含量也较少，但此二种固体培养基中存在柳珊瑚端的同系物存在。
含2β-羟基柳珊瑚酸的固体培养基：4种固体培养基中2β-羟基柳珊瑚酸的 GNPS分析图如图18所示，其中，左图为ST2，右图为不同培养基中ST2情况， Node颜色代表不同培养基中含有ST2情况，右图Node中饼图的大小代表其对 ST2的贡献多少。由图18可知，在此四种培养基：糯米、东北米、东北玉米、丝苗培养基中均可检测的2β-羟基柳珊瑚酸，四者含量关系为：丝苗米>东北玉米>东北大米≈糯米。
5.GNPS分析总结
从GNPS分析可以得出，能够产生柳珊瑚酸的培养基共4种：3种液体，一种固体。生物转化培养基对于柳珊瑚酸来说产生效果较差。PDA和GPY+CaCO3的菌液和菌丝体中均可检测到柳珊瑚酸；而真1培养基仅在菌液中存在；固体培养基中丝苗米培养基可以检测到柳珊瑚酸。
而2β-羟基柳珊瑚酸可以在18种培养基(14种液体和4种固体)中检测到。其中GPY和GPY+CaCO3培养基的菌液和菌丝体中均可检测到2β-羟基柳珊瑚酸；液体培养基PDA、真1培养基、真3培养基和C培养基的菌丝体中可以检测到，但是在真4培养基、E培养基的菌液中可以检测到。对于生物转化培养基而言，由于氨基酸的加入，仅在生转1、生转2、生转3、生转9和生转11的菌丝体中可以检测到，而在生转1和生转8的菌液中可以检测到。对于固体培养基而言，2β-羟基柳珊瑚酸没有区别，四种培养基均可检测到，但其含量存在丝苗米>东北玉米>东北大米≈糯米关系。
因此可以看出氨基酸的加入或富培养，对柳珊瑚酸而言导致其产生减弱，但可以促进2β-羟基柳珊瑚酸的生成。可以根据实际需要，对培养基进行调控。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.Aspergillus sp.EGF15-0-3在制备柳珊瑚酸中的应用，其特征在于，所述Aspergillus sp.EGF15-0-3的保藏号为GDMCC No.60476。
2.一种柳珊瑚酸的微生物制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将保藏号为GDMCCNo.60476的Aspergillus sp.EGF15-0-3接种于PDA液体培养基中培养，得种子培养液；将种子培养液移入至发酵培养基中培养，得到柳珊瑚酸。
3.如权利要求2所述的微生物制备方法，其特征在于，所述发酵培养基为以下培养基中的一种：
PDA培养基：葡萄糖2.0％、土豆200g/L、余量为陈海水，盐度3.5％，pH自然；
GPY+CaCO3培养基：葡萄糖1.0％、酵母膏0.2％、蛋白胨0.1％、海盐0.25％、CaCO30.1％，pH＝7.5；
真1培养基：山梨醇5.0％、麦芽糖4.0％、味精1.0％、色氨酸0.05％、酵母膏1.3％、MgSO4·7H2O 0.03％、KH2PO4 0.05％、余量为陈海水，pH＝6.5；
固体培养基4：丝苗4g、陈海水80mL、蛋白胨0.3％。
4.如权利要求2所述的微生物制备方法，其特征在于，具体操作为：将保藏号为GDMCCNo.60476的Aspergillus sp.EGF15-0-3接种于PDA液体培养基中，在25～28℃的恒温摇床中以150～170转/分钟的转速培养2～3天，得种子培养液；将种子培养液以1.5％的接种量移入至发酵培养基中，于25～28℃下静置培养48～60天，得到柳珊瑚酸；所述PDA液体培养基由以下成分组成：土豆200g/L、葡萄糖2.0％、余量为陈海水，自然pH。
5.如权利要求3所述的微生物制备方法，其特征在于，发酵培养基为PDA培养基、GPY+CaCO3培养基、真1培养基时，产物后处理的方法为：发酵培养基用纱布过滤，得到菌丝体和发酵液；将发酵液先后用等体积的乙酸乙酯、正丁醇萃取三次，萃取液进行浓缩，得到发酵液乙酸乙酯相浸膏、发酵液正丁醇相浸膏；将菌丝体用甲醇提取3次，合并甲醇提取液，减压浓缩得到甲醇浸膏，用水涅溶后，先后用等体积的乙酸乙酯、正丁醇萃取三次，得到菌丝体乙酸乙酯相浸膏、菌丝体正丁醇相浸膏。
6.如权利要求3所述的微生物制备方法，其特征在于，发酵培养基为固体培养基4时，产物后处理的方法为：发酵培养基加入等体积的乙酸乙酯振摇萃取3次，萃取液进行浓缩，得到发酵液乙酸乙酯相浸膏。
7.如权利要求5或6所述的微生物制备方法，其特征在于，所述柳珊瑚酸的分离方法为：取菌丝体乙酸乙酯相浸膏或发酵液乙酸乙酯相浸膏经硅胶柱分离，以石油醚-乙酸乙酯体系梯度洗脱，得到柳珊瑚酸。
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