JPH04321698A - 生理活性物質ｍ６１２４及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規な生理活性物質Ｍ６
１２４またはその薬理上許容される塩、並びに生理活性
物質Ｍ６１２４の製造方法に関するものである。さらに
詳しくいえば、本発明は、トロンボキサンＡ２（ｔｈｒ
ｏｍｂｏｘａｎｅ　　Ａ２、以下ＴＸＡ２と略記する）
の生合成阻害作用を有し、ＴＸＡ２の生理作用を強力に
抑制しうる環状ペプタイド系生理活性物質Ｍ６１２４ま
たはその薬理上許容される塩、並びに該Ｍ６１２４をボ
ウベリア属の属する微生物の産生物として製造する方法
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】トロンボキサンはアラキドン酸などのエ
イコサポリエン酸から動物組織で生合成される生理活性
物質の１種であり、トロンバン酸を基本構造とし、六員
環のオキサン部分にエポキシドをもつものをＴＸＡ、２
つの水酸基をもつものをＴＸＢと呼ばれ、プロスタグラ
ンジン（ＰＧ）のように、側鎖の二重結合の数に応じて
１〜３群がある。このトロンボキサンの中でＴＸＡ２は
血小板凝集作用、血管収縮作用、気管支及び気管平滑筋
収縮作用などの生理活性を有することが知られており、
したがって、広範囲の病態、例えば（１）血栓症や心筋
梗塞症などの虚血性疾患、（２）脳梗塞や脳溢血などの
脳血管疾患、（３）気管支喘息や気管支炎など炎症及び
アレルギー疾患、（４）アテローム性動脈硬化症、未梢
循環不全、肺栓塞などの末梢血管疾患及び脂質不均衡に
よる疾患などに関与するものと考えられている。このＴ
ＸＡ２は、生体内において、アラキドン酸からＰＧＧ２
を経て生じたＰＧＨ２のエンドペルオキシドが開裂し、
これにＴＸＡシンターゼが作用して生合成される。該Ｔ
ＸＡ２は極めて不安定で、例えば３７℃の中性の水の中
で半減期約３０秒で分解してＴＸＢ２となる。該ＴＸＡ
２は前記のような生理活性を有することから、ＴＸＡ２
の生合成を阻害する物質は、前記疾患やＴＸＡ２の作用
を抑制することが望ましい他の疾患に対し、予防及び治
療効果を有することが期待され、新規な優れた効力を有
するＴＸＡ２生合成阻害剤の開発が望まれていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明はこのような事
情のもとで、ＴＸＡ２の生合成阻害作用を有し、ＴＸＡ
２の生理作用を強力に抑制しうる新規な生理活性物質を
提供することを目的としてなされたものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＴＸＡ２
の生合成阻害作用を有する新規な生理活性物質の探索を
目的として多数の微生物を土壌より分離し、その産生物
を分離探索した結果、長野県須坂市の畑土壌より分離さ
れたある種の糸状菌がＴＸＡ２合成酵素阻害物質を産生
すること、該微生物がボウベリア属に属すること、この
微生物を適当な培地に培養することによってＴＸＡ２合
成酵素を特異的に阻害する物質を培地中に蓄積しうるこ
と、そしてこの阻害物質を単離し、その理化学的及び生
物学的諸性質から、該阻害物質は文献未載の新規なＴＸ
Ａ２合成酵素阻害物質であることを見い出し、この知見
に基づいて本発明を完成するに至った。すなわち、本発
明は、式

【０００５】

【化３】

【０００６】で表される新規な生理活性物質Ｍ６１２４
またはその薬理上許容される塩を提供するものである。 本発明に従えば、前記生理活性物質Ｍ６１２４は、ボウ
ベリア属に属する生理活性物質Ｍ６１２４生産菌を培養
し、次いで培養物から該Ｍ６１２４を採取することによ
り、製造することができる。以下、本発明を詳細に説明
する。本発明の生理活性物質Ｍ６１２４は、前記式［１
］で表される環状ペプタイド系化合物であり、またその
薬理上許容される塩も本発明に包含される。該塩につい
ては薬理上許容されるものであればよく、特に制限され
ず、例えば塩酸、リン酸や炭酸などの無機酸との塩であ
ってもよいし、酢酸、リンゴ酸、コハク酸、グリシン、
アスパラギン酸やグルタミン酸などの有機酸との塩であ
ってもよく、常法に従って塩を形成すればよい。該生理
活性物質Ｍ６１２４は、次に示す理化学的及び生物学的
性質を有するＴＸＡ２合成酵素阻害物質である。

【０００７】（１）外観：白色針状結晶（２）比施光度
：［α］Ｄ２６°　　−２２３°（Ｃ＝０．４％、クロ
ロホルム） （３）分子量測定値：ＦＡＢ−ＭＳ法　　（Ｍ＋Ｈ）＋
　　７０４ （４）分子式：Ｃ３９Ｈ５３Ｎ５Ｏ７ （５）元素分析値（％）：

【０００８】（６）紫外部吸収スペクトル：メタノール
溶液λｍａｘ　　ｎｍ（Ｅ１％、１ｃｍ）２０３（６０
５．７）、２５２（８．１）、２５９（７．２）、２６
５（５．４）、２６９（３．７）（７）赤外部吸収スペ
クトル：図１参照臭化カリウム錠中の主な波数（ｃｍ−
１）は次のとおりである。３４５０、１７４０、１６９
０、１６２０、１４６０、１３８０、１１７０、１１３
０、１０９０、１０７５、１０５０ （８）核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル：図２参
照（重クロロホルム中３００ＭＨｚ）

【０００９】（９）核磁気共鳴（１３Ｃ−ＮＭＲ）スペ
クトル：重クロロホルム中、１００ＭＨｚでのシグナル
は少なくとも下記に認められる。 １７３．８０（ｓ）、１７３．５４（ｓ）、１７１．６
６（ｓ）、１６９．７９（ｓ）、１６９．７９（ｓ）、
１６７．７８（ｓ）、１３７．１０（ｓ）、１３６．１
６（ｓ）、１２８．９０（ｄ）、１２８．９０（ｄ）、
１２８．７８（ｄ）、１２８．７８（ｄ）、１２８．７
１（ｄ）、１２８．７１（ｄ）、１２８．６６（ｄ）、
１２８．６６（ｄ）、１２７．２０（ｄ）、１２６．８
４（ｄ）、７２．８６（ｄ）、６１．８７（ｄ）、６０
．７８（ｄ）、５７．５２（ｄ）、５３．１９（ｄ）、
４７．０７（ｔ）、３８．７１（ｔ）、３６．６１（ｔ
）、３５．６４（ｔ）、３５．４５（ｔ）、３５．０８
（ｔ）、３２．１７（ｔ）、２９．８９（ｑ）、２８．
９３（ｑ）、２７．２５（ｄ）、２４．２７（ｄ）、２
３．３６（ｑ）、２１．９１（ｔ）、２０．１１（ｑ）
、１９．３１（ｑ）、１８．９６（ｑ）

【００１０】（１０）加水分解：６ＮＨＣｌ水溶液中１
０５℃、２０時間で分解 Ｌ−フェニルアラニン（１モル）、Ｌ−プロリン（１モ
ル）、β−アラニン（１モル）が生成 （１１）溶解性：メタノール、アセトン、酢酸エチル、
クロロホルム、ベンゼン、ジメチルスルホキシドに可溶
（１２）呈色反応：過マンガン酸カリウム反応及びヨー
ド反応に陽性、ニンヒドリン反応、塩化第二鉄反応及び
ドラゲンドルフ反応に陰性

【００１１】（１３）ＴＬＣ：スポットフイルム　　シ
リカゲルｆ［東京化成工業（株）］使用 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　溶媒系
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　Ｒｆ値　　　　　　　　　　クロロホルム／メ
タノール（１０／０．１容量比）　　０．４６　　　　
　　　　　　クロロホルム／酢酸エチル（１０／２容量
比）　　　　　０．２７　　　　　　　　　　ベンゼン
／酢酸エチル（１０／５容量比）　　　　　　　　　０
．１６（１４）構造：前記式［１］で表される構造を有
する。 （１５）ＴＸＡ２合成酵素阻害活性：ＩＣ５０　　８．
２５×１０−６Ｍ

【００１２】なお、ＴＸＡ２合成酵素阻害活性は次のよ
うにして求めた。すなわち、牛血小板ミクロソーム２４
μｌ（１７３μｇタンパク量、１００ｍＭトリス−塩酸
緩衝液ｐＨ８．０）と試験化合物溶液６μｌ（１０％メ
タノール含有１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液）とを混合
し、０℃の温度で５分間静置後、基質のプロスタグラン
ジンＨ２溶液３０μｌを加え、室温で２分間反応させた
のち、停止液（メタノール／酢酸エチル容量比３／２混
合液）６０μｌを加え、良く混和して反応を停止させた
。反応液中の生成したトロンボキサンＢ２（ＴＸＢ２）
量（ＴＸＡ２は緩衝液中不安定で非酵素的にＴＸＢ２に
転換される）をラジオイムノアッセイ法［「メソッド・
イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎＥｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ）」第８６巻、第２８６ページ（１９
８２年）］で測定し、ＴＸＡ２合成酵素阻害活性を求め
た。

【００１３】前記Ｍ６１２４と同一の分子式Ｃ３９Ｈ５
３Ｎ５Ｏ７を有し、分子内にフェニルアラニン残基及び
プロリン残基を有する公知の化合物としてＩＣＩ１７４
６４４が知られている［「ジャーナル・オブ・ファーマ
コロジィー・アンド・エックスペリメンタル・セラピュ
ーティックス（Ｊ．ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈ
ｅｒ）」第２４４巻、第１１６９〜１１７７ページ（１
９８８年）］。このＩＣＩ１７４６４４は前記の残基以
外にロイシン残基、α−アミノ酪酸残基及びＮ，Ｎ−ジ
アリルチロシン残基を分子内に有しているが、本発明の
生理活性物質Ｍ６１２４はこれらの残基がなく、明らか
にＩＣＩ１７４６４４とは異なる。したがって該Ｍ６１
２４は文献未載の新規な化合物である。

【００１４】本発明においては、前記生理活性物質Ｍ６
１２４は、ボウベリア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）属に属す
る生理活性物質Ｍ６１２４生産菌を培地に培養し、培地
中に生理活性物質Ｍ６１２４を生成蓄積させ、この培養
物から該Ｍ６１２４を採取することにより、製造するこ
とができる。生理活性物質Ｍ６１２４生産菌については
、ボウベリア属に属し、Ｍ６１２４生産能を有するもの
であればよく、特に制限されず、いずれの微生物でもよ
い。このＭ６１２４生産菌の好適な１例として長野県須
坂市の畑土壌より分離されたボウベリア・エスピー・Ｍ
６１２４（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ　　ｓｐ．Ｍ６１２４）
（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１２１８４）株が挙げられる。

【００１５】このボウベリア・エスピー・Ｍ６１２４株
の菌学的性質は次のとおりである。 （１）各培地における生育状態 （ａ）麦芽エキス寒天培地 麦芽エキス寒天培地上での生育は極めて遅く、２５℃１
４日間で直径６〜９ｍｍに達するにすぎない。菌叢は厚
く盛り上がり、不規則なしわを形成する。気中菌糸はほ
とんど形成されない。表面の色は灰橙色（ｇｒｅｙｉｓ
ｈ　　ｏｒａｎｇｅ５Ｂ３）〜褐橙色（ｂｒｏｗｎｉｓ
ｈ　　ｏｒａｎｇｅ　　７Ｃ４）を呈し、周辺部はクモ
の巣状で裏面は褐橙色（ｂｒｏｗｎｉｓｈ　　ｏｒａｎ
ｇｅ５Ｃ５〜６Ｃ５）を呈する。 （ｂ）バレイショ・ブドウ糖寒天培地 バレイショ・ブドウ糖天培地上での生成は遅く、２５℃
１４日間で直径９〜１３ｍｍに達するにすぎない。菌叢
は厚く盛り上がり、不規則なしわを形成する。気中菌糸
は表面に薄く形成されビロード状を呈する。表面の色は
灰橙色（ｇｒｅｙｉｓｈ　　ｏｒａｎｇｅ　　５Ｂ３〜
５Ｂ４）を呈し、周辺部はクモの巣状で裏面は淡褐色（
ｌｉｇｈｔ　　ｂｒｏｗｎ　　６Ｄ６）を呈する。 （ｃ）オートミール寒天培地 オートミール寒天培地上での生育はやや遅く、２５℃１
４日間で直径２３〜２６ｍｍに達する。菌叢は薄くビロ
ード状、ときにやや綿毛状であり、また菌糸束が垂直に
形成され１０数ｍｍまで伸長する。表面の色は黄灰色（
ｙｅｌｌｏｗｉｓｈｇｒｅｙ　　３Ｄ２）〜褐灰色（ｂ
ｒｏｗｎｉｓｈ　　ｇｒｅｙ　　４Ｄ２）を呈し、周辺
部は全縁で裏面は褐色（ｂｒｏｗｎ６Ｄ７）を呈する。 なお各培地における生育状態の色の表示は「Ｋｏｒｎｅ
ｒｕｐ，Ａ．ａｎｄＪ．Ｈ．Ｗａｎｓｃｈｅｒ．１９７
８．“Ｍｅｔｈｕｅｎ　　Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆ　　Ｃ
ｏｌｏｕｒ．３ｒｄ　　ｅｄ”Ｅｙｒｅ　　Ｍｅｔｈｕ
ｅｎ，Ｌｏｎｄｏｎ」の表示法に従った。

【００１６】（２）生理的諸性状 生育し得るｐＨ　　３〜９ 最適生育ｐＨ　　４〜８ 生育し得る温度　　１２〜３３℃ 最適生育温度　　２５〜３０℃ （３）顕微鏡下における形態的特徴 気中菌糸は菌糸束を形成、菌糸束の長さは１０数ｍｍで
あり、分生子柄は気中菌糸から直接あるいは短い柄が生
じ、滑面、まれに粗面である。分生子形成細胞は分生子
柄の先端あるいは中間から生じ、その大きさは７〜１０
×３．５〜４．５μｍで、中間部が膨らみフラスコ型で
あるが、しばしば大きく湾曲し、先端部は細くなってい
る。分生子形成様式はシンポジュラ型（Ｓｙｍｐｏｄｕ
ｌａｓｐｏｒｅ）である。分生子は楕円形〜卵形で、滑
面ないしわずかに粗面であり、その大きさは２．５〜３
．３×２．３〜２．５μｍ、色は無色で数十個の胞子塊
を形成している。子のう世代は形成されない。

【００１７】このように、Ｍ６１２４株は、子のう世代
は形成されず、外生的に分生子を形成、菌糸束を形成し
、中間部が膨らみ湾曲した特徴ある分生子形成細胞の先
端にシンポジュラ型に分生子を形成することから、不完
全菌のボウベリア属に属するものと思われる。ボウベリ
ア属は現在４、５種認められている。分生子の形成の仕
方、分生子の形態などの特色は、ボウベリア・フェリナ
（Ｂｅａｕｖｅｒｉａｆｅｌｉｎａ）に類似しているも
のの菌糸束の形態、色、集落の特色などが異なる。した
がって本菌はボウベリア・エスピー・Ｍ６１２４（Ｂｅ
ａｕｖｅｒｉａ　　ｓｐ．Ｍ６１２４）と同定された。

【００１８】前記のボウベリア属に属する生理活性物質
Ｍ６１２４生産菌の培養については特に制限はなく、従
来菌類の培養に慣用されている方法を用いることができ
る。この際用いられる培地は菌の資化しうる炭素源、窒
素源、無機物などを適当に含有する培地であれば、天然
培地、合成培地のいずれも用いることができる。該炭素
源としては、例えばグルコース、デンプン、デキストリ
ン、シュークロス、廃糖蜜、グリセロール、油脂類、有
機酸類などが用いられ、窒素源としては、例えば大豆粉
、棉実粉、ＣＳＬ、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、
胚芽、尿素、硫酸アンモニウムなどが用いられる。

【００１９】また、無機物としては、例えば塩化ナトリ
ウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、炭酸カル
シウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、塩化コバル
ト、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸第一鉄などが用いられる。 その他必要に応じて、培地にビオチンやビタミンＢ１な
どのビタミンやサイアミンなどの菌体増殖促進物質、あ
るいはＭ６１２４の産生を促進する物質を添加すること
ができる。培養法としては、一般の微生物の培養に慣用
されている方法を用いることができ、固体培養法、液体
培養法のいずれでもよく、また振とう培養法、通気撹拌
培養法のいずれであってもよいが、通常通気撹拌培養法
が用いられる。培養条件については、温度１０〜３５℃
、好ましくは２５〜３０℃、ｐＨ３〜９、好ましくは４
〜８の条件で、２〜１０日間程度培養することにより、
Ｍ−６１２４の蓄積が最大に達し、培養が完了する。

【００２０】このようにして産生された生理活性物質Ｍ
６１２４を培養物から採取する方法については特に制限
はなく、一般の微生物の培養物から有用物質を採取する
のに従来慣用されている分離手段が適宜利用される。例
えば該Ｍ６１２４は脂溶性であるので、酢酸エチル、酢
酸ブチル、ブタノールなどで溶媒抽出を行ったのち、抽
出液を濃縮することにより、Ｍ６１２４の粗物質が得ら
れる。この粗物質をさらに精製するには、シリカゲルや
アルミナなどによるカラムクロマトグラフィー法、ダイ
ヤイオンＨＰ−２０（三菱化成社製）やアンバーライト
ＸＡＤ−ＩＩ（ローム・アンド・ハース社製）などの合
成吸着剤を用いる方法、ＬＨ−２０（ファルマシア社製
）などによるゲルろ過クロマトグラフィー法、あるいは
アルキル基結合シリカゲルによる逆相クロマトグラフィ
ー法など、通常有機化合物の分離精製に慣用されている
方法を適宜組み合わせて用いればよい。

【００２１】次に、該Ｍ６１２４の採取方法の好適な１
列について説明すると、まず、培養物を適当な溶媒を用
いて抽出処理したのち、この抽出液を濃縮後、ヘキサン
沈殿を行い、その上清液を濃縮し、次いで残留物をシリ
カゲルカラムクロマトグラフィーに付したのち、クロロ
ホルム、酢酸エチル、ベンゼン、メタノール、アセトン
などの有機溶媒単独又は混合溶媒により溶出する。次に
、Ｍ６１２４を含む画分を集めて、減圧下で濃縮したの
ち、適当な溶媒、例えばクロロホルム／ヘキサン混合溶
媒に加え、室温で放置してＭ６１２４の結晶を析出させ
、次いで、ろ過などの手段で該結晶を取り出し、必要な
らば、適当な溶媒、例えばクロロホルム／ヘキサン混合
溶媒から再結晶することにより、Ｍ６１２４の単一物か
ら成る白色針状結晶が得られる。

【００２２】

【実施例】次に、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定され
るものではない。

【００２３】実施例１ グルコース１．０ｗｔ％、デキストリン１．０ｗｔ％、
カゼイン水解物０．５ｗｔ％、イーストエキス０．５ｗ
ｔ％、炭酸カルシウム０．１ｗｔ％及びセライト１．０
ｗｔ％を含有する培地（ｐＨ６．５）１００ｍｌを５０
０ｍｌ容三角フラスコに入れ、この培地に、栄養寒天斜
面上に生育したボウベリア・エスピー・Ｍ６１２４（Ｆ
ＥＲＭＰ−１２１８４）の菌株を接種して、２６℃で３
日間振とう培養し、その培養物を種苗とした。次いで、
グルコース２ｗｔ％、ペプトン１ｗｔ％、コーンスティ
ープリカー１ｗｔ％、ＫＨ２ＰＯ４０．２ｗｔ％及びＭ
ｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．１ｗｔ％を含有する培地（ｐＨ
６．５）に０．０２ｗｔ％のＦＳ・アンチフォーム０２
８（消泡剤、ダウコーニング社製）を加えた培地２０リ
ットルを含む３０リットル容ジャーファーメンターに、
先に調製した種菌１００ｍｌを移植し、毎分２０リット
ルの通気及び毎分２００回転の撹拌をしながら、２６℃
で６８時間培養した。

【００２４】実施例２ 実施例１で得られた培養液にケイソウ土を加えてろ過、
水洗し、ろ液１８リットルを得た。このろ液をｐＨ７．
０に調整後、酢酸エチル１０リットルを加えて撹拌し、
酢酸エチル抽出処理を行った。次いで、抽出液を減圧濃
縮したのち、ヘキサンを添加して沈殿を生成させ、次い
でこの沈殿を遠心処理により除き、上清ヘキサン層を減
圧下に濃縮することにより、黄色油状物質が得られた。 次いで、これを予めクロロホルムにて作製したシリカゲ
ルカラムクロマトグラフィー（１２５ｍｌ）に付したの
ち、クロロホルム溶液で展開を行い、２０ｇずつ分画を
行うと、目的物質はフラクションＮｏ．２１〜Ｎｏ．２
９に溶出された。これらの画分を集め、減圧濃縮し、ク
ロロホルム／ヘキサン混合溶媒に加え室温で放置すると
白色針状結晶が生じた。この結晶をグラスフィルター上
に集め、さらにクロロホルム／ヘキサン混合溶媒にて再
結晶を行うことにより、Ｍ６１２４の単一物として白色
針状結晶５１ｍｇが得られた。このものは前記したよう
な理化学的性質及び生物学的性質を有していた。

【００２５】

【発明の効果】本発明の生理活性物質Ｍ６１２４は、ボ
ウベリア属に属する微生物が産生する文献未載の新規な
環状ペプタイド系化合物であって、ＴＸＡ２合成酵素阻
害作用を有し、ＴＸＡ２の生理作用を強力に抑制しうる
ので、例えば血栓症や心筋梗塞症などの虚血性疾患、脳
梗塞や脳溢血などの脳血管疾患、気管支喘息や気管支炎
などの炎症及びアレルギー疾患、アテローム性動脈硬化
症、末梢循環不全、肺栓塞などの末梢血管疾患及び脂質
不均衡による疾患などに対し、予防及び治療効果を有す
ることが期待される。

【００２６】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明の生理活性物質Ｍ６１２４の赤外
吸収スペクトル図である。

【００２７】

【図２】図２は本発明の生理活性物質Ｍ６１２４の核磁
気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式 【化１】 で表される生理活性物質Ｍ６１２４またはその薬理上許
   容される塩。
2. 【請求項２】ボウベリア属に属する生理活性物質Ｍ６１
   ２４生産菌を培養し、次いで培養物から、式【化２】 で表される生理活性物質Ｍ６１２４を採取することを特
   徴とする生理活性物質Ｍ６１２４の製造方法。
3. 【請求項３】ボウベリア属に属する生理活性物質Ｍ６１
   ２４生産菌がボウベリア・エスピー・Ｍ６１２４（Ｂｅ
   ａｕｖｅｒｉａ　　ｓｐ．Ｍ６１２４）（ＦＥＲＭＰ−
   １２１８４）である請求項２記載の生理活性物質Ｍ６１
   ２４の製造方法。