FR2579599A1 - Substance physiologiquement active tpi et procede de preparation - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENTION CONCERNE UNE NOUVELLE SUBSTANCE PHYSIOLOGIQUEMENT ACTIVE PTI DE FORMULE: (CF DESSIN DANS BOPI) OU R EST UN B-D-GLUCOPYRANOSYLE, B-D-GALACTOPYRANOSYLE, 6-O-ACETYL-B-D-GLUCOPYRANOSYLE, 6-O-ACETYL-B-D-GALACTO-PYRANOSYLE OU HYDROGENE, OU UN DE SES SELS, AYANT UNE ACTIVITE INHIBITRICE SUR L'ADENOSINE CYCLIQUE-3, 5-MONOPHOSPHATE PHOSPHODIESTERASE. LA PRESENTE INVENTION CONCERNE EGALEMENT UN PROCEDE DE PRODUCTION DE CETTE SUBSTANCE PHYSIOLOGIQUEMENT ACTIVE PTI.

Description

La présente invention concerne une nouvelle substance physio-

logiquement active TPI avant une activité inhibitrice sur l'adénosine cyclique-

3',5'-monophosphate phosphodiestérase, et sa production.

L'adénosine cyclique-3',5'-monophosphate (appelée ci-dessous AMP cyclique) est connu comme second messager in vivo pour le fonctionnement

de la membrane cellulaire, la croissance cellulaire ou la différentiation.

Une enzyme qui catalyse la décomposition de l'AMP-c en 5'-adénosine mono-

phosphate (appelé ci-dessous 5'-AMP) est l'adénosine cyclique-3',5'-mono-

phosphate phosphodiestérase (appelée ci-dessous PDE et un de ses inhibiteurs peut accroître le niveau de l'AMP cyclique in vivo. Suite à ce phénomène, on connaît divers effets comme la bronchodilatation, l'activité cardiaque,

l'activité de relaxation du muscle lisse et l'activité de stimulation de l'excré-

tion hormonale.

On connaît jusqu'à présent parmi les inhibiteurs de PDE produits par des microorganismes, PDE-I ou PDE-II (Agr. Biol. Chem., 42 (7), 1331-1336

(1978)), le Terférol (J. Antibiotics, 37 (1), 6-9 (1984)), CC-1065 (ibid., 33(8), 902-

903 (1980)) et le Réticulol (ibid., 28(7), 558-560 (1975)) produit par Streptomyces.

On connaît également une substance produite par les bactéries, à savoir APD-I, APD-II et APD-III (ibid., 36, 194-196 (1983)). On connaît d'autres produits chimiques synthétiques inhibiteurs de PDE comme la théophylline, la papavérine

ou la nicardipine. On les utilise comme bronchodilatateurs et vasodilatateurs.

Comme il a été dit ci-dessus, la recherche de microorganismes produisant des substances physiologiquement actives est très importante dans le domaine médical, et de plus la prospection d'inhibiteurs de PDE est

utile pour l'application médicale et les études de recherche sur l'AMP-c.

On a trouvé au cours du programme de prospection d'une substance physiologiquement active produite par des microorganismes qu'une substance ayant une action inhibitrice contre l'activité de PDE est produite dans un bouillon cultivé du genre Nodulisporium et on a isolé lesdits principes actifs, qui ont été identifiés comme substances nouvelles et appelées TPI-1,

TPI-2, TPI-3 et TPI-4. En outre on a trouvé qu'on obtient une substance dé-

glycosylée par l'action d'une glycosidase sur TPI-1, TPI-2, TPI-3 et TPI4

et on a appelé ladite substance TPI-5.

Dans l'invention, TPI-1, TPI-2, TPI-3, TPI-4 et TPI-S sont généra-

lement désignés par TPI.

L'invention a pour objet de fournir une nouvelle substance physiologiquement active TPI de formule

OR OH

HO0 C- COcOH(1

CH2(CH2)5CH3 CH 2(CH2)5CH3

o R est B-D-glucopyranosyle, B-D-galactopyranosyle, 6'-O-acêtyl-B-Dgluco-

pyranosyle, 6'-O-acétyl-B-D-galactopyranosyle ou hydrogène, ou un de leurs sels. Un autre objet de l'invention est de fournir un procédé de production d'un nouvel inhibiteur de PDE, TPI, avant la formule (1) dans lequel on cultive un microorganisme Nodulisporium producteur de TPI et on en

isole le TPI.

Dans la formule (1), les substituants R et les noms des composés

sont pr6cisés comme suit.

Composé R TPI-1 B-D-glucopyranosyle TPI-2 B-D-galactopyranosyle TPI-3 6'0-acétyl-B-D-glucopyranosyle TPI-4 6'-O-acétyl-[-D-galactopyranosyle TPI5 hydrogène Une souche de microorganisme M5220 produisant une substance physiologiquement active TPI(II) de formule (II)

OR' OH

(Ii)

/ \0C-0- COOH

CH2 (CH2) 5CH3 CH2 (CH2) 5CH3

o R' est 13-D-glucopyranosyle, 3-D-galactopyranosyle, 6'-0-acétyl-B-Dgluco-

pyranosyle, ou 6'-0-acétyl-B13-D-galactopyranosyle, a la situation taxonomique suivante. (1) Propriétés morphologiques: Observations sur milieu de gélose Czapek, milieu de gélose à l'extrait de malt et milieu de gélose pomme de terre-glucose, comme suit: Les mycelia végétatifs forment des structures monotriches ou

synnemata jaunâtres, allongés, de 2,5-3,0 Um de largeur et de surface lisse.

Les conidiophores ont une taille de 50-130 x 2,5-3,0 pm, incolores à jaune pâle, ramifiés, avec septa et surface lisse. Les cellules conidiogènes sont simples ou verticillées avec 2 à 3 verticilles au sommet d'un conidiophore, d'une taille de 6-20 x 2,0-2,5 im, incolores à jaune pâle. Le type de formation de conidies est celui des Sympodulosporae. Les conidies formées ont une taille de 3,0-5,0 x 2,0-2,8 em, elles sont unicellulaires et ont une surface

lisse.

(2) Condition de croissance sur divers milieux: L'observation sur divers milieux cultivés à 26 C pendant 10 jours sefait comme suit. La représentation des couleurs est conforme à "A. Kornerup & J.H. Wanscher, Methuen Handbook of Colour, 3e éd., Eyre Methuen, Londres

(1978)".

(1) Milieu de gélose Czapek: Croissance lente avec 11-13 mm de diamètre à 26 C pour 10 jours

de culture. Les colonies sont plates, veloutées à légèrement cotonneuses.

Couleur vert foncé (30F6). Bord lisse. Pas d'exsudat et pigment diffusible.

La couleur de l'envers est vert foncé. (27F5).

(2) Milieu de gélose d'extrait de malt: Croissance lente avec 15-17 mm de diamètre à 26 C pour 10 jours

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de culture. Les colonies sont épaisses et légèrement cotonneuses. Couleur vert foncé (27F3). Bord lisse. Pas d'exsudat et pigment diffusible. La couleur

de l'envers est vert foncé (27F3).

(3) Milieu de gélose pomme de terre-glucose: Croissance lente avec 15-16 mm de diamètre à 260C pendant pour 10 jours de culture. Couleur vert foncé (27F3). Bord lisse. Pas d'exsudat

et pigment diffusible. La couleur de l'envers est vert foncé (27F3).

(3) Propriétés physiologiques: 1 pH de croissance: 1 - 9,5 pH optimal: 3 7 Z Température de croissance: 13 - 40 C

Température optimale: 25 - 30 C.

Selon les propriétés taxonomiques présentées ci-dessus, la présente souche ayant la propriété de former des conidies sans gamogenèse et des mycelia avec septa, appartient à Deuteromycotina. En outre, la présente

souche o la formation de conidies est de type Sympodulosporae, les conidio-

phores sont bien ramifiées, et les cellules formant conidies sont fréquemment

verticillées, est une souche appartenant au genre Nodulisporium.

La présente souche est appelée Nodulisporium sp. M5220 et a été déposée au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science

and Technology, M.I.T.I., Japon, sous le N de dépôt FERM P-8133.

On peut produire la substance physiologiquement active TPI(II) en cultivant, par exemple, un microorganisme producteur de TPI(II) appartenant

au genre Nodulisporium et en isolant TPI(II) de la masse cultivée.

Un exemple de microorganisme producteur de TPI(II) est la souche Nodulisporium sp. M5220 présentée ci-dessus; cependant on peut utiliser dans l'invention une souche ayant une activité productrice de TPI(II) y compris

les mutants naturels et artificiels.

La culture de la souche dans l'invention peut être conduite

par des moyens classiques pour la culture des champignons.

Les milieux de culture peuvent être une source de carbone assimilable, une source d'azote digestible et si nécessaire des sels inorganiques et des vitamines. Comme exemples de sources de carbone on peut citer les saccharides comme le glucose, le fructose, le maltose, le saccharose, le lactose, le galactose, la dextrine, l'amidon, le glycérol et le sorbitol, et les huiles végétales comme l'huile de soja, combinées ou seules. Comme exemples de sources d'azote on peut citer la peptone, l'extrait de levure, l'extrait de viande, la poudre de soja, la poudre de graine de coton, la liqueur de maïs

macérée, l'extrait de malt, la caséine, les acides aminés, l'urée, les sels d'am-

monium et les sels de nitrate, en combinaison ou seuls. En outre, si nécessaire on peut ajouter un sel inorganique de magnésium, calcium, sodium, potassium, fer et magnésium, et des vitamines comme la vitamine B et le pantothénate

de calcium.

Le milieu de culture préféré est une culture liquide agitée ou une culture en aération. Le pH préférable du milieu est pH 3-7 et la température est de 25-30 C. Le temps de culture dans le milieu liquide est généralement de 2-10 jours, cependant on peut atteindre l'accumulation maximum de TPI(II) en 5 jours et on la termine de préférence à ce point. On peut modifier les conditions de culture, comme la composition du milieu, la température, la durée, etc, selon le type de souche et les autres conditions, pour obtenir le rendement et la qualité maximum. On peut ajouter si nécessaire un antimousse

comme une huile siliconée, une huile végétale ou des agents tensio-actifs.

On inclut le TPI(II) dans un bouillon de culture, et on l'isole de préférence en ajoutant un auxiliaire de filtration comme la Celite,la Perlite et l'Hvflosupercel (marque déposée) dans un bouillon de culture, ou

par centrifugation.

L'isolement du TPI(II) du filtrat de culture peut s'effectuer en extrayant avec un solvant organique non miscible comme l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle ou le butanol et on concentre l'extrait pour obtenir la substance brute TPI(II). On peut conduire une purification plus poussée en combinant une chromatographie d'adsorption en utilisant du gel de silice, de l'alumine active, du charbon actif ou une résine d'adsorption non ionique, une chromatographie de partage à phases inversées en utilisant du gel de silice à liaison alcovle, et une filtration sur gel en utilisant un support de filtration sur gel. Ainsi, on adsorbe le TPI(II) brut sur une colonne de gel

de silice ou d'alumine et on élue avec une solution mixte comme le chloroforme-

isopropanol-acide acétique, l'acétate d'éthyle-isopropanol-acide acétique, et l'acétate d'éthyle-méthanol-acide acétique. On peut contrôler la fraction active par chromatographie sur couche mince de gel de silice ou en dosant

une activité inhibitrice en utilisant du PDE de coeur de boeuf.

Par cette chromatographie sur colonne, on peut isoler chacun

des composants, à savoir TPI-1, TPI-2, TPI-3 et TPI-4.

On peut produire le TPI-5, qui est un composé de formule (1) o R" est un hydrogène, de formule (III)

OR" OH(I I I)

O

H C-- 0 COOH

CH (CH2)SCH3 CH2 (CH2) 5CH3

o R" est un hydrogène, en traitant TPI(II) ou un de ses sels avec une glycosidase

ou sa modification pour couper enzymatiquement la liaison glycoside.

Comme exemples de glycosidases on peut citer la 13-glucosidase de TPI-1 ou TPI-3, et la 13-galactosidase de TPI-2 ou TPI-4. La glycosidase peut être n'importe quelle enzyme d'origine animale, végétale ou microbienne,

et se trouve dans le commerce sous forme de B-glucosidase et de 13galacto-

sidase. Les enzymes microbiennes sont des exo- et des endo-enzymes. On On peut obtenir l'exo-enzyme par des procédés classiques de purification à partir d'un filtrat de culture de la souche produisant l'enzyme. Dans le

cas de l'endo-enzyme, on peut utiliser les cellules microbiennes en elles-

même. On peut utiliser dans l'invention des cellules microbiennes traitées, par exemple des cellules séchées préparées par déshydratation avec un solvant organique non miscible à l'eau comme l'acétone, le méthanol ou l'éthanol, des cellules microbiennes broyées par un broyeur de cellules ou par traitement

aux ultra-sons, et un lysat cellulaire en traitant avec du chlorure de cétyl-

pyridinium et un agent tensio-actif, ou une enzyme préparée à partir de

ces cellules traitées par un procédé classique de purification.

L'enzyme modifi e ci-dessus signifie qu'on inclut également ici un type varié de matière ayant une activité de glycosidase, ou encore

une enzyme immobilisée ou des cellules immobilisées.

On peut préparer des enzymes ou cellules immobilisées par des moyens classiques. Ainsi, on peut mentionner un procédé immobilisant l'enzyme ou les cellules par liaison transversale, et un procédé d'enveloppement piégeant

l'enzyme ou les cellules avec une membrane semi-perméable pour la microcap-

sulation, une fibre ou membrane vide. On peut obtenir une réaction continue

en utilisant une enzyme ou des cellules immobilisées.

On peut conduire de préférence la réaction enzymatique ci- dessus à un pH optimal. La température de la réaction doit être la condition optimale et est généralement de 25-37 C. On peut déterminer la durée de la réaction en vérifiant le TPI par chromatographie sur couche mince (CCM) ou chromatographie en phase liquide à haute efficacité (CLHE) et on termine

de préférence à une accumulation maximale de TPI-5.

On acidifie le pH du milieu réactionnel enzymatique ainsi obtenu, on extrait avec un solvant organique non miscible à l'eau comme l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle ou le butanol et on concentre ledit extrait pour en obtenir le TPI-5 brut. On peut obtenir une purification plus poussée par chromatographie, filtration sur gel ou un procédé analogue comme pour

TPI(II).

On peut préparer de façon classique le sel de TPI à partir du

TPI brut; cependant la préparation du sel se fait de préférence après puri-

fication. Le sel préférable est un sel de métal alcalin comme le sodium et le potassium, un sel de métal alcalino-terreux comme le calcium et le magnésium, l'aluminium ou un autre sel métallique, un sel d'ammonium, un sel d'un acide

aminé basique connu ou un sel d'une amine organique connUe.

Les propriétés physico-chimiques du TPI sont précisées comme suit.

(TPI-1)

(1) Couleur et nature: poudre blanche (2) Nature: substance acide (3) Analyse élémentaire (C34 H 48 12.3/2 H O): Observé: C 60,43% H 7,48% Calculé: C 60,44% H 7,56% (4) Formule moléculaire: C34 H 48012 (5) Poids moléculaire (spectre de masse FAB): 648 (6) Pouvoir rotatoire spécifique: (o!) D -20,6 (c - 1,0, MeOH) (7) Spectre d'absorption ultra-violet: (Fig. 1) dans MeOH ou MeOH acide; max (nm): 253 (E' 250). 311 (inflexion) dans MeOH alcalin: -.x (nm): 240 (inflexion), 300 (E"' 350) (8) Spectre d'absorption infra-rouge: (KBr)(Fig.2)

3400, 2930, 2850, 1720. 1590. 1470. 1430. 1370. 1340, 1250,

1170, 1140, 1060 cm -' (9) Spectre 1 H-RMN (dans le deutérium-méthanol, 100 MHz): d (ppm): 0,88(t,3H), 0,90(t,3H), 1,31(m,20H), 1,61(m,4H), 2, 68(t,2I) 2,94(t.2H), 3,40-4,00(51), 4,89(d,11H), 6,42(d,.1H), 6,61(d,d,2H) , 6,71(d,1H) (10) Spectre 13 C-RMN (dans le deutérium-méthanol, 25 MHz): 174,1(s), 168,2(s), 164,2(s), 161,8(s), 158,4(s), 156,0(s), 149,1(s), 145, 2(s), 116,5(d), 116,1(s), 113,5(s), 112,1(d), 109,3(d), 103,4(d), 102,7(d) , 78,6(d), 78,4(d), 75,3(d), 71,6(d), 63,0(t),37,2(t), ,2(t), 33,3(t), 33, 3(t), 33,3(t), 33,0(t), 31,1(t),

,9(t), 30,6(t), 30,6(t), 24,0(t). 24,0(t), 14,8(q).

14,8(q) (11) Solubilité: Soluble: alcool inférieur comme méthanol, éthanol et butanol,

acétate d'éthyle, diméthylsulfoxyde, base aqueuse.

Insoluble: hexane, benzène et éther de pétrole.

(12) Réaction colorée: Positive: réaction du permanganate de potassium, réaction du chlorure ferrique, réaction de l'iode et réaction de Molisch Négative: réaction de la ninhydrine et réaction de l'iodoforme (13) Chromatographie sur couche mince: (gel de silice f de Tokyo Kasei K.K.) (Liquide de développement) (Rf) chloroforme-isopropanol-acide acétique: 0, 25

(10: 4: 0,1)

acétate d'éthyle-isopropanol-acide acétique: 0,36

(10: 4: 0,1)

acétate d'éthyle-acétone-acide acétique: 0,17

(6: 6: 0,1)

chloroforme-méthanol-acide acétique: 0,38

(10: 2: 0,1)

(TPI-2)

(1) Couleur et nature: poudre blanche (2) Nature: substance acide (3) Analyse élémentaire (C34 48O12 H2 O) Observé: C 61,79 H 7,56% Calculé: C 61,26% H 7,51% (4) Formule moléculaire: C34 H 48012

34 48 12

(5) Poids moléculaire (spectre de masse FAB): 648 (6) Pouvoir rotatoire spécifique: ce (.)s -12,6 (c 0,9, HeOH) C)D (7) Spectre d'absorption ultra-violet: (fig. 3) dans MeOH ou MeOH acide: l.,x (nm): 253 (El' 230), 311 (inflexion) dans MeOH alcalin: A".ax (nm): 240 (inflexion), 300 (El% 325) (8) Spectre d'absorption infra-rouge: (KBr) (fig. 4)

3400, 2930, 2850, 1720, 1600, 1470, 1410, 1320, 1240, 1170,

1140, 1050 cm -' (9) Spectre 1 H-RMN (dans le deutérium-méthanol, 100 MHz) : (ppm): 0387(t,3H), 0,89(t,3H11), 1,31(m,20H11), 1,60(m,4H), 2,68(t,2H) 2,94(t,2H), 3,50-4,00(5H), 4,88(d,1H), 6,42(d,1H), 6,64(d,d,2H), 6,74(d, 1H) (10) Spectre 13 C-RMN (dans le deutérium-méthanol, 25 MHz): 174,1(t), 168,2(s), 164,2(s), 161,8(s), 158,4(s), 156,0(s), 149,1(s), 145,2(s), 116, 5(d), 116,1(s), 113,4(s), 112,1(d), 109,4(d), 104,1(d), 102,8(d), 77,4(d), 75,3(d), 72,7(d), 70,5(d), 62,7(t),37,2(t), ,2(t), 33,3(t), 33,3(t), 33, 3(t), 33,0(t), 31,1(t), 31,0(t), 30,6(t)., 30,6(t), 24,0(t), 24,0(t), 14, 8(q), 14,8(q) (11) Solubilité: Soluble: alcool inférieur comme méthanol, éthanol et butanol, acétate d'éthyle, diméthylsulfoxyde,

base aqueuse.

Insoluble: hexane, benzène et éther de pétrole.

(12) Réaction colorée: Positive: réaction du permanganate de potassium, réaction du chlorure ferrique, réaction de l'iode et réaction de Molisch Négative: réaction de la ninhydrine et réaction de l'iodoforme (13) Chromatographie sur couche mince: (gel de silice f Tokyo Kasei K.K.) (Liquide de développement) Rf Chloroforme- isopropanol-acide acétique: 0, 19

(10: 4: 0,1)

Acétate d'éthyle-isopropanol-acide acétique: 0,21

(10: 4: 0.1)

Acétate d'éthyle-acétone-acide acétique: 0,14

(6: 6: 0,1)

Chloroforme-méthanol-acide acétique: 0,22

(10;: 2 0,1)

(TPI-3)

(1) Couleur et nature: poudre blanche (2) Nature: substance acide (3) Analyse élémentaire: Observé: C 61,93%- H 7,36% Calculé: C 62,59% H 7,30% (4) Formule moléculaire: C36 H 50013 (5) Poids moléculaire (spectre de masse FAB): 690 (6) Pouvoir rotatoire spécifique: (î) I5 -19,6 ' (c = 0,6, MleOH) D (7) Spectre d'absorption ultra-violet: (Fig. 5) dans MeOH: x (nm): 252 (El% 184). 310 (inflexion) (8) Spectre d'absorption infrarouge: (KBr)(Fig. 8)

3400, 2925, 2850, 1720, 1650, 1600, 1460, 1240, 1130, 1040

cm (9) Spectre 1 H-RMN (dans le deutérium-méthanol, 100 MHz): 6 (ppm): 0, 88(t,3H), 0,90(t,3H), 1,31(m,20H). 1,61(m,4H), 2,08(s,3H) 2,68(t,2H), 2, 94(t,2H), 3,20-4,00(m,3H), 4,00-4,60(m,2H), 4,35(d,1H), 6,44(d.1H), 6, 59(d,d,2H), 6,73(d,1lH) (10) Spectre 13 C-RMN (dans le deutérium-méthanol, 25 MHz): 174,2(s),173,1(s). 167,9(s), 164,4(s). 161,7(s), 158,3(s), 156, 0(s). 149,2(s). 145,2(s). 116,5(d), 116,3(s), 113,3(s), 112,1(d),. 109, 4(d). 103,3(d),. 103,0(d), 78,3(d), 75,8(d). 75,2(d). 71,8(d). 65,0(t),37, 2(t),

,2(t), 33.3(t), 33,3(t), 33,3(t), 32,9(t). 31,1(t).

,9(t), 30,6(t). 30,6(t). 24,0(t),. 24,0(t), 21,0(q), 14,8(q) 14,8(q) (11) Solubilité: Soluble: alcool inférieur comme méthanol, éthanol et butanol,

acétate d'éthyle, diméthylsulfoxyde, base alcaline.

Insoluble: hexane, benzène et éther de pétrole.

(12) Réaction colorée: - Positive: réaction du permanganate de potassium, réaction du chlorure ferrique, réaction de l'iode et réaction de Molisch Négative: réaction de la ninhydrine et réaction de l'iodoforme (13) Chromatographie sur couche mince: (gel de silice f Tokvo Kasei K.K.) (Liquide de développement) (Rf) chloroforme-isopropanol-acide acétique: 0, 54

S (10:4: 0,1)

acétate d'éthyle-isopropanol-acide acétique: 0,51

(10: 4: 0,1)

acétate d'éthyle-acétone-acide acétique: 0,35

(6: 6: 0,1)

chloroforme-méthanol-acide acétique: 0,52

(10: 2: 0.1)

(TPI-4)

(1) Couleur et nature: poudre blanche (2) Nature: substance acide (3) Analyse élémentaire: Observé: C 62,35% H 7,57% Calculé: C 62,59% H 7,30% (4) Formule moléculaire: C36 H 50013 (5) Poids moléculaire (spectre de masse FAB): 690 (6) Pouvoir rotatoire spécifique: Ce) 2: -13,3 (c = 0,4, MeOH) D (7) Spectre d'absorption ultra-violet: (Fig. 6) dans MeOH: X (nm) : 252 (E's 172), 310 (inflexion) (8) Spectre d'absorption infra-rouge: (KBr)(Fig. 8)

3420, 2930, 2860, 1730, 1660. 1610, 1470, 1240, 1140, 1040

cm ' ?9599 (9) Spectre H-RMN (dans le deutérium-méthanol, 100 MHz): d (ppm): 0,87(t,3H), 0,90(t,3H), 1,31(m,20H), 1,61(m,4H), 2,03(s,3H) 2,68(t, 2H), 2,95(t,2H), 3,20-4,00(m,3H), 4,00-4,60(m,2H), 4,87(d, lH), 6,43(d, lH), 6,60(d,d,2H), 6,73(d, lH) (10) Spectre 13 C-RMN (dans le deutériumméthanol, 25 MHz): 174,2(s),173,0(s), 168.0(s). 164,2(s), 161,8(s), 158, 4(s), 156,0(s), 149,1(s), 145,2(s), 116,5(d), 116,1(s), 113,5(s), 111,9(d) , 109,4(d), 103,7(d), 102,9(d), ,2(d), 74,7(d), 72.5(d), 70,4(d), 64,9(t), 37,2(t), ,2(t), 33,3(t), 33,3(t), 33,3(t), 33,0(t), 31,1(t), 31,0(t), 30, 6(t), 30,6(t), 24,0(t), 24,0(t), 21,0(q), 14,8(q) 14,8 (q) (11) Solubilité: Soluble: alcool inférieur comme méthanol, éthanol et butanol,

acétate d'éthyle, diméthylsulfoxyde, base aqueuse.

Insoluble: hexane, benzène et éther de pétrole.

(12) Réaction colorée: Positive: réaction du permanganate de potassium, réaction du chlorure ferrique, réaction de l'iode et réaction de Molisch Négative: réaction de la ninhydrine et réaction de l'iodoforme (13) Chromatographie en couche mince:( gel de silice f Tokyo

Kasei K.K.

(Liquide de développement) (Rf) chloroforme-isopropanol-acide acétique: 0, 46

(10:4: 0,1)

acétate d'éthyle-isopropanol-acide acétique: 0,43

(10: 4: 0,1)

acétate d'éthyle-acétone-acide acétique: 0,29

(6:6: 0,1)

chloroforme-méthanol-acide acétique: 0,48

(10:2: 0,1)

(TPI-5)

(1) Couleur et nature: poudre blanche (2) Nature: substance acide (3) Analyse élémentaire: Observé: C 69,30% H 7,72% calculé: C 69,11% H 7,87% (4) Formule moléculaire: C28 H 3807 (5) Poids moléculaire: 486 (6)Spectre d'absorption ultra-violet: (Fig. 7) dans MeOH: A..x (nm): 271 (E' 389)

305 (E.. 243)

(7) Spectre d'absorption infra-rouge: (KBr)(Fig. 8)

3320, 2920, 2850, 1650, 1600, 1580, 1450, 1300, 1240, 1200, 1140,

1060 cm " (8) Spectre 1 H-RMN (dans le deutérium-méthanol, 100 MHz): 6(ppm): 0,85(t,3H), 0,88(t,3H), 1,27(m,2011H), 1,60(m,4H), 3,02(t, t,) roe2t're ou 6,,,d 11, 6,.1 1o H 1 1 0'7 ( 1 US (9) Spectre 13 C-RMN (dans le deutérlum-méthanol, 25 MHz): 174,7(s),169,3(s), 166,3(s), 165,3(s),. 161,4(s),. 155,0(s), ,0(s), 149,5(s), 116,2(d), 111,5(d), 109,0(d), 108, 7(s),. 104,2(s),. 101,8(d),. 37,3(t), 36,7(t), 32,3(t), 31,9(t), 3i,9(t), 31,9(t). 29,9(t).29,9(t), 29,3(t),. 29,2(t), 22,8(t). 22,8(t). 14,2(q), 14,2(q) (10) Solubilité: Soluble: alcool inférieur comme méthanol, éthanol et butanol, chloroforme, acétate d'éthyle, diméthylsulfoxyde,

base aqueuse.

Insoluble: hexane, benzène et éther de pétrole.

(11) Réaction colorée: Positive: réaction du permanganate de potassium, réaction du chlorure ferrique, réaction de l'iode et réaction de Molisch Négative: réaction de la ninhydrine et réaction de l'iodoforme (12) Chromatographie sur couche mince: (gel de silice f Tokyo Kasei K.K.) (Liquide de développement) (Rf) chloroforme-isoproPanol-acide acétique: 0. 87

(10: 4: 0,1)

acétate d'éthyle-isopropanol-acide acétique: 0,68

(10: 4: 0,1)

acétate d'éthyle-acétone-acide acétique: 0,78

(6: 6: 0,1)

chloroforme-méthanol-acide acétique: 0,77

(10: 2: 0,1)

Selon les propriétés physico-chimiques ci-dessus, TPI-1, TPI-2, TPI-3, TPI-4 et TPI-5 ont la structure chimique telle que présentés

dans la formule (I).

Le TPI de l'invention est une substance nouvelle complètement

différente des inhibiteurs de PTE produits par des microorganismes antérieu-

rement connus. Parmi les inhibiteurs de PDE connus, PDE-I, PDE-II, CC1065, APD-I, APD-II et APD-III sont des substances azotées et le réticulol et le terférol sont des composés de formule moléculaire C11 H0 O5 et

C19 H16 0, respectivement, tous étant différent du présent TPI.

19 16 5

Le TPI de l'invention a une forte activité d'inhibition de PDE.

L'activité d'inhibition du PDE de coeur de boeuf du TP! est présentée ci-

dessous. (Mode opératoire) On verse 40 mM de solution tampon Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM de

chlorure de magnésium, 0,4 mM de c-AMP, du PDE (30 çg de protéine, Boeh-

ringer Mannheim Co.) et du TPI dans un mélange réactionnel (1,0 ml) et on fait incuber à 30 C pendant 30 minutes. On arrête la réaction en ajoutant de l'acide trichloracétique à 55% (0,1 ml) et on mesure le 5'-AMP produit par CLHP (Hitachi, système 655) (colonne: Hitachi q 3056, 4 x 150 mm, couche de migration: KH PO 10 mM (pH 2,0)-MeOH (10: 1), vitesse de migration: 2 4 1,5 ml/min. détecteur: 262 me). On calcule le rapport d'inhibition par l'équation suivante. Rapport d'inhibition = (A - B)/A x 100 (%) o A: quantité de 5'-AMP sans TPI B: quantité de 5'-AMP avec TPI On donne ci-dessous la CI, concentration de TPI à un rapport

d'inhibition de 50%.

(Résultat) Composé Concentration CI50 (eg/ml)

TPI-1 2.8

TPI-2 5,4

TPI-3 2,8

TPI-4 3,5

TPI-5 2,3

Papavérine 25 Nicardipine 6,0 Théophilline 470 On n'observe pas de décès lorsqu'on injecte le TPI-1 à raison

de 100 mg/kg par voie intrapéritonéale chez les souris.

Comme il a été dit ci-dessus, le TPI de l'invention a une forte activité inhibitrice contre le PDE et une faible toxicité, et est donc utile comme bronchodilatateur, stimulateur cardiaque, relaxant du muscle lisse

et stimulant de l'excrétion hormonale.

Les dessins annexés représentent, comme il est apparu au

cours de la description des propriétés physicochimiques de PTI ci-

dessus, les spectres suivants: Fig. 1: spectre d'absorption ultra-violet de TPI-1; Fig. 2: spectre d'absorption ultraviolet de TPI-2; Fig. 3: spectre d'absorption infra-rouge deTPI-1; Fig. 4: spectre d'absorption infra-rouge de TPI-2; Fig. 5: spectre d'absorption ultra-violet de TPI-3; Fig. 6: spectre d'absorption ultra-violet de TPI-4; Fig. 7: spectre d'absorption ultra-violet de TPI-5; Fig. 8: spectre d'absorption ultraviolet de TPI-3; Fig. 9: Spectre d'absorption infra-rouge de TPI-4;

Fig. 10: spectre d'absorption infra-rouge de TPI-5.

Les exemples suivants précisent l'invention mais ne doivent

pas être compris comme limitant la portée de l'invention.

EXEMPLE 1

On inocule une boucle de souche de Nodulisporium sp. M5220 FERM P-8133 dans un milieu (pH 6,5. 100 mi, stérilisé à 120 C pendant 20 min.) contenant 2% de glucose, 1% de peptone, 1%. de CSL, 0,2% de phosphate diacide

de potassium, 0,1% de sulfate de magnésium et 1% de Celite dans un erlen-

meyer de 500 ml, et on cultive à 26 C pendant 4 jours pour préparer une culture d'ensemencement. On inocule la culture d'ensemencement à un rapport volumique de 3%, dans un milieu (pH 7,0, 100x100 ml) constitué de 5% de glucose, 30. 2% de milieu pharma 2%, 0,5% de CSL. 0,1% de phosphate monoacide de potassium, 0,1% de sulfate de magnésium,.,5% de carbonate de calcium, 0,0005% de sulfate ferreux, 0,0002% de sulfate de zinc, 0,0001% de chlorure de cobalt, 0,0003%

de sulfate de manganèse et 0,0002% de sulfate de cuivre. On conduit la fermen-

tation à 260C pendant 5 jours sur un agitateur rotatif. On centrifuge le

bouillon cultivé (10 litres) pour obtenir une solution surnageante (8,5 litres).

On ajoute au surnageant de l'acétate d'éthyle (5 litres), on ajuste son pH

à 2 en ajoutant goutte à goutte de l'HCI 2 N, et on obtient une couche d'acé-

tate d'éthyle (4,5 litres). On ajoute de l'eau (3 litres) à la couche d'acétate d'éthyle et on ajuste à pH 9 en ajoutant de l'ammoniqueconcentrée pour transférer le TPI dans la couche aqueuse. On ajoute de l'acétate d'éthyle (2 litres) dans la couche aqueuse (3 litres), on ajuste le pH à 2 en ajoutant de l'HCI 2 N tout en agitant pour obtenir la couche d'acétate d'éthyle (environ 2 litres). On sèche la couche d'acétate d'éthyle en ajoutant du sulfate de sodium anhydre et on concentre sous vide pour obtenir une poudre brunâtre

(environ 6 g).

EXEMPLE 2

On mélange de la poudre de TPI brute (6 g) obtenue dans l'exemple 1 dissoute dans le méthanol (30 ml) avec une poudre de gel de silice (4 g), on agite et on concentre sous vide pour enlever le méthanol. On met le mélange au sommet d'une colonne de gel de silice (400 ml) préalablement remplie d'une solution mixte de chloroforme-isopropanol-acide acétique (10: 2: 0,1) et on élue avec le même mélange solvant. On vérifie chaque fraction de 20 g par CCM développée avec du chloroforme-isopropanol-acide acétique (10 4: 0,1). On sépare les taches présentant un Rf = 0,54, Rf = 0,46, Rf = 0,25 et Rf = 0,19 détecté par absorption UV en utilisant une lampe Manasule (marque déposée) ou une réaction de décoloration avec du permanganate de potassium. Les fractions N 13-N 28 contiennent le TPI-3 (Rf = 0,54) et le TPI-4 (Rf = 0,46), les fractions Nu 71-N 122 contiennent le TPI-1 (Rf = 0,25) et les fractions N 123-187 contiennent le TPI-1 (Rf - 0,25) et le TPI-2

(Rf = 0,19).

On recueille les fractions N 13-N0 28, on concentre sous vide à 20 ml, on charge dans une colonne de gel de silice (200 ml) préalablement remplie d'un mélange d'acétate d'éthvle-acétone-acide acétique (10: 6: 0, 1) et on élue.avec le même solvant. On fractionne l'éluat en fractions de 20 g. on détecte par CECM sur gel de silice en développant avec un mélange d'acétate d'éthvle-acétone-acide acétique (6: 6: 0,1) et on recueille les fractions contenant des taches correspondant à Rf = 0,35 et Rf = 0,29. On recueille les fractions N 35-N 40 contenant la substance correspondant à Rf = 0,35 et on concentre sous vide à environ 3 ml. On ajoute du n-hexane au résidu pour précipiter la substance TPI-3, qu'on lave avec du n-hexane

et qu'on sèche sous vide pour obtenir le TPI-3 (20 mg).

On recueille les fractions No 48-N 69 contenant la substance correspondant à Rf = 0,29 et on concentre sous vide à environ 3 mi. On ajoute du n-hexane au résidu pour précipiter la substance TPI-4, qu'on lave avec du n-hexane et qu'on sèche sous vide pour obtenir le TPI-4 (15 mg).

EXEMPLE 3

On recueille les fractions N 71-N 122 contenant le TPI présentant un Rf = 0,25 et on concentre à 20 ml sous vide. On y ajoute de l'acétate d'éthyle

jusqu'à 200 ml. On ajoute encore de l'eau (200 ml) et on agite vigoureusement.

On concentre la couche d'acétate d'éthyle sous vide à environ 10 ml. On y ajoute du n-hexane pour précipiter TPI-1. On met le précipité sur le filtre en verre, on lave avec du n-hexane et on concentre sous vide pour obtenir

le TPI-1 purifié (1,8 g).

On recueille et on concentre sous vide les fractions N 123-

N0 187 contenant le TPI-1 (Rf = 0,25) et le TPI-2 ( Rf = 0,19) obtenues dans l'exemple 2. On mélange bien le résidu dissous dans le méthanol (20 ml) avec une poudre de gel de silice (2 g). Après avoir enlevé le méthanol sous vide, on introduit le mélange dans une colonne de gel de silice (200 ml) préalablement remplie de chloroforme-méthanol-acide acétique (10: 2: 0,1) et on élue avec le même mélange solvant. On vérifie chaque fraction (20 g) par CCM sur gel de silice développée avec du chloroforme-isopropanol-acide acétique (10: 4: 0,1) et on détecte la tache par absorption UV en utilisant une lampe

* Manasule et une réaction de décoloration au permanganate de potassium.

On recueille les fractions N 54-N 130 ne contenant qu'une substance présen-

tant un Rf = 0,19, on concentre sous vide jusqu'à 20 ml, on y ajoute de l'acétate d'éthyle (200 ml) et de l'eau (200 ml) et on agite vigoureusement. On sépare l'acétate d'éthyle, on concentre sous vide à 10 ml et on y ajoute du n-hexane pour précipiter le TPI-2, qu'on lave avec du n-hexane, puis on sèche sous

vide pour obtenir le TPI-2 (600 mg).

EXEMPLE 4

On dissout le TPI-1 (50 mg) obtenu dans l'exemple 3 dans un tampon phosphaté 0,1 M (pH 6,5, 4 ml), et on y ajoute de la B13-glucosidase (Sigma Co., 4,5 U/mg, 4 mg). On fait incuber le mélange à 26 C pendant 7 jours, pendant lesquels environ 50% du TPI-1 sont transformés en TPI-5. On ajuste le mélange réactionnel à pH 3 avec du sulfate de sodium anhydre et on concentre sous vide. On met le résidu dans une colonne de gel de silice (28 ml) préalablement remplie d'un mélange de chloroforme-méthanolacide acétique (20: 1: 0,1) et on élue avec le même mélange. On recueille un éluat de fractions de g chacune aux fractions N 28-N 31 et on concentre, on lave avec du n-hexane et on sèche sous vide pour obtenir le TPI-5 poudreux blanc

(15 mg).

Claims (5)

REVENDICATIONS

1. Substance physiologiquement active TPI de formule

OR OH

oitC

HO C - 0 COOH

CH 2(CH2)5CH3 CH2(CH2)5CH3

o R est un B3-D-glucopyranosyle, B-D-galactopyranosyle, 6'-0-acétyl-B-D-

glucopyranosyle, 6'-0-acétyl-B3-D-galactopyranosYle ou hydrogène, ou un

de ses sels.

2. Procédé de production de la substance physiologiquement active TPI de formule

OR ' OH

o

HO C 0 / COOT{

CH2 (CH") 5CH3 CH2 ( CH2)5CH3

o R' est un 13-D-glucopyranosyle, 3-D-galactopyranosyle, 6'-0-acétyl-B-

D-glucopvranosvle, ou 6'-0o-acétyl-B3-D-galactopyranosyle, ou d'un de ses

sels, dans lequel on cultive un microorganisme producteur de TPI apparte-

nant au genre Nodulisporium et on en isole la substance physiologiquement

active TPI-1 produite, et si nécessaire on la transforme en son sel.

3. Procédé selon la revendication 2 o le microorganisme produisant la substance.

physiologiquement active est Nodulisporium sp. M5220 FERM P-8133.

4. Procédé de production de la substance physiologiquement active de formule

OR ' OH

HO C- o COOH CH 2(CH2)s5CE3 C2 (CH3,) 5CH3 o R" est un hydrogène, dans lequel on traite un composé de formule

OR" OH

HO C - 0 COOH

CH2 (CH2) 5CH3 CH2 (CH2) 5CH3

o R' est un B-D-glucopyranosvle, 13-D-galactopyranosvle, 6'-O-acétyl-B-

D-glucopyranosyle, ou 6'-O-acétyl-3-D-galactoPyranosyle, ou un de ses sels,

avec une glycosidase ou une glycosidase modifiée dans un milieu aqueux.

5. Procédé selon la revendication 4 o la glycosidase est la Bglucosidase

ou la 13-galactosidase.