JP3195409B2 - Ａｃａｔ阻害物質 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、式Ｉ：

【化４】 （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄はそれぞれ独立して水
素、低級アルキル基、または低級アルカノイル基を表わ
す。）で示される化合物、該化合物を産生する微生物、
該化合物の製造法、および該化合物を有効成分として含
有するＡＣＡＴ阻害剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】

酵素アシルコエンザイムＡ：コレステロ−ルアシルトラ
ンスフェラ−ゼ（ＡＣＡＴ）はコレステロ−ルのエステ
ル化酵素であり、本酵素の阻害剤は動脈硬化の治療薬
（Drago R. et al., Tips 1991 (12), 194〜199）とし
て期待されている。近年わが国においても、生活水準の
変化に伴い欧米型食生活の増加、人口の高齢化とともに
高脂血症およびそれに起因する動脈硬化性疾患が増加し
社会問題となっている。動脈硬化症は、血管の内膜肥厚
と脂質蓄積が特徴的な病変である。近年、粥状動脈硬化
症の病巣に、マクロファ−ジ由来の細胞がコレステロ−
ルエステルを脂肪滴として貯蔵している泡沫細胞が観察
され、病変の進展に深く関わっていると推定されてい
る。また、動脈硬化病変部位の血管壁のＡＣＡＴ活性が
高くなっており、血管壁へコレステロ−ルエステルが蓄
積している事が報告されている。ＡＣＡＴ阻害剤により
コレステロ−ルのエステル化を阻害すれば、細胞内の遊
離コレステロールは高比重リポ蛋白質（ＨＬＤ）により
沈着部位から取り去られ肝臓に運ばれ代謝されるので、
病変部位でのコレステロ−ルエステルの蓄積が抑制され
直接的な抗動脈硬化作用を得ることができる。

【０００３】また、食事中に含まれるコレステロ−ルは
小腸粘膜細胞においてＡＣＡＴによりエステル化された
後、キロミクロンの成分として血流中に放出される。Ａ
ＣＡＴの阻害剤を用いれば、食事中のコレステロ−ルの
小腸からの吸収を阻害することにより血中コレステロ−
ルを低下させることができ、その結果、動脈硬化を抑制
することができる。本発明化合物と類似の構造を持つ化
合物として、Arturo San Feliciano et al., Phytochem
istry 21(8), 2115-2117, 1982およびArturo San Felic
iano et al., Phytochemistry 29(2), 645-648, 1990に
記載されているものがあるが、これらの化合物のＡＣＡ
Ｔ阻害作用はもちろん、医薬としての有用性についても
一切記載されていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ＡＣＡＴには、肝臓に
存在する酵素と副腎に存在する酵素の２つのサブタイプ
が存在し、高コレステロ−ル食を負荷したときには、小
腸や血管壁において副腎に存在するタイプの酵素が誘導
されることが報告されている（Paul M. Kinnunenet a
l., Biochemistry 1988, 27, 7344〜7350）。これまで
ＡＣＡＴ阻害剤の研究の多くは肝臓の酵素を対象として
行われている。本発明者らは、高コレステロ−ル食で誘
導される副腎に存在するタイプの酵素を選択的に阻害す
る化合物は、より副作用の少ない動脈硬化の予防・治療
薬になりうると考え研究を行った。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、以上の事
柄を鑑み鋭意研究を行なった結果、カビの１種であるス
タキボトリス エレガンス ＲＦ−４６６７株（Stachy
botrys elegans RF-4667）の培養液中に生産される化合
物が副腎に存在するタイプのＡＣＡＴの活性を特異的に
阻害することを見出し、質量分析、¹Ｈ−、¹³Ｃ−ＮＭ
Ｒ等のスペクトルデーターの解析、および化学分解反応
より該化合物がセスキテルペン配糖体の構造を有するこ
とを確認して本発明を完成させるに至った。すなわち本
発明は、式Ｉ：

【化５】 （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄はそれぞれ独立して水
素、低級アルキル基、または低級アルカノイル基を表わ
す。）で示される化合物に関する。本発明化合物は式I
I：

【化６】 で示される立体構造をもつことが確認された。

【０００６】また本発明は、スタキボトリス エレガン
ス（Stachybotrys elegans）種に属し、式III：

【化７】 （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄はそれぞれ独立して水
素または低級アルカノイル基を表わす。）で示される化
合物を産生する微生物を提供する。本発明のスタキボト
リス エレガンス（Stachybotrys elegans）種に属する
ＲＦ−４６６７株は以下のような性状を有していた。

【０００７】ＲＦ−４６６７株の菌学的諸性状 本菌株をポテトデキストロ−ズ寒天上で２５℃にて１０
日間培養するとコロニ−は白いうぶ毛でおおわれた状態
になり、胞子の形成に伴い薄オレンジ色を呈するように
なる。コロニ−の裏面はオレンジ色である。分生胞子柄
は分枝するものとしないものがあり、無色で長さは２０
０μｍに達し、幅は３〜４μｍで、その頂端に数個の梗
子（phialide）が形成される。梗子は棍棒状で頂点に開
口部を持ち、表面は平滑で、大きさは１４〜１６×４〜
６μｍである。分生胞子は紡錘形で両端は丸く、無色で
表面は平滑であり、８〜１１×５〜６μｍである。これ
らの諸性状から、本菌株はスタキボトリス（Stachybotr
ys）属に属する株と判断される。上述した諸性状をDoms
ch, K. H., Gams, W., Anderson, T. H. 共著、”Compe
ndium of Soil Fungi”Vol. 1 Academic Press, New Yo
rk, 1980 のStachybotrys属についての記載と比較した
結果、ＲＦ−４６６７株はStachybotrys elegans (Pido
pl.) W. Gams, comb. nov. に属すると結論し、本菌株
をStachybotryselegans RF-4667と命名した。本菌株
は、茨城県つくば市東１−１−３（郵便番号３０５）に
ある工業技術院微生物工業研究所に、平成４年（１９９
２年）４月４日よりブダペスト条約に基づき「Stachybo
trys elegans RF-4667」微工研条寄第３８２３号（FERM
BP-3823)として寄託されている。

【０００８】本発明において、低級アルキルとしては直
鎖または分岐していてもよいＣ₁〜Ｃ₆アルキル、具体的
にはメチル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、
ペンチル、ヘキシルが挙げられる。低級アルカノイルと
しては直鎖または分岐していてもよいＣ₂〜Ｃ₆アルカノ
イル、具体的には、アセチル、プロピオニル、ブチリ
ル、イソブチリル、バレリルなどが例示される。

【０００９】さらに本発明は、スタキボトリス（Stachy
botrys）属に属し式IIIで示される化合物を産生する微
生物を培養し、該培養培地から該化合物を採取し、所望
により加水分解、アルカノイル化、またはアルキル化す
ることを特徴とする本発明化合物の製造法を提供する。
以下に、本発明化合物の一般的製造法を記載する。スタ
キボトリス（Stachybotrys）属に属する菌株、例えば上
記のStachybotryselegans RF-4667を、通常の発酵生産
に用いる培地組成、培地条件で培養する。培地は原則と
して、炭素源、窒素源、無機塩などを含む。必要に応じ
て、ビタミン類、先駆物質などを加えてもよい。炭素源
としては、例えば、グルコ−ス、可溶性澱粉、デキスト
リン、グリセリン、糖類、有機酸などが単独または混合
物として用いられる。窒素源としては、例えば、大豆
粉、コ−ンスチ−プリカ−、肉エキス、酵母エキス、綿
実粉、ペプトン、小麦麦芽、硫酸アンモニウム、硝酸ア
ンモニウムなどが単独または混合物として用いられる。
無機塩としては、例えば、炭酸カルシウム、塩化ナトリ
ウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、塩化
マンガン、硫酸亜鉛、塩化コバルト、各種リン酸塩など
が挙げられ、必要に応じて培地に添加する。

【００１０】培養温度は約２５〜３７℃で行なうと良
く、特に２８〜３２℃が好ましい。培養時間は発酵の規
模に大きく左右されるが、約５〜７日が大量生産を行な
う場合に要する培養時間である。培養中に激しい発泡が
起こる場合には、培養前または培養中に例えば、植物
油、ラ−ド、ポリプロピレングリコ−ルなどの消泡剤を
適宜添加するとよい。培養終了後、培養物から式IIIで
示される化合物を分離採取するには、通常の発酵生産物
を分離採取する方法を適宜用いる。例えば、濾過、遠心
分離、各種イオン交換樹脂やその他の活性吸着剤による
吸脱着やクロマトグラフィ−、各種有機溶媒による抽出
などを適当に組み合わせるとよい。

【００１１】得られた式IIIで示される化合物のうち、R
₁〜R₄のいずれかまたは全てが水素の物については、所
望により適宜アルカノイル化を行なって、R₁〜R₄の全て
をアルカノイル基とすることができる。アルカノイル化
は、低級アルカノイルやその無水物を用いて通常のエス
テル化の方法で行なうことができる。

【００１２】以下に上記培養工程で得られた化合物ＲＦ
−４６６７Ａ，Ｄ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊの物理化学的性
状を示す。

【００１３】(1) ＲＦ−４６６７Ａ 1)構造：式Ｉまたは式III中、R₁〜R₄が全てアセチル基 2)性状：無色のオイル (中性) 3)溶解性：可溶；メタノ−ル、アセトン、クロロホル
ム、酢酸エチル、エ−テル ：不溶；水 4)分子式：C₂₉H₄₄O₁₀ (分子量：552.66) 5)質量分析 (LSI-MS)：m/z 553 (M+H)⁺, 575 (M+Na)⁺,
331 (C₁₄H₁₉O₉)⁺＝マンノ−スのtetra-O-acetyl体のオ
キソニウムイオン、205 (C₁₅H₂₅)⁺＝アグリコン 6)HR-LSIMS：C₂₉H₄₄O₁₀Naとして 理論値：575.2831 実測値：575.2838 (M+Na)⁺ 7)元素分析：C₂₉H₄₄O₁₀として 理論値：C: 63.03, H: 8.02 実測値：C: 62.91, H: 7.99.

【００１４】 8)ＵＶ：λ_max ^{70% CH3CN}, End absorption (末端吸収) 9)ＩＲ：ν_max ^film cm^-1：2960, 2920, 1745, 1435, 17
30, 1225, 1177, 1119, 1051, 989, 963, 914 10)[α]_D ²⁴°；−50.6±0.8° (c 1.16, CHCl₃) 11)ＴＬＣ (KGF)：Rf＝0.78 [ジクロロメタン／メタノ
−ル (10:1)] 12)ＨＰＬＣ：保持時間 (Rt)；12.1分, カラム；YMC-OD
S-5 (4.6 × 150mm), UV；220nm, 流速；1ml/分, 溶
媒；アセトニトリル／水 (70:30).

【００１５】13)¹Ｈ−ＮＭＲ (CDCl₃)； (アグリコン)；5.368 (1H, m, H-2), 1.816 (1H, m, Ha
-3), ca 1.93 (1H,m, Hb-3), 1.70 (1H, m, J=2, 〜4.
5, 〜11.5, H-4), 1.239 (1H, m, J=6.0, 11.8, Ha-5),
ca 1.87 (1H, m, Hb-5), ca 1.96 (2H, m, H-6), 1.63
1 (3H, s, Me-7), 1.536 (1H, ddd, J=5.3, 11.3, 14.
0, Ha-9), 1.422 (1H, ddd, J=5.2, 11.8, 14.0, Hb-
9), ca 1.88 (1H, m, 11-Ha), 1.94 (1H, m, 11-Hb),
1.172 (3H,s, Me-10), 5.051 (1H, m, J=ca 1, 7), 1.5
88 (3H, s, Me-14), 1.672 (3H, s, Me-15) (糖)；4.781 (1H, d, J=1.0, 1’-H), 5.341 (1H, dd,
J=1.0, 3.4, H-2’), 5.075 (1H, dd, J=3.4, 10.0, H-
3’), 5.180 (1H, t, J=10.0, H-4’), 3.626 (1H, dd
d, J=2.7, 6.6, 9.5, H-5’), 4.127 (1H, dd, J=2.7,
12.0, Ha-6’), 4.215 (1H, dd, J=6.6, 12.0), 2.173
(3H, s, OAc-2’), 1.999 (3H, s, OAc-3’), 2.041 (3
H, s, OAc-4’), 2.057 (3H, s, OAc-6’)

【００１６】14)¹³Ｃ−ＮＭＲ (CDCl₃)； (アグリコン)；133.94 (s, C-1), 120.85 (d, C-2), 2
6.63 (t, C-3), 41.70 (d, C-4), 23.63 (t, C-5), 31.
03 (t, C-6), 23.35 (q, C-7), 82.37 (s, C-8), 35.87
(t, C-9), 21.19 (q, C-10), 21.95 (t, C-11), 124.3
3 (d, C-12),131.56 (s, C-13), 17.59 (q, C-14), 25.
68 (q, C-15), (糖)；92.83 (d, C-1’), 70.40 (d, C-2’), 71.25
(d, C-3’), 66.58 (d, C-4’), 72.17 (d, C-5’), 6
3.06 (t, C-6’), 20.85 (q, C-2’-0COCH₃), 20.60
(q, C-3’-0COCH₃), 20.71 (q, C-4’-OCOCH₃), 20.71
(q, C-6’-OCOCH₃), 170.37 (s, C-2’-0COCH₃), 170.0
2 (s, C-3’-OCOCH₃), 169.72 (s, C-4’-OCOCH₃), 17
0.64 (s, C-6’-OCOCH₃)

【００１７】(2)ＲＦ−４６６７Ｄ 1)構造：式Ｉまたは式III中、R₁＝R₃＝水素、R₂＝R₄＝
アセチル基 2)質量分析：m/z 468 (M)⁺ (C₂₅H₄₀O₈) 3)¹Ｈ−ＮＭＲ (CDCl₃)： (アグリコン）；1.203 (3H, s), 1.20〜1.60 (3H, m),
1.594 (3H, s), 1.643 (3H, s), 1.678 (3H, s), 1.75
〜2.05 (8H, m), 5.080 (1H, m), 5.375 (1H,m) (糖)；2.095 (3H, s), 2.186 (3H, s), 2.462 (1H, s),
2.65 (1H, d, J=5Hz), 3.425 (1H, m), 3.875 (1H,
m), 3.975 (1H, d, J= 2.5), 4.28〜4.48 (2H, m), 4.7
23 (1H, d, J=1), 4.800 (1H, m) 3)IR：ν_max ^CHCl3 cm^-1；3564, 2960, 2922, 1736, 160
3, 1439, 1375, 1240,1149, 1066, 1030.

【００１８】(3)ＲＦ−４６６７Ｆ 1)構造：式Ｉまたは式III中、R₂＝R₃＝水素、R₁＝R₄＝
アセチル基 2)質量分析：m/z 468 (M)⁺ (C₂₅H₄₀O₈) 3)¹Ｈ−ＮＭＲ (CDCl₃)： (アグリコン）；1.170 (3H, s), 1.20〜1.56 (3H, m),
1.597 (3H, s), 1.635 (3H, s), 1.673 (3H, s), 1.70
〜2.02 (8H, m), 5.05 (1H, m), 5.375 (1H,m) (糖)；2.099 (3H, s), 2.169 (3H, s), 2.725 (1H, br-
s), 3.087 (1H, br-s), 3.425 (1H, m), 3.600 (1H,
m), 3.720 (1H, m), 4.363 (2H, d, J=4), 4.725 (1H,
d, J=1), 5.185 (1H, d, J=4).

【００１９】(4)ＲＦ−４６６７Ｇ 1)構造：式Ｉまたは式III中、R₁＝R₃＝R₄＝水素、R₂＝
アセチル基 2)質量分析：m/z 426 (M)⁺ (C₂₃H₃₈O₇) 3)¹Ｈ−ＮＭＲ (CDCl₃)： (アグリコン）；1.191 (3H, s), 1.28〜1.60 (3H, m),
1.598 (3H, s), 1.645 (3H, s), 1.682 (3H, s), 1.175
〜2.10 (8H, m), 5.075 (1H, m), 5.385 (1H, m) (糖)；2.185 (3H, s), 2.310 (1H, br-s), 2.530 (1H,
br-s), 2.675 (1H,br-s), 3.325 (1H, m), 3.70〜3.95
(2H, m), 3.98〜4.09 (2H, m), 4.768 (1H,d, J=1), 4.
80 (1H, m). 3)ＩＲ：ν_max ^CHCl3 cm^-1；3568, 3430, 2960, 2920, 1
736, 1600, 1452, 1376, 1243, 1066, 1027.

【００２０】(5)ＲＦ−４６６７Ｈ 1)構造：式Ｉまたは式III中、R₁＝R₂＝R₃＝水素、R₄＝
アセチル基 2)質量分析：m/z 426 (M)⁺ (C₂₃H₃₈O₇) 3)¹Ｈ−ＮＭＲ (CDCl₃)： (アグリコン)；1.198 (3H, s), 1.26〜1.56 (3H, m),
1.599 (3H, s), 1.642 (3H, s), 1.684 (3H, s), 1.70
〜2.03 (8H, m), 5.075 (1H, m), 5.375 (1H,m) (糖)；2.080 (3H, s), 2.60 (1H, br-s), 2.85 (1H, br
-s), 3.340 (1H, m), 3.46〜3.66 (2H, m), 3.88 (1H,
d, J=4), 4.337 (2H, d, J=4.2), 4.665 (1H, d, J =
1).

【００２１】(6)ＲＦ−４６６７Ｉ 1)構造：式Ｉまたは式III中、R₂＝R₃＝R₄＝水素、R₁＝
アセチル基 2)質量分析：m/z 426 (M)⁺ (C₂₃H₃₈O₇) 3)¹Ｈ−ＮＭＲ (CDCl₃)： (アグリコン)；1.162 (3H, s), 1.19〜1.55 (3H, m),
1.601 (3H, s), 1.636 (3H, s), 1.675 (3H, s), 1.70
〜2.00 (8H, m), 5.050 (1H, m), 5.375 (1H,m), (糖)；2.166 (3H, s), 2.25 (1H, br-s), 2.60 (1H, br
-s), 2.85 (1H, br-s), 3.30 (1H, m), 3.725 (2H, d,
J=5.2), 3.88〜3.95 (2H, m), 4.763 (2H, d, J=1), 5.
270 (1H, d, J= 1.4).

【００２２】(7)ＲＦ−４６６７Ｊ 1)構造：式Ｉまたは式III中、R₁〜R₄は全て水素 2)ＭＳ：m/z (M)⁺ 384 (C₂₁H₃₆O₆) 3)ＩＲ：ν_max ^CHCl3 cm^-1；3394, 2962, 2922, 1603, 1
451, 1378, 1066, 1027 4)ＴＬＣ：メルク KGf, Rf=0.18, 溶媒；ジクロロメタ
ン／メタノ−ル＝10／1 5)ＨＰＬＣ：Rt＝2.7分, カラム；YMC-ODS-5 (4.6 × 1
50 mm), 溶媒；アセトニトリル／水=70/30, 検出；UV
(220 nm), 流速；1 ml/分 6)¹Ｈ−ＮＭＲ (CDCl₃) ppm： (アグリコン）：1.175 (3=H, s), 1.21〜1.59 (3H, s),
1.599 (3H, s), 1.638 (3H, s), 1.682 (3H, s), 1.74
0〜2.100 (8H, m), 5.069 (1H, m), 5.373 (1H, m), (糖); 3.12〜3.28 (2H, m), 3.395 (1H, m), 3.525 (1
H, m), 3.75〜3.95 (6H, m), 4.868 (1H, s)

【００２３】上記化合物中、ＡＣＡＴ阻害活性の最も強
いＲＦ−４６６７Ａを得るためには粗抽出物の段階でア
セチル化を行い、部分アセテ−トをＲＦ−４６６７Ａに
変換させることにより、簡便、且つ容易に単離精製する
ことができる。

【００２４】また、所望により、上記培養工程で得られ
た式IIIに示される化合物のアルキル化を行ない、該化
合物より数倍強いＡＣＡＴ阻害活性をもつ誘導体を得る
ことができる。アルキル化はつぎの方法で行なうことが
できる。すなわち、式IIIで示される化合物のうちＲ₁〜
Ｒ₄の全てが水素である化合物、あるいはいずれかが低
級アルカノイル基である化合物の場合は加水分解（脱ア
ルカノイル）を行なって全て水素とした化合物をＮ,Ｎ-
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの適当な溶媒に溶
かし、酸化銀などの触媒の存在下でヨウ化メチルなどの
ヨウ化アルキルと反応させることにより該誘導体を得る
ことができる。また、上記加水分解産物を前記エステル
化の方法に従ってアルカノイル化を行なえば、所望の低
級アルカノイル化合物を得ることもできる。以下に上記
アルキル化によって得られた化合物ＲＦ−４６６７Ｊ−
ＯＭｅの物理化学的性状を示す。

【００２５】ＲＦ−４６６７Ｊ−ＯＭｅ 1)構造：式Ｉ中、R₁〜R₄は全てメチル基 1)性状：無色のオイル (中性) 2)溶解性：溶解；メタノ−ル, アセトン, クロロホル
ム, Ｎ−ヘキサン 不溶；水 3)分子式：C₂₅H₄₄0₆ (分子量；440.62) 4)質量分析 (LSI-MS)：m/z 463 (M+Na)⁺, m/z 479 (M+
K)⁺, m/z 205 (C₁₅H₂₅ ⁺, アグリコン), m/z 219 (C₁₀H
₁₉O₅ ⁺, テトラ-O-メチル-6-糖 オキソニウムイオン) 5)[α]_D ²⁶°；−75.5°±1.1° (c 1.05, CHCl₃) 6)ＴＬＣ；Rf＝0.49 [ジクロロメタン／メタノ−ル (10
0:3)]. Rf＝0.65 [ジクロロメタン／アセトン (80:20)]

【００２６】7)¹Ｈ−ＮＭＲ (CDCl₃) ppm：1.192 (3H,
s), 1.2〜1.6 (4H, m), 1.604 (3H,s), 1.641 (3H, s),
1.692 (3H, s), 1.7〜2.1 (7H, m), 3.122〜3.233 (3
H, m), 3.52〜3.60 (3H, m), 3.370 (3H, s), 3.487 (3
H, s), 3.505 (3H, s), 3.655 (3H, s), 4.502 (1H, s-
br), 5.051 (1H, m), 5.388 (1H, m) 8)¹³Ｃ−ＮＭＲ (CDCl₃)：17.63, 21.34, 22.29, 23.4
2, 23.88, 25.74, 26.75, 30.98, 35.88, 41.49, 57.4
4, 59.11, 60.72, 61.94, 71.12, 75.29, 76.71,78.73,
81.62, 81.39, 95.62, 120.92, 124.60, 131.32, 134.
14,

【００２７】本発明はさらに、本発明化合物を有効成分
として含有するＡＣＡＴ阻害剤を提供する。本発明のＡ
ＣＡＴ阻害剤は、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散
剤、シロップ剤などによる非経口投与、注射剤による静
脈注射、筋肉注射、皮下注射のような投与方法、あるい
は軟膏剤などによる経皮投与の方法で投与することがで
きる。

【００２８】錠剤の場合は活性成分の外に補助成分と一
緒に圧縮または成型して作られる。この補助成分として
は薬学的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例：トウ
モロコシでん粉）、充填剤（例：ラクト−ス、微結晶性
セルロ−ス）、崩壊剤（例：でん粉グリコ−ル酸ナトリ
ウム）または滑沢剤（例：ステアリン酸マグネシウム）
を用いることができる。また、錠剤をコ−ティングして
もよい。シロップ剤、液剤、懸濁剤などの液体製剤の場
合、例えば懸濁化剤（例：メチルセルロ−ス）、乳化剤
（例：レチシン）、保存剤などを用いて慣用の方法によ
り調製することができる。注射用に調製する場合、溶
液、懸濁液、油性または水性乳濁液の形態でもよく、懸
濁液安定剤または分散剤などを含有してもよい。

【００２９】有効成分の投与量は、投与形態、患者の症
状、年齢、体重、性別により異なるが、体重１ｋｇあた
り、１日１０〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜１００
ｍｇを投与する。ただし、これら投与量はこれらの範囲
に限定されるものではない。

【００３０】以下に実施例により本発明を詳細に説明す
る。

【００３１】

【実施例】

１．培養（発酵） グルコース２.０％、ポリペプトン（日本製薬製）１.０
％、肉エキス０.３％、酵母エキス０.２％および食塩
０.１％よりなる培地８００ｍｌを入れた２Ｌ容三角フ
ラスコに、２８℃で１０日間培養した Stachybotrys el
egans RF-4667の斜面培養物を接種する。接種したフラ
スコは、振幅７０ｍｍ、回転数１８０ｒｐｍのシェーカ
ー上で、２８℃で３日間振盪培養する。この培養液８０
０ｍｌを、上記と同一組成を有する培地２０Ｌを入れた
３０Ｌ容ジャーファメンターに接種する。接種した培地
を１５０ｒｐｍで撹拌下、２８℃で２３時間培養する。
次いでこの培養液８Ｌを,サッカロース２.０％を含む２
０％馬鈴薯浸出液２００Ｌを入れた５００Ｌ容タンクに
接種し、撹拌回転数３５０ｒｐｍ、通気量毎分２００Ｌ
で２８℃で６日間培養する。

【００３２】２．分離精製 (1) ＲＦ−４６６７Ａの分離工程 上記工程で得られた発酵液１８１Ｌを、遠心分離機によ
り菌体層と水層に分離する。得られた湿菌体１３ｋｇを
アセトン７８Ｌで抽出し、抽出液を減圧留去して水層１
２Ｌとする。この水層を酢酸エチル１８Ｌで抽出する。
抽出液を水１０Ｌで洗浄後、減圧留去し残渣９７ｇを得
る。この残渣をピリジン２１３ｍｌと無水酢酸２１３ｍ
ｌに溶解し、室温で４時間アセチル化を行う。氷水２Ｌ
に添加して反応を終了させた後、塩化メチレン２Ｌで２
回抽出する。溶媒を減圧留去して油状粗物質１１８ｇを
得た。次にこの物質をシリカゲル４ｋｇを使用するカラ
ムクロマトを行い、トルエン：酢酸エチル（９：１）で
溶出されるフラクションを集め減圧留去し３９ｇのＲＦ
−４６６７Ａを得た。

【００３３】上記工程を少量で行なう場合には、培養液
（８Ｌ）にセライトを加え、ｐＨ７で濾過する。菌体部
はアセトン（４Ｌ）抽出後、減圧濃縮し、これを濾液と
合わせｐＨ７で酢酸エチル（８Ｌ）抽出する。酢酸エチ
ル層は水洗後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮
して油状残渣５.７ｇを得る。次に前記残渣５.５ｇを真
空ポンプで完全に溶媒を留去した後、ピリジン１２.５
ｍｌおよび無水酢酸１２.５ｍｌを加え、室温で４時間
撹拌し、アセチル化を行う。反応液を氷水５００ｍｌに
注入し、酢酸エチル抽出（５００ｍｌ×２回）、無水硫
酸ナトリウムで脱水乾燥後、濃縮し、油状残渣（８.５
ｇ、ＲＦ−４６６７Ａを主含有)を得る。これを塩化メ
チレンに溶解し、カラムクロマトを行う（カラム：Loba
r, SiO₂ 60, 380g, Type C: Merck）い、塩化メチレン
（１７００ｍｌ）〜塩化メチレン／メタノ−ル（１０
０：１）（１７００ｍｌ）で溶出する。ＴＬＣ（塩化メ
チレン／メタノ−ル＝２００：３）をモニタ−として単
一分画の溶媒溜去し、残渣１７６０ｍｇを得る。更に精
製するために同じくカラムクロマト（カラム：Lobar Si
O₂ 60, 70g, Type B，溶媒：塩化メチレン(５００ｍ
ｌ)）で溶出し、これを減圧留去してＲＦ−４６６７Ａ
のオイル（１５６０ｍｇ）を得る。

【００３４】(2)ＲＦ−４６６７Ａ〜Ｊの各成分の分離
精製 培養液（１.７Ｌ）にセライトを加えｐＨ７に調整して
濾過し、濾液と菌体に分離する。菌体部分は７０％含水
アセトンで抽出後、減圧濃縮する。これを濾液と混ぜｐ
Ｈ７で酢酸エチル抽出（１Ｌ×２回）する。酢酸エチル
層を無水硫酸ナトリウムで脱水乾燥後、減圧濃縮し、油
状残渣８８０ｍｇを得る。次にこの残渣をカラムクロマ
トにかける（カラム：Lobar SiO₂ 60, 70g, TypeB）。
溶出溶媒は塩化メチレン（８００ｍｌ）、１％メタノ−
ル／塩化メチレン（４００ｍｌ）、２％メタノ−ル／塩
化メチレン（４００ｍｌ）、３％メタノ−ル／塩化メチ
レン（４００ｍｌ）、５％メタノ−ル／塩化メチレン
（８００ｍｌ）の順で溶出する。溶出液は、ＴＬＣをモ
ニタ−として９分画（計４３０ｍｇ）に分け、各分画を
ＨＰＬＣ（カラム：YMC-ODS-5, 20×10mm, 検出：UV(25
4nm),流速：6ml/分, 溶媒：アセトニトリル：水＝７
５：２５〜アセトニトリル：水＝９０：１０）で分離精
製を行う。分離液は濃縮し、酢酸エチル抽出、無水硫酸
ナトリウムで脱水後、溶媒を留去し、成分ＡからＪまで
の１１化合物を、油〜アメ状物質として得た。収量は以
下の通り。 Ａ＝６５ｍｇ、Ｂ₁＝１１.５ｍｇ、Ｂ₂＝７.５ｍｇ、Ｃ
＝３.４ｍｇ、Ｄ＝１０.７ｍｇ、Ｅ＝２.８ｍｇ、Ｆ＝
５３ｍｇ、Ｇ＝５１ｍｇ、Ｈ＝１９ｍｇ、Ｉ＝３０ｍ
ｇ、Ｊ＝１２ｍｇ

【００３５】３． ＲＦ−４６６７Ａ〜Ｊの構造決定、
およびアグリコンと糖部の決定 (1)アグリコンの単離と構造決定：ＲＦ−４６６７Ａ ５
０ｍｇを無水ｐ−トルエンスルホン酸７.８ｍｇ、無水
メタノ−ル０.６ｍｌと４６℃で２.５時間後、０.５Ｎ
水酸化ナトリムで中和し、濃縮乾固して残渣に少量の水
を加えエ−テル抽出し、水洗、硫酸ナトリウム脱水後、
減圧留去し油状残渣を得る。これをＴＬＣ（メルク KG
F, 溶媒：ｎ−ヘキサン／アセトン (80:20) Rf=0.30）
で分離精製し、無色の油状物質５.５ｍｇを得た。得ら
れた油状物質を、(-)-エピ(8)-α-ビサボロ−ルおよび
(-)-α-ビサボ−ルと比較した。その結果を表１に示
す。

【００３６】

【表１】 1)参考値：D. Babin et al. Tetrahedron. Vol 37, Sup
plement No.1, p. 1〜7(1981) 2) (-)-α-ヒ゛サホ゛ロ-ル：市販品 Extrasynthese社製 (Fran
ce) 以上の結果よりアグリコンは(-)-エピ(8)-α-ビサボロ
−ルと決定した。

【００３７】(2) 糖の決定 ＲＦ−４６６７Ａ ３２０ｍｇを２５％ＴＦＡ ５ｍｌと
６０℃で１時間反応（アグリコンと糖の開裂）後、脂溶
性物質（アグリコン）は塩化メチレンで抽出して除き、
残りの水層部を濃縮し、アセトンで洗浄後濃縮乾固し
て、残渣５０ｍｇ（糖）得る。これに５％塩酸−メタノ
−ル３ｍｌを加え、３５℃で３.５時間撹拌する。この
濃縮乾燥残渣にピリジン２.５ｍｌと無水酢酸２.５ｍｌ
を加え、室温で６時間アセチル化する。反応液を冷却
下、水３０ｍｌに希釈し、減圧濃縮後、シロップ状残渣
をＴＬＣ（メルク KGF, 溶媒：ｎ−ヘキサン／アセトン
(70:30), Rf=0.22）で分離精製して、４５ｍｇの無色
油状物質を得た。この油状物質は、標品（α−メチル−
2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−D−マンノピラノシド
(α-methyl-2,3,4,6,-tetra-O-acetyl-D-mannopyranosi
de)）とのＮＭＲ、ＭＳ、[α]_Dの比較からＤ−マンノ−
スと決定した。

【００３８】この物質の物理化学的性質を以下に示す。 a)ＴＬＣ：メルク KGF, Rf=0.34；ｎ−ヘキサン／アセトン (6:4) Rf=0.48；トルエン／酢酸エチル／エタノ−ル(10:3:1)
標品と一致 b)[α]_D ²⁴°：＋41.9°±0.4 (c 2.1, CHCl₃). 標品；[α]_D ²⁴°：＋42.5°±0.7 (c 1.2, CHCl₃). c)ＭＳ (LSI-MS)：m/z 363(M+H)⁺, d)¹Ｈ−ＮＭＲ：標品に一致した。

【００３９】(3)ＲＦ−４６６７Ａ〜Ｊの構造決定： (a)ＲＦ−４６６７Ａのアルカリ加水分解 ＲＦ−４６６７Ａ９ｍｇをメタノ−ル０.３ｍｌ、０.５
Ｎ水酸化ナトリウム０.３ｍｌに溶解し室温で１０分間
放置後、中和濃縮する。濃縮残渣を酢酸エチルで抽出
後、ＴＬＣ（メルク, KGF）で分離し、５.６ｍｇの脱ア
セチル体を得た（収率：９０％）。ＴＬＣ、ＨＰＬＣ及
び¹Ｈ−ＮＭＲ比較からＲＦ−４６６７Ｊと一致した。

【００４０】(b)ＲＦ−４６６７Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、
Ｊのアセチル化 ＲＦ−４６６７Ｊ（５ｍｇ）を過剰の無水酢酸／ピリジ
ン（１：１）２ｍｌに溶解し、室温で１０時間反応後、
水を加え濃縮する。濃縮残渣をＴＬＣで分離し４.６ｎ
ｇ（収率：７０％）のＲＦ−４６６７Ａ（tetraacetat
e）を得た（ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、¹Ｈ−ＮＭＲでＲＦ−４
６６７Ａと一致）。同様にＤ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉの混合物
についてもＲＦ−４６６７Ａを生成した。

【００４１】(c)ＲＦ−４６６７Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、
Ｉ、Ｊは、¹Ｈ−ＮＭＲ、ＥＩ−ＭＳの測定結果及びア
セチル化実験により、糖部分のアセテ−トの相違物質と
判明した。表２に、ＲＦ−４６６７Ａ〜ＪのＴＬＣ、Ｈ
ＰＬＣ、ＭＳ、¹Ｈ−ＮＭＲの測定結果、および糖部分
のアセテ−トの状態を示す。

【００４２】

【表２】 a) TLC: メルク KGF, 溶媒；塩化メチレン／メタノ−ル
＝10/1 b) HPLC: カラム；YMC-ODS-5 (4.6 × 150 mm), 溶媒；
アセトニトリル／水＝70/30, 検出；ＵＶ (220 nm), 流
速；1 ml/分 (主要成分はＡ及びＦ)

【００４３】５．(-)-α-エピ(8)-ビサボロ−ル-2,3,4,
6-テトラ-O-メチル-β-D-マンノピラノシド（(-)-α-Ep
i(8)-bisabolol-2,3,4,6-tetra-O-methyl-β-D-mannopy
ranoside）(テトラ−O−メチル 誘導体，ＲＦ−４６６
７Ａ−ＯＭｅ)の合成 ＲＦ−４６６７Ａ １８ｇをメタノ−ル１５０ｍｌに溶
解し、０.５Ｎ水酸化ナトリウム４０ｍｌを加え、室温
で３０分撹拌後、３Ｎ塩酸で中和し、濾過、減圧濃縮を
行う。濃縮残渣を酢酸エチル３００ｍｌで抽出し、水洗
後、無水硫酸ナトリウムで脱水乾燥した後減圧留去し、
油状のAcetyl-free体の残渣（ＲＦ−４６６７Ｊ）１４.
４ｇを得る。次に得られたＲＦ−４６６７Ｊ ４.９ｇを
ＤＭＦ２５ｍｌ、酸化銀２６ｇ、ヨウ化メチル２７ｇを
加え室温で３時間反応後、濾過し、濾液を濃縮して、反
応残渣５.５ｇを得る。これをカラムクロマト（Lobar,
LiChroprep SiO₂ 60, 380g. TypeB）に付し、塩化メチ
レン／メタノ−ル（２００：１）８６０ｍｌ、ジクロロ
ロメタン／メタノ−ル（１００：１）６００ｍｌの順に
溶出し、この溶出分を減圧の濃縮して、単一濃縮物ＲＦ
−４６６７Ｊ−ＯＭｅ ４.４ｇを得た。

【００４４】８．ＡＣＡＴ阻害活性の測定 (1)副腎のミクロソ−ムを用いる方法 ０.８ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、２ｍＭ ＤＴＴ、および１０
０μｇのコレステロ−ルを含む０.１Ｍリン酸緩衝液
（０.５ｍｌ）中、副腎のミクロソ−ム存在下で９０,０
００ｄｐｍ／５ｎｍｏｌｅの放射活性をもつオレオイル
−コエンザイムＡ（Oleoyl-Coenzyme A）と本発明化合
物を３７℃で２０分間反応させた。なお副腎のミクロソ
−ムは、Paulらの方法（Paul M. Kinnunen, Angela DeM
ichele, and Louis G. Lang., Biochemistry 1988, 27,
7344〜7350)に準じて調製し、２０分間に０.５ｎｍｏ
ｌｅのコレステロ−ルオレエ−トを生じる蛋白量を用い
た。Bleigh ＆ Dyerの方法（Bleigh, E. G., ＆ Dyer,
W. J., Can. J. Biochem. Physiol, 37 911〜917, 195
9)により反応を停止させた後、6μgのコレステロ−ルオ
レエ−トを添加し、溶媒を留去した。残渣の薄層クロマ
トグラフィ−を行い、生成したコレステロ−ルオレエ−
トの放射活性により酵素活性を測定した。

【００４５】(2)肝臓のミクロソ−ムを用いる方法 副腎のミクロソ−ムを用いる方法と同様の方法で行っ
た。但し，肝臓のミクロソ−ムは，ミクロソ−ム中に十
分な内在性のコレステロ−ルが含まれるのでコレステロ
−ルの添加は行わなかった。

【００４６】測定結果を表３に示す。

【表３】 *：N’-(2,4-ジメチルフェニル)-N-ベンジル-N-ブチル
尿素［N’-(2,4-dimethylphenyl)-N-benzyl-N-butylure
a］（Vern G. DeVries et al., J. Med. Chem., 1989,
32, 2318〜2325）

【００４７】表１に示す如く、標品が肝臓の酵素を強く
阻害するのに対し、本発明化合物は副腎由来の酵素に対
して強い阻害活性を示した。

【００４８】

【発明の効果】本発明化合物は吹く副腎由来のＡＣＡＴ
の活性を特異的に阻害することから、動脈硬化およびそ
れに起因する動脈硬化性病気の治療剤として有用であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｐ 19/44 Ｃ１２Ｐ 19/44 //(Ｃ１２Ｎ 1/14 (Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 19/44 (Ｃ１２Ｐ 19/44 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 板崎 弘 兵庫県宝塚市清荒神３−９−４ (56)参考文献 Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏ ｌ．29，Ｎｏ．２，ｐｐ．645−648, （1990) Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏ ｌ．21，Ｎｏ．８，ｐｐ．2115−2117, （1982) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 265，Ｎｏ．14，ｐｐ．8042−8051, （1990) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 19/00 - 19/64 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式Ｉ： 【化１】 （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄はそれぞれ独立して水
   素、低級アルキル基、または低級アルカノイル基を表わ
   す。）で示される化合物。
2. 【請求項２】 式II： 【化２】 （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は前記と同義。）で示
   される請求項１記載の化合物。
3. 【請求項３】 スタキボトリス エレガンス（Stachybo
   trys elegans）種に属し、式III： 【化３】 （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄はそれぞれ独立して水
   素または低級アルカノイル基を表わす。）で示される化
   合物を産生する微生物。
4. 【請求項４】 スタキボトリス エレガンス ＲＦ−４
   ６６７（Stachybotrys elegans RF-4667）（FERM BP-38
   23）である請求項３に記載の微生物。
5. 【請求項５】 スタキボトリス（Stachybotrys）属に属
   し、式IIIで示される化合物を産生する微生物を培養
   し、該培養培地から該化合物を採取し、所望により加水
   分解、アルカノイル化、またはアルキル化することを特
   徴とする、請求項１に記載の化合物の製造法。
6. 【請求項６】 請求項１または２に記載の化合物を有効
   成分として含有するＡＣＡＴ阻害剤。