KR0131956B1 - 타이로시네이즈 활성 및 멜라닌 생성 저해제 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 구조식(I)로 표시되는 MR-304A 화합물, 그를 생산할 수 있는 미생물, 그의 제조 방법 및 MR-304A 또는 그의 유도체를 유효성분으로 포함하는 타이로시네이즈 활성 및 멜라닌 생성 저해제에 관한 것이다.

Description

타이로시네이즈 활성 및 멜라닌 생성 저해제 및 그의 제조 방법

제1도는 MR-304A 화합물의 수소 핵자기공명(¹H-NMR) 스펙트럼이고,

제2도는 MR-304A 화합물의 탄소 핵자기공명(¹³C-NMR) 스펙트럼이고,

제3도는 MR-304A 화합물의 적외선 흡수 스펙트럼이다.

본 발명은 신규 타이로시네이즈 활성 및 멜라닌 생성 저해제, 그를 생산하는 미생물 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 멜라닌 생성에 관여하는 효소인 타이로시네이즈의 활성을 저해하여 멜라닌 생성을 억제할 수 있는 신규 화합물 MR-304A를 함유하는 타이로시네이즈 활성 및 멜라닌 생성 저해제, MR-304A를 생산할 수 있는 트리코데르마속(Trichoderma) 미생물 및 상기 미생물을 배양하여 MR-304A를 생산하는 방법에 관한 것이다.

멜라닌은 색소 세포 내에 존재하는 타이로시네이즈(tyrosinase)의 작용에 의해 타이로신으로부터 도파(dopa), 도파퀴논(dopaquinone)으로 변환되어 도파크롬(dopachrome) 등을 거쳐 생성된다. 이 멜라닌은 피부에 존재하여 자외선 등으로부터 신체를 보호하는 중요한 기능이 있다. 그러나 멜라닌의 과잉생산은 기미, 주근깨 등을 형성하고, 피부노화를 촉진하며, 피부암 유발에 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있으므로, 최근에 멜라닌 과잉생성 예방을 목적으로 하는 개발이 활발히 진행되고 있다.

미백효과제로서 이미 파라메톡시페놀(p-metoxyphenol), 하이드로퀴논(hydroquinone), 코지산(kojic acid) 또는 아부틴(arbutin) 등이 사용되고 있으나, 이들은 활성이 약하거나 색소세포의 변성 또는 치사를 일으키고 세포 본래의 기능을 손상시키는 등의 부작용을 나타내기도 한다. 한편, 멜라닌 생성 억제를 목적으로 비타민 C 및 그 유도체 등이 사용되고 있으나, 이들 또한 타이로시네이즈 저해 활성이 낮다는 단점을 가지고 있다. 따라서, 소량으로도 타이로시네이즈 저해 활성을 나타내며, 멜라닌 생합성을 저해할 수 있는 저해제의 개발이 요구되고 있다.

본 발명자들은 기존의 멜라닌 생성 저해제들의 문제점을 해결하고, 활성이 높은 신규 타이로시네이즈 활성 및 멜라닌 생성 저해제를 개발하기 위해 연구를 계속한 결과, 곰팡이 균인 트리코데르마속(Trichoderma)에 속하는 MR-304 균주의 배양액으로부터 신규 저해물질을 분리하고 이를 포함하는 타이로시네이즈 활성 및 멜라닌 생성 저해제를 개발하였다.

본 발명의 목적은 타이로시네이즈 활성 저해 및 멜라닌 생성저해 활성을 나타내는 신규 화합물 MR_304A 및 이를 함유하는 신규 타이로시네이즈 활성 및 멜라닌 생성 저해제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 저해 화합물을 생산할 수 있는 미생물, 및 이를 배양하고 배양액으로부터 타이로시네이즈 활성저해 및 멜라닌 생성 저해 활성을 나타내는 화합물을 분리함을 포함하는, 타이로시네이즈 활성 및 멜라닌 생성 저해 화합물을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 하기 구조식(I)의 신규 화합물 MR-304A를 함유하는 타이로시네이즈 활성 및 멜라닌 생성 저해제에 관한 것이다.

상기 화합물 MR-304A는 트리코데르마 종(Trichoderma sp.) MR-304 균주를 배양한 후 그 배양액으로부터 분리할 수 있으며 트리코데르마 종 MR-304 균주의 균학적 성상은 하기 표 1과 같다.

본 발명의 MR-304A 화합물을 생산하는 트리코데르마 종 MR-304A 균주는 한국과학기술연구원 유전공학 연구소 유전자원센타(KCTC)에 1994년 10월 1일자로 기탁번호 제 KCTC 0123BP호로서 기탁하였다. MR-304A 균주는 다른 곰팡이와 마찬가지로 그 성상이 변하기 쉬우므로 MR-304 균주의 돌연변이주(자연 발생 또는 유발생), 형질융합체 또는 유전자 재조합체라도 MR-304A의 생산성이 있는 트리코데르마 속의 균은 모두 본 발명의 범위에 포함된다.

트리코데르마 종 MR-304A 균주를 이용하여 MR-304A를 생산하고자 할 때, 상기 균주는 통상 미생물이 이용하는 영양원을 함유하는 배지에서 배양한다. 영양원은 탄소원으로서는 슈크로스, 락토스 등을 사용하고 질소원으로서는 펩톤, 콘스팁리쿼(corn steep liquor), 질산칼륨 등을 사용한다. 기타 필요에 따라서 황산 마그네슘 및 기타 무기염류를 첨가할 수도 있다.

배양방법으로는 호기적인 조건에서의 배양법, 특히 액침배양법이 적당하며, 배양은 26-30℃, 바람직하게는 26℃에서 행한다.

배양이 완료된 후, 배양액을 여과하여 균체를 제거하고, 여액을 흡착 크로마토그래피, 부탄올 추출, 겔 여과 크로마토그래피 및 2회의 고압 액체 크로마토그래피 등의 과정을 통해 정제할 수 있다.

이상과 같이 정제된 MR-304A 화합물의 이화학적 특성은 다음과 같다.

MR-304A의 배양공정 중이나 정제과정 중의 확인은 스트렙토마이세스 비키니엔시스(Streptomyces bikiniensis) NRRL B-1049의 멜라닌 생성 저해 및 타이로시네이즈 저해 활성에 기준을 두어 다음과 같이 행한다. 먼저 스트렙토마이세스 비키니엔시스 NRRL B-1049를 VDYA-한천배지(V-8 주스 200ml, 포도당 2g, 효모 추출물 2g, 탄산칼슘 1g, 한천 20g, 증류수 800ml, pH 7.2)에서 2주간 배양하여 포자를 생성시킨 후 멸균수로 포자 현탁액을 제조한다. 효모 추출액을 첨가한 ISP 7번 배지(글리세롤 15g, 타이로신 0.5g, 아스파라진 1g, 인산 칼륨 0.5g, 염화나트륨 0.5g, 황산철 0.01g, 증류수 1ℓ, 미량염액 1㎖, 한천 20g)에 포자 현탁액을 도포한 후 배지 표면에 검체를 적신 종이판을 올려놓고 28℃에서 48시간 배양 후 생성된 환의 크기를 비교하여 멜라닌 생성 저해도를 판별할 수 있다.

또한 타이로시네이즈 저해 활성을 확인하기 위해서는 검체를 마이크로플레이트(microplate)에 넣고, 0.1M 인산염 완충액 (pH 6.5)과 1.5mM L-타이로신 용액을 넣은후, 타이로시네이즈 용액을 첨가하여 마이크로플레이트리더(microplate reader)로 490nm에서 흡광도을 측정하고, 이 플레이트를 37℃에서 10분간 반응시킨 후 다시 490nm에서 흡광도를 측정하여 타이로시네이즈에 대한 저해율(%)을 계산하고, IC₅₀값은 효소 활성 저해율이 50%에 달하는 저해제의 농도로 결정한다.

한편, 공지된 화학적 합성방법에 의해 MR-304A와 동일하거나 유사한 타이로시네이즈 활성 저해 및 멜라닌 생성저해 활성을 갖는 유도체를 제조할 수 있고, 그 제조방법 또는 구조의 변화가 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것이고 상기 저해제로서의 효과가 유사할 경우 이들 역시 본 발명의 범위에 포함되며, 이러한 유도체의 생산은 트리코데르마 종 MR-304균주 또는 그의 돌연변이주, 형질융합체 또는 유전자 재조합체 등의 배양을 통해서도 얻어질 수 있을 것이다.

본 발명의 타이로시네이즈 활성 및 멜라닌 생성저해제는 의약품, 의약부외품, 화장품 등에 사용가능하며, 유효량의 MR-304A 또는 그의 유도체 및 약제학적으로 유용한 담체를 포함하도록 제조되거나, 화장품 등의 경우 적정량을 혼합하여 제조할 수 있고 그 적용량은 사용하는 계에 따라 다양할 수 있다. MR-304A는 낮은 농도에서도 타이로시네이즈 활성 저해 및 멜라닌 생성저해 활성이 기존의 저해제들보다 양호하였다.

또한, 본 발명의 저해제와 동일하거나 유사한 구조를 갖는 이소니트릴 항생제(Fujiwara et al., Agric. Biol. Chem. 46(7), 1803-1809(1982))들의 급성 독성 시험결과, 쥐에게 복강내 주사시 LD50이 약 20-300mg/kg인 사실로부터 본 발명의 타이로시네이즈 활성 및 멜라닌 생성저해제도 유사한 급성 독성 결과를 나타낼 것으로 예상된다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하나 본 발명이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 발효생산

종배지 및 생산배지로서 슈크로스 2%, 락토스 1%, 펩톤 0.3%, 염화나트륨 0.5%, 콘스팁리쿼(corn steep liquor) 0.3%, 질산칼륨 0.23%, 황산마그네슘 0.05%, 무기염류액 0.1%를 함유한 배지를 사용하였다. 종 배양으로서, 500ml의 삼각 프라스크 2개에 각각 100ml씩 분주한 종배지를 121℃에서 20분간 살균하고, 여기에 트리코데르마 종 MR-304 균주(KCTC 0123BP)의 사면 배양 1-2 백금이를 접종한 후 25℃에서 2일간 진탕배양하였다. 121℃에서 1시간동안 살균한 3ℓ의 생산배지를 함유한 5ℓ배양기(fermentor)에 상기 종배양액 150ml를 접종하여 25℃에서 6일간 300rpm의 교반소도로 통기 배양하였다.

실시예 2 : MR-304A의 분리 및 정제

상기 실시예 1의 배양액을 여과지로 여과하여 균체를 제거하고 배양여액을 얻었다. 배양여액 3ℓ를 다이아이온(Diaion) HP-20 컬럼(Nippon Rensui Co., 일본)에 통과시킨 후 컬럼을 물로 세척하고 30% 메탄올로 용출시켜 결합된 물질을 탈착시킨 후 용출물을 500ml 부피로 감압농축시켰다. 이 수용액을 동량의 부탄올로 3회 반복 추출한 후 부탄올층을 재농축하였다.

이 농축물을 4ml의 30% 메탄올에 녹인 후 세파덱스 (Sephadex) LH-20 컬럼(Pharmacia, 스웨덴)으로 겔 여과 크로마토그라피(용출액: 30% 메탄올)을 행하여 활성 분획을 수집하였다. 수집된 분획을 고압 액체 크로마토그라피(컬럼:PLRS-S(Phenomenex, 100Å, 8㎛, 300×7.5mm I.D.), 유속: 1.5ml/분, 220nm 검출, 용출액;10% 아세토니트릴)하여 MR-304A를 포함하는 분획을 모으고, 이를 다시 2차 고압액체 크로마토그라피(컬럼:ODS-AM(제조사 YMC, 120Å, 10㎛, 250×4.6mm I.D.), 유속: 0.7ml/분, 220nm 검출, 용출액;10% 아세토니트릴)하여 체류시간 10분 근처에서 MR-304A를 순수 분리하였다.

용매를 감압건조기로 제거한 후 잔류물을 냉동건조하여 갈색의 분말로서 MR-304A 1.5mg을 얻었다.

실시예 4. MR-304A의 구조 결정

본 발명의 화합물들의 구조분석을 위하여 NMR 분석기(Varian UNITY 300)를 이용하고, CD3OD를 용매로서 사용하여 NMR스펙트럼을 측정하였다. 분자량 결정은 ESIMS(electrospray ionization mass spectroscopy, VG Quattro 400 mass spectrometer)로 측정하였으며, UV 스펙트럼(Shimazu UV-260)은 메탄올을 용매로 사용하여 측정하였고, IR 특성은 FT-IR(Laser Precision Analytical, IFX-65s)을 사용하여 측정하였다.

그 결과, 트리코데르마종 MR-304 균주가 생산한 활성물질 MR-304A의 이화학적 특성은 상기 표 1과 같았다.

MR-304A는 갈색 분말로서 UVλ(MeOH) max 209nm에서 최대 흡수 피크를 보였으며, ESIMS 분석 결과 이소시아나이드의 전하로 인하여 208m/z에서 (M+Na)⁺피크가 관찰되어 분자량은 185로 확인되었다. IR 스펙트럼에서는 2120cm 부근에서 이소시아나이드 기의 특이적 피크를 보였고, NMR에 의한 구조분석 결과 분자식은 C₈H₁₁NO₄결정되었다. 또한, HMBC(heteronuclear multiple bond cohere nce) 및 NOE(nuclear overhauser effect)등에 의하여 구조를 확인한 결과 MR-304A의 구조가 식(I)과 같음을 알수 있었다.

실시예 5 : MR-304A의 타이로시네이즈 저해 활성 측정

검체 15㎕를 96공 마이크로플레이트(96 well microplate)의 각 공에 넣고, 0.1M 인산염 완충액(pH 6.5) 150㎕와 1.5mM L-타이로신 용액 25㎕를 넣은후, 효소용액(타이로시네이즈, 시그마제) 7㎕를 첨가하여 마이크로플레이트 리더(microplate reader, 바이오라드제)를 이용하여 490nm에서흡광도를 측정하였다. 이 플레이틀를 37℃에서 10분간 반응시킨후 다시 490nm에서 흡광도를 측정하여 다음 식에 의해 타이로시네이즈에 대한 저해율(%)을 계산하였으며, IC₅₀값은 효소 활성 저해율이 50%에 달하는 저해제의 농도로 결정하였다.

A : 저해제를 넣은 시료의 반응 전 흡광도

B : 저해제를 넣은 시료의 반응 후 흡광도

C : 저해제를 넣지 않은 시료의 반응 전 흡광도

D : 저해제를 넣지 않은 시료의 반응 후 흡광도

저해제로서 MR-304A 코지산 및 알부틴을 사용하여 IC₅₀값을 조사한 결과는 하기 표 3과 같았다.

실시예 6 : MR-304A의 멜라닌 생성 저해 활성 측정

먼저 스트렙토마이세스 비키니엔시스 NRRL B-1049를 VDYA-한천배지(V-8주스 200ml, 포도당 2g, 효모 추출물 2g, 탄산칼슘1g, 한천 20g, 증류수 800ml, pH 7.2)에서 2주간 배양시켜 포자를 생성시킨 후 멸균수로 포자 현탁액을 제조하였다. 0.2%의 효모 추출액을 첨가한 ISP 7번 배지(글리세롤 1.5g, 타이로신 0.5g, 아스파라진 1g, 인산칼륨 0.5g, 염화나트륨 0.5g, 황산철 0.01g, 증류수 1l, 미량염액 1ml, 한천 20g)에 포자 현탁액 0.2ml씩을 도포한 후 배지표면에 시료를 적신 종이원판(0.8cm)을 올려놓고 28℃에서 48시간동안 배양한 후 생성된 환의 크기를 비교하였다. 시료로서 MR-304A, 코지산 및 하이드로퀴논을 이용하여 멜라닌 생성 저해 활성을 조사한 결과는 하기 표 4와 같았다.

상기 실시예들에서 알 수 있는 바와 같이, MR-304A는 낮은 농도에서도 우수한 타이로시네이즈 저해 활성 및 멜라닌 생성 저해 활성을 나타낸다.

본 발명은 상기의 특정 실시예들에 의해 상세히 설명되었지만, 특허청구 범위에 정의된 본 발명의 진의 및 범위를 벗어나지 않는 많은 변형 및 치환이 가능하다는 것은 당분야의 숙련자들에게 자명하며, 그러한 변형 및 치환 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims (4)

1. 하기 구조식(I)의 신규 타이로시네이즈 저해 활성 및 멜라닌 생성 저해제 MR-304A 및 그의 유도체:
2. 제1항의 화합물 MR-304A를 생산하는 트리코데르마 종(Trichoderma sp.) MR-304 균주(KCTC 0123BP).
3. 트리코데르마 종(Trichoderma sp.) MR-304 균주(KCTC 0123BP)를 배양하고, 배양물로부터 균체를 제거한 후 여액으로부터 MR-304A 화합물을 분리함을 포함하는, MR-304A화합물의 제조방법.
4. MR-304A 또는 그의 유도체를 유효성분으로 포함하는 타이로시네이즈 활성 및 멜라닌 생성 저해제.