KR100290532B1

KR100290532B1 - 신균주 곰팡이 mt51005(kctc 8787p)와 이 균주로부터생산된 포스포리파제 c 활성저해용 조성물

Info

Publication number: KR100290532B1
Application number: KR1019970040065A
Authority: KR
Inventors: 안종석; 오원근; 민태익; 이현선; 안순철; 김보연; 강대욱; 박찬선; 고학룡
Original assignee: 박호군; 한국과학기술연구원
Priority date: 1997-08-22
Filing date: 1997-08-22
Publication date: 2001-12-05
Also published as: KR19990017226A

Abstract

본 발명은 신균주 곰팡이 MT51005(KCTC 8787P)와 포스포리파제 C 활성저해용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 세포내 신호전달과정의 중요효소인 포스포리파제 C(Phospholipase C)의 활성을 저해하여 세포의 이상증식을 억제할 수 있는 물질을 생산하는 신규 곰팡이 균주 MT51005와, 곰팡이 MT51005의 배양액으로부터 분리 정제된 2,4-디하이드록시-3-에틸-6-(1'-메틸펜텐-1'-닐)-벤즈알데하이드, 2,4-디하이드록시-3-에틸-6-(1'-메틸펜텐)-벤즈알데하이드, 또는 이들 각각을 유효성분으로 함유한 포스포리파제 C 활성저해용 조성물에 관한 것이다.

Description

신균주 곰팡이 ＭＴ51005(ＫＣＴＣ 8787Ｐ)와 이 균주로부터 생산된 포스포리파제 Ｃ 활성저해용 조성물

본 발명은 신균주 곰팡이 MT51005(KCTC 8787P)와 포스포리파제 C 활성저해용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 세포내 신호전달과정의 중요효소인 포스포리파제 C(Phospholipase C)의 활성을 저해하여 세포의 이상증식을 억제할 수 있는 물질을 생산하는 신규 곰팡이 MT51005와, 곰팡이 MT51005의 배양액으로부터 분리 정제된 다음 화학식 1로 표시되는 신규 화합물 2,4-디하이드록시-3-에틸-6-(1'-메틸펜텐-1'-닐)-벤즈알데하이드와 화학식 2로 표시되는 2,4-디하이드록시-3-에틸-6-(1'-메틸펜텐)-벤즈알데하이드(이하, "앙귈로스포랄(anguillosporal)"이라 함), 또는 이들 각각을 유효성분으로 함유한 포스포리파제 C 활성저해용 조성물에 관한 것이다.

포스포리파제 C(phospholipase C)는 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 표피성장인자(epidermal growth factor, EGF) 등의 세포성장인자(growth factor)나 바소프레신(vasopressin), 안기오텐신(angiotensin) 등의 자극인자가 세포막에 존재하는 각각의 수용체에 결합하므로써 활성화되고, 활성화된 포스포리파제 C는 긍극적으로 세포의 성장과 분화를 일으킨다. 가령, 이러한 포스포리파제 C의 한 종류인 포스포리파제 C_Y를 미세조작에 의하여 NIH3T3 세포주에 주입해주거나[Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3659 ∼ 3663(1989)], 또는 이의 유전자를 증폭 발현시켜주면[Science, 248, 607 ∼ 610(1990)] 그에 따른 세포 분열이 활성화된다. 또한, 폐암 및 유방암 조직의 세포에서도 포스포리파제 C 발현량이 증가되었다는 보고[Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 10435 ∼ 10439(1991)]도 제시되고 있다.

따라서, 포스포리파제 C의 저해물질이 새로운 항암제로의 가능성이 제시되어 최근에 포스포리파제 C 저해물질을 찾으려는 연구가 진행되고 있다.

이러한 포스포리파제 C 저해물질로는 이미 비나크산톤(vinaxanthone) [Tetrahed. Lett., 32, 4737 ∼ 4740(1991)], 칼로포로시드(caloporoside)[J. Antibiotics, 47, 1188∼1194(1994)], 히스피도스페르미딘(hispidospermidin)[J. Antibiotics, 47, 1 ∼ 15(1994)] 등이 보고되고 있으나, 이들은 단순히 세포로부터 분리한 포스포리파제 C의 활성저해만을 보고하고 있을 뿐이다.

따라서, 소량으로서 세포로부터 분리한 포스포리파제 C의 활성저해뿐만이 아니라 세포내에서도 이들에 대한 저해작용을 보이는 물질의 개발이 요구되고 있다.

본 발명자들은 세포내 포스포리파제 C에 대하여 강한 저해활성을 나타내는 물질을 개발하기 위하여 오랜동안 연구를 수행하였다. 그 결과, 토양으로부터 곰팡이 MT51005를 선별하고, 이 균주의 배양액으로부터 포스포리파제 C를 저해할 수 있는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물(CRM-51005)과 상기 화학식 2로 표시되는 앙귈로스포랄를 분리·추출하고 이들 화합물이 포스포리파제 C에 대한 저해활성이 있음을 알게됨으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 토양으로부터 분리한 신규한 곰팡이 MT51005와 이러한 신균주 배양액으로부터 분리·추출한 신규 화합물 CRM-51005 또는 기지물질인 앙귈로스포랄이 유효성분으로 함유된 포스포리파제 C 저해활성 조성물을 제공하는 데 그 목적이 있다.

도 1은 CRM-51005의¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 2는 CRM-51005의¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 3은 CRM-51005와 이성질체의 HMBC 공명 스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 4는 앙귈로스포랄의¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 5는 앙귈로스포랄의¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.

본 발명은 곰팡이 MT51005를 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 신규 화합물 2,4-디하이드록시-3-에틸-6-(1'-메틸펜텐-1'-닐)-벤즈알데하이드, 상기 화학식 2로 표시되는 앙귈로스포랄, 또는 이들 각각을 유효성분으로 함유한 포스포리파제 C 활성저해용 조성물을 그 특징으로 한다.

본 발명에 따른 신균주 곰팡이 MT51005의 분리 및 동정과정은 다음과 같다.

[신규 미생물의 분리]

멸균 생리식염수 10㎖에 풍건한 토양시료 1g을 넣고 30분동안 교반한 다음, 10^-2∼ 10^-4배로 희석하여 0.1㎖을 포테이토 덱스트로스(potato dextrose) 한천배지에 도말한 후 25℃에서 7 ∼ 10일간 배양하여 나타난 집락을 순수분리하였다.

[신규 미생물의 동정]

1) 형태 및 배양학적 특성

MT51005는 전형적인 곰팡이의 특성을 보이는 균주로서 배양학적 특성은 다음과 같다. 포테이토 덱스트로스 한천 배지에서 14일간 배양시 균총의 색깔은 검은색으로 뭉쳐서 성장하였다. 와이엠 배지에서 진탕배양시 직경 3 ∼ 5 mm의 작은구를 형성하면서 성장하였으며, 구의 표면은 실날 모양의 솜털을 형성하였다. 배양액의 색깔은 처음의 엷은 노란색에서 검은색으로 변하였다.

2) 생리학적 특성

곰팡이 MT51005의 성장은 12일째 최고치에 다다르며, 앙귈로스포랄의 생산은 6일 배양시, CRM-51005의 생산은 12일째 배양시 극대화되었다. 앙귈로스포랄과 CRM-51005의 생산 최적온도는 25℃이며, pH 7.0에서 배양이 시작되었을 때 6일 후 약산성인 pH 5.5 ∼ 6.0으로 변하였다가 12일째는 약염기성인 pH 8.0 ∼ 8.5로 변하였다. 두 화합물의 생산은 0.5 vvm, 200 rpm, 25℃의 배양조건에서 최적이었다.

3) 신균주 미생물 곰팡이 MT51005의 동정 및 명명

형태적·배양학적 및 생리적 특성을 분석한 결과, 본 발명에서 분리된 균주는 곰팡이에 속하는 미생물임을 메디칼 임포탄트 펀자이[Medically Important Fungi, 1995, ASM press, Washington D.C.]와 컴펜디움 오브 소일 펀자이[Compendium of Soil Fungi, 1980, Academic Press, London]로부터 확인할 수 있었다. 동정 결과가 정확하게 일치되는 균주는 없었지만, 곰팡이와 가장 비슷한 결과를 가지는 것으로 보아 곰팡이의 변종으로 판단된다.

따라서, 분리된 미생물을 곰팡이 MT51005로 명명하고, 1997년 3월 5일부로 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국과학기술연구원 생명공학연구소내 유전자은행에 기탁하여 수탁번호 KCTC 8787P를 부여받았다.

[신균주 미생물의 배양]

곰팡이 MT51005를 배양하기 위해, 통상적으로 미생물이 이용하는 영양원을 함유하는 배지를 준비한다. 즉, 영양원으로서 탄소원은 포도당, 과당 등을 사용하며, 질소원으로는 펩톤, 트립톤 등을 사용한다. 기타 필요에 따라서 황산 마그네슘 및 기타 무기염류를 첨가하는 것이 바람직하다. 그리고, 배양방법으로는 23 ∼ 28℃ 부근의 호기적인 조건하에서의 액침 배양법이 적당하다.

즉, 이를 구체적으로 살펴보면, 종배지 및 생산배지로서 이스트 엑기스(0.3%), 말트 엑기스(0.3%), 펩톤(0.5%), 포도당(1%)이 함유된 배지를 사용한다. 1ℓ의 삼각플라스크 3개에 각각 200 ㎖씩 분주한 종배지를 121℃에서 20분간 살균한 후, 사면배양한 MT51005 균주를 백금이로 접종하고, 25℃에서 3일간 진탕배양하여 배양기의 종배양으로 한다. 121℃에서 1시간 살균한 생산배지(10ℓ)를 함유한 15ℓ 배양기(fermentor)에 상기의 종 배양액 600 ㎖를 접종한 뒤, 25℃에서 300 rpm의 속도로 교반과 함께 통기하의 호기적 조건에서 10일간 배양한다.

[곰팡이 MT51005로부터 생산된 신규 화합물과 앙귈로스포랄의 분리 및 정제]

본 발명은 곰팡이 MT51005의 배양액으로부터 에틸아세테이트 용매로 추출하고, 수득된 추출액으로부터 감압건조기를 이용하여 감압증발방법으로 농축한 뒤, 흡착 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 고압 액체 크로마토그래피를 이용하여 정제하여 상기 화학식 1로 표시되는 2,4-디하이드록시-3-에틸-6-(1'-메틸펜텐-1'-닐)-벤즈알데하이드(이하, "CRM-51005"라 함)와 화학식 2로 표시되는 앙귈로스포랄(2,4-디하이드록시-3-에틸-6-(1'-메틸펜텐)-벤즈알데하이드)을 분리·정제하였다.

이들에 대한 구체적인 구조를 분석한 결과, 우선 CRM-51005는 신규 화합물으로서 엷은 노란색 분말로 메탄올, 에틸아세테이트, 아세톤 등의 유기용매에는 잘 녹았으나 물에는 녹지 않았다. 고해상도 질량 분석(HREI-MS)결과 분자량은 248로 나타났고, 그 분자식은 C₁₅H₂₀O₃임을 알 수 있었다. 또한, 양성자(¹H)와 탄소(¹³C) 핵자기 공명 스펙트럼 분석결과는 다음 표 1과 첨부한 도 1 및 도 2에 나타내었다. 그 결과 상기 화학식 1에 나타낸 바와 같은 신규 화합물 CRM-51005는 기지물질인 앙귈로스포랄의 1'와 2'위치에 불포화수소가 존재하는 구조임을 알 수 있었다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 광학이성질체도 포함하는 바, CRM-51005는 2'-치환기의 배향에 따라 E-형태 또는 Z-형태를 갖게 된다. 즉, 활성물질의 광학 이성질체는 HMBC 실험과 NOESY 결과로부터 E-형태인 것으로 결정되었으나, 클로로포름 용매하에서의 CRM-51005는 Z-형태를 생성하였으며, 그들의 비율은 HMBC 결과로부터 2 : 1로 섞여서 존재함을 알 수 있다(도 3).

그리고, 상기 화학식 2로 표시되는 앙귈로스포랄은 기지물질로서 해리건(Harrigan) 등에 의하여 분리[J. Nat. Prod., 58, 1467 ∼ 1469(1995)]된 바 있다.

기지 물질인 앙귈로스포랄은 노란색 분말로 메탄올, 에틸아세테이트, 아세톤 등의 유기용매에는 잘 녹았으나 물에는 녹지 않았다. 고해상도 질량 분석결과 분자량은 250으로 나타났고, 그 분자식은 C₁₅H₂₂O₃임을 알 수 있었다. 또한, 양성자(¹H)와 탄소(¹³C) 핵자기 공명 스펙트럼 분석결과는 다음 표 1과 첨부한 도 4 및 도 5에 나타내었다. 그 결과, 양성자 공명 스펙트럼의 경우 5.51 ppm과 12.8 ppm에서 하이드록시 피크를 확인할 수 있었으며, 탄소 핵자기 공명 스펙트럼의 경우는 5개의 4급탄소(C-1, C-2, C-3, C-4, C-6)와 192.6 ppm 위치에서 1개의 알데하이드 탄소(C-7)가 존재함을 알 수 있었다.

위와 같은 양성자와 탄소 핵자기 공명 스펙트럼 분석결과로부터 이 물질은 해리건(Harrigan) 등이 곰팡이 균인 앙귈라스포라 롱기시마(Anguillospora longissima)로부터 분리한 앙귈로스포랄이란 물질과 기기분석치가 일치하였고, 따라서 상기 화학식 2에 나타낸 '앙귈로스포랄'로 동정하였다.

CRM-51005와 앙귈로스포랄에 대한¹H-NMR 및¹³C-NMR 스펙트럼 분석

번 호	CRM-51005	앙귈로스포랄
번 호	¹H	¹³C	¹H	¹³C
1	-	112.7	-	112.4
2	-	163.1	-	164.0
3	-	115.4	-	114.5
4	-	159.9	-	160.8
5	6.19(s)	107.5	6.28(s)	105.4
6	-	150.9	-	152.1
7	9.83(s)	195.1	10.17(s)	192.6
2-OH	12.47(s)	-	12.89(s)	-
4-OH	5.30(s)	-	5.51(s)	-
1′	-	131.5	3.33(sextet, 6.9)	32.4
2′	5.39(t, 7.2)	134.0	1.60(m)	38.1
3′	2.18(q, 7.2)	30.6	1.27(m)	29.8
4′	1.54(m)	22.5	1.27(m)	22.7
5′	0.95(t, 6.9)	14.0	0.87(t, 6.9)	14.0
6′	1.98(s)	19.2	1.26(s)	22.2
1″	2.62(q, 7.5)	15.4	2.63(q, 7.5)	15.3
2″	1.15(q, 7.5)	13.9	1.15(t, 7.5)	13.0

[포스포리파제 C 활성저해용 조성물]

본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물 CRM-51005 또는 상기 화학식 2로 표시되는 앙귈로스포랄을 유효성분으로 함유하는 포스포리파제 C 활성저해용 조성물을 포함한다.

즉, 신균주 곰팡이 MT51005로부터 분리·정제된 상기 화학식 1로 표시되는 CRM-51005와 상기 화학식 2로 표시되는 기지 화합물인 앙귈로스포랄(2,4-디하이드록시-3-에틸-6-(1'-메틸펜텐)-벤즈알데하이드)이 포스포리파제 C에 대한 저해 활성을 갖는 것을 처음으로 알아내고, 이들 화합물을 유효성분으로 함유하는 포스포리파제 C의 활성저해용 조성물을 개발하였다.

본 발명에 따른 조성물은 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 유효성분이외에도 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 전문가라면 용이하게 알 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 정제, 산제, 과립, 캅셀제, 현탁액, 유화액 또는 비경구 투여용의 단위투여형 또는 수회 투여형 제제로 제형화하여 사용할 수 있다.

상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 유효성분의 유효투입량은 환자의 나이, 신체적조건, 몸무게 등에 의해 다양화질 수 있지만, 일반적으로 1 내지 100 ㎎/㎏(몸무게)/1일 범위내에서 투여된다. 그리고, 1일 유효투입량 범위내에서 하루에 한 번 또는 하루에 여러번 나누어 투입한다.

이하 본 발명을 실시예에 의거 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : CRM-51005와 앙귈로스포랄의 분리 및 정제

신균주 MT51005의 배양액을 5,000 rpm에서 원심분리하여 배양 상등액과 균체 침전물로 분리하였다. 우선, 배양 상등액을 디아이온(Diaion) HP-20에 흡착시킨 다음 30% 메탄올로 세척하였다. 아세톤을 사용하여 흡착물질을 용출시킨 뒤 균체 침전물의 아세톤 추출액과 합하여 농축하였다. 이어서 농축액을 소량의 물에 녹여 에틸아세테이트로 추출한 뒤 추출물을 농축한 후 실리카겔에 흡착시켜 클로로포름/메탄올(20/1)을 전개용매로하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피하였다.

포스포리파제 C 저해활성이 강한 분획을 모아 농축시킨 후, 70% 메탄올을 전개용매로 로바(Lobar) RP-18 칼럼 크로마토그래피하였다.

이때 활성물질과 물리적 성상이 비슷한 물질들을 제거하기 위하여 클로로포름/노말헥산/메탄올(2/3/1) 혼합용액을 사용하여 세파덱스(Sephadex) LH-20 칼럼 크로마토그래피를 동일한 방법으로 2회 실시하였다. 분리된 분획들중 활성분획을 모아 농축한 뒤 고압 액체 크로마토그래피(칼럼 : J'sphere ODS-H80, 용매 : 75% 메탄올, 유속 : 4 ㎖/분, 검출 : 254 ㎚)를 실시하여 체류시간 16분대에서 앙귈로스포랄을, 그리고 17분대에서 신규 화합물인 CRM-51005를 순수 분리하였고, 용매를 감압 건조기로 제거하여 엷은 노란색 분말들을 수득하였다.

실시예 2 : 포스포리파제 C 저해활성 측정

20μCi의 삼중수소로 표식된 [³H]-포스포이노시톨([³H]-Phosphatidyl Inositol, PI)(아머삼사)이 포함된 50μM 포스포이노시톨(시그마사), 1mM 이지티에이(EGTA), 3mM 염화칼슘(CaCl₂), 50mM 헤페스(HEPES)(pH 7.0) 및 0.1% 데옥시콜레이트나트륨(sodium deoxycholate)으로 구성된 반응액(185㎕)에 효소액(5㎕)와 검정시료(10㎕)를 첨가한 다음, 37℃에서 10분간 반응시킨 후 클로로포름/메탄올(2/1) 혼합용액 1㎖을 넣어 반응을 중지시켰다. 이 후 원심분리하여 상등액층의 방사능도(radioactivity)를 측정하였다. 효소 저해율은 하기 수학식 1과 같이 계산하였으며, IC₅₀값은 효소 활성의 저해율이 50%에 달하는 저해제의 농도로 결정하였다.

A : 저해제를 넣지 않은 것의 반응후 방사능도

B : 효소액을 넣지 않은 것의 반응후 방사능도

C : 저해제를 넣은 것의 반응후 방사능도

분리된 신규 화합물 CRM-51005와 앙귈로스포랄이 포스포리파제 C 효소의 활성을 50% 저해하는 농도(IC₅₀)를 측정한 결과 IC₅₀값은 두 화합물 모두 13 ㎍/㎖이었고, 이를 몰 농도로 계산하면 52μM 이었다.

이때, 포스포리파제 C는 소의 작은 뇌로부터 정제하여 사용하였다[과기처 연구보고서, 세포반응의 신호전달조절 선도물질의 탐색기술개발(1993)].

실시예 3 : 세포 내에서의 신호전달과정의 저해활성 측정

신규 화합물 CRM-51005와 앙귈로스포랄의 세포내에서 신호전달과정의 저해활성은 NIH3T3γ1 세포주를 사용하여 세포내 총 이노시톨 포스페이트(inositol phosphate total, IP_t)양을 측정함으로써 결정하였다.

즉, 이노시톨(inositol)을 제거한 DMEM 배지에 6×10⁵세포/㎖의 NIH3T3γ1 세포주를 접종하고, 24시간 동안 1μCi의 삼중수소로 표식된 마이오-[2-³H]-이노시톨(myo-[2-³H]-inositol)과 함께 배양하였다. 이렇게 배양한 세포주를 PBS로 세척한 뒤 15분 동안 배양을 계속하였다. 그런 다음, 여기에 검정시료(5㎕)를 첨가한 뒤 20분 동안 계속 배양하였고, 그 후 혈소판유래 성장인자(PDGF)로 30분 동안 자극하였다. 이렇게 자극된 세포주를 5% 과염소산을 사용하여 반응을 중지시킨 뒤, 세포내의 이노시톨 포스페이트(inositol phosphate)를 추출하였다. 추출된 이노시톨 포스페이트를 음이온 교환칼럼(바이오라드(Biorad) AG 1X-8)을 사용하여 흡착시킨 뒤, 증류수(10㎖)로 세척하고 5mM 사보릭나트륨(sodium tetraborate)과 60mM 포름산암모늄(ammonium formate)용액(10㎖)을 사용하여 다시 세척하였다. 마지막으로 1M 포름산암모늄과 0.1M 포름산(formic acid)를 사용하여 이노시톨 포스페이트를 용출시킨 뒤 방사능도를 측정하였다.

이때, 저해율은 상기 수학식 1의 저해율 계산방법에 따라 행하였다.

분리된 신규 화합물 CRM-51005와 앙귈로스포랄을 NIH3T3γ1 세포주를 사용하여 혈소판유래 성장인자(PDGF) 자극에 의한 이노시톨포스페이트(IP_t)생성을 보는 방법으로 세포내 신호 전달과정의 저해정도를 측정한 결과, 두 화합물 모두 0.8 ㎍/㎖의 농도에서 IC₅₀값을 보여주었으며, 이를 몰 농도로 계산하면 3.2μM 이었다.

실시예 4 : 정제의 제조

유효성분 10g

락토스 70g

결정성 셀룰로오스 15g

마그네슘 스테아레이트 5g

총 량 100g

상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합한 후, 직타법(direct tableting method)에 의해 정제를 제조하였다. 각 정제의 총량은 100㎎ 이었고, 그 중 유효성분의 함량은 10㎎ 이었다.

실시예 5 : 분말제의 제조

유효성분 10g

옥수수전분 50g

카르복시 셀룰로오스 15g

총 량 100g

상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합하여 분말을 제조하였다. 5번 경질캡슐에 분말 100㎎을 넣어 캡슐제를 제조하였다.

실시예 6 : 세포독성실험결과

세포독성실험은 미국 국립암연구소(NCI)에서 유래한 3종의 인체 암세포주를 사용하였다. 암세포주는 전립선암 세포주(PC-3), 폐암 세포주(NCI-H23), 흑색종암 세포주(CRL1579)로 10% 소 태아혈청(fetal calf serum)을 함유한 알피엠아이(RPMI) 1640배지(기프코사, Gibco)에서 배양하였다. 상기 세포주들의 배양은 모두 37℃, 5% CO₂배양기에서 수행하였다. 대수 증식기에 있는 세포 각각을 96웰(well) 마이크로플레이트(microplate)에 100㎕의 양으로 분주한 뒤 24시간동안 배양한 후, 단계별로 희석한 CRM-51005와 앙귈로스포랄을 각각 처리하고 48시간동안 더 배양하여 SRB(sulforhodamine B)법에 의해 세포독성을 측정하였다. 즉, 냉 50% 트리클로르아세테이트(TCA)용액 50㎕를 각각의 마이크로 플레이트에 가하고 4℃에서 1시간 동안 배양하여 살아있는 세포를 고정시킨후 수도물로 5회 씻어낸다음 건조시킨다. 그런다음, 0.4% SRB 용액으로 30분간 염색한다음 남아있는 염색액을 1% 아세트산용액으로 4회 씻어낸후 10mM 트리스 염기(pH 10.5)에 용해시켜 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포성장의 저해도는 시료 처리군의 흡광도에 대한 대조군 흡광도의 백분율로 표시하고 각 세포주의 CRM-51005와 앙귈로스포랄 각각에 대한 50% 저해농도(IC₅₀)를 프로비트(Probit)법에 의해 구하였다(표 2).

구 분	IC₅₀(㎍/㎖)
구 분	PC-3	NCI-H223	CRL1579
CRM-51005	1.7	2.2	3.3
앙귈로스포랄	1.6	2.0	3.1

이상에서 설명한 바와 같이 본 발명에 따른 신균주 곰팡이 MT51005 배양액으로부터 분리 정제된 신규 화합물 2,4-디하이드록시-3-에틸-6-(1'-메틸펜텐-1'-닐)-벤즈알데하이드(CRM-51005)와 기지물질인 2,4-디하이드록시-3-에틸-6-(1'-메틸펜틸)-벤즈알데하이드(앙귈로스포랄)은 포스포리파제 C의 활성을 저해하는 작용이 있어 항암제의 유효성분으로 유용하다.

Claims

포스포리파제 C 활성저해 물질을 생산하는 곰팡이 MT51005(KCTC 8787P).
다음 화학식 1로 표시되는 2,4-디하이드록시-3-에틸-6-(1'-메틸펜텐-1'-닐)-벤즈알데하이드(CRM-51005).

화학식 1
다음 화학식 1로 표시되는 2,4-디하이드록시-3-에틸-6-(1'-메틸펜텐-1'-닐)-벤즈알데하이드(CRM-51005)가 유효성분으로 함유된 것임을 특징으로 하는 포스포리파제 C 활성저해용 조성물.

화학식 1
다음 화학식 2로 표시되는 2,4-디하이드록시-3-에틸-6-(1'-메틸펜틸)-벤즈알데하이드(앙귈로스포랄)가 유효성분으로 함유된 것임을 특징으로 하는 포스포리파제 C 활성저해용 조성물.

화학식 2
제 3 항에 있어서, 상기 조성물이 항암제인 것임을 특징으로 하는 포스포리파제 C 활성저해용 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 조성물이 항암제인 것임을 특징으로 하는 포스포리파제 C 활성저해용 조성물.