KR100383215B1

KR100383215B1 - 신균주 ｍｔ90049(ｋｃｔｃ 18043ｐ)와 이 균주로부터생산된 신규 화합물과 신규 화합물의 용도

Info

Publication number: KR100383215B1
Application number: KR10-2000-0056228A
Authority: KR
Inventors: 안종석; 오원근; 김보연; 민태익; 안순철; 강대욱
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2000-09-25
Filing date: 2000-09-25
Publication date: 2003-05-12
Also published as: KR20020024467A

Abstract

본 발명은 토양에서 분리한 미동정 곰팡이 균주 MT90049(KCTC 18043P)와 이 균주로부터 생산된 신규 화합물과 신규 화합물의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 포스포리파제 C(phospholipase C)의 활성을 저해하여 세포의 이상증식을 억제할 수 있는 물질을 생산하는 신균주 MT90049(KCTC 18043P)와 상기 신균주 배양액으로부터 분리 정제된 신규 화합물, 그리고 이러한 신규 화합물을 유효성분으로 함유하는 포스포리파제 C 활성 저해용 조성물에 관한 것이다.

Description

신균주 ＭＴ90049(ＫＣＴＣ 18043Ｐ)와 이 균주로부터 생산된 신규 화합물과 신규 화합물의 용도{A new fungal strain MT90049(KCTC 18043P), novel compound produced by this strain and their use}

본 발명은 토양에서 분리한 미동정 곰팡이 균주 MT90049(KCTC 18043P)와 이 균주로부터 생산된 신규 화합물과 신규 화합물의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 포스포리파제 C(phospholipase C)의 활성을 저해하여 세포의 이상증식을 억제할 수 있는 물질을 생산하는 신균주 MT90049(KCTC 18043P)와 상기 신균주 배양액으로부터 분리 정제된 다음 화학식 1로 표시되는 신규 화합물, 그리고 이러한 신규 화합물을 유효성분으로 함유하는 포스포리파제 C 활성 저해용 조성물에 관한 것이다.

포스포리파제 C는 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 표피성장인자(epidermal growth factor, EGF) 등의 세포성장인자(growth factor)나 바소프레신(vasopressin), 안기오텐신(angiotensin) 등의 자극인자가 세포막에 존재하는 각각의 수용체에 결합함으로써 활성화되며 활성화된 포스포리파제 C는 긍극적으로 세포의 성장과 분화를 일으킨다. 이러한 포스포리파제 C 중 한 종류인 포스포리파제 Cγ(PLCγ)를 미세조작에 의하여 NIH3T3 세포주에 주입해주거나[Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3659∼3663(1989)], 이의 유전자를 증폭 발현시켜주면[Science, 248, 607∼610(1990)] 이에 따른 세포 분열작용의 활성화가 관찰되었다. 또한, 폐암 및 유방암 조직의 세포에서 포스포리파제 C 효소의 발현량이 증가되었다고 보고[Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 10435∼10439(1991)] 되고 있다.

따라서, 포스포리파제 C의 저해물질이 새로운 항암제로의 가능성이 제시되어 최근에 포스포리파제 C 저해물질을 찾으려는 연구가 진행되고 있다. 포스포리파제 C 저해물질로는 이미 비나크산톤(vinaxanthone)[Tetrahed. Lett., 32, 4737-∼4740(1991)], 칼로포로시드(caloporoside)[J. Antibiotics,47, 1188∼1194(1994)], 히스피도스페르미딘(hispidospermidin)[J. Antibiotics,47, 1∼15(1994)] 등이 보고되고 있으나, 이들은 단순히 세포에서 분리한 포스포리파제 C 효소 활성 저해만을 보고하고 있을 뿐이다. 따라서, 소량으로서 세포에서 분리한 포스포리파제 C 효소활성 저해만이 아니라 세포 내에서 저해작용을 보이는 물질의 개발이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 포스포리파제 C에 대하여 강한 저해활성을 나타내는 물질을 개발하기 위한 연구를 계속해서 수행하여 토양에서 분리한 곰팡이 균인 MT90049(KCTC 18043P)를 선별하고, 이 균주의 배양액으로부터 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물을 분리 추출함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 토양으로부터 분리된 MT90049(KCTC 18043P) 균주와, 이러한 균주 배양액으로부터 분리한 포스포리파제 C의 활성을 저해하는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 그리고 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물을 함유하는 포스포리파제 C 활성 저해용 조성물을 제공하는 데 그 목적이 있다.

도 1은 화학식 1로 표시되는 화합물(CRM-90049)에 대한 중수소클로로포름(CDCl₃) 용액에서의 프로톤 핵자기 공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 2는 화학식 1로 표시되는 화합물(CRM-90049)에 대한 중수소클로로포름(CDCl₃) 용액에서의 탄소 핵자기 공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 3은 화학식 1로 표시되는 화합물(CRM-90049)에 대한 중수소클로로포름(CDCl₃) 용액에서의 HMQC 공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 4는 화학식 1로 표시되는 화합물(CRM-90049)에 대한 중수소클로로포름(CDCl₃) 용액에서의 HMBC 공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.

본 발명은 포스포리파제 C 활성 저해물질을 생산하는 MT90049(KCTC 18043P) 균주를 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 포스포리파제 C의 활성을 저해하는 다음 화학식 1로 표시되는 1-(3'-에틸-2',4'-디하이드록시페닐)-2-메틸-1-헥사논("CRM-90049"이라 약칭함)을 또 다른 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 MT90049 균주는 토양에서 분리한 곰팡이 균주로 포테이토 덱스트로스 아가(potato dextrose agar) 배지에서 천천히 성장하였다. 균총의 색깔은 검은색으로 뭉쳐서 성장하였다. 액체 배지인 YM 배지에서 진탕배양 시 직경 3 ∼ 5 mm의 작은 구를 형성하며 성장하였으며 구의 표면은 실날 모양의 솜털을 형성하였다. 배양액의 색깔은 처음의 엷은 갈색에서 진한 검은색으로 변하였다. 그러나 상기 균주에서는 포자(spore)의 형성을 관찰하지 못하였다.

이에, 본 발명에서 분리한 신균주를 분리 번호인 MT90049로 명명하고, 생명공학연구소 유전자은행에 2000년 8월 28일 보관 위탁 신청하고, 수탁번호 KCTC 18043P를 부여받았다. MT90049 균주는 다른 곰팡이와 같이 그 성상이 변하기쉬우므로 MT90049 균주, 또는 상기 균주의 돌연변이주(자연발생 또는 유발생), 형질융합체 또는 유전자 재조합체라도 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 생산성이 있으며 MT90049와 유사한 특성을 지니는 균주는 모두 본 발명의 방법을 사용하는 것이 된다.

한편, 상기한 곰팡이 분리주 MT90049(KCTC 18043P)로부터 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물을 생산하는 방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

즉, 통상적으로 미생물이 이용하는 영양원을 함유하는 배지에서 배양한다. 영양원으로서 탄소원은 포도당, 과당 등을 사용한다. 또한 질소원으로는 펩톤, 트립톤 등을 사용한다. 기타 필요에 따라서 황산 마그네슘 및 기타 무기염류를 첨가하는 것이 유효하다. 배양방법으로는 호기적인 조건하에서의 배양법, 특히 액침 배양법이 적당하다. 배양은 23 ∼ 28℃ 부근에서 행한다. 배양이 완료되면 원심분리하여 배양액을 용매추출, 흡착 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 고압 액체 크로마토그래피를 이용하여 정제함으로써 포스포리파제 C 저해활성을 갖는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 수득한다.

배양과정 또는 정제과정 중에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 생성유무는 포스포리파제 C 효소의 저해율을 이용하여 다음과 같이 확인할 수 있다. 포스포리파제 C 효소는 소의 작은 뇌로부터 분리 정제하여 사용하였다[과기처 연구보고서, 세포반응의 신호전달조절 선도물질의 탐색기술 개발(1993)]. 활성측정 기질로 포스포이노시톨[시그마사]과 3번 위치의 수소가 방사성 동위원소로 표지된 포스포이노시톨[아머삼사]를 시험관에 넣고 포스포리파제 C와 시료를 첨가한 뒤 반응시킨 후 클로로포름/메탄올(2/1) 혼합액을 넣어 생성된 이노시톨 포스페이트(IPs)양을 측정함으로써 포스포리파제 C 저해율(%)을 계산하고, IC₅₀값을 측정한다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물은 포스포리파제 C의 활성을 저해시킬 수 있으므로 항암제로서 이용될 수 있다. 즉, 상기와 같이 곰팡이 균주 MT90049(KCTC 18043P)의 배양액으로부터 분리 정제된 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 통상적인 방법에 의해 정제, 산제, 과립, 캅셀제, 현탁액, 유화액 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위투여형 또는 수회 투여형 제제로 제형화하여 항암제로 사용될 수 있다.

유효성분으로서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 본 발명의 조성물들은 목적하는 바에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 kg당 유효성분이 5 내지 20 mg의 양으로 투여될 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 사용된 특정 화합물, 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.

이하, 본 발명을 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하겠는바, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 발효생산

종배지 및 생산배지로서 이스트 엑기스 0.3%, 말트 엑기스 0.3 %, 펩톤0.5%, 포도당 1%가 함유된 배지를 사용하였다. 1 ℓ의 삼각 플라스크 3개에 각각 200 ㎖씩 분주한 종배지를 121 ℃에서 20 분간 살균한 후 MT90049 균주(KCTC 18043P)의 사면배양을 백금이로 접종하고 25 ℃에서 3일간 진탕배양하여 배양기의 종배양으로 하였다. 121 ℃에서 1시간 살균한 10 L 생산 배지를 함유한 15 L 배양기(fermentor)에서 전기의 종 배양액 600 ㎖을 접종하여 25 ℃에서 10일간 통기 하에 300 rpm 교반속도로 배양하였다.

실 시 예 2: 화학식 1로 표시되는 신규 화합물의 분리정제

상기 실시예 1에서 수득한 배양액을 5,000 rpm에서 원심분리하여 배양 상등액과 균체 침전물로 나누었다. 배양 상등액을 디아이온 HP-20(Diaion HP-20)에 흡착시킨 다음 30% 메탄올로 세척하였다. 아세톤을 사용하여 흡착물질을 용출시킨 뒤 균체 침전물의 아세톤 추출액과 합하여 농축하였다. 이어서 농축액을 소량의 물에 녹여 에틸아세테이트로 추출한 뒤 추출물을 농축한 후 실리카겔에 흡착시켜 클로로포름/메탄올(20/1)을 전개용매로 하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 하였다. 포스포리파제 C 저해활성이 강한 분획을 모아 농축시킨 후, 70% 메탄올을 전개용매로 로바(Lobar) RP-18 칼럼 크로마토그래피 하였다. 이때 활성물질과 물리적 성상이 비슷한 물질들을 제거하기 위하여 클로로포름/노말핵산/메탄올(2/3/1) 혼합용액을 사용하여 세파덱스(Sephadex) LH-20 칼럼 크로마토그래피를 2회 동일하게 실시하였다. 분리된 분획들 중 활성 분획을 모아 농축한 뒤 고압 액체 크로마토그래피[칼럼: J'sphere ODS-H80, 용매:75% 메탄올, 유속: 4 ㎖/분, 검출: 254 nm]를 실시하여 체류시간 19 분대에서 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물을 순수 분리하고, 용매를 감압 건조기로 제거하여 엷은 노란색 분말을 수득하였다.

실 시 예 3: 화학식 1로 표시되는 화합물의 구조분석

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 엷은 노란색 분말로 메탄올, 에틸아세테이트, 아세톤 등의 유기용매에는 잘 녹았으나 물에는 녹지 않았다. 고해상도 질량분석 결과(HREI-MS) 분자량은 250로 나타났고 분자식은 C₁₅H₂₂O₃임을 알 수 있었다. 양성자(¹H)와 탄소 핵자기(¹³C) 공명 스펙트럼 분석 결과는 다음 표 1에 나타내었다.

실시예 4: 포스포리파제 C 저해활성 측정

20 μCi의 [³H]-포스포이노시톨(PI)이 포함된 50 ㎛ 포스포이노시톨, 1 M EGTA, 3 mM 염화칼슘(CaCl₂), 50 M HEPES(pH 7.0) 및 0.1% 데옥시콜레이트 나트륨(sodium deoxycholate)로 구성된 반응액 185 ㎕에 효소액 5 ㎕와 검정시료10 ㎕를 첨가한 다음 반응액을 37 ℃에서 10 분간 반응시킨 후 클로로포름/메탄올(2/1) 혼합용액 1 ㎖을 넣어 반응을 중지시켰다. 그 다음 원심분리하여 상등액층의 방사능도(radioactivity)를 측정하였다. 효소 저해율은 다음 수학식 1로 계산하였으며, IC₅₀값은 효소 활성의 저해율이 50%에 달하는 저해제의 농도로 결정하였다.

상기 수학식 1에서: A는 저해제를 첨가하지 않은 것의 반응 후 방사능도를 나타내고; B는 효소액을 첨가하지 않은 것의 반응 후 방사능도를 나타내고; C는 저해제를 첨가한 것의 반응 후 방사능도를 나타낸다.

분리된 상기 화학식 1로 표시되는 화합물에 대한 포스포리파제 C 효소의 활성을 50% 저해하는 농도(IC₅₀)를 측정한 결과 IC₅₀값은 2 ㎍/㎖이었고, 이를 몰농도로 계산하면 8 μM이었다.

실시예 5: 세포 내에서의 신호전달과정의 저해활성 측정

상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 세포 내에서 신호전달과정의 저해활성은 NIH3T3γ1 세포주를 사용하여 세포 내 이노시톨 포스페이트 토탈(inositolphosphate total, IPt)양을 측정하는 방법으로 행하였다. 6 ×10⁵세포/㎖의 NIH3T3γ1 세포주를 이노시톨(inositol)을 제거한 DMEM 배지에서 24 시간 동안 1 μCi의 마이오-[2-³H]-이노시톨(myo-[2-³H]-inositol)과 함께 배양하였다. 이렇게 배양한 세포주를 PBS로 세척한 뒤 15분 동안 배양하였다. 여기에 검정 시료를 5 ㎕ 첨가한 뒤 20분 동안 배양하고 PDGF로 30분 동안 자극하였다. 상기 세포주를 5% 과염소산를 사용하여 반응을 중지시킨 뒤 세포 내 이노시톨 포스페이트(inositol phosphate)를 추출하였다. 추출된 이노시톨 포스페이트를 바이오라드(Biorad) AG 1X-8 음이온 교환 칼럼을 사용하여 흡착시킨 뒤 10 ㎖의 증류수로 세척하고 5 mM 사보릭나트륨(sodium tetraborate)와 60 mM 암모늄포르메이트(ammonium formate)용액 10 ㎖로 다시 세척하였다. 마지막으로 1 M 암모늄포르메이트(ammonium formate)와 0.1 M 포름산(formic acid)를 사용하여 이노시톨 포스페이트를 용출시킨 후 방사능도를 측정하였다.

저해율은 포스포리파제 C 활성 저해의 저해율 계산에 따라 행하였다.

분리된 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물을 NIH3T3γ1 세포주를 사용하여 PDGF 자극에 의한 IPt생성을 보는 방법으로 세포 내 신호 전달과정의 저해정도를 측정한 결과, 두 화합물 모두 0.8 ㎍/㎖의 농도에서 IC₅₀값을 보여주었으며, 이를 몰농도로 계산하면 3.2 μM이었다.

상술한 바와 같이, 토양에서 분리한 신균주 MT90049(KCTC 18043P)의 배양액으로부터 분리 정제된 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물 CRM-90049인 1-(3'-에틸-2',4'-디하이드록시페닐)-2-메틸-1-헥사논은 포스포리파제 C의 활성을 저해하는 작용이 우수하므로 항암제로서 이용될 수 있다.

Claims

포스포리파제 C 활성 저해물질을 생산하는 것임을 특징으로 하는 MT90049(KCTC 18043P) 균주
다음 화학식 1로 표시되는 것임을 특징으로 하는 화합물.

화학식 1
다음 화학식 1로 표시되는 화합물이 함유된 것임을 특징으로 하는 포스포리파제 C 활성 저해용 조성물.

화학식 1
제 3 항에 있어서, 상기 조성물이 항암제인 것을 특징으로 하는 조성물.