KR100427411B1

KR100427411B1 - 아스퍼질러스 속 Ｆ７０６０９（ＫＣＴＣ１８０５５Ｐ）와 β－글루코시다제 저해제

Info

Publication number: KR100427411B1
Application number: KR10-2000-0079925A
Authority: KR
Inventors: 김창진; 권오성; 박동진
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2000-12-21
Filing date: 2000-12-21
Publication date: 2004-04-17
Also published as: KR20020050674A

Abstract

본 발명은 신균주 아스퍼질러스 속(Aspergillussp.) F70609(KCTC 18055P)와β-글루코시다제 저해작용을 갖는 다음 화학식 1로 표시되는 다이케토피페라진 유도체에 관한 것이다.

Description

아스퍼질러스 속 Ｆ７０６０９（ＫＣＴＣ１８０５５Ｐ）와 β－글루코시다제 저해제{Invention of a new β－Glucosidase inhibitor from a Fungus, Aspergillus sp．Ｆ７０６０９（ＫＣＴＣ１８０５５Ｐ）}

본 발명은 신균주 아스퍼질러스 속(Aspergillussp.) F70609(KCTC 18055P)와β-글루코시다제 저해작용을 갖는 다음 화학식 1로 표시되는 다이케토피페라진(Diketopiperazine) 유도체에 관한 것이다.

화학식 1

당(Sugar)의 아노머 히드록시기(anomeric hydroxy group)는 당과 가역적으로 축합되어α,β-글리코시드를 형성하게 되며, 이때의 아노머 탄소와 산소를 연결하는 결합을 글리코시드 결합(glycosidic bond)이라고 한다. 이러한 글리코시드 결합의 가수분해는 글리코시다제라는 효소에 의해 촉매화된다.

β-글루코시다제(β-glucosidase)는 막결합 리소솜 효소(membrane-associated lysosomal enzyme)로서β-글리코시드 결합(glycosidic linkage)을 절단하는 기능을 가지고 있다[Grabowski 등, 1996; Mahdiyoun 등, 1992; Zimmer 등, 1999]. 즉, 글리코리피드 프로세싱(glycolipid processing)에 관여하면서 글리코실세라마이드(glycosylceramide)를 분해하는 기능을 하는데 이것이 세망내피 세포에 축적이 되어 신생아의 유전적 질환인 고우쉬(Gaucher's) 질환 등을 유발하게된다[Grace 등, 1999; Cox 등, 2000]. 따라서, 이러한 효소의 작용을 억제함으로써 고우쉬 질환 등의 치료에 이용될 수 있다. 즉, 신생아의 유전적인 고우쉬 질환 치료에 이용될 수 있는β-글루코시다제 저해물질을 탐색하였다. 현재 미생물 및 천연물 그리고 합성을 통하여 저해물질의 탐색연구가 활발히 이루어지고 있다. 대표적인 것을 살펴보면 버섯인 펠리너스 속(Phellinussp.) 배양액으로부터 사이클로펠리톨(cyclophellitol)[Atsumi 등, 1990]이 분리되었으며 식물로부터는 알칼로이드(alkaloid) 계열의 카스타노스퍼민(castanospermine)이 분리되었고 화학합성으로는 디옥시노지리마이신(deoxynojirimycine)이 포함되는 호모이소파고민스(homoisofagomines) 계열의 유도체 화합물의 유기합성을 통한 연구가 진행되고 있다[Schuster 등, 1999].

이에, 본 발명자들은 토양 곰팡이류로부터 신균주 아스퍼질러스 속(Aspergillussp.) F70609(KCTC 18055P)를 분리하였고, 이러한 신균주로부터 생산하거나 또는 화학적 방법으로 합성하여 습득된 상기 화학식 1로 표시되는 다이케토피페라진 유도체가β-글루코시다제 저해활성을 가지고 있음을 알게됨으로써 본 발명을 완성하였다.

도 1은 아스퍼질러스 속(Aspergillussp.) F70609(KCTC 18055P)의 전자현미경 사진이다.

도 2는 아스퍼질러스 속(Aspergillussp.) F70609(KCTC 18055P)의 균주 배양기간에 따른 세포성장 및β-글루코시다제 저해율을 나타낸 그래프이다.

도 3은 화학식 1로 표시되는 다이케토피페라진 유도체의 EIMS(electron ionization mass spectroscopy)이다.

도 4는 CD₃OD 용액에서 화학식 1로 표시되는 다이케토피페라진 유도체의 300 MHz 수소핵자기공명 스펙트럼이다.

도 5은 화학식 1로 표시되는 다이케토피페라진 유도체 투여량에 따른 알몬드(Almonds) 유래의β-글루코시다제 저해 활성을 나타낸 그래프이다.

본 발명은β-글루코시다제 저해물질을 생산하는 아스퍼질러스속(Aspergillussp.) F70609(KCTC 18055P)를 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은β-글루코시다제 저해활성을 가지는 다음 화학식 1로 표시되는 다이케토피페라진 유도체 및 이의 제조방법을 포함한다.

화학식 1

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 다이케토피페라진 유도체가 포함되어 있는 β-글루코시다제 저해제를 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

1. 신균주의 동정

대한민국 전국의 토양으로부터 10,000여 미생물 균주를 순수 분리한 후, 각 균주 배양액을 대상으로β-글루코시다제 저해활성을 스크리닝하여 가장 우수한 한 곰팡이 균주 F70609을 선발하였다. 선발된 균주를 포테이토-덱스트로스 한천, 챠펙크 한천(Czapek's agar) 및 맥아 추출 한천배지에 접종한 후에 관찰한 결과는 다음 표 1에 나타내었다.

생육은 매우 양호하였으며 25 ℃에서 7일간 배양 시 콜로니 직경이 30 ∼ 40 ㎜에 이르렀다. 표면 색깔은 흑색이었고, 뒷면 색깔도 짙은 흑색을 보였다.

형태적인 관찰을 위해 포테이토-덱스트로스 한천 배지에서 광학현미경과 전자현미경을 이용하여 관찰한 결과[도 1 참조]에 의하면, 분생자 자루(conidiophore)는 기저균사로부터 직립(elect), 단순(simple) 형태로 관찰되었으며 분생자병(conidial head)은 컬럼나(columnar) 형태로 나타났다. 피아리드(Phialides)의 크기는 3 ∼ 5 ×7.5 ㎛이고, 분생자(conidia)의 형태는 구형(globose)과 반구형(subglobose)이 혼재하며, 표면은 러프(rough) 형태이며 직경은 2.3 ∼ 3.1 ㎛ 이었다.

상기한 특성으로 미루어보아 이 생산균주는 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 균주로 동정하였으며 아스퍼질러스 속 F70609로 명명하였다. 본 균주를 2000년 11월 14일자로 생명공학연구소 유전자원센터에 기탁하여 KCTC 18055P의 수탁번호를 부여받았다.

2. 신균주의 배양

본 발명에 있어서의 균주 배양은 통상의 미생물이 사용할 수 있는 영양원을 함유하는 배지에서 배양한다. 예를 들어, 탄소원은 글루코오스를 사용하고, 질소원으로 효모추출액, 폴리펩톤 등을 사용한다. 그리고, 황산 마그네슘, 다이포타슘 포스페이트 등의 무기염류를 첨가하여 배양한다. 배양방법으로는 호기적 조건에서 진탕 배양 혹은 통기교반 배양하는 것이 좋다. 배양온도는 각 조건에 따라서 약간씩 상이하기는 하나 25 ∼ 30 ℃에서 배양하는 것이 적당하고 더욱 바람직하게는 28 ℃에서 배양하였다. 또한, 배양기간이나 진탕 배양의 경우 통상 5 ∼ 8일 배양함으로써 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물의 생산이 최고에 달하도록 한다[도 2 참조].

3. 신규 화합물의 분리 및 정제

상기와 같은 배양 조건하에서 아스퍼질러스 속(Aspergillussp.) F70609(KCTC 18055P) 균주를 배양하여 상기 화학식 1로 표시되는 신규한 다이케토피페라진 유도체를 얻는다. 상기 화학식 1로 표시되는 다이케토피페라진 유도체는 균주 배양액뿐만 아니라 균체 부분에서도 존재하므로 배양액을 원심분리하여 배양 상등액과 균체를 분리한 후, 다음에서 기술하는 방법에 의하여 효율적으로 추출 정제를 실시한다. 즉, 상기 화학식 1로 표시되는 다이케토피페라진 유도체는 지용성 물질이므로 배양액을 에틸아세테이트, 클로로포름 등의 유기용매를 가하여 추출한다. 한편, 균체 부분은 아세톤 등의 유기용매를 가하여 교반하여 균체로 부터도 유효성분을 추출한 후 아세톤 등의 용매는 증발시키고 다시 에틸아세테이트, 클로로포름 등으로 추출한 후 배양액과 합친다. 얻어진 유효성분이 포함된 혼합액으로부터 에틸아세테이트, 클로로포름 등의 용매를 증발 건조시킨 후 클로로포름/메탄올 = 100/1 ∼ 10/1(V/V)의 용매를 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토 그라피를 실시한다. 그리고, 얻어진 활성부위를 다시 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토 그라피를 클로로포름/메탄올 = 1/1(V/V)로 재차 실시한다. 그런 다음, HPLC에 의해서 순수한 유효 화합물을 얻을 수 있다. 상기한 바와 같은 분리 정제방법을 단독 또는 복합적으로 반복하면 더욱 손쉽게 순수한 정제 품을 얻을 수 있다.

구조분석을 위하여 NMR 분석[Varian UNITY 300]을 하였으며, 용매는 CD₃OD를 이용하여 측정하였다. 분자량 결정은 EIMS(electron ionization mass spectroscopy)[Hewlett-Packard, MS-Engine 5989A]로 측정하였으며, UV 스펙트럼 [Pharmacia Ultra 3000]은 메탄올을 용매로 측정하였다.

아스퍼질러스 속(Aspergillussp.) F70609(KCTC 18055P) 균주가 생산하는 활성물질은 백색분말로 UV(MeOH) 210 ㎚에서 최대흡수 피크를 보였으며, EIMS 분석결과 분자량이 196으로 확인되었고,¹H,¹³C,¹H-¹H COSY(two-dimensional 1H-1H correlated spectroscopy) 등에 의해 구조를 확인하였다.

그 밖의 활성물질에 대한 이화학적 특징은 다음과 같다;

1) 물질의 성상 : 백색분말

2) 분자량: 196

3) 분자식:C₁₀H₁₆N₂O₂

4) 질량분석(M) : [도 3 참조]

5) 자외선 흡수 스펙트럼(UV(MeOH)) : 210 ㎚

6) 핵자기공명 (NMR) 흡수스펙트럼 : CD₃OD를 용매로 하고 TMS(Si(CH₃)₄)를 표준물질로 하여 수소핵자기공명(1H-NMR) 스펙트럼을 조사하여 도 4 에 나타내었다.

7) 용해성

용해: 아세톤, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메탄올, DMSO(Dimethyl sulfoxide)

불용: 물, n-헥산

8) 박층 크로마토 그라피 : R_f값: 0.31

흡착제 : 머크사 실리카겔 60F 254

전개용매 : CHCl₃/MeOH = 10/1(V/V)

9) 화학 구조식

4. 신규 화합물의 화학적 합성

상기 화학식 1로 표시되는 다이케토피페라진 유도체는 아스퍼질러스 속 F70609(KCTC 18055P) 균주 배양물로부터 얻을 수 있고, 또한 화학적 합성방법으로도 제조가 가능하다. 즉, 상기 화학식 1로 표시되는 다이케토피페라진 유도체는 사이클로 프롤린과 발린이 결합하고 있는 구조를 지니고 있는 바, 먼저 t-Boc-프롤린과 발린 메틸 에스테르(valine methyl ester)를 고리화 반응시킨 후 정제를 실시한 후 완성하였다.

5. 신규 화합물에 대한 β -글루코시다제 저해활성 검정

상기 화학식 1로 표시되는 다이케토피페라진 유도체에 대한β-글루코시다제 저해활성은 검체 30 ㎕, 완충액(0.1 M 인산완충액 pH 7.0) 250 ㎕ 및 기질로서 p-니트로페닐-β-D-글루코피라노사이드(5 mM, pH 7.0) 250 ㎕를 넣은 후, 효소용액(β-글루코시다제(30 unit/㎖,[시그마사]) 10 ㎕를 첨가하였다. 37 ℃에서 30분간 반응시킨 후 0.4 M 글리신-수산화나트륨용액(pH 10.4) 2 ㎖를 가해 반응을 정지시킨 후 410 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 후, 결과를 다음 수학식 1에 대입하여 효소활성 저해율(%)을 계산하였다.

상기 수학식 1에서 : A는 저해제를 넣은 것의 반응전 흡광도이고; B는 저해제를 넣은 것의 반응후 흡광도이고; C는 저해제를 넣지 않은 것의 반응전 흡광도이고; D는 저해제를 넣지 않은 것의 반응후 흡광도이다.

이에, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 다이케토피페라진 유도체가 유효성분으로 함유되어 있는β-글루코시다제 저해제를 포함한다. 본 발명에 따른 약제에는 상기 화학식 1로 표시되는 다이케토피페라진 유도체 이외에도 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 전문가라면 용이하게 알 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제가 함께 함유되어 정제, 산제, 과립, 캅셀제, 현탁제, 유화액 또는 비경구 투여용의 단위투여용 또는 수회 투여용 제제로 제형화할 수 있다. 약제의 유효투입량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등에 의해 다양해질 수 있으며, 일반적으로 1 ∼ 10 ㎎/㎏(몸무게)/1일 범위 내에서 투여된다. 그리고, 1일 유효투입량 범위 내에서 하루에 한 번 또는 하루에 여러 번 나누어 투입할 수 있다.

상기에 설명한 바와 같은 본 발명은 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 다음의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 미생물 배양

종배지 및 생산배지로서 글루코스 2%, 효모추출액 0.2%, 폴리펩톤 0.5%, 황산마그네슘 0.05%, 포타슘 다이포스페이트 0.1%를 함유한 배지에 pH 5.6으로 조정한 후 사용하였다. 500 ㎖의 삼각 플라스크 2개에 각각 100 ㎖씩 분주한 종배지를 121 ℃에서 20분간 살균하고 이것에 아스퍼질러스 속 F70609 균주의 사면배양 1 ∼ 2 백금이를 접종하고 28 ℃에서 3일간 진탕 배양하여 배양기의 종배양으로 사용하였다. 121 ℃에서 30분 살균한 3 ℓ생산배지를 함유한 5 ℓ발효조(fermentor)에 종배양액 200 ㎖를 접종하여 28 ℃에서 7일간 통기 하에서 400 rpm의 교반속도로 배양하였다.

실시예 2 : 배양물질의 구조 결정

상기 실시예 1에서 얻은 배양여액 5 ℓ를 12,000 ×g에서 30분간 원심 분리하여 배양 상등액과 균체를 분리하고, 균체는 다시 동량의 100% 아세톤으로 3회 반복 추출하고 감압 농축하여 아세톤을 제거한 후 배양 상등액과 합하여 다시 동량의 에틸아세테이트로 3회 반복 추출하였다. 에틸아세테이트 추출물을 농축한 후 클로로포름에 용해하여 실리카 겔(70 ∼ 230 mesh)[Merck 사] 크로마토그라피상에서 클로로포름/메탄올=100/1 →10/1(V/V)로 조성된 유기용매로 전개시켜 활성 분획을 모았다. 이 활성 분획을 농축한 후 클로로포름/메탄올=1/1(V/V)의 전개용매로 하여 세파덱스 LH-20[Pharmacia] 컬럼 크로마토그라피상에서 전개하여 활성 분획을 모았다. 상기 활성 분획을 농축한 다음, 고압액체 크로마토그라피(칼럼: YMC-pak ODS 250 ×100㎜, 5 ㎛, 유속 1 ㎖/분, 254 ㎚ 검출, 용출액 55% 메탄올)상에서 분리하여 체류시간 33분 근처에서 활성물질을 순수 분리하고, 용매를 감압 건조기로 제거한 후 냉동 건조하여 백색의 분말 10 ㎎을 얻었다.

구조분석을 위하여 NMR 분석[Varian UNITY 300]을 하였으며, 용매는 CD₃OD를 이용하여 측정하였다. 분자량 결정은 EIMS로 측정하였으며, UV 스펙트럽[Pharmacia Ultra 3000]은 메탄올을 용매로 측정하였다.

그 결과, 활성물질은 백색분말로 UV λmax(MeOH) 210 ㎚에서 최대흡수 피크를 보였으며, EIMS 분석결과 분자량이 196로 확인되었다. 또한, NMR에 의한 구조분석 결과 분자식은 C₁₀H₁₆N₂O₂로 결정되었으며,¹H-¹H COSY(two-dimensional 1H-1H correlated spectroscopy) 등에 의해 구조를 확인하였다.

실시예 3 : 화학식 1로 표시되는 다이케토피페라진 유도체의 화학적 합성

t-Boc-프롤린(205 ㎎, 1 mmol) 205 ㎎을 염화메틸렌(10 ㎖)에 가하고, 얼음 중탕 하에서 발린 메틸 에스테르(181 ㎎, 1 mmol), 트리에틸아민(140 ㎕, 1 mmol) 및 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(192 ㎎, 1 mmol)을 투입하였다. 반응용액은 얼음 중탕 하에서 하루 동안 반응시켰다. 염화메틸렌(10 ㎖)을 가하고 증류수(40 ㎖)로 세척한 다음, 유기층은 1 N 시트르산(40 ㎖)으로 세척하고 1 N 탄산수소나트륨(40 ㎖)으로 계속해서 세척하고 건조시켜 액상(240 ㎎)을 얻었다. 포름산(20 ㎖)을 첨가한 후에 상온에서 2시간 30분 동안 유지시키고, sec-부탄올(20 ㎖) 및 톨루엔 (10 ㎖)을 가하고 2시간 30분 동안 환류하였다. 에테르(20 ㎖)를 첨가하고 메탄올로 세척한 후에 건조하여 노란 액상의 사이클로 D-pro-L-val을 얻었다. 상기와 같은 방법으로 상기 화학식 1로 표시되는 다이케토피페라진 유도체를 합성하였다.

실시예 4 : β- 글루코시다제 저해활성 측정

β-글루코시다제에 대한 상기 화학식 1로 표시되는 다이케토피페라진 유도체의 저해활성 정도를 조사하였다. 다이케토피페라진 유도체 투여량에 따른 효소 저해율은 상기 화학식 1과 같이 계산하여 도 5에 나타내었으며, 알몬드 유래의β-글루코시다제 효소에 대한 IC₅₀값은 50 ㎍/㎖ 이었다.

또한, 다른 글루코시다제에 대한 상기 화학식 1로 표시되는 다이케토피페라진 유도체의 활성 비교는 다음 표 2에 나타내었다.

실시예 5 : 글루코시다제 저해제의 급성독성 조사

실험동물은 생명공학연구소에서 유지 관리되고 있는 SPF(Specific Pathogens Free; 특정 병원체 부재) 상태의 6주령 암컷 ICR 마우스를 사용하였다. 실험동물은 온도 22 ±1℃, 습도 55 ±5%, 조명 12L/12D의 동물실 내에서 유지되었다. 마우스는 실험에 사용하기 전에 순화시켰다. 시료의 조제는 10 mg/kg의 용량으로 조제하였다. 투여방법은 먼저 그룹당 마우스를 3 마리로 나눈 뒤 마우스 10 g-체중 변화 및 사망여부를 관찰하였다. 약물 투여 후 10일 동안 마우스 체중 변화 및 사망여부를 관찰하였다. 투여당일은 투여 후 1시간, 4시간, 8시간, 12시간 뒤에, 투여 익일부터 10일째까지는 매일 오전, 오후 1회 이상씩 일반 증상의 변화 및 사망동물의 유무를 관찰하였다. 또한, 투여 당일부터 3일 간격으로 체중 변화를 측정하여 시료에 의한 동물의 체중 변화를 관찰하였다. 그 결과 급성 독성 실험결과 본 시료를 100 mg/kg의 용량으로 경구 투여한 후 10일간 치사동물은 관찰되지 않았다. 그리고 부검시 특별한 병변 육안 소견이 없었으며, 투여 익일부터 10일간 어떠한 체중의 감소 없이 정상적인 체중의 증가가 관찰되었다. 결론적으로 본 시료는 경구 투여시 독성이 관찰되지 않았다[표 3 및 표 4 참조].

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 신균주 아스퍼질러스 속(Aspergillussp.) F70609(KCTC 18055P)로부터 생산 또는 화학적인 합성 방법으로 합성된 상기 화학식 1로 표시되는 다이케토피페라진 유도체는β-글루코시다제에 대한 저해활성이 우수하므로 고우쉬(Gaucher's) 질환 치료를 위한 유효약물로 유용하다.

Claims

β-글루코시다제(β-Glucosidase) 저해물질을 생산하는 것을 특징으로 하는 아스퍼질러스 속(Aspergillussp.) F70609(KCTC 18055P).
다음 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 다이케토피페라진(Diketopoperazine) 유도체.

화학식 1
다음 화학식 1로 표시되는 다이케토피페라진 유도체가 유효성분으로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는β-글루코시다제 저해제.

화학식 1
t-Boc-프롤린(t-Boc-proline)과 발린 메틸 에스테르(valine methyl ester)를 고리화 반응시킨 후 정제하는 것을 특징으로 하는 다음 화학식 1로 표시되는 다이케토피페라진 유도체의 제조방법.

화학식 1