KR100398065B1 - 신균주 곰팡이 아크레모니움속 ｍｔ70646(ｋｃｔｃ8973ｐ)와 이 균주로부터 생산된 신규 화합물과 이의 용도 - Google Patents

신균주 곰팡이 아크레모니움속 ｍｔ70646(ｋｃｔｃ8973ｐ)와 이 균주로부터 생산된 신규 화합물과 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 토양에서 분리한 신균주 곰팡이 아크레모니움속(Acremoniumsp.) MT70646(KCTC 8973P)와 이 균주로부터 생산된 신규 화합물과 신규 화합물 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 암 전이시에 일어나는 암세포의 내피세포 침윤(invasion)이나 신혈관 형성(angiogenesis) 시에 필요한 헤파리나제(heparinase)와 헤파라나제(heparanase)의 활성을 저해하며 암세포의 전이를 억제할 수 있는 물질을 생산하는 신규 곰팡이 아크레모니움속(Acremoniumsp.) MT70646(KCTC 8973P)과 상기 신균주 배양액으로부터 분리 정제된 신규 화합물, 그리고 이러한 신규 화합물을 유효성분으로 함유한 헤파리나제 활성 저해제, 헤파라나제 활성 저해제, 암전이 저해제 및 혈관생성 저해제에 관한 것이다.

Description

신균주 곰팡이 아크레모니움속 ＭＴ70646(ＫＣＴＣ 8973Ｐ)와 이 균주로부터 생산된 신규 화합물과 이의 용도{A new fungal strain Acremoniem sp. MT70646(KCTC 8973P), novel compounds produced by this strain and their use}
본 발명은 토양에서 분리한 신균주 곰팡이 아크레모니움속(Acremoniumsp.) MT70646(KCTC 8973P)와 이 균주로부터 생산된 신규 화합물과 신규 화합물 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 암 전이 시에 일어나는 암세포의 내피세포 침윤(invasion)이나 소혈관 형성시에 필요한 헤파리나제와 헤파라나제의 활성을 저해하며 암세포의 전이를 억제할수 있는 물질을 생산하는 신규 곰팡이 아크레모니움속(Acremoniumsp.) MT70646(KCTC 8973P)과 상기 신균주 배양액으로부터 분리정제된 신규 화합물, 그리고 이러한 신규 화합물을 유효성분으로 함유한 헤파리나제 활성 저해제, 헤파라나제 활성 저해제, 암전이 저해제 및 혈관생성 저해제에 관한 것이다.
상기 화학식 1에서 : R1은 수소원자, 할로겐원자, 또는 C1∼C6알킬기를 나타내고; R2는 C1∼C20알킬기를 나타내고; R3은 수소원자, 할로겐원자, 또는 C1∼C6알킬기를 나타낸다.
포유동물 세포에서 일어나는 종양세포의 침투(tumor invasion)나 암세포의 전이(metastasis)는 세포 외부에 존재하는 기저막(basement membranes)의 효소적 분해과정을 반드시 수반한다. 헤파란썰페이트(heparan sulfate)나 헤파린(heparin)은 콜라젠(collagen), 라미닌(laminin) 및 피브로넥틴(fibronectin) 등과 함께 대부분의 포유동물 세포에 존재하는 기저막의 주요 구성성분 중의 하나이다. 헤파란썰페이트와 헤파린은 고도로 N-아세틸화(N-acetylation) 또는 N-황화(N-sulfation)된 글루코사민(glucosamine)과 헥스유로네이트(hexuronate)의 이당단위가 연속적으로 결합된 복합선상다당으로서 서로 구조적으로 매우 유사하다.
헤파란썰페이트와 헤파린은 각각 헤파라나제(heparanase)와 헤파리나제(heparinase) 효소에 의해 분해되며, 이때 헤파리나제는 헤파린 뿐만 아니라 헤파란썰페이트도 분해할 수 있다. 일찍이 이들 효소는 혈관생성(angiogenesis)이나 암전이 과정에 밀접하게 관련되어 있는 것으로 알려져 있다[J. Biol. Chem. 257, 2678∼2686(1982);Science220, 313∼325(1983)]. 또한, 이들 효소의 저해제들이 암전이를 억제하는 것이 보고되면서[Biochemistry. 25, 5322∼5328,(1986);Cancer Res. 50, 3631∼3637,(1990)] 항암제로서의 개발가능성이 제시되었고, 몇몇 연구자들에 의해 새로운 저해제를 찾으려는 탐색연구가 진행되고 있다. 또한, 암전이를 위하여는 새로운 혈관이 생겨 이를 통한 영양물질의 공급이 이루어져 암조직의 성장이 일어난다. 이러한 신혈관생성(angiogenesis)에는 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)나 염기성 섬유모세포성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF)가 요구된다. 이들 성장인자들은 헤파린 혹은 헤파린설페이트에 결합되어있다가 해파리나제나 헤파라나제가 이들을 분해하면 유리되며 혈관생성세포의 성장을 유도시켜 혈관생성이 이루어진다. 따라서, 헤파리나제 혹은 헤파라나제 활성을 저해하면 신혈관 생성을 저해할 수 있어 암세포의 성장저해, 특히 전이 암세포의 성장을 억제할 수 있다[J. Biol. Chem. 270, 11322∼11326(1995)]. 신혈관 생성도를 측정하는 방법으로서 "HUVEC"이라 불리는 혈관 내피세포를 이용한 방법이 많이 알려지고 있다[Biol. Pharm. Bull. 20, 1131∼1135(1997)]. 현재까지 헤파라나제 저해제로서 트라치스픽산(trachyspic acid)[J. Antibiotics48, 357∼362,(1994)]과 A-72363C[J. Antibiotics49, 61∼64(1996)]가 보고되어 있으며, 이미 임상적으로 항암제로 사용되고 있는 수라민(suramin)[J. Biol. Chem. 266, 9661∼9666(1991)]도 헤파라나제 활성을 저해하고 종양세포의 전이도 억제하는 것으로 알려지고 있다.
따라서, 소량으로서 헤파라나제 또는 헤파리나제 효소활성 저해 뿐만 아니라 세포에서도 이들을 저해하여 암전이 억제 및 혈관생성을 억제할 수 있는 신규 화합물의 개발이 요구되고 있다.
본 발명자들은 그 동안 새로운 형태의 항암제 개발의 일환으로 헤파리나제에 대하여 강한 저해활성을 나타내는 물질을 개발하기 위하여 오랜동안 연구를 수행하였다. 그 결과, 토양으로부터 곰팡이 균주 아크레모니움속 MT70646(KCTC 8973P)을 분리선별하고, 이 균주의 배양액으로부터 헤파리나제와 헤파라나제를 강하게 저해하는 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물을 분리 추출함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 토양으로부터 분리한 신규 곰팡이 균주 아크레모니움속 MT70646(KCTC 8973P)과, 이러한 신균주 배양액으로부터 분리추출한 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물, 그리고 이러한 신규 화합물이 유효성분으로 함유된 헤파리나제 활성 저해제, 헤파라나제 활성 저해제, 암전이 저해제 및 혈관생성 저해제를 제공하는 데 그 목적이 있다.
도 1는 화학식 1a로 표시되는 화합물(CRM646-A)의 양성자 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이고,
도 2은 화학식 1a로 표시되는 화합물(CRM646-A)의 탄소 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이고,
도 3는 화학식 1a로 표시되는 화합물(CRM646-A)의 HMBC 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이고,
도 4는 화학식 1b로 표시되는 화합물(CRM646-B)의 양성자 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이고,
도 5은 화학식 1b로 표시되는 화합물(CRM646-B)의 탄소 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이고,
도 6은 신균주 곰팡이 아크레모니움속 MT70646(KCTC 8973P)이 생산하는 유도체들의 HPLC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7은 신균주 곰팡이 아크레모니움속 MT70646(KCTC 8973P)이 생산하는 유도체들의 합성 기저막을 통한 B16 멜라노마세포의 전이(암세포 침투)저해활성을 나타낸 것이다.
본 발명은 신균주 아크레모니움속 MT70646(KCTC 8973P)을 그 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 헤파리나제 저해 활성, 헤파라나제 저해 활성,암전이 저해 활성 및 혈관생성 저해 활성을 가지고 있어 항암제로서 유용한 다음 화학식 1로 표시되는 화합물을 또 다른 특징으로 한다.
화학식 1
상기 화학식 1에서 : R1은 수소원자, 할로겐원자, 또는 C1∼C6알킬기를 나타내고; R2는 C1∼C20알킬기를 나타내고; R3은 수소원자, 할로겐원자, 또는 C1∼C6알킬기를 나타낸다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 따른 신균주 곰팡이 아크레모니움속 MT70646(KCTC 8973P)의 분리 및 동정 과정은 다음과 같다.
[신규 미생물의 분리]
멸균 생리 식염수 10 ㎖에 풍건한 토양시료 1 g을 넣고 30 분간 교반한 다음 10-2∼ 10－4배로 희석하여 0.1 ㎖을 포테이토 덱스트로스 아가(potato dextrose agar) 배지에 도말한 후 25 ℃에서 7 ∼ 10일간 배양하여 나타난 집락을 순수분리한다.
[신규 미생물의 동정]
1) 형태 및 배양학적 특성
상기 분리된 신균주 MT70646은 전형적인 곰팡이의 특성을 보이는 균주로서 배양학적 특성은 다음과 같다. 포테이토 덱스트로스 아가 배지에서 배양시 균총의 색깔은 초기에는 하얀색으로 자라다가 점점 중앙부분은 엷은 주황색을 띄며, 14일간 배양 후 원형의 균총의 지름은 약 3.5 ㎝ 정도 되었다. 14일 이상 배양시에는 균사가 자란 배지부분은 딱딱하게 되며, 중앙의 오래된 주황색 균총에는 하얀색의 기균사가 형성된다. 현미경 관찰결과, 균사는 두께가 2.0 ∼ 2.5 ㎛인 실모양으로 길게 뻗어 서로 얽혀 있었으며, 이들 수십 가닥의 균사가 각종 크기의 다발을 형성하고, 이들 중 큰 다발들은 서로 그물망 모양으로 연결되어 있다. 작은 크기의 다발에는 각각의 단일 균사가 여러 방향으로 가지를 치고 있었다. 배양액의 색깔은 초기 엷은 노란색에서 배양말기에는 갈색으로 변하였다.
2) 생리학적 특성
MT70646의 성장은 액상배지에서 배양 6일째에 최고치에 도달하며, 신규 화합물의 생산은 5일 배양시 극대화되었다. 생산을 위한 최적 배양온도는 26 ℃이며 pH 6.8에서 배양이 시작되었을 때 3일 후 약산성인 pH 5.5 정도로 떨어졌다가 시간이 경과하면서 서서히 증가되어 배양 종료시 pH 7.5∼8.0로 되었다. 신규 화합물의 생산조건은 통기 1.0 vvm, 교반속도 300 rpm, 온도 26 ℃의 배양조건이 필수적이다.
3) 신균주 미생물 MT70646의 동정 및 명명
신균주 미생물 MT70646의 형태적, 배양학적 및 생리적 특성 등의 균학적 성상을 분석한 결과[표 1 참조], 본 발명에서 분리된 균주는아크레모니움속(Acremoniumsp.)에 속하는 미생물임을 메디칼 임포탄트 펀자이[Medically Important Fungi, 1995, ASM press, Washington D.C.]와 컴펜디움 오브 소일 펀자이[Compendium of Soil Fungi, 1980, Academic Press, London]에서 확인할 수 있었다.
이에, 본 발명에서 분리한 신균주를 아크레모니움속 MT70646으로 명명하고, 1999년 11월 5일자로 대한민국 특허균주 기탁기관인 생명공학연구소내 유전자은행에 기탁하여 수탁번호 KCTC 8973P를 부여 받았다.
[신균주 미생물의 배양]
곰팡이 균주 MT70646(KCTC 8973P)을 배양하기 위해, 통상적으로 미생물이 이용하는 영양원을 함유하는 배지를 준비한다. 즉, 탄소원은 포도당, 과당 등을 사용하며, 질소원으로는 펩톤, 트립톤 등을 사용한다. 기타 필요에 따라서 황산 마그네슘 및 기타 무기염류를 첨가하는 것이 바람직하다. 그리고, 배양방법으로는 23 ∼ 28 ℃의 호기적인 조건하에서의 액침 배양법이 적당하다.
즉, 이를 구체적으로 살펴보면, 종배지 및 생산배지로서 이스트 엑기스(0.3％), 말트 엑기스(0.3％), 펩톤(0.5％), 포도당(2％), 마그네슘 썰페이트·7H2O(0.05％), 포타슘디하이드로겐 포스페이트(0.1％)이 함유된 배지를 사용한다. 1 ℓ의 삼각플라스크에 200 ㎖의 분주한 종배지를 121 ℃에서 20분간 가압멸균한 후, 사면배양한 MT70646(KCTC 8973P) 균주를 백금이로 접종하고 25 ℃에서 3일간 진탕배양하여 배양기의 종배양으로 한다. 10 ℓ의 생산배지를 함유한 15 ℓ 배양기(fermentor)를 121 ℃에서 1시간 가압멸균한 다음 상기의 종배양액 600 ㎖을 접종한 뒤 26 ℃에서 300 rpm의 속도로 교반과 함께 통기하의 호기적 조건에서 7일간 배양한다.
[곰팡이 MT70646(KCTC 8973P)으로부터 생산된 신규화합물의 분리 및 정제]
아크레모니움속 MT70646(KCTC 8973P)의 배양액을 부탄올 용매로 추출하고 수득된 추출액으로부터 감압건조기를 이용하여 감압증발 방법으로 농축한 뒤, 흡착 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 고압 액체 크로마토그래피를 이용하여 분리 정제한 결과, 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물을 얻는다.
이에, 본 발명에서는 편의상 다음 화학식 1로 표시되는 화합물을 다음과 같이 약칭한다: R1=H, R2=(CH2)14CH3, R3=H인 화합물 즉, 다음 화학식 1a로 표시되는 6-[4-카르복시-3-하이드록시-5-메틸-페녹시카르보닐)-3-하이드록시-5-펜타데실-페녹실]-3,4,5-트리하이드록시-테트라하이드로-피란-2-카르복실산을 "CRM646-A"로 약칭한다. 그리고 R1=CH3, R2=(CH2)14CH3, R3=H인 화합물 즉, 다음 화학식 1b로 표시되는 6-[4-카르복시-3-하이드록시-5-메틸-페녹시카르보닐)-3-하이드록시-5-펜타데실-페녹실]-3,4,5-트리하이드록시-테트라하이드로-피란-2-카르복실 메틸 에스터를 "CRM646-B"로 약칭한다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물 각각에 대한 구체적인 구조를 분석한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
상기 화학식 1a로 표시되는 화합물(CRM646-A)은 흰색 분말의 성상을 가지며 메탄올, 에탄올, 부탄올, 디메칠썰프옥사이드(DMSO) 등의 용매에는 잘 녹으나 물, 헥산, 클로로포름 등에는 잘 녹지 않았다. 자외선 분광광도 스펙트럼 분석 결과 214, 260 및 305 ㎚에서 최대 흡수대를 나타내었으며, 고해상도 질량분석(HRFAB-MS) 결과 분자량은 690, 분자식은 C36H50O13으로 확인되었다. 또한, 원적외선(IR) 스펙트럼 분석결과는 다음 표 2에, 양성자(1H)와 탄소(13C) 핵자기 공명 스펙트럼의 분석결과는 다음 표 3과 첨부한 도 1와 2에, 그리고 HMBC 핵자기 공명 스펙트럼 분석결과는 첨부한 도 3에 각각 나타내었다. 그 결과 CRM646-A는 상기 화학식 1a에 나타낸 바와 같은 구조의 신규 화합물임을 확인할 수 있었고, 지금까지 알려진 화합물 중 포스포다이에스테라제에 대해 저해활성을 가지는 TPI-3 및 4와는 분자량과 분자식이 같고 구조적으로 유사하나 CRM646-A의 한쪽 고리에 위치한 메칠기, 그리고 다른 고리에 결합되어 있는 지방족 탄소의 길이와 위치, 당의 종류(글루쿠로닉산(glucuronic acid))에서 차이가 있으므로 구조적으로 확연히 다른 화합물임을 알 수 있었다. 따라서, CRM646-A는 헤파리나제와 헤파라나제 저해 활성을 가지는 신규 생리활성물질임에 틀림이 없다.
또한, 상기 화학식 1b로 표시되는 화합물(CRM646-B)은 상기한 CRM646-A의 유도체로서 고해상도 질량분석 결과 분자량은 704, 분자식은 C37H52O13으로 확인되었다. 기타 물리·화학적 특성은 상기한 CRM646-A와 거의 같다. 그 밖에원적외선(IR) 스펙트럼 분석결과는 다음 표 2에, 그리고 양성자(1H)와 탄소(13C) 핵자기 공명 스펙트럼 분석결과는 다음 표 3과 첨부한 도 4 및 5에 각각 나타내었다. 그 결과, CRM646-A에서는 확인되지 않았던 피크들이 양성자 공명 스펙트럼의 경우 3.66 ppm에서 탄소 공명스펙트럼의 경우 51.95 ppm에서 관찰되었으므로 메톡시(OCH3) 피크가 존재 함을 알 수 있었다. 이는 CRM646-A의 화합물에 존재하는 글루쿠로닉산의 C-6의 카르복실기 말단에 결합된 것을 알 수 있었다. 따라서, CRM646-B는 신규 화합물인 CRM646-A의 변형으로서 이 또한 신규 생리활성물질임에 틀림이 없다.
한편, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물을 유효성분으로 함유하는 헤파리나제 활성 저해제, 헤파라나제 활성 저해제, 암전이 저해제 및 혈관생성 저해제를 포함한다. 즉, 신균주 곰팡이 아크레모니움속 MT70646(KCTC 8973P)으로부터 분리 정제된 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 각각에 대한 헤파리나제와 헤파라나제 저해활성을 갖는 것을 처음으로 알아내고, 이들 각각의 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암활성 약제조성물을 개발하였다.
본 발명에 따른 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 유효성분 이외에도 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 전문가라면 용이하게 알 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 정제, 산제, 과립, 캅셀제, 현탁액, 유화액 또는 비경구 투여용의 단위투여형 또는 수회 투여형 제제로 제형화하여 사용할 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 유효성분의 유효투입량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로 1 내지 100 ㎎／㎏(몸무게)／1일 범위 내에서 투여된다. 그리고, 1일 유효투입량 범위 내에서 하루에 한번 또는 하루에 여러번 나누어 투입한다.
이하 본 발명을 실시예에 의거 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 :신균주 아크레모니윰속 MT70646(KCTC 8973P)의 배양
곰팡이 MT70646의 종배지 및 생산배지로서 이스트 엑기스(0.3％), 말트 엑기스(0.3％), 펩톤(0.5％), 포도당(2％), 마그네슘 썰페이트·7H2O(0.05％), 포타슘디하이드로겐 포스페이트(0.1％)이 함유된 배지를 사용하였다. 종배지 200 ㎖을 함유한 1 ℓ의 삼각플라스크를 121 ℃에서 20분간 가압멸균한 후, 포테이토덱스트로스 또는 와이엠 배지에서 사면배양한 MT70646 균주를 백금이로 접종하고 26 ℃에서 4일간 진탕배양하여 배양기의 종배양으로 하였다. 10 ℓ의 생산배지를 함유한 15 ℓ 배양기(fermentor)를 121 ℃에서 1시간 가압멸균한 다음 상기의 종배양액 200 ㎖을 접종한 뒤 26 ℃에서 300 rpm의 속도로 교반과 함께 1.0 vvm의 통기하의 호기적 조건에서 7일간 배양하였다.
실시예 2: CRM646-A 및 CRM646-B의 분리 및 정제
신균주 아크레모니움속 MT70646(KCTC 8973P)의 배양액에 동량의 아세톤을 첨가하여 3시간 이상 추출한 액을 감압농축한 후 적당한 물에 현탁하고 동량의 부탄올로 세 번에 걸쳐 용매추출하여 CRM646-A와 -B를 포함하는 조추출물을 얻었다. 이 조추출물을 실리카젤에 흡착시켜 실리카젤 칼럼 크로마토그래피를 하였으며 이때, 헤파리나제 활성분획은 클로로포름／메탄올(20／1, v/v)을 혼합용매로 단계적으로 메탄올 농도를 증가시켜 용출시켰다. 용출된 활성분획만을 모아 감압농축한 다음, 60％ 아세토나이트릴을 전개용매로 RP-18 칼럼 크로마토그래피하였다. 활성분획은 재농축하여 소량의 50％ 아세토나이트릴에 녹인 다음 동일용매를 전개용매로 하여 세파덱스(Sephadex) LH-20 칼럼 크로마토그래피하였다. 활성분획만을 모아 농축한 결과 엷은 노란색의 분획을 얻었으며, 이어서 고압 액체 크로마토그래피(칼럼: J'sphere ODS-H80, 용매: 0.05％ 트리플로르아세트산을 포함하는80％ 아세토나이트릴, 유속: 5 ㎖／분, 검출: 210 nm)를 실시하여 체류시간 17 분대의 CRM646-A와 26 분대의 CRM646-B를 순수분리하였고 이들을 각각 감압농축한 결과 백색의 분말을 얻을 수 있었다.
실시예 3: 헤파리나제 저해활성 측정
헤파린 10 ng을 포함하는 완충용액 17 ㎕에 검정할 시료용액 3 ㎕을 넣고 헤파리나제 0.2 유니트(Unit)를 첨가한 다음 상온에서 15 분간 방치한다. 다시 안티쓰롬빈(antithrombin) Ⅲ 용액 25 ㎕을 첨가하고 상온에서 2 분간 반응시킨 후 펙타(factor) Ⅹa 용액 25 ㎕을 첨가하였다. 첨가 1 분 후 펙타 Ⅹa 기질 25 ㎕을 첨가하여 5∼10 분간 반응시키고 빙초산 25 ㎕을 첨가하여 반응을 중지시킨 후 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소 저해율은 다음 수학식 1과 같이 계산하였으며, IC50값은 효소활성의 저해율이 50％에 달하는 저해제의 농도로 결정하였다.
상기 수학식 1에서 :
A는 저해제를 넣지 않은 시료의 반응 후 흡광도를 나타내고, B는 효소액을 넣지 않은 시료의 반응 후 흡광도를 나타내고, C는 저해제를 넣은 시료의 반응 후 흡광도를 나타낸다.
분리된 신규 화합물 CRM646-A와 CRM646-B가 헤파리나제 효소의 활성을 50％ 저해하는 농도(IC50)를 측정한 결과 각각 3 μM과 25 μM로 나타났다. 반면 수라민은 본 실험에서 5 μM로 나타났다. 이때 헤파리나제는 플라보박테리움 헤파리눔(Flavobacterium heparinum)에서 분리된 것을 시그마사(Sigma Co.)로부터 구입하여 사용하였다.
실시예 4: 헤파라나제 저해활성 측정
3중수소(3H)로 표식된 헤파란설페이트 90 pmol을 5mM의 엔아세틸만노사민(N-acetylmannosmine)과 0.1mg의 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하고 있는 0.05M 소디움 아세테이트(Na-acetate) 완충용액(pH 5.1) 17 ㎕에 첨가하고 검정할 시료용액 3 ㎕을 넣고 인간 혈소판유래 헤파라나제 10 ng을 첨가한 다음 37℃에서 30 분간 반응을 시킨다. 반응 후에 위의 반응혼합용액을 에치알쥐-세파로즈 비드(HRG-Sepharose bead)로 충진된 컬럼에 통과시켜 헤파라나제에 의해 분해된 헤파란설페이트 만을 용출시켜서 방사능도(radioactivity)를 측정한다. 시료의 효소 저해율은 다음 수학식 2와 같이 계산하였으며, IC50값은 효소활성의 저해율이 50％에 달하는 저해제의 농도로 결정하였다.
상기 수학식 2에서 :
A는 저해제를 넣지 않은 시료의 반응 후 방사능도를 나타내고, B는 효소액을 넣지 않은 시료의 반응 후 방사능도를 나타내고, C는 저해제를 넣은 시료의 반응 후 방사능도를 나타낸다.
분리된 신규 화합물 CRM646-A와 CRM646-B가 헤파리나제 효소의 활성을 50％ 저해하는 농도(IC50)를 측정한 결과 두화합물 모두 10 μM로 나타났다.
실시예 5: 합성 기저막을 통한 B16 멜라노마세포의 전이(암세포 침투) 저해활성 측정
바이오코트 챔버(Biocoat chamber)를 무혈청 배지로 30분간 부풀린 다음 에치티 1080 배지(HT 1080 conditioned medium) 600 ㎕가 들어있는 각 웰(well)에 챔버를 넣고 0.5%의 알부민(BSA)이 첨가된 디엠이엠(DMEM) 배지에 멜라노마세포를 4.5 ×103의 농도로 하여 450 ㎕씩 넣었다. 여기에 50 ㎕의 시료용액을 넣고 37 ℃에서 22 ∼ 24 시간을 배양한 후 메탄올로 세포를 고정화 시키고 5% 염색시약(crystal violet)으로 세포를 염색하여 기저막을 통과한 세포의 수를 현미경으로 관찰하였다.
상기 표 4에서 보는 바와 같이 CRM646-A는 비교적 약한 활성을 나타냈으나 CRM646-B는 IC50값이 약 2 ㎍/㎖ 정도로 추정되며 10 ㎍/㎖의 농도에서는 거의 완벽한 저해활성을 보임을 알 수 있다.
실시예 6 :신혈관생성 저해활성 측정
마트리겔(Matrigel)을 얼음위에서 녹인후 40 ㎕씩을 차가운 96웰 배양기의 각 웰에 넣고 37 ℃에서 30분간 방치하여 마트리겔을 고형화 시키고 인간 태정맥내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cell)인 HUVEC를 180 ㎕에 2 ×104되게하여 고형화된 마트리겔의 각 웰에 넣어 37 ℃의 CO2배양기에서 18시간 배양한 후 신혈관 생성도를 관찰하였다.
상기 표 5에서 보는 바와 같이 CRM646-B는 CRM646-A보다 강력하게 혈관신생억제능을 가졌으며 10 ㎍/㎖의 농도에서 약 60 % 저해도를 보였다.
실시예 7: 독성 실험
본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물에 대한 독성을 알아보기 위하여, 신규 화합물을 300 ㎎/kg 용량으로 14일간 10마리의 생쥐에게 복강내 투여하여 행동의 이상유무 및 생존여부를 확인하였다. 그 결과, 300 ㎎/kg을 투여한 생쥐의 경우 투여기간 중 특별한 행동이상은 관찰되지 않았으며 최종일까지 모두 생존하였다. 또한, 행동 관찰상 약물을 투여하지 않았던 생쥐와 비교하여 통계학상의 유의성 있는 차이를 보이지 않았다. 이상의 결과를 고려할 때, 본 발명의 신규 화합물들이 처리된 생쥐에서의 독성용량은 300 mg/kg 이상으로 판단된다.
실시예 8: 정제의 제조
유효성분 10 g
락토스 70 g
결정성 셀룰로오스 15 g
마그네슘 스테아레이트 5 g
총 량 100 g
상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합한 후 직타법(direct tableting method)에 의해 정제를 제조하였다. 각 정제의 총량은 100 ㎎ 이었고, 그 중 유효성분의 함량은 10 ㎎ 이었다.
실시예 9: 분말제의 제조
유효성분 10 g
옥수수 전분 50 g
카르복시 셀룰로오스 40 g
총 량 100 g
상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합하여 분말을 제조하였다. 5 번 경질 캡슐에 분말 100 ㎎을 넣어 캡슐제를 제조하였다.
실시예 10: 주사제의 제조
유효성분 1 g
염화나트륨 0.6 g
아스코르브산 0.1 g
주사용 물 적량
총 량 100 ㎖
상기와 같은 조성으로 100 ㎖ 용액을 얻었다. 이 용액은 유효성분 10 ㎎을 함유하고 있으며, 이 용액을 앰플에 넣고 20 ℃에서 30분동안 가열 멸균하였다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 신균주 아크레모니움속 MT70646(KCTC 8973P)으로부터 분리정제된 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물은 헤파리나제 또는 헤파라나제의 활성을 저해하는 작용 우수하다.
따라서, 신균주 아크레모니움속 MT70646(KCTC 8973P)으로부터 분리정제된 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물을 유효성분으로 하는 조성물은 헤파리나제 활성 저해, 헤파라나제 활성저해, 암전이 저해 및 혈관생성 저해에 매우 유효하다.

Claims (8)

  1. 항암활성 물질을 생산하는 것임을 특징으로 하는 아크레모니움속 MT70646(KCTC 8973P).
  2. 다음 화학식 1로 표시되는 것임을 특징으로 하는 화합물.
    화학식 1
    상기 화학식 1에서 : R1은 수소원자, 할로겐원자, 또는 C1∼C6알킬기를 나타내고; R2는 C1∼C20알킬기를 나타내고; R3은 수소원자, 할로겐원자, 또는 C1∼C6알킬기를 나타낸다.
  3. 제 2 항에 있어서, 다음 화학식 1a로 표시되는 것임으로 특징으로 하는 화합물.
    화학식 1a
  4. 제 2 항에 있어서, 다음 화학식 1b로 표시되는 것임으로 특징으로 하는 화합물.
    화학식 1b
  5. 다음 화학식 1로 표시되는 화합물이 유효성분으로 함유된 것임을 특징으로 하는 헤파리나제 활성저해제.
    화학식 1
    상기 화학식 1에서 : R1은 수소원자, 할로겐원자, 또는 C1∼C6알킬기를 나타내고; R2는 C1∼C20알킬기를 나타내고; R3은 수소원자, 할로겐원자, 또는 C1∼C6알킬기를 나타낸다.
  6. 다음 화학식 1로 표시되는 화합물이 유효성분으로 함유된 것임을 특징으로 하는 헤파라나제 활성저해제.
    화학식 1
    상기 화학식 1에서 : R1은 수소원자, 할로겐원자, 또는 C1∼C6알킬기를 나타내고; R2는 C1∼C20알킬기를 나타내고; R3은 수소원자, 할로겐원자, 또는 C1∼C6알킬기를 나타낸다.
  7. 다음 화학식 1로 표시되는 화합물이 유효성분으로 함유된 것임을 특징으로 하는 암전이 저해제.
    화학식 1
    상기 화학식 1에서 : R1은 수소원자, 할로겐원자, 또는 C1∼C6알킬기를 나타내고; R2는 C1∼C20알킬기를 나타내고; R3은 수소원자, 할로겐원자, 또는 C1∼C6알킬기를 나타낸다.
  8. 다음 화학식 1로 표시되는 화합물이 유효성분으로 함유된 것임을 특징으로 하는 혈관생성 저해제.
    화학식 1
    상기 화학식 1에서 : R1은 수소원자, 할로겐원자, 또는 C1∼C6알킬기를 나타내고; R2는 C1∼C20알킬기를 나타내고; R3은 수소원자, 할로겐원자, 또는 C1∼C6알킬기를 나타낸다.
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