KR100675252B1

KR100675252B1 - 신규 7,8-디히드로-잔테논-8-카르복실산 유도체 및 이를생산하는 신규 미생물

Info

Publication number: KR100675252B1
Application number: KR1020000011563A
Authority: KR
Inventors: 이정준; 이정형; 김항섭; 홍영수; 박윤주
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2000-03-08
Filing date: 2000-03-08
Publication date: 2007-02-08
Also published as: WO2001066783A1; KR20010087681A; US6770671B2; US20030073735A1; AU4122901A

Abstract

본 발명은 신규 7,8-디히드로-잔테논-8-카르복실산 유도체, 이를 생산하는 신규 미생물, 상기 미생물을 이용하여 상기 유도체를 제조하는 방법 및 상기 유도체를 유효 성분으로 하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 하기 화학식 1로 표시되는 7,8-디히드로-1,7-디히드록시-3-히드록시메틸-잔테논-8-카르복실산 메틸에스테르는 신규 화합물로서 토양에서 분리된 신규 아스페르질러스속 미생물 Y80118로부터 생산되며, 본 발명에 의한 상기 화합물은 신생 혈관 형성 인자인 VEGF (vascular endothelial growth factor)의 활성을 저해하는 효과가 우수할 뿐만 아니라 동물 실험에서도 우수한 항암 효과를 나타내므로 암, 류마티스, 당뇨병성 망막증 등과 같은 혈관 신생과 관련된 질환 (angiogenic disease)의 예방제 또는 치료제로 사용될 수 있다.

Description

신규 7,8-디히드로-잔테논-8-카르복실산 유도체 및 이를 생산하는 신규 미생물 {Novel 7,8-dihydro-xanthenone-8-carboxylic acid derivative and novel microbe making the same}

도 1 은 혈관 신생 인자에 의해 유도되는 HUVEC의 세포 증식을 ACRL-B4 (본 발명에 의한 화학식 1의 화합물)가 억제하는 효과를 나타낸 그래프이고,

도 2 는 ACRL-B4가 루이스 폐암 (Lewis lung carcinoma)의 성장을 억제하는 효과를 나타낸 그래프이고,

도 3 은 ACRL-B4가 흑색종 (melanoma)의 성장을 억제하는 효과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 신규 7,8-디히드로-잔테논-8-카르복실산 유도체, 이를 생산하는 신규 미생물, 상기 미생물을 이용하여 상기 유도체를 제조하는 방법 및 상기 유도체를 유효 성분으로 하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

암은 전인류가 극복해야 할 난치병 중 하나로서, 현재 여러 가지 항암제가 개발되어 임상적으로 사용되고 있으나 기존의 항암제들은 비선택적이기 때문에 심각한 부작용을 유발할 뿐만 아니라 암세포의 이종성 (heterogeneity) 및 유전적 불안정성 (genetic instability)으로 인해 내성 세포가 출현하는 문제점이 있다. 또한 기존의 항암제는 대부분 고형암 치료에 적합하지 않다. 따라서 최근의 진보된 암세포 생물학을 이용하여 상기와 같은 문제점을 해결하려는 노력이 세계적으로 활발히 진행되고 있으며, 그 중의 하나가 혈관 신생 저해를 통해 암을 치료하고자 하는 것이다.

고형암은 그 크기가 약 1∼2 mm³일 때까지는 성장에 필요한 성장 인자 (growth factor), 산소 및 영양분을 확산 (diffusion)에 의해 공급받을 수 있으나 그 이상 성장하기 위해서는 새로운 혈관 형성을 통해서 공급받아야 한다. 즉, 암의 성장 및 전이에 필수 불가결한 혈관 신생을 차단함으로써 암의 성장을 효과적으로 막을 수 있는 것이다.

지금까지 여러 각도로 혈관 신생 (angiogenesis 또는 neovascularization)에 대한 연구가 진행되어 온 결과, VEGF (vascular endothelial growth factor), bFGF (basic fibroblast growth factor), HGF (hepatocyte growth factor), EGF (epithelial growth factor), 앤지오포이에틴 (angiopoietin) 등의 혈관 신생 인자 들과 FGFR (fibroblast growth factor receptor), Flk-1/KDR, Flt-1, Flt-3, Tie-1, Tie-2/Tek, Eph 등과 같은 티로신 키나제 (tyrosine kinase) 활성을 갖는 혈관 신생 인자들의 수용체 (receptor)들, 또한 앤지오스태틴 (angiostatin)이나 엔도스태틴 (endostatin)과 같은 내인성 혈관 신생 저해제 등이 발견되어 혈관 신생의 기전은 물론 혈관 신생과 인간의 질병과의 관련성이 점차 밝혀지고 있으며, 또한 혈관 신생을 조절할 수 있는 여러 가지 새로운 방법들이 제시되고 있다.

특히 혈관 신생 인자 중 VEGF는 많은 암에서 암의 진행 정도, 암의 치료율 등과 밀접한 상관 관계를 보이고 있으며 그 수용체인 Flk-1/KDR가 혈관 내피 세포에 매우 특이적으로 발현되어 있어 VEGF는 선택적인 혈관 신생 저해제 개발을 위한 목표로 주목받고 있다.

암과 혈관 형성과의 관계는 1971년 미국의 포크만 박사에 의해 제기된 암의 성장에 신생 혈관 형성이 필수적이라는 가설로 최초로 보고되었고 (J. Folkman, Tumor Angiogenesis: Therapeutic Implications. New England Journal of Medicine, 285, 1182-1186, 1971), 1990년 천연물로부터 얻은 푸마질린 (fumagillin)이 선택적인 혈관 신생 저해 효과를 나타내는 것이 보고된 이후 혈관 신생 저해제가 암의 치료제로서 주목을 받기 시작했다 (D. Ingber, T. Fujita, et al. Synthetic analogues of fumagillin that inhibit angiogenesis and suppress tumor growth. Nature, 348, 555-557, 1990). 또한 최근에 발견된 앤지오스태틴 (angiostatin) (M. S. O'Reilly, L. Holmgren, Y. Shing, C. Chen, R. A. Rosenthal, M. Moses, W. S. Lane, Y. Cao, E. H. Sago and J. Forkman., Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis Lung Carcinoma, Cell, 79, 315-328, 1994), 엔도스태틴 (endostatin) (M. S. O'Reilly, T. Boehm, C. Chen, et al., Endostatin: an endogeneous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell, 88, 277-285, 1997) 등의 내인성 혈관 신생 저해제가 실험 동물 모델에서 항암제로서의 우수한 효능을 갖는 것이 입증되어 혈관 신생 저해제의 항암제로서의 이용에 더욱 많은 관심이 집중되고 있다.

더욱이 혈관 신생 저해제를 항암제로서 이용할 경우 기존의 항암제보다 나은 장점이 있는데, 혈관 신생은 암의 성장이나 전이에 필수적인 현상이므로 암의 성장과 전이를 동시에 차단할 수 있고, 혈관 신생 저해제는 비배체 (aneuploid)인 암세포가 아닌 정상 2배체 (diploid)인 혈관 내피 세포를 표적으로 하기 때문에 암세포의 이종성 및 유전적 불안정성으로 인한 내성 등의 문제점이 일어나지 않는다. 또한 혈관 신생 저해제는 기존의 항암제가 특정 또는 몇몇 종류의 암에만 효능을 나타냈던 것과는 달리 혈관 형성이 필수 불가결한 모든 종류의 암에 효능을 나타내며, 혈관 신생은 정상 성인에게는 몇몇 특별한 경우, 즉 상처의 치유, 여성의 생리 등을 제외하고는 매우 드문 현상으로 알려져 있으므로 혈관 신생 저해제를 항암제로 사용할 경우 기존의 항암제에서 볼 수 있는 부작용이 크게 감소할 것이다.

또한 혈관 신생은 암의 성장과 전이 (metastasis) 뿐만 아니라, 류마티스 (Rheumatoid arthritis), 당뇨병성 망막증 (diabetic retinopathy) 등과 같은 소위 혈관 증식에 관련된 병 (angiogenic disease)를 유발시키는 것으로 알려져 있기 때문에, 혈관 신생 저해제는 암 외에도 다른 종류의 혈관 증식에 관련된 병을 치료 및 예방하는데 유용할 것으로 기대된다.

이에 본 발명자들은 새로운 혈관 신생 억제제를 찾고자 노력하던 중, 토양에서 신규 아스페르질러스속 미생물 Y80118을 분리하고 이 미생물로부터 신규 7,8-디히드로-잔테논-8-카르복실산 유도체를 얻어내었으며, 상기 유도체의 혈관 신생 저해 효과 및 항암 효과가 우수하다는 것을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규 7,8-디히드로-잔테논-8-카르복실산 유도체, 이를 생산하는 신규 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 상기 7,8-디히드로-잔테논-8-카르복실산 유도체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 7,8-디히드로-잔테논-8-카르복실산 유도체를 VEGF 활성 저해제 및 혈관 신생과 관련된 질환 (angiogenic disease)의 예방제 또는 치료제로 사용하는 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 하기 화학식 1로 표시되는 7,8-디히드로-1,7-디히드록시-3-히드록시메틸-잔테논-8-카르복실산 메틸에스테르 (7,8-dihydro-1,7-dihydroxy-3-hydroxymethyl-xanthenone-8-carboxylic acid methylester, 이하 'ACRL-B4'라 약칭함)를 제공한다.

화학식 1

또한 본 발명에서는 신규 아스페르질러스속 미생물 Y80118 (Aspergillus sp. Y80118, 수탁번호 : KCTC 0737BP)을 제공한다.

또한 본 발명에서는 상기 미생물을 이용하여 ACRL-B4를 제조하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명에서는 상기 ACRL-B4를 유효 성분으로 함유하는 VEGF (vascular endothelial growth factor) 활성 저해제를 제공한다.

또한 본 발명에서는 상기 ACRL-B4를 유효 성분으로 함유하는, 혈관 신생과 관련된 질환 (angiogenic disease)의 예방제 또는 치료제용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

HUVEC (human umbillical vein endothelial cell)는 VEGF, bFGF 등의 혈관 신생 인자들에 반응하여 증식하게 되는데, 새로운 혈관 신생 저해제를 미생물의 2차 대사 산물로부터 개발하기 위하여 이러한 HUVEC의 성질, 즉 VEGF에 의해 유도되는 HUVEC의 증식을 지표로 하여 본 발명자들은 여러 가지 미생물로부터 새로운 활성 물질들을 분리 정제하였다.

그 중 본 발명자들은 토양으로부터 곰팡이의 특성을 나타내는 아스페르질러스속 균주 Y80118을 분리하고 동정한 결과, 형태적 특성은 아스페르질러스 디플렉투스 펜넬 및 라페르 1955 (Aspergillus deflectus Fennell and Raper 1955) 균주의 것과 유사하기는 하나 신규 7,8-디히드로-잔테논-8-카르복실산 유도체인 ACRL- B4를 생산하는 특성과 차펙 효모 추출물 한천 배지 (Czapek yeast extract agar)에서 황갈색의 삼출액을 다량 분비하는 특성에 의해 서로 다른 균주임을 확인하였다. 따라서 신규 미생물인 상기 아스페르질러스속 균주 Y80118를 생명공학연구소 유전자은행에 2000년 2월 18일자로 기탁하고, 기탁번호 KCTC 0737BP를 부여받았다.

상기 언급한 HUVEC의 성질, 즉 VEGF에 의해 유도되는 HUVEC의 증식을 지표로 하여 신규 아스페르질러스속 균주 Y80118로부터 새로운 활성 물질을 분리 정제하고 기기 분석을 통해 그 구조를 분석한 결과, 상기 화학식 1의 구조를 갖는 신규 화합물 7,8-디히드로-1,7-디히드록시-3-히드록시메틸-잔테논-8-카르복실산 메틸에스테르 (ACRL-B4)를 얻었다.

구체적으로 ACRL-B4는 상기 아스페르질러스속 미생물 Y80118을 배양하여 균사체를 파괴하고 유기 용매로 추출한 후 통상의 크로마토그래피에 의해 정제 및 분 리하여 제조된다.

이 때 아스페르질러스속 미생물 Y80118은 통상의 배지에서 통상의 조건으로 배양될 수 있다. 균사체를 파괴한 배양액은 농축한 후 통상의 방법에 의해 유기 용매로 추출할 수 있다. 상기 추출물은 다시 통상의 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 활성 분획을 얻고, 이 활성 분획에 대해 HPLC (High Performance Liquid Chromatography)를 실시하여 정제된 ACRL-B4를 얻을 수 있다.

한 예시로서 상기 아스페르질러스속 미생물 Y80118로부터 ACRL-B4를 얻는 방법을 설명하면 다음과 같다.

아스페르질러스속 Y80118 균주 배양액에 아세톤을 가해 균사체를 파괴한 후 배양액을 농축한다. 농축된 배양액을 에틸아세테이트로 추출하여 에틸아세테이트 추출물을 얻고 이 추출물을 디클로로메탄과 메탄올의 혼합 용매를 사용한 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 활성 분획을 얻는다. 이 활성 분획에 대해 물과 메탄올의 혼합 용매를 사용한 HPLC를 실시하여 ACRL-B4를 얻는다.

한편 본 발명에 의한 신규 화합물 ACRL-B4는 하기 화학식 2 또는 하기 화학식 3으로 표시되는 광학 이성질체의 분리된 형태일 수 있고 그의 라세믹 혼합물일 수도 있으며, 광학 이성질체의 분리된 형태 및 그 라세믹 혼합물은 모두 본 발명에 포함된다.

본 발명에 의한 신규 화합물 ACRL-B4는 사이도위닌 A (sydowinin A) (Hamasaki et al., Agr. Biol. Chem. 39: 2337-2340, 2341-2345, 1975)와 최근에 평활근 미오신 경쇄 키나제 (smooth muscle myosin light chain kinase)의 저해제 연구 결과로 보고된 사이도위닌 B (sydowinin B) (Nakanishi et al., J. Antibiotics, 46: 1775-1781, 1993)와 유사한 화학 구조를 갖고 있다. 특히 사이도위닌 B와 같이 보고된 MS-347a는 사이도위닌 B의 1번과 2번 위치의 탄소 이중 결합이 에폭사이드 (epoxide) 결합으로 이루어진 화합물로서, 평활근 미오신 경쇄 키나제의 저해 활성이 강력하고 단백질 키나제 C (protein kinase C)의 저해 활성도 우수하다는 보고 (Nakanishi et al., J. Antibiotics, 46: 1775-1781, 1993)를 참고해 볼 때, 신규 화합물 ACRL-B4도 키나제 저해 활성이 있을 것으로 예상되고, 특 히 혈관내피세포성장인자인 VEGF의 수용체인 KDR의 단백질 티로신 키나제 (protein tyrosine kinase)의 활성을 저해하는 작용이 있을 것으로 예상된다.

혈관 신생 인자에 의한 HUVEC 증식에 관한 시험관 내 실험 결과, ACRL-B4는 특히 VEGF에 의해 유도되는 HUVEC의 증식을 특이적으로 저해하는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에서는 ACRL-B4를 유효 성분으로 함유하는 VEGF 활성 저해제를 제공한다.

또한 계란의 수정란을 이용한 융모요막 분석 (chorioallantoic membrane assay: CAM assay) 결과, ACRL-B4는 1 ㎍/egg의 투여량에서도 71% 이상의 혈관 형성을 저해하는 활성을 나타내는 등 혈관 신생을 억제하는 효과가 우수하다.

따라서 본 발명에서는 ACRL-B4를 유효 성분으로 함유하는, 혈관 신생과 관련된 질환 (angiogenic disease)의 예방제 또는 치료제용 약학적 조성물을 제공한다.

이 때 상기 혈관 신생과 관련된 질환은 혈관 신생이 병리 기전에 중요한 역할을 하는 각종 질환을 의미하며, 특히 암, 류마티스, 당뇨병성 망막증 등을 포함한다.

C57BL/6 마우스에서 유래한 루이스 폐암 (Lewis lung carcinoma) 3LL 세포주 및 흑색종 (melanoma) B16-BL6 세포주를 이식한 마우스에 대한 동물 실험 결과에서, ACRL-B4는 우수한 항암 효과를 나타내었으며 체중 감소 등의 부작용도 나타내지 않는 것을 확인하였다.

또한 본 발명에 의한 신규 화합물 ACRL-B4는 상기 언급한 바와 같이 혈관 신생 인자들의 활성을 억제하고 혈관 신생을 저해하므로, 새로운 혈관 신생 저해 활성을 갖는 물질을 합성하기 위한 선도 물질 (lead compound)로 유용하게 사용될 수 있다.

ACRL-B4는 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

또한 안트라사이클린 화합물, 택솔, 에토포사이드, 캠프토태신, 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 메토트랙세이트, 백금 착화합물 등의 항암제와 병용 사용하여 기존 항암제의 독성을 줄이고 치료 효과를 증강시킬 수 있다. 또한 비스테로이드성 관절염 치료제나 기존의 당뇨병성 망막증 치료제와 병용할 수 있다.

즉, 본 발명에 의한 ACRL-B4는 실제 임상투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 화학식 1의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들 면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 화합물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

ACRL-B4의 유효 용량은 1∼50 mg/kg 이고, 바람직하기로는 5∼30 mg/kg 이며, 하루 1∼3회 투여될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다.

단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 신규 아스페르질러스속 미생물 Y80118의 분리 및 동정

대한민국 충청남도 유성 지역의 야산에서 채취한 토양을 증류수로 세척하여 상등액을 몰트 익스트렉트 한천 배지 (Malt extract agar)에 도말하고 10일간 배 양하였을 때 녹회색 (greenish grey) 균총을 형성하면서 자라나는 미생물을 Y80118로 명명하였다.

분리된 균주 Y80118은 아스페르질러스속 곰팡이의 특성을 보였으며, 2% 맥아 추출물 한천 배지 (Malt Extract Agar)에서 10일간 배양한 경우 25℃에서는 1.4∼1.9 cm, 37℃에서는 2.0∼2.6 cm 크기의 콜로니를 형성하면서 성장하였다. 콜로니의 전면은 엷은 녹회색이었고 후면은 황갈색이었으며 삼출액은 없었다. 차펙 효모 추출물 한천 배지 (Czapek yeast extract agar)에서 10일간 배양한 경우 25℃에서는 1.4∼2.2 cm, 37℃에서는 2.8∼3.0 cm 크기의 콜로니를 형성하면서 성장하였다. 이 때 콜로니 전면은 회백색이었고 후면의 중앙은 적갈색, 가장자리는 황갈색이었으며 황갈색의 삼출액을 다량 분비하는 특성을 보였다.

상기 균주의 분생자 (conidia)는 구형이고 직경은 2.4∼2.8μm 이었다. 분생자 표면은 초기에는 매끈하였고 투명하였으나 포자기 성숙한 후에는 약간 불규칙하고 거칠었으며 적갈색을 나타내었다.

상기와 같은 형태적 특성은 아스페르질러스 디플렉투스 펜넬 및 라페르 1955 (Aspergillus deflectus Fennell and Raper 1955) 균주와 유사하기는 하나 아스페르질러스속 균주 곰팡이의 변종으로 판단되었으며, 분명히 새로운 균주임을 확인하였다. 따라서 분리된 아스페르질러스속 균주 Y80118를 생명공학연구소 유전자은행에 2000년 2월 18일자로 기탁하고, 기탁번호 KCTC 0737BP를 부여받았다.

<실시예 2> 신규 화합물 ACRL-B4의 제조

상기 실시예 1에서 얻은 아스페르질러스속 Y80118 균주를 2.0% 포도당 (glucose), 0.2% 효모 추출물 (yeast extract), 0.5% 폴리펩톤 (polypeptone), 0.05% MgSO₄ 및 0.1% KH₂PO₄를 함유한 배지 6ℓ에서 28℃로 7일간 배양하고 아세톤 6ℓ를 가해 균사체를 파괴하였다. 균사체를 파괴한 배양액을 농축한 후 에틸아세테이트로 추출하여 에틸아세테이트 추출물을 얻었다.

상기 에틸아세테이트 추출물을 디클로로메탄과 메탄올의 20:1 (부피비) 혼합 용매를 사용한 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 활성 분획을 얻었다. 이 활성 분획에 대해 HPLC (사용 용매 : 메탄올 : 물 = 30:70 (부피비))를 실시하여 HUVEC 증식 억제 활성이 강력한 화합물을 정제해 650 mg의 ACRL-B4를 얻었다.

<실시예 3> 신규 화합물 ACRL-B4의 구조 분석

상기 실시예 2에서 얻은 화합물에 대한 NMR (Nuclear Magnetic Resonance) 결과를 하기 표 1에 나타내었으며, MS (Mass Spectroscopy), 자외선-가시광선 분광법 등에 의한 상기 화합물의 물리화학적 성질은 다음과 같다.

mp 166-168 ℃

UV λmax (MeOH) : 208, 271, 343 nm

EIMS m/z : 318 (M⁺)

ACBL-B4의 수소 및 탄소 핵자기 공명 분석 결과

위치	ACRL-B4
위치	δH	δC
1		161.5
2	6.78 (br,s)	109.7
3		152.5
4	7.01 (br,s)	105.7
4a		157.1
5	6.52 (d, J=9.9)	123.2
6	6.66 (dd, J=9.9,4.8)	140.6
7	4.71 (dd, J=4.8,3.6)	65.8
8	4.15 (d, J=3.6)	46.2
8a		111.6
9		182.5
9a		110.4
10a		160.8
11	4.67(s)	64.3
12		172.8
13	3.70(s)	53.2

상기 분석에 의해, 실시예 1에서 얻은 아스페르질러스속 Y80118 균주로부터 얻어진 화합물은 신규 7,8-디히드로-잔테논-8-카르복실산 유도체인 상기 화학식 1로 표시되는 7,8-디히드로-1,7-디히드록시-3-히드록시메틸-잔테논-8-카르복실산 메틸에스테르인 것으로 밝혀졌다.

<실험예 1> VEGF에 유도되는 HUVEC의 증식에 대한 ACRL-B4의 저해 작용

내피 세포 (endothelial cell)는 VEGF, bFGF 등의 혈관 신생 인자들에 반응하는데, 이 과정은 혈관 형성 과정의 초기 단계로서 일단 혈관 신생 인자에 의해 자극된 혈관 내피 세포는 복잡한 세포내 반응을 거쳐 세포의 증식, 분화를 통해 혈관 신생을 유도한다. 따라서 혈관 신생 인자 중 암으로의 혈관 신생과 가장 밀접 히 관련된 것으로 알려진 VEGF에 의해 유도되는 혈관 내피 세포의 증식은 혈관 형성 저해 활성을 검색할 수 있는 좋은 모델이므로, 하기 실험을 통해 ACRL-B4가 VEGF에 의해 유도되는 혈관 내피 세포 증식을 억제하는지 조사하였다.

M199 배지 [20% FBS, 3 ng/㎖ bFGF, 100 ㎍/㎖ 헤파린 (heparin 함유)]로 배양한 HUVEC (human umbellical vein endothelial cell)를 젤라틴 (gelatin)으로 피복된 96-웰 플레이트에 10⁴ 세포수/웰의 농도로 넣고 24시간 동안 무혈청 조건으로 배양 (serum starvation)하였다. 배양 후 각각의 웰에 VEGF와 bFGF를 20 ng/㎖ 씩 넣고 48시간 동안 두어 세포 증식을 자극한 후 상기 혈관 신생 인자에 의해 유도되는 세포의 증식을 산성 인산염 분해효소 분석 (acid phosphatase assay)에 의해 정량하였다. 실험군 웰에는 상기 혈관 신생 인자를 처리할 때 상기 실시예 3을 통해 아스페르질러스속 Y80118 균주로부터 분리한 여러 화합물들 (ACRL-B4 포함)을 각각 여러 농도로 처리하였다. 대조군 웰에는 혈관 신생 인자만을 처리하였다.

ACRL-B4를 각각 0.004, 0.02, 0.08, 0.4, 2, 10 ㎍/㎖ 농도로 처리한 경우의 세포 증식률 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, ACRL-B4는 혈관 신생 인자에 의해 유도되는 HUVEC의 세포 증식을 억제하였다. 특히 ACRL-B4는 VEGF에 의해 유도되는 세포 증식을 특이적으로 억제하는 것으로 나타났다.

이와 같이 본 발명에 의한 ACRL-B4는 VEGF에 의해 유도되는 세포 증식을 특이적으로 억제하므로 혈관 신생과 관련된 질환의 치료 및 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

<실험예 2> 생체 내 신생 혈관 형성 저해 효과

신규 화합물 ACRL-B4가 시험관 내 (in vivo)에서도 신생 혈관 형성을 저해하는지 알아보기 위하여, 계란의 수정란을 이용한 융모요막 분석 (chorioallantoic membrane assay: CAM assay)을 실시하였다.

90%의 습도가 유지되는 37℃ 배양기에서 계란의 수정란을 3일 동안 성장시킨 후, 구멍을 내고 18-게이지 피하 주사 바늘을 이용하여 알부민 2 ㎖를 뽑아냈다. 수정란이 4일 배가 되었을 때 원형의 창을 내어 융모요막의 바깥막을 벗겨내었고, 4.5일 배가 되었을 때 ACRL-B4 농도가 각각 1, 5 ㎍/CAM이 되도록 써마녹스 (thermanox) 커버 유리에 ACRL-B4 에탄올 용액을 도포하고 에탄올 용매를 날려 보냈다. 이 커버 유리를 직경 3∼5 ㎚인 발생 중의 배 (embryo) 융모요막 위에 얹어 37℃에서 2일간 더 배양하고 10% 지방 유탁액 (fat emulsion)을 주사하여 혈관형성 억제 여부를 해부 현미경으로 관찰하였다. 이 때 항혈관신생 효과 (anti-angiogenic response)는 커버 유리 아래의 무혈관 영역 (avascular zone)을 관찰하여 조사하였다.

대조군으로는 커버 유리만을 융모요막에 부착시킨 것 (음성 대조군)과 혈관신생 억제 효과가 있다고 알려진 레티놀산 (retinoic acid)을 1 ㎍/CAM 처리한 후 3일 더 배양한 것 (양성 대조군)을 사용하였다. 실험 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

ACRL-B4의 생체 내 혈관 신생 저해 효과

화합물	농도 (㎍/egg)	CAM assay에 사용한 계란수	혈관 형성 저해된 계란수	저해율(%)
음성 대조군	-	20	3	15.0
양성 대조군 (레티논산)	1	8	6	75
ACRL-B4	1	14	10	71.4
ACRL-B4	5	10	9	90

상기 표 2에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 의한 신규화합물 ACRL-B4는 1㎍/CAM에서 71%, 5 ㎍/CAM에서는 90%의 혈관 신생 억제 효과를 나타내었으며, 양성 대조군에 사용된 레티논산에 버금가는 혈관 신생 억제 효과가 있는 것으로 나타났다.

<실험예 3> 항암 효과 실험 1

C57BL/6 마우스에서 유래한 루이스 폐암 (Lewis lung carcinoma) 3LL 세포주를 이용하여, ACRL-B4의 항암 효과를 조사하였다.

4∼5주령의 C57BL/6 생쥐 (mouse)의 등 뒤에 3LL 암세포 (생명공학연구소 유전자원센터)를 10⁶개 피하 이식한 후 암의 크기가 100∼250 mm³로 성장했을 때 무작위적으로 생쥐를 섞어 그룹 당 6마리 씩 총 4개의 그룹으로 나누어 약물 투여를 시작하였다. 그룹 1은 용매만 주사하였고, 그룹 2는 30 mg/kg의 ACRL-B4, 그룹 3은 15 mg/kg의 ACRL-B4, 그룹 4는 5 mg/kg의 ACRL-B4을 이틀에 한번 복강 주사하고 암의 크기 및 체중을 측정하였다. 시험 화합물은 85% 생리식염수, 5% DMSO (dimethylsulfoxide), 10% 크레모포 (cremophore)의 혼합 용매에 녹여 주사하였다.

암의 크기는 하기 수학식 1에 의해 계산하였으며, 암세포 이식 후로부터의 암세포 크기 변화를 도 2에 나타내었다.

암의 크기 (mm3) = {장축의 길이(mm)} × {단축의 길이(mm)}2 / 2

ACRL-B4는 루이스 폐암 3LL 세포주를 이식한 C57BL/6 마우스에서 체중 감소 등의 독성을 나타내지 않았다. 또한 도 2에서 볼 수 있듯이, ACRL-B4는 루이스 폐암의 성장을 농도 의존적으로 저해하였으며, 구체적으로 투여량 30 mg/kg에서는 약 80%, 15 mg/kg에서는 약 60%, 5 mg/kg에서는 40%의 암세포 성장 저해율을 나타내었다.

<실험예 4> 항암 효과 실험 2

C57BL/6 마우스에서 유래한 흑색종 (melanoma) B16-BL6 세포주를 이용하여, ACRL-B4의 항암 효과를 조사하였다.

4∼5주령의 C57BL/6 생쥐 (mouse)의 등 뒤에 B16-BL6 암세포 (생명공학연구소 유전자원센터)를 10⁶개 피하 이식한 후 암의 크기가 100∼250 mm³로 성장했을 때 무작위적으로 생쥐를 섞어 그룹 당 6마리 씩 총 4개의 그룹으로 나누어 약물 투여를 시작하였다. 그룹 1은 용매만 주사하였고, 그룹 2는 30 mg/kg의 ACRL-B4, 그룹 3은 15 mg/kg의 ACRL-B4, 그룹 4는 5 mg/kg의 ACRL-B4을 이틀에 한번 복강 주사하고 암의 크기 및 체중을 측정하였다. 시험 화합물은 85% 생리식염수, 5% DMSO, 10% 크레모포의 혼합 용매에 녹여 주사하였다.

암의 크기는 상기 수학식 1에 의해 계산하였으며, 암세포 이식 후로부터의 암세포 크기 변화를 도 3에 나타내었다.

ACRL-B4는 흑색종 B16-BL6 세포주를 이식한 C57BL/6 마우스에서 체중 감소 등의 독성을 나타내지 않았다. 또한 도 3에서 볼 수 있듯이, ACRL-B4는 농도 의존적으로 B16/BL6 흑생종의 성장을 저해하였으며, 구체적으로 화합물 투여량 30 mg/kg에서는 약 65%, 15 mg/kg에서는 약 50%, 5 mg/kg에서는 40%의 암세포 성장 저해율을 나타내었다.

<실험예 5> 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

ACRL-B4의 급성 독성을 알아보기 위하여, 6주령의 특정병원부재 (SPF) SD계 랫트를 사용해 하기와 같은 급성 독성 실험을 실시하였다.

랫트 3 마리에 ACRL-B4를 0.5% 메틸셀룰로스 용액에 현탁하여 500mg/㎏/15㎖의 용량으로 단회 경구 투여하였다. ACRL-B4 투여 후 동물의 폐사 여부, 임상 증상 및 체중 변화 등을 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며 부검하여 육안으로 복강 장기와 흉강 장기의 이상 여부를 관찰하였다. 시험 결과, 시험 물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상 증상은 없었고 폐사된 동물도 없었으며, 또한 체중 변화, 혈액 검사, 혈액생화학 검사, 부검 소견 등에서도 독성에 의한 변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 ACRL-B4는 랫트에서 500 mg/㎏까지 독성 변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소 치사량 (LD₅₀)은 500 mg/㎏ 이상인 안전한 물질인 것으로 판단되었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 신규 화합물 ACRL-B4는 혈관 신생을 억제하는 효과가 우수하고 부작용도 적을 뿐만 아니라 동물 실험에서도 우수한 항암 효과를 나타내므로, 암, 류마티스, 당뇨병성 망막증 등과 같은 혈관 신생과 관련된 질환을 예방 및 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 7,8-디히드로-1,7-디히드록시-3-히드록시메틸-잔테논-8-카르복실산 메틸에스테르 (7,8-dihydro-1,7-dihydroxy-3-hydroxymethyl- xanthenone-8-carboxylic acid methylester, 명세서 내 'ACRL-B4'라 명명된 화합물로서 이하 'ACRL-B4'라 약칭함).

화학식 1
제 1항의 ACRL-B4를 생산하는 신규 아스페르질러스속 미생물 Y80118 (Aspergillus sp. Y80118, 수탁번호 : KCTC 0737BP).
제 1 항의 ACRL-B4를 유효 성분으로 함유하는 VEGF 활성 저해제.
제 1 항의 ACRL-B4를 유효 성분으로 함유하는, 혈관 신생과 관련된 질환 (angiogenic disease)의 예방제 또는 치료제용 약학적 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 혈관 신생과 관련된 질환은 암, 류마티스 또는 당뇨병성 망막증 (diabetic retinopathy)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.