CN103467479B

CN103467479B - 螺环化合物、其组合物、其制备方法和用途

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Publication number: CN103467479B
Application number: CN201310190518.1A
Authority: CN
Inventors: 崔承彬; 房士明; 李长伟; 王楠; 吴长景
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date: 2013-05-22
Filing date: 2013-05-22
Publication date: 2016-06-08
Anticipated expiration: 2033-05-22
Also published as: CN103467479A

Abstract

本发明属于医药化工领域，涉及螺环化合物、其组合物、其制备方法和用途。具体地，涉及式I化合物或其药学上可接受的盐，其结构特征是，螺环六元环上有两个环氧乙烷片段和同时连有一个氧取代基和一个碳取代基的sp³杂化碳，与螺环五元环相连的脂肪酸侧链上有一个双键。本发明还涉及用于制备式I化合物的产紫青霉。经实验证实，该类化合物可用于制备细胞骨架蛋白抑制剂、细胞凋亡诱导剂、肿瘤细胞增殖抑制剂、肿瘤细胞杀伤剂、或抗肿瘤药物。本发明的化合物具有良好的抗肿瘤活性。

Description

螺环化合物、其组合物、其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药化工领域，涉及1-氧杂螺[4,5]癸烷类螺环化合物，本发明还涉及包含所述1-氧杂螺[4,5]癸烷类螺环化合物的组合物以及1-氧杂螺[4,5]癸烷类螺环化合物的制备方法和用途。

背景技术

肿瘤（Tumor）是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。一般将肿瘤分为良性和恶性两大类。所有的恶性肿瘤总称为癌症（cancer）。

螺环化合物结构类型非常丰富。仅螺[4,5]癸烷类化合物，就可因螺环骨架上不同位置的一处或多处被氧、氮、硫等杂原子取代而形成很多种不同结构类型。具有1-氧杂螺[4,5]癸烷骨架结构的螺环化合物迄今已知的已有一些，但在该类螺环骨架的环己烷环上具有两个环氧乙烷结构片段的已知化合物却并不很多。其中，环己烷的6,7位和9,10位分别为环氧乙烷片段、碳8位为酮羰基或为sp³杂化的氧取代碳原子，其五元螺环上的碳2位为内酯羰基或半缩醛碳的已知1-氧杂螺[4,5]癸烷类化合物更是为数有限。文献1（H.W.Fehlhaberetal,Structureofaranorosin,anewantibioticofanovelskeletaltype,J.Am.Chem.Soc.,1988,110(24):8242-8244）、文献2（H.-W.Fehlhaberetal,Aranorosin,anovelantibioticfromPseudoarachniotusroseus,II.Structureelucidation,J.Antibiot.,1988,XLI(12):1785-1794）和文献3（F.Koizumi,etal,EI-2128-1,anovelinterleukin-1βconvertingenzymeinhibitorproducedbyPenicilliumsp.E-2128,J.Antibiot.,2003,56(11):891-898）记述了四个该类碳8位为酮羰基、碳2位为内酯羰基或半缩醛碳、碳3位连有携带两个支链甲基的不饱和十二碳脂肪酰胺取代基的螺环化合物。该类部分化合物具有抗菌活性（参见上述文献1、文献2、文献3和文献4[K.Roy,etal,Aranorosin,anovelantibioticfromPseudoarachniotusroseusI.Taxonomy,fermentation,isolation,chemicalandbiologicalproperties,J.Antibiot.,1988,XLI(12):1780-1784]），有些还具有对白介素-1β转换酶活性的选择性抑制作用和抑制脂多糖（LPS）诱导THP-1细胞分泌成熟的白介素-1β转换酶的作用（参见上述文献3）。文献5（K.Roy,etal,AranorosinolAandaranorosinolB,twonewmetabolitesfromPseudoarachniotusroseus:Production,isolation,structureelucidationandbiologicalproperties,J.Antibiot.,1992,45(10):1592-1598）则记述了五个碳8为连有氧取代基的sp³杂化碳、碳2为内酯羰基或半缩醛碳、碳3位连有携带两个支链甲基的不饱和十二碳脂肪酰胺取代基的该类螺环化合物，其中碳8上同时连有碳-碳相连取代基的仅3个化合物。目前已知该类两个化合物具有弱的抗细菌和抗真菌活性（参见上述文献5）。

发明内容

本发明人通过创造性的劳动和不懈的努力，成功获得了2株突变型产紫青霉（Penicilliumpurpurogenum）BD-1-3和3-f-31菌株，并从其发酵产物中发现了下述式I所示的1-氧杂螺[4,5]癸烷类化合物：

式I

其中，

螺环骨架上的阿拉伯数字表示相应标位，其显著的结构特征在于，构成螺环骨架的环己烷碳6,7位和9,10位分别为环氧乙烷片段、其sp³杂化的碳8上同时连有一个氧取代基和一个通过碳-碳化学键相连的取代基，并且在与氮原子相连的脂肪酸侧链上具有一个双键。

其中，

R₁-R₄各自独立地代表氢、羟基、取代或未取代的以下基团：C_1-10直链或支链饱和或不饱和的烃基、C_1-10直链或支链饱和或不饱和的烃氧基、C_2-18直链或支链饱和或不饱和的脂肪酰基或芳香酰基、或C_2-18直链或支链饱和或不饱和的脂肪酰氧基或芳香酰氧基，其中R₃可以取向α或β。

本发明人还惊奇地发现，所述的式I化合物能够有效地杀伤多种肿瘤细胞或者抑制多种肿瘤细胞的增殖，具有良好的抗肿瘤活性，故而具备作为抗肿瘤抗癌药物的很好潜力。

由此提供了下述发明：

本发明的第一方面涉及式I化合物，或其药学上可接受的盐，

式I

其中，

螺环骨架上的阿拉伯数字表示相应标位，R₁-R₄各自独立地代表氢、羟基、取代或未取代的以下基团：C_1-10（例如C_1-6、C_1-8）直链或支链饱和或不饱和的烃基、C_1-10（例如C_1-6、C_1-8）直链或支链饱和或不饱和的烃氧基、C_2-18（例如C_2-6、C_2-10、C_7-8、C_7-12）直链或支链饱和或不饱和的脂肪酰基或芳香酰基、或C_2-18（例如C_2-6、C_2-10、C_7-8、C_7-12）直链或支链饱和或不饱和的脂肪酰氧基或芳香酰氧基，

所述取代基选自羟基、卤素（例如氟、氯、溴、碘）、硝基、苄氧基，所述取代基的个数为1-3个（例如1个、2个、3个），

其中R₃可以取向α或β。

在本发明中，所述式I化合物在溶液状态下，当R₃为羟基时，以下面用式II所示的互变异构体IIa和IIb平衡共存的形式存在：

式II

其中，螺环骨架上的阿拉伯数字表示相应标位。

在本发明中，所述的C_1-10直链或支链饱和或不饱和的烃基为甲基、乙基、C₃直链或支链烷基、C₄直链或支链烷基、C₅直链或支链烷基、C₆直链或支链烷基、C₇直链或支链烷基、C₈直链或支链烷基、C₉直链或支链烷基、或C₁₀直链或支链烷基等烷烃基，或为乙烯基、C₃直链或支链烯烃基、C₄直链或支链烯烃基、C₅直链或支链烯烃基、C₆直链或支链烯烃基、C₇直链或支链烯烃基、C₈直链或支链烯烃基、C₉直链或支链烯烃基、或C₁₀直链或支链烯烃基等烯烃基，或为乙炔基、C₃炔烃基、C₄直链或支链炔烃基、C₅直链或支链炔烃基、C₆直链或支链炔烃基、C₇直链或支链炔烃基、C₈直链或支链炔烃基、C₉直链或支链炔烃基、或C₁₀直链或支链炔烃基等炔烃基，或为苯基、取代苯基、苄基、取代苄基、C₈直链或支链芳烃基、C₉直链或支链芳烃基、或C₁₀直链或支链芳烃基等芳香烃基。

在本发明中，所述的C_1-10直链或支链饱和或不饱和的烃氧基为甲氧基、乙氧基、C₃直链或支链烷氧基、C₄直链或支链烷氧基、C₅直链或支链烷氧基、C₆直链或支链烷氧基、C₇直链或支链烷氧基、C₈直链或支链烷氧基、C₉直链或支链烷氧基、或C₁₀直链或支链烷氧基等烷烃氧基，或为乙烯烃氧基、C₃直链或支链烯烃氧基、C₄直链或支链烯烃氧基、C₅直链或支链烯烃氧基、C₆直链或支链烯烃氧基、C₇直链或支链烯烃氧基、C₈直链或支链烯烃氧基、C₉直链或支链烯烃氧基、或C₁₀直链或支链烯烃氧基等烯烃氧基，或为乙炔烃氧基、C₃炔烃氧基、C₄直链或支链炔烃氧基、C₅直链或支链炔烃氧基、C₆直链或支链炔烃氧基、C₇直链或支链炔烃氧基、C₈直链或支链炔烃氧基、C₉直链或支链炔烃氧基、或C₁₀直链或支链炔烃氧基等炔烃氧基，或为苯氧基、取代苯氧基、苄氧基、取代苄氧基、C₈直链或支链芳烃氧基、C₉直链或支链芳烃氧基、或C₁₀直链或支链芳烃氧基等芳香烃氧基。

在本发明中，所述的C_2-18直链或支链饱和或不饱和的脂肪酰基或芳香酰基为甲酰基、乙酰基、丙酰基、丙烯酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、琥珀酰基、辛烷酰基、癸烷酰基、王浆酰基、月桂酰基、3-羟基月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、油酰基、或亚油酰基等脂肪酰基，或为苯甲酰基、取代苯甲酰基、苯乙酰基、取代苯乙酰基、2位被直链或支链C_2-8烃基取代的苯乙酰基、苯丙酰基、2位被直链或支链C_2-7取代的苯丙酰基、3位被直链或支链C_2-7烃基取代的苯丙酰基、2位和3位同时被直链或支链C_2-6烃基取代的苯丙酰基、苯丁酰基、2位被直链或支链C_2-6烃基取代的苯丁酰基、3位被直链或支链C_2-6烃基取代的苯丁酰基、4位被直链或支链C_2-6烃基取代的苯丁酰基、2位和3位或2位和4位或3位和4位同时被直链或支链C_2-5烃基取代的苯丁酰基、或2位至4位同时被直链或支链C_2-4烃基取代的苯丁酰基等芳香酰基。

在本发明中，所述的C_2-18直链或支链饱和或不饱和的脂肪酰氧基或芳香酰氧基为甲酰氧基、乙酰氧基、丙酰氧基、丙烯酰氧基、丁酰氧基、异丁酰氧基、戊酰氧基、异戊酰氧基、琥珀酰氧基、辛烷酰氧基、癸烷酰氧基、王浆酰氧基、月桂酰氧基、3-羟基月桂酰氧基、肉豆蔻酰氧基、棕榈酰氧基、硬脂酰氧基、油酰氧基、或亚油酰氧基等脂肪酰氧基，或为苯甲酰氧基、取代苯甲酰氧基、苯乙酰氧基、取代苯乙酰氧基、2位被直链或支链C_2-8烃基取代的苯乙酰氧基、苯丙酰氧基、2位被直链或支链C_2-7烃基取代的苯丙酰氧基、3位被直链或支链C_2-7烃基取代的苯丙酰氧基、2位和3位同时被直链或支链C_2-6烃基取代的苯丙酰氧基、苯丁酰氧基、2位被直链或支链C_2-6烃基取代的苯丁酰氧基、3位被直链或支链C_2-6烃基取代的苯丁酰氧基、4位被直链或支链C_2-6烃基取代的苯丁酰氧基、2位和3位或2位和4位或3位和4位同时被直链或支链C_2-5烃基取代的苯丁酰氧基、或2位至4位同时被直链或支链C_2-4烃基取代的苯丁酰氧基等芳香酰氧基。

根据本发明第一方面所述的式I化合物，或其药学上可接受的盐，其中，

R₁代表取代或未取代的C_1-10（例如C_1-6、C_1-8）直链或支链烷基，优选1-(2-甲基)辛烷基；

R₂和R₄各自独立地代表氢、取代或未取代的以下基团：C_2-18（例如C_2-6、C_2-10、C_7-8、C_7-12）直链或支链饱和或不饱和脂肪酰基或芳香酰基（例如苯甲酰基）；

R₃代表α或β取向的羟基、取代或未取代的以下基团：C_1-10（例如C_1-6、C_1-8）直链或支链烷氧基、或C_2-18（例如C_2-6、C_2-10、C_7-8、C_7-12）直链或支链饱和或不饱和的脂肪酰氧基或芳香酰氧基（例如苯甲酰氧基）；

所述取代基选自羟基、卤素（例如氟、氯、溴、碘）、硝基、苄氧基，所述取代基的个数为1-3个（例如1个、2个、3个）。

根据本发明第一方面所述的式I化合物，或其药学上可接受的盐，其中,

R₁代表1-(2-甲基)辛烷基；

R₂和R₄各自独立地代表氢、乙酰基、苯甲酰基、对硝基苯甲酰基、对氯苯甲酰基、对氟苯甲酰基、没食子酰基、或三苄基没食子酰基；

R₃代表α或β取向的羟基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧基、苯甲酰氧基、对硝基苯甲酰氧基、对氯苯甲酰氧基、对氟苯甲酰氧基、没食子酰氧基、或三苄基没食子酰氧基。

本发明的再一方面涉及产紫青霉BD-1-3，其保藏编号为CGMCCNo.4284，保藏日期为2010年11月1日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

该菌株是将从天津塘沽驴驹河渤海湾潮间带海泥样品中分离并经分类学研究鉴定为产紫青霉（Penicilliumpurpurogenum）的青霉菌属真菌野生株产紫青霉G59经硫酸二乙酯诱变所获得的突变株BD-1-3。其具有如下微生物菌物学特征：

划线接种在PDA平板培养基上28°C培养3－5天后，从平板正面观察，可见到已生长形成的略偏灰色的浅灰浅青色菌落，从平板反面观察，可见到渗透培养基底部的橘黄略带红色或粉紫色的色素；

菌落在查氏培养基上25°C培养12天直径达17-30mm，平坦、近于平坦或有几道同心环纹；质地绒状或兼絮状；分生孢子面暗灰绿色或暗绿色，近于橄榄柠檬色、褐橄榄色、或微暗橄榄绿色；菌丝体橘黄色、黄色或橙红色；反面暗红色、橘红色或紫红色；分生孢子梗发生于基质，发生气生菌丝者少，孢梗茎(70-)100-250(-300)×2.5-3.2(-3.5)μm，壁平滑，顶端通常膨大；帚状枝双轮生，偶有三轮生或单轮生，彼此紧贴而近于平行；梗基每轮4-8个，9.0-13(-14)×2.5-3.0μm；瓶梗每轮4-6个，9.5-13×(1.8-)2.0-2.4μm，披针形，梗茎明显；分生孢子呈椭圆形，充分成熟时部分呈近球形，2.8-3.5(-4.0)×2.2-3.0μm，壁平滑或稍粗糙；分生孢子链较疏松，叉开或近于圆柱形。

本发明的还一方面涉及产紫青霉3-f-31，其保藏编号为CGMCCNo.7286，保藏日期为2013年3月7日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

该菌株是将从天津塘沽驴驹河渤海湾潮间带海泥样品中分离并经分类学研究鉴定为产紫青霉（Penicilliumpurpurogenum）的青霉菌属真菌野生株产紫青霉G59经50%(v/v)DMSO中5mg/ml新霉素抗性筛选所获得的产紫青霉G59的新霉素抗性突变株3-f-31。其具有如下微生物菌物学特征：

划线接种在PDA平板培养基上28°C培养3－5天后，从平板正面观察，可见到已生长形成的略偏青色的浅灰浅青色菌落，菌落菌体色泽与上述的产紫青霉BD-1-3相比更偏青色、有明显差异，从平板反面观察，可见到渗透培养基底部的橘红略带黄色的色素；

本发明的再一方面涉及化合物1的制备方法，包括如下步骤：

将本发明的产紫青霉BD-1-3或3-f-31进行发酵培养，获得含有化合物1的发酵物，将发酵物进行分离纯化，得到化合物1；其中所述化合物1为本发明第一方面所述的式I化合物，其中，R₁代表1-(2-甲基)辛烷基，R₂和R₄代表氢，R₃代表羟基。

具体地，所述分离纯化包括利用本领域技术人员熟知的天然产物分离纯化的常规方法，如液液萃取、柱层析、薄层层析、高效液相层析及重结晶等。

也可以使用青霉菌属的其它能够产生化合物1的生产菌株进行发酵培养。

在本发明的一个实施方案中，所述的制备方法，包括如下步骤：

1）将上述的产紫青霉进行发酵培养，获得发酵液；

2）将发酵液过滤，得到滤液和菌体；

3）将步骤2）中得到的滤液用乙酸乙酯萃取，得到滤液的乙酸乙酯萃取物；

4）将步骤2）中得到的菌体悬浮于50％－95％（v/v）的丙酮水溶液中，超声破碎菌体细胞，室温浸提过滤，滤液经减压浓缩至不含丙酮后用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取物；

5）将步骤3）和4）中得到的乙酸乙酯萃取物合并后减压浓缩至干，得到乙酸乙酯总浸膏；

6）将乙酸乙酯总浸膏直接用氯仿-甲醇体积比为1:1的混合溶剂溶解，或者将乙酸乙酯总浸膏经大量甲醇溶解所得甲醇可溶部分用二氯甲烷-甲醇体积比为1:2的混合溶剂溶解，用100-200目硅胶柱分离，以石油醚-氯仿-甲醇溶剂系统或者石油醚-二氯甲烷-丙酮-甲醇溶剂系统为洗脱剂进行减压梯度洗脱，得到含有所述化合物的粗组分，再经对所得粗组分的两次SephadexLH-20柱层析（均用氯仿-甲醇体积比1:1混合溶剂洗脱）和一次100-200目硅胶柱层析（用氯仿-丙酮溶剂系统梯度洗脱）分离，或者一次SephadexLH-20柱层析（用体积分数95%的乙醇洗脱）和一次反相硅胶ODS柱层析（用水-甲醇-丙酮溶剂系统梯度洗脱）分离，得到所含主要成分为所述化合物的柱层析组分；

7）将含有所述化合物的柱层析组分用反相HPLC（C18柱，甲醇-水体积分数80:20洗脱）分离精制，制得所述化合物。

在本发明的一个实施方案中，所述的制备方法，其中，步骤4）中的丙酮水溶液为丙酮占70％－90％（v/v）的丙酮水溶液；具体地，为丙酮占75％－85％（v/v）的丙酮水溶液，例如丙酮占75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、或85％（v/v）的丙酮水溶液。

在本发明的一个实施方案中，所述的制备方法，其中，步骤4）中的丙酮水溶液为丙酮占55％－75％（v/v）的丙酮水溶液；具体地，为丙酮占60％－70％（v/v）的丙酮水溶液，例如丙酮占60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、或70％（v/v）的丙酮水溶液。

本发明的还一方面涉及上述的产紫青霉在制备本发明的式I化合物中的用途；具体地，涉及保藏编号为CGMCCNo.4284的产紫青霉BD-1-3和保藏编号为CGMCCNo.7286的产紫青霉3-f-31在制备本发明的式I化合物中的用途。

本发明的还一方面涉及化合物1的衍生物的制备方法，包括如下步骤：

将本发明上述的式I中R₁为1-(2-甲基)辛烷基、R₂和R₄分别为氢、R₃为羟基的化合物1分别与醇、酸、酸酐、或酰氯等试剂进行衍生化反应，将反应产物进行分离纯化，得到所述的化合物；

具体地，所述分离纯化包括利用本领域技术人员熟知的分离纯化的常规方法，如柱层析、薄层层析、高效液相层析及重结晶等。

1）将上述的式I中R₁为1-(2-甲基)辛烷基、R₂和R₄分别为氢、R₃为羟基的化合物1用甲醇、乙醇、丙酮、或无水吡啶溶解；

2）在室温避光和加盐酸催化或不加盐酸催化的条件下，分别与溶液中的甲醇或乙醇、或与新添加的醋酐、没食子酸、三苄基没食子酰氯、苯甲酰氯、p-硝基苯甲酰氯、p-氯苯甲酰氯、或p-氟苯甲酰氯进行衍生化反应1－48h或3－10天；

3）将反应产物用制备硅胶薄层层析（氯仿-甲醇体积比80:20－99:1的混合溶剂作为展开剂）分离纯化，制得所述的化合物。

本发明的另一方面涉及一种组合物，其含有本发明第一方面的式I化合物或其药学上可接受的盐，任选地，还含有一种或多种药用载体或赋形剂。具体地，所述组合物为药物组合物。所述组合物或药物组合物能够用于抗肿瘤或抑制肿瘤细胞增殖或杀伤肿瘤细胞。

本发明的还一方面涉及本发明第一方面的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备细胞骨架蛋白抑制剂、细胞凋亡诱导剂、肿瘤细胞增殖抑制剂、或肿瘤细胞杀伤剂中的用途；进一步地，所述肿瘤细胞为白血病细胞或来源于上皮的癌细胞（例如为宫颈癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、或结肠癌细胞）；更进一步地，所述白血病细胞为慢性髓性白血病细胞或急性早幼粒细胞白血病细胞。

在本发明的实施方案中，所述肿瘤细胞为人慢性髓性白血病K562细胞、人急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞、人子宫颈癌HeLa细胞、人胃癌BGC-823细胞、或人乳腺癌MCF-7细胞。。

这些试剂可作为生物分子探针在肿瘤分子生物学等生命科学相关实验中使用。

本发明的再一方面涉及本发明第一方面的式I化合物或其药学上可接受的盐、或者本发明所述的组合物在制备杀伤肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞增殖的药物或试剂中的用途；进一步地，所述肿瘤细胞为白血病细胞或来源于上皮的癌细胞（例如为宫颈癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、或结肠癌细胞）；更进一步地，所述白血病细胞为慢性髓性白血病细胞或急性早幼粒细胞白血病细胞。

在本发明的实施方案中，所述肿瘤细胞为人慢性髓性白血病K562细胞、人急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞、人子宫颈癌HeLa细胞、人胃癌BGC-823细胞、或人乳腺癌MCF-7细胞。

本发明的再一方面涉及一种在体内或体外杀伤肿瘤细胞或者抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括使用有效量的本发明第一方面的式I化合物或其药学上可接受的盐、或者本发明任一项所述的组合物的步骤；进一步地，所述肿瘤细胞为白血病细胞或来源于上皮的癌细胞（例如为宫颈癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、或结肠癌细胞）；更进一步地，所述白血病细胞为慢性髓性白血病细胞或急性早幼粒细胞白血病细胞。

本发明的再一方面涉及本发明第一方面的式I化合物或其药学上可接受的盐、或者本发明任一项所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途；例如，所述肿瘤为白血病或来源于上皮的癌（例如宫颈癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、或结肠癌）；进一步地，所述白血病为慢性髓细胞性白血病、急性早幼粒细胞白血病。

本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防和/或辅助治疗肿瘤的方法，包括给予受试者有效量的本发明第一方面的式I化合物或其药学上可接受的盐、或者本发明任一项所述的组合物的步骤；所述肿瘤为白血病或来源于上皮的癌（例如宫颈癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、或结肠癌）；进一步地，所述白血病为慢性髓性白血病、急性早幼粒细胞白血病。

本发明采用MTT法，测试了所述的式I化合物对人慢性髓性白血病K562细胞、人早幼粒白血病HL-60细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人胃癌BGC-823细胞的抑制作用。并经实验证实，本发明的式I化合物可显著抑制上述各种人癌细胞的（体外）增殖，因而具有抗肿瘤作用。

本发明的式I化合物可与各种药物上可接受的载体、赋形剂或辅料配伍制成抗肿瘤药物，用于肿瘤的治疗。

本发明化合物可单独或以药物组合物的形式给药。给药途径可以是口服、非肠道或局部给药。药物组合物可根据给药途径配成各种适宜的剂型。

本发明化合物的药物组合物可以以下面的任意方式施用：口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，局部用药，非肠道用药，如皮下，静脉，肌内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中优选口服、腹膜内或静脉内给药方式。

当口服用药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊制剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。

当皮肤局部施用时，本发明化合物可制成适当的软膏、洗剂或霜剂制剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、吐温60、十六烷酯蜡、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。

本发明化合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液或无菌注射溶液。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。

另外需要指出，本发明化合物使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。优选的使用剂量介于0.01－100mg/kg体重/天。

本发明中，

术语“药学上可接受的盐”是指药用无机或有机盐。本发明式I中具有碱性基团的化合物可以与无机酸形成药用盐，例如硫酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐；也可与有机酸形成药用盐，例如乙酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、葡萄糖酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、马来酸盐等。本发明式I中具有酸性基团的化合物可以与碱金属或碱土金属形成药用盐，优选但不限于钠盐、钾盐、镁盐或钙盐。

术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。

术语“受试者”可以指患者或者其它接受式I化合物或者本发明任一项所述的药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。

术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。

发明的有益效果

本发明的式I化合物能够有效地杀伤肿瘤细胞或者抑制肿瘤细胞的增殖，具有良好的抗肿瘤活性，故而具备作为抗肿瘤药物的潜力。

涉及保藏的生物材料

产紫青霉BD-1-3已于2010年11月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏编号为CGMCCNo.4284；分类命名为产紫青霉（Penicilliumpurpurogenum）。

产紫青霉3-f-31已于2013年3月7日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏编号为CGMCCNo.7286；分类命名为产紫青霉（Penicilliumpurpurogenum）。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。

在下面的实施例中，

以下称为化合物1的本发明化合物具有如下结构：式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=R₄=H，R₃=OH；

式I

其中，阿拉伯数字表示标位；R₁的辛烷基自与碳4'相连的碳原子开始依次标位5'→12'，其2-甲基则标位14'。

其在溶液状态下，以下面所示的2,3位顺式异构体1a和2,3位反式异构体1b平衡共存的形式存在：

其中，1a和1b在氯仿溶液中的比例约为5.5:1，在甲醇溶液中的比例约为1.8:1。

在下面的实施例中，

以下称为化合物2a的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=R₄=H，R₃=α-OCH₃；以下称为化合物2b的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=R₄=H，R₃=β-OCH₃；以下称为化合物3a的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=R₄=H，R₃=α-OCH₂CH₃；以下称为化合物3b的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=R₄=H，R₃=β-OCH₂CH₃；以下称为化合物4a的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=R₄=H，R₃=α-OCOCH₃；以下称为化合物4b的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=R₄=H，R₃=β-OCOCH₃；以下称为化合物5a的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=H，R₃=α-OCOCH₃，R₄=-COCH₃；以下称为化合物5b的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=H，R₃=β-OCOCH₃，R₄=-COCH₃；以下称为化合物6a的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=R₄=-COCH₃，R₃=α-OCOCH₃；以下称为化合物6b的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=R₄=-COCH₃，R₃=β-OCOCH₃；以下称为化合物7a的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=R₄=H，R₃=α-没食子酰氧基；以下称为化合物7b的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=R₄=H，R₃=β-没食子酰氧基；以下称为化合物8a的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=H，R₃=α-三苄基没食子酰氧基，R₄=三苄基没食子酰基；以下称为化合物8b的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=H，R₃=β-三苄基没食子酰氧基，R₄=三苄基没食子酰基；以下称为化合物9a的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=H，R₃=α-苯甲酰氧基，R₄=苯甲酰基；以下称为化合物9b的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=H，R₃=β-苯甲酰氧基，R₄=苯甲酰基；以下称为化合物9c的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=R₄=苯甲酰基，R₃=β-苯甲酰氧基；以下称为化合物10a的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=H，R₃=α-对硝基苯甲酰氧基，R₄=对硝基苯甲酰基；以下称为化合物10b的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=H，R₃=β-对硝基苯甲酰氧基，R₄=对硝基苯甲酰基；以下称为化合物10c的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=R₄=对硝基苯甲酰基，R₃=β-对硝基苯甲酰氧基；以下称为化合物11a的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=H，R₃=α-对氯苯甲酰氧基，R₄=对氯苯甲酰基；以下称为化合物11b的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=H，R₃=β-对氯苯甲酰氧基，R₄=对氯苯甲酰基；以下称为化合物11c的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=R₄=对氯苯甲酰基，R₃=β-对氯苯甲酰氧基；以下称为化合物12a的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=H，R₃=α-对氟苯甲酰氧基，R₄=对氟苯甲酰基；以下称为化合物12b的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=H，R₃=β-对氟苯甲酰氧基，R₄=对氟苯甲酰基；以下称为化合物12c的本发明化合物具有如下结构：所述的式I化合物，其中，R₁=1-(2-甲基)辛烷基，R₂=R₄=对氟苯甲酰基，R₃=β-对氟苯甲酰氧基。

在下面的实施例中，

熔点用北京天地宇科技有限责任公司X-4型精密显微熔点测定仪测定，温度未校正。比旋光度用英国OA公司PolAAr3005旋光仪、日本JASCO公司JASCOP2000旋光仪、或美国RudolphResearch公司AutopolII旋光仪测定。正负离子ESI-MS和HR-ESI-MS分别用美国AB公司API3000型液相色谱-质谱联用仪和美国Agilent公司6520Q-TOF质谱仪测定。紫外（UV）光谱用澳大利亚GBC公司Cintra20紫外可见分光光度仪测定，红外（IR）光谱用德国Bruker公司Tensor27型红外光谱仪测定。核磁共振图谱用日本JEOL公司JNM-ECA-400型和美国Varian公司INOVA600型超导核磁共振仪测定。园二色散（CD）光谱用日本JASCO公司JASCOJ-815圆二色谱仪、或法国BiologicScience公司MOS-450圆二色谱仪测定。

在所有实验中使用的全部溶剂均为分析纯级别溶剂，所使用的石油醚沸点范围为60－90°C。

实施例1：产紫青霉BD-1-3的发酵培养与化合物1的分离制备

1.发酵培养与发酵物的提取处理

1）生产菌株

本实施例中用于发酵生产化合物1的产素菌是保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的产紫青霉BD-1-3（PenicilliumpurpurogenumBD-1-3），保藏编号为4284（CGMCCNo.4283）。

2）发酵培养

从4°C冰箱保存的产紫青霉BD-1-3的PDA培养基（组成：葡萄糖2%、琼脂2%、NaCl1.5%，用20％土豆的水煮液配制）试管斜面，用接种环在无菌条件下刮取适量孢子，划线接种到新配制的PDA固体培养基平板上，28°C培养箱中活化培养4天。从活化培养4天的试管斜面，用接种环刮取适量菌体，接种于装有200ml液体发酵培养基（组成：葡萄糖2％、麦芽糖1％、甘露醇2％、谷氨酸1％、蛋白胨0.5％、酵母浸粉0.3％）的1个500ml三角烧瓶中，28°C、200rpm摇床进行一级种子培养48h。将该培养液按5%接种量接种到15个分别装有200ml液体发酵培养基（组成：葡萄糖2％、麦芽糖1％、甘露醇2％、谷氨酸1％、蛋白胨0.5％、酵母浸粉0.3％）的500ml三角烧瓶中，28°C、200rpm摇床进行二级种子培养48h。将该培养液作为种子按5%的接种量接种到分别装有200ml液体发酵培养基（组成：葡萄糖2％、麦芽糖1％、甘露醇2％、谷氨酸1％、蛋白胨0.5％、酵母浸粉0.3％）的200个500ml三角烧瓶中，28°C、200rpm摇床发酵培养12天，得发酵液共约40L。

2.提取处理与乙酸乙酯浸膏的制备

将全部发酵液共约40L用4层纱布过滤，分为滤液和菌体。滤液共约36L直接用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并所得乙酸乙酯萃取液并减压浓缩，得滤液的乙酸乙酯萃取物。菌体用80%（v/v）丙酮水溶液10L充分搅拌悬浮，超声2h破碎菌体，室温浸提12h，经用4层纱布过滤，滤取含水丙酮提取液。对菌体的相同提取操作重复进行共计3次，合并所得含水丙酮提取液，减压浓缩至不含丙酮。残余水层约5L用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并所得乙酸乙酯萃取液并减压浓缩，得菌体的乙酸乙酯萃取物。硅胶薄层层析检测结果显示，滤液和菌体的乙酸乙酯萃取物所含产物斑点基本相同，故将该两部分萃取物合并后减压浓缩至干，得到乙酸乙酯总浸膏40g。该浸膏在100μg/ml浓度下对K562细胞的抑制率为67.8%（抑制率测试方法同实施例4）。

3.乙酸乙酯浸膏的分离与含有目标化合物的柱层析组分制备

将上述乙酸乙酯总浸膏40g用适量氯仿-甲醇（体积比1:1）混合溶剂溶解并加60g硅胶（100-200目）吸附均匀拌样，充分干燥并研磨均匀后添加到装有100-200目硅胶180g的玻璃减压柱（柱床：7.5cm×14cm）上，以石油醚-氯仿-甲醇溶剂系统为洗脱剂，通过依次递增洗脱剂中氯仿或甲醇的体积比增大洗脱剂极性来进行减压梯度洗脱层析分离。根据薄层层析检测结果，收集合并相应洗脱液浓缩，共得13个组分：Fr-1(0.9g，石油醚-氯仿体积比2:1溶剂洗脱组分)、Fr-2(1.3g,石油醚-氯仿体积比1:2溶剂洗脱组分)、Fr-3(9.3g,氯仿洗脱组分)、Fr-4(2.1g,氯仿洗脱组分)、Fr-5(1.6g,氯仿-甲醇体积比99:1溶剂洗脱组分)、Fr-6(2.1g,氯仿-甲醇体积比99:1溶剂洗脱组分)、Fr-7(0.6g,氯仿-甲醇体积比98:2溶剂洗脱组分)、Fr-8(6.2g,氯仿-甲醇体积比97:3溶剂洗脱组分)、Fr-9(3.6g,氯仿-甲醇体积比95:5溶剂洗脱组分)、Fr-10(2.7g,氯仿-甲醇体积比93:7溶剂洗脱组分)、Fr-11(2.6g,氯仿-甲醇体积比9:1溶剂洗脱组分)、Fr-12(3.0g,氯仿-甲醇体积比8:2溶剂洗脱组分)、Fr-13(甲醇洗脱组分)。其中，9个组分Fr-1、Fr-2、Fr-3、Fr-5、Fr-6、Fr-7、Fr-8、Fr-9、Fr-10均示有较强的抗肿瘤活性，各组分在100μg/ml浓度下对K562细胞的抑制率分别为45.7%、41.9%、91.0%、54.9%、90.7%、78.9%、48.6%、54.5%、46.1%。薄层层析检测分析结果显示，其中一个组分Fr-5含有目标化合物1。

将Fr-5（1.6g）用适量氯仿-甲醇体积比1:1混合溶剂溶解，湿法上样，添加到氯仿-甲醇体积比1:1溶剂中预装好的SephadexLH-20柱上（柱床：2.0cm×110cm），以氯仿-甲醇体积比1:1混合溶剂为洗脱剂进行洗脱分离，根据薄层检测结果收集洗脱液合并浓缩，按洗脱先后顺序依次得到7个组分：Fr-5-1(45mg)、Fr-5-2(90mg)、Fr-5-3(481mg)、Fr-5-4(860mg)、Fr-5-5(70mg)、Fr-5-6(20mg)、Fr-5-7(20mg)。其中组分Fr-5-3在100μg/ml浓度下对K562细胞的抑制率高达81.5%，为含有化合物1的目标组分。Fr-5-3（481mg）再用适量氯仿-甲醇体积比1:1混合溶剂溶解，同样湿法上样，添加到氯仿-甲醇体积比1:1溶剂中预装好的SephadexLH-20柱上（柱床：2.0cm×110cm），继续采用氯仿-甲醇体积比1:1混合溶剂为洗脱剂再次进行洗脱层析，收集合并含有化合物1的洗脱液，并经减压浓缩，得到含有较大量目标化合物的层析组分（82mg）。该组分（82mg）用适量甲醇溶解，加200mg硅胶（100-200目）均匀拌样，干燥并研磨均匀后，添加到装有2.2g硅胶（100-200目）的玻璃层析柱上，以氯仿-丙酮溶剂系统为洗脱剂，通过依次递增洗脱剂中丙酮的体积分数增大洗脱剂极性，进行梯度洗脱柱层析分离。根据薄层层析检测结果，收集合并含有化合物1的洗脱液，经减压浓缩干燥，得到所含主要物质为目标化合物1的柱层析组分A（25mg，氯仿-丙酮体积比5:1洗脱组分）。

4.化合物1的HPLC分离制备

将含有化合物1的柱层析组分A（25mg）用适量甲醇溶解，并用0.22μm滤膜过滤后，用Waters600高效液相色谱仪（Waters600控制器、Waters600泵，Waters2998PDA检测器、Empower色谱工作站）进行半制备反相HPLC（HPLC柱：CapcellPakC18，，10mm×250mm；柱温：室温；流动相：甲醇-水体积分数80:20；流速：3ml/min；检测波长：210nm）分离和精制，得化合物1（保留时间t_R=21.3min）纯品21mg。

化合物1为无色块状结晶（甲醇），mp146－148°C，易溶于氯仿、甲醇、乙醇，可溶于丙酮，不溶于水，(c1,甲醇)。正离子ESI-MSm/z:480[M+H]⁺,502[M+Na]⁺,518[M+K]⁺;负离子ESI-MSm/z:524[M+HCOO]^-。正离子HR-ESI-MSm/z:实测值480.2974[M+H]⁺,计算值480.2961(C₂₆H₄₂NO₇[M+H]⁺)；实测值502.2793[M+Na]⁺,计算值502.2781(C₂₆H₄₁NO₇Na[M+Na]⁺)；实测值518.2530[M+K]⁺,计算值518.2520(C₂₆H₄₁NO₇K[M+K]⁺)。UVλ_maxnm(logε)inMeOH:215(4.21)。IRν_maxcm^-1(KBr):3314,2935,2869,1701,1669,1625,1510,1459,1421,1377,1363,1326,1269,1151,1124,1038,986，933,859,735。CDλ_maxnm(mdeg)inMeOHat200μg/ml:190.6(0),192.5(-1.55),194.0(-1.48),196.5(-1.89),204.5(-2.50),208.5(-3.04),215(-2.93),217.5(-2.85),220.5(-2.60),227.5(-1.44),239.5(-0.34),241.7(0),272.1(0),282.5(+0.25),285.0(+0.21),297(+0.25),300.5(+0.21),306.5(+0.21),319.0(+0.40),320.0(+0.40),328.5(+0.36),330.5(+0.37),339.5(+0.47),343.0(+0.51),351.0(+0.61),359.5(+0.40),369.0(+0.37),371.5(+0.33),375.5(+0.30),387.0(+0.44),399.8(0)。¹H及¹³CNMR数据：其CD₃OD中400MHz¹H及100MHz¹³CNMR数据见表1，CDCl₃中600MHz¹H及150MHz¹³CNMR数据见表2。

表1和表2中所示化合物1的NMR数据分别根据其在CD₃OD和CDCl₃中测定的¹H谱、¹³C全去偶谱、DEPT谱、NOE差光谱等一维图谱以及¹H-¹HCOSY、HMQC、HMBC、NOESY等二维图谱解析结果予以归属。其中，HMBC图谱通过设定4、6、8或12Hz碳氢远程偶合常数分别进行多次测定。

化合物1在溶液状态下以2,3位顺式异构体1a和反式异构体1b平衡共存的形式存在。其在CD₃OD和CDCl₃中测定的NMR谱均给出分别与1a和1b相应的两组¹H和¹³C信号(见表1和表2)。由于2位羟基处于游离状态，化合物1的异构体1a和1b实际上是分离不到的，因此化合物1实为1a和1b的平衡共存物。其中，1a根据其H-10与H-2,3和Hβ-4之间、H-3与Hβ-4之间、以及H-6与Hα-4之间的NOE效应确定为2,3顺式异构体；而1b则根据其H-10与H-3和Hβ-4之间、H-3与Hβ-4之间、以及H-6与H-2和Hα-4之间的NOE效应确定为2,3反式异构体。另据部分¹H信号的积分比，测定1a和1b在CDCl₃中的比例约为5.5：1，在CD₃OD中的比例约为1.8：1。

表1化合物1在CD₃OD中的400MHz¹H及100MHz¹³CNMR数据

表2化合物1在CDCl₃中的600MHz¹H及150MHz¹³CNMR数据

实施例2：产紫青霉3-f-31的发酵培养与化合物1的分离制备

1.发酵培养与发酵物的提取处理

1)生产菌株

本实施例中用于发酵生产化合物1的产素菌是保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会音通微生物中心的产紫青霉3-f-31(Penicilliumpurpurogenum3-f-31)，保藏编号为7286(CGMCCNo.7286)。

2)发酵培养

从4℃冰箱保存的产紫青霉3-f-31的PDA培养基(组成：葡萄糖2％、琼脂2％、NaCl1.5％，用20％土豆的水煮液配制)试管斜面，用接种环在无菌条件下刮取适量孢子，划线接种到新配制的PDA固体培养基平板上，28℃培养箱中培养3-5天。待孢子形成，用接种环刮取适量新鲜孢子，置于装有适量无菌水和玻璃珠的50ml锥形瓶中，充分摇动锥形瓶使玻璃珠旋转打匀分散孢子，制得粗制孢子悬液。取该粗制孢子悬液200μl，置于96孔板中，用酶标仪测定600nm下的OD值，并在OD值检测下进行稀释，至OD值达0.5，记录稀释倍数。据此，将全部粗制孢子悬液用无菌水稀释相同倍数，制得接种用3-f-31的孢子悬液。将该孢子悬液按每瓶140μl的接种量，接种到120个分别装有240ml液体发酵培养基(组成：葡萄糖2％、麦芽糖1％、甘露醇2％、谷氨酸1％、蛋白胨0.5％、酵母浸粉0.3％)的500ml三角烧瓶中，28℃、180rpm摇床发酵培养10天，得发酵液共约28.8L。

2.提取处理与乙酸乙酯浸膏的制备

将全部发酵液共约28.8L用4层纱布过滤，分为滤液和菌体。滤液直接用等体积乙酸乙酯萃取4次，合并所得乙酸乙酯萃取液并减压浓缩，得滤液的乙酸乙酯萃取物。菌体加两倍体积的丙酮使丙酮的体积百分数达约67％，充分搅拌悬浮，超声5h破碎菌体，经用4层纱布过滤，滤取含水丙酮提取液。对菌体的相同提取操作重复进行共计4次，合并所得含水丙酮提取液，减压浓缩至不含丙酮。残余水层约4L用等体积乙酸乙酯萃取5次，合并所得乙酸乙酯萃取液并减压浓缩，得菌体的乙酸乙酯萃取物。硅胶薄层层析检测结果显示，滤液和菌体的乙酸乙酯萃取物所含产物斑点基本相同，故将该两部分萃取物合并后减压浓缩至干，得到乙酸乙酯总浸膏29.9g。该浸膏在100μg/ml浓度下对K562细胞的抑制率为78%。

3.乙酸乙酯浸膏的分离与含有目标化合物的柱层析组分制备

将上述乙酸乙酯总浸膏29.9g用大量甲醇充分溶解，再经过滤和浓缩干燥，分为甲醇不溶物6.5g和甲醇可溶物23.4g。其中，甲醇不溶物主要为粘液质类物质和细胞膜破碎残留的部分固形物，对K562细胞无抑制作用，而甲醇可溶物则对K562细胞有很强的抑制作用，在100μg/ml浓度下对K562细胞的抑制率高达82.4%。

将上述甲醇可溶物23.4g用适量二氯甲烷-甲醇体积比1:2混合溶剂溶解并加60g硅胶（100-200目）吸附均匀拌样，充分干燥并研磨均匀后添加到装有100-200目硅胶200g的玻璃减压柱（柱床：6.3cm×16cm）上，以石油醚-二氯甲烷-丙酮-甲醇溶剂系统为洗脱剂，通过依次递增洗脱剂中二氯甲烷、丙酮或甲醇的体积分数增大洗脱剂极性来进行减压梯度洗脱层析分离。洗脱液按每500ml为一个流份，共收集75个流份，再根据硅胶薄层层析检测结果，合并相应流份，减压浓缩至干，共得14个组分：Fr-1(0.11g，石油醚洗脱组分)、Fr-2(1.90g,二氯甲烷洗脱组分)、Fr-3(1.50g,二氯甲烷-甲醇体积比99:1溶剂洗脱组分)、Fr-4(5.45g,二氯甲烷-甲醇体积比99:1→98:2溶剂洗脱组分)、Fr-5(7.28g,二氯甲烷-甲醇体积比98:2→97:3溶剂洗脱组分)、Fr-6(0.99g,二氯甲烷-甲醇体积比97:3→96:4溶剂洗脱组分)、Fr-7(0.90g,二氯甲烷-甲醇体积比96:4→95:5→92:8溶剂洗脱组分)、Fr-8(0.41g,二氯甲烷-甲醇体积比92:8→9:1溶剂洗脱组分)、Fr-9(0.66g,二氯甲烷-甲醇体积比9:1→17:3溶剂洗脱组分)、Fr-10(0.69g,二氯甲烷-甲醇体积比17:3→12:3→7:3溶剂洗脱组分)、Fr-11(0.87g,二氯甲烷-甲醇体积比7:3→1:1溶剂洗脱组分)、Fr-12(1.05g,丙酮→甲醇洗脱组分)、Fr-13(0.05g,甲醇洗脱组分)、Fr-14(1.10g,甲醇洗脱组分)。其中，8个组分Fr-3、Fr-4、Fr-5、Fr-6、Fr-7、Fr-8、Fr-9、Fr-10、Fr-11、Fr-12示有不同程度的抗肿瘤活性，在100μg/ml浓度下对K562细胞的抑制率分别为30.4%、67.6%、73.2%、58.1%、58.8%、26.1%、54.1%、54.0%、43.3%、31.1%。薄层层析检测分析结果显示，其中一个组分Fr-5含有目标化合物。

将Fr-5（7.28g）用适量甲醇溶解，湿法上样，添加到95%(v/v)乙醇中预装好的SephadexLH-20柱上（柱床：5cm×43cm），并用95%(v/v)乙醇为洗脱剂进行洗脱和层析分离，根据薄层检测结果收集洗脱液合并浓缩，按洗脱先后顺序依次得到11个组分：Fr-5-1(600mg)、Fr-5-2(2.75g)、Fr-5-3(180mg)、Fr-5-4(1.7g)、Fr-5-5(170mg)、Fr-5-6(70mg)、Fr-5-7(28mg)、Fr-5-8(1.5g)、Fr-5-9(130mg)、Fr-5-10(15mg)、Fr-5-11(10mg)。这些组分在100μg/ml浓度下对K562细胞的抑制率分别为67.2%、80.2%、77.4%、51.1%、14.8%、16.8%、14.4%、25.3%、62.2%、63.5%、75.5%，表明Fr-5-1－Fr-5-4和Fr-5-9－Fr-5-11等7个组分为具有较强抗肿瘤作用的活性组分。其中，Fr-5-2为含有化合物1的目标组分。将Fr-5-2(2.75g)用适量甲醇溶解，再加8.5g反相硅胶ODS（YMC*GELODS-A-HG，12nmS–50μm，AAG12S50）均匀拌样，干燥并研磨均匀后添加到装有35g相同反相硅胶ODS的减压玻璃层析柱上（柱床：5cm×21cm），以水-甲醇-丙酮混合溶剂系统为洗脱剂，通过依次递增洗脱剂中甲醇或丙酮的体积分数减小洗脱剂极性，来进行减压梯度洗脱柱层析分离。根据薄层层析检测结果，收集合并相应洗脱液流份，并分别浓缩干燥，得7个组分：Fr-5-2-1(80mg，水-甲醇体积比1:1→2:3溶剂洗脱组分)、Fr-5-2-2(1.3g，水-甲醇体积比7:13→1:3溶剂洗脱组分)、Fr-5-2-3(165mg，水-甲醇体积比1:3→1:4溶剂洗脱组分)、Fr-5-2-4(240mg，水-甲醇体积比1:9溶剂洗脱组分)、Fr-5-2-5(110mg，水-甲醇体积比1:9溶剂洗脱组分)、Fr-5-2-6(200mg，甲醇洗脱组分)、Fr-5-2-7(60mg，甲醇→甲醇-丙酮积比1:1溶剂洗脱组分)。这些组分在100μg/ml浓度下对K562细胞的抑制率分别为5.9%、87.6%、84.2%、85.5%、62.2%、84.9%、1.0%，表明Fr-5-2-2、Fr-5-2-3、Fr-5-2-4、Fr-5-2-5和Fr-5-2-6为具有较强抗肿瘤活性的活性组分。薄层层析检测结果显示，其中Fr-5-2-2为所含主要物质为化合物1的含有目标化合物的柱层析组分。

4.化合物1的分离制备

1)柱层析组分Fr-5-2-2中化合物1的HPLC分离制备

将组分Fr-5-2-2（0.8g）用适量甲醇溶解，经0.22μm滤膜过滤后，用Waters600高效液相色谱仪（Waters600控制器、Waters600泵，Waters2998PDA检测器、Empower色谱工作站）进行制备反相HPLC（HPLC柱：CapcellPakC18，20mm×250mm；柱温：室温；流动相：甲醇-水体积分数80:20；流速：6ml/min；检测波长：230nm）分离和精制，得化合物1（保留时间t_R=24.0min）纯品760mg。其质谱、比旋光度、紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱等数据与实施例1中制得的化合物1数据一致。

2)柱层析组分Fr-5-2-2中化合物1的重结晶分离与精制制备

将含有化合物1的柱层析组分Fr-5-2-2（0.5g）用适量甲醇溶解过滤，再利用重结晶分离纯化技术，通过反复的甲醇溶液中重结晶分离与纯化精制，制得纯品化合物1的无色块状结晶470mg。其质谱、比旋光度、紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱等数据与实施例1中制得的化合物1数据一致。

实施例3：其他本发明式I化合物2a－12c的衍生化制备

称取2份上述实施例1制得的化合物1各约10mg，分别用适量甲醇和乙醇溶解后，滴加6N盐酸各1滴混匀，避光放置室温10天，进行甲基化和乙基化反应。反应产物分别用制备硅胶薄层层析（氯仿-甲醇体积比94:6或93:7展开）进行分离纯化，除了回收8mg的原料化合物1以外，从甲醇溶液反应产物中制得2a（1.8mg，正离子ESI-MSm/z:494[M+H]⁺）和2b（0.8mg，正离子ESI-MSm/z:494[M+H]⁺），从乙醇溶液反应产物中制得3a（1.5mg，正离子ESI-MSm/z:508[M+H]⁺）和3b（0.7mg，正离子ESI-MSm/z:508[M+H]⁺）。

称取上述实施例2制得的化合物1约50mg，加0.25ml无水吡啶溶解，迅速加0.25ml醋酐混匀，避光放置室温24h进行乙酰化反应。反应产物用制备硅胶薄层层析（氯仿-甲醇体积比95:5展开）进行分离纯化，制得4a（16mg，正离子ESI-MSm/z:522[M+H]⁺）、4b（4mg，正离子ESI-MSm/z:522[M+H]⁺）、5a（11.5mg，正离子ESI-MSm/z:564[M+H]⁺）和5b（2.5mg，正离子ESI-MSm/z:564[M+H]⁺）。

称取上述实施例2制得的化合物1约10mg，加0.2ml无水吡啶溶解，迅速加0.1ml乙酰氯混匀，避光放置室温24h进行乙酰化反应。反应产物用制备硅胶薄层层析（氯仿-甲醇体积比98:2展开）进行分离纯化，制得5a（2mg，正离子ESI-MSm/z:564[M+H]⁺）、5b（0.5mg，正离子ESI-MSm/z:564[M+H]⁺）、6a（4mg，正离子ESI-MSm/z:606[M+H]⁺）和6b（1mg，正离子ESI-MSm/z:606[M+H]⁺）。

称取上述实施例2制得的化合物1约10mg，加0.25ml丙酮溶解，加0.25ml没食子酸的10mg/ml丙酮溶液混匀，再滴加6N盐酸1滴混匀后，避光放置室温进行酰化反应7天。反应产物用制备硅胶薄层层析（氯仿-甲醇体积比80:20展开）进行分离纯化，除了回收4mg的原料化合物1以外，制得7a（1mg，正离子ESI-MSm/z:632[M+H]⁺；负离子ESI-MSm/z:630[M-H]^-）和7b（2mg，正离子ESI-MSm/z:632[M+H]⁺；负离子ESI-MSm/z:630[M-H]^-）。

称取在上述实施例2中制得的化合物1共10mg，加0.2ml无水吡啶溶解，迅速加58mg三苄基没食子酰氯混匀溶解，避光放置室温进行酰化反应48h。反应产物用制备硅胶薄层层析（氯仿-甲醇体积比95:5展开）进行分离纯化，制得8a（1mg，正离子ESI-MSm/z:1324[M+H]⁺；负离子ESI-MSm/z:1322[M-H]^-）和8b（3.5mg，正离子ESI-MSm/z:1324[M+H]⁺；负离子ESI-MSm/z:1322[M-H]^-）。

称取上述实施例2制得的化合物1约10mg，加0.2ml无水吡啶溶解，迅速加10μl苯甲酰氯混匀，避光放置室温进行酰化反应24h。反应产物用制备硅胶薄层层析（氯仿-甲醇体积比94:6展开）进行分离纯化，制得9a（1.3mg，正离子ESI-MSm/z:688[M+H]⁺；负离子ESI-MSm/z:686[M-H]^-）、9b（4mg，正离子ESI-MSm/z:688[M+H]⁺；负离子ESI-MSm/z:686[M-H]^-）和9c（0.8mg，正离子ESI-MSm/z:792[M+H]⁺；负离子ESI-MSm/z:790[M-H]^-）。

称取上述实施例2制得的化合物1约10mg，加0.2ml无水吡啶溶解，迅速加p-硝基苯甲酰氯16mg混匀，避光放置室温进行酰化反应6h。反应产物用制备硅胶薄层层析（氯仿-甲醇体积比91:9展开）进行分离纯化，制得10a（2.2mg，正离子ESI-MSm/z:778[M+H]⁺；负离子ESI-MSm/z:776[M-H]^-）、10b（5mg，正离子ESI-MSm/z:778[M+H]⁺；负离子ESI-MSm/z:776[M-H]^-）和10c（1mg，正离子ESI-MSm/z:927[M+H]⁺；负离子ESI-MSm/z:925[M-H]^-）。

称取上述实施例2制得的化合物1约10mg，加0.2ml无水吡啶溶解，迅速加p-氯苯甲酰氯11μl混匀，避光放置室温进行酰化反应10h。反应产物用制备硅胶薄层层析（氯仿-甲醇体积比92:8展开）进行分离纯化，制得11a（1.7mg，正离子ESI-MSm/z:756[M+H]⁺；负离子ESI-MSm/z:754[M-H]^-）、11b（5mg，正离子ESI-MSm/z:756[M+H]⁺；负离子ESI-MSm/z:754[M-H]^-）和11c（1.2mg，正离子ESI-MSm/z:894[M+H]⁺；负离子ESI-MSm/z:892[M-H]^-）。

称取上述实施例2制得的化合物1约10mg，加0.2ml无水吡啶溶解，迅速加p-氟苯甲酰氯10μl混匀，避光放置室温进行酰化反应8h。反应产物用制备硅胶薄层层析（氯仿-甲醇体积比92:8展开）进行分离纯化，制得12a（1.5mg，正离子ESI-MSm/z:724[M+H]⁺；负离子ESI-MSm/z:722[M-H]^-）、12b（4.5mg，正离子ESI-MSm/z:724[M+H]⁺；负离子ESI-MSm/z:722[M-H]^-）和12c（0.9mg，正离子ESI-MSm/z:846[M+H]⁺；负离子ESI-MSm/z:844[M-H]^-）。

实施例4：本发明式I化合物的抗肿瘤活性测试

1.实验材料

1）被测样品溶液的配制

测试样品为上述实施例1和实施例2中分离制得的化合物1和上述实施例3中衍生化制得的其他本发明式I化合物2a－12c。其中，化合物1先用甲醇配制成10.0mg/ml的母液，再通过倍比稀释配成10.0、5.0、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.1562、0.0781mg/ml系列浓度的甲醇溶液测试活性，而化合物2a－12c则仅配成2.5mg/ml的单一浓度甲醇溶液测试活性。5-氟尿嘧啶（阿拉丁试剂有限公司，批号5402）的10.0mg/ml甲醇溶液用作阳性对照，甲醇作为空白对照。

2）细胞系及细胞的继代培养

活性测试采用人慢性髓性白血病K562细胞系、人急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞系、人宫颈癌HeLa细胞系、人胃癌BGC-823系、人乳腺癌MCF-7系（上述细胞均可以商购获得，例如从上海雅吉生物科技有限公司、上海锐聪实验室设备有限公司、上海麦莎生物科技有限公司等购买）。

K562、HL-60、HeLa、BGC-823、MCF-7细胞分别用含10%胎牛血清以及青霉素和链霉素各100μg/ml的RPMI-1640培养基常规传代，并于37°C通入5%二氧化碳的细胞培养箱中培养维护。

2.活性测试方法

样品的抗肿瘤活性采用MTT法结合细胞形态学检测的方法进行测试。分别取对数生长期的K562、HL-60、HeLa、BGC-823、MCF-7细胞，用新鲜RPMI-1640培养基配制成细胞密度为2×10⁴个/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200μl。接种后，悬浮细胞K562和HL-60于37°C培养2h，而贴壁细胞HeLa、BGC-823、MCF-7则于37°C培养12h。之后，样品组每孔各加药物样品溶液2μl，空白对照组则每孔各加甲醇2μl，继续于37°C培养24h。培养结束后在光学显微镜下观察受试细胞的形态变化，观测有无典型的异形细胞、凋亡细胞或坏死细胞的形态特征，并根据观测到的受试细胞的形态变化情况，通过与空白对照组进行直接比较对照，初步判断样品对受试细胞有无抗肿瘤活性，必要时拍照。之后，每孔各加预冷的5mg/ml的MTT溶液（用PBS溶液配制）20μl，37°C孵育4h后，于4°C、2000rpm离心10min，吸去上清液，每孔各加150μlDMSO，置于酶标仪上充分振荡使MTT紫色产物完全溶解，测量每孔570nm下的OD值。实验中样品和空白对照组均分别设三个平行孔，取三孔OD平均值，按公式IR%=(OD_空白-OD_样品)/OD_空白×100%，计算样品对受试癌细胞的抑制率（IR%）。化合物1对受试癌细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）则根据不同浓度下的抑制率求算。

3.实验结果

1）MTT法测试结果

在MTT法测试中，化合物1对受试K562、HL-60、HeLa、BGC-823、MCF-7细胞均显示出很强的抑制细胞增殖的抗肿瘤活性，其对上述5种受试细胞的IC₅₀值测定结果如下面的表3中所示。

表3化合物1抑制人癌细胞增殖的IC₅₀值MTT法测定结果

化合物2a－12c对受试K562、HL-60、HeLa、BGC-823、MCF-7细胞也都显示出很强的抑制细胞增殖的抗肿瘤活性，在25μg/ml浓度下对这些细胞的抑制率均在45%以上，并分别分布在45%－85%的区间里。

实验中，阳性对照5-氟尿嘧啶在100μg/ml浓度下对受试K562、HL-60、HeLa、BGC-823、MCF-7细胞的抑制率分别为39.3%、54.2%、55.5%、49.6%、43.2%。

这些结果表明，本发明的化合物对上述癌细胞的体外抗肿瘤活性优于5-氟尿嘧啶。

2）细胞形态学检测结果

在光学倒置显微镜下观察到，上述受试细胞分别经100μg/ml－0.781μg/ml系列浓度的化合物1处理24h后，视野中部分细胞呈胞体膨大、细胞质凝集等坏死性细胞的典型形态，部分细胞则呈雪花状或尚未完全散开的碎片状等凋亡细胞的形态特征，同时还有部分细胞呈未完成细胞完整分裂的短粗棒状、梭状、或二联体状等异型形态：在100μg/ml高浓度处理组视野中坏死性形态细胞居多，但随着浓度降低，视野中坏死性细胞慢慢减少，而凋亡形态细胞和异型形态细胞逐渐增多，同时还伴随正常形态细胞也渐渐增多；随着浓度降至3.125μg/ml及在其以下进一步降低时，正常形态细胞数逐渐明显增多。这些形态学检测结果表明，化合物1通过对受试肿瘤细胞的杀伤性细胞毒、诱发受试细胞发生凋亡、作用于骨架蛋白抑制受试细胞分裂等多种途径，发挥其抑制癌细胞增殖的抗肿瘤作用。

此外，在光学倒置显微镜下还观察到，上述受试癌细胞分别经25μg/ml的化合物2a－12c处理24h后，视野中大多细胞也呈胞体膨大、细胞质凝集等坏死性细胞的典型形态，同时还有部分细胞呈雪花状或尚未完全散开的碎片状等凋亡细胞的形态特征，也有部分细胞呈未完成细胞完整分裂的短粗棒状、梭状、或二联体状等异型形态，而视野中呈正常形态的细胞数则相对较少。这些形态学检测结果表明，化合物2a－12c也和化合物1一样，也同样通过对受试癌细胞的杀伤性细胞毒、诱发受试细胞发生凋亡、作用于骨架蛋白抑制受试细胞分裂等多种途径，发挥其抑制癌细胞增殖的抗肿瘤作用。

4.结论

本发明的式I化合物具有很强的抗肿瘤活性，式I化合物通过对受试癌细胞的杀伤性细胞毒、诱发受试细胞发生凋亡、作用于骨架蛋白抑制受试细胞分裂等途径，发挥其抑制癌细胞增殖的抗肿瘤作用。因此，式I化合物可用作细胞骨架蛋白抑制剂、细胞凋亡诱导剂、肿瘤细胞增殖抑制剂、或肿瘤细胞杀伤剂，也可作为抗肿瘤药物用于肿瘤治疗。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.式I化合物，或其药学上可接受的盐，

其中，

R₁代表1-(2-甲基)辛烷基；

R₂和R₄各自独立地代表氢、取代或未取代的以下基团：C_2-6直链或支链饱和或不饱和的脂肪酰基或苯甲酰基；

R₃代表α或β取向的羟基、取代或未取代的以下基团：C_1-6直链或支链的烷氧基、或C_2-6直链或支链饱和或不饱和的脂肪酰氧基或苯甲酰氧基；

所述取代基选自羟基、卤素、硝基、苄氧基，所述取代基的个数为1个、2个或3个。

2.权利要求1所述的式I化合物，或其药学上可接受的盐，其中所述卤素选自氟、氯、溴或碘。

3.根据权利要求1或2的式I化合物，或其药学上可接受的盐，

其中，

R₁代表1-(2-甲基)辛烷基；

R₃代表α或β取向的羟基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧基、没食子酰氧基、三苄基没食子酰氧基、苯甲酰氧基、对硝基苯甲酰氧基、对氯苯甲酰氧基、或对氟苯甲酰氧基。

4.产紫青霉BD-1-3(PenicilliumpurpurogenumBD-1-3)在制备权利要求1-3任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐中的用途，其中，所述产紫青霉BD-1-3的保藏编号为CGMCCNo.4284，保藏日期为2010年11月1日，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。

5.产紫青霉3-f-31(Penicilliumpurpurogenum3-f-31)在制备权利要求1-3任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐中的用途，其中，所述产紫青霉3-f-31的保藏编号为CGMCCNo.7286，保藏日期为2013年3月7日，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。

6.化合物1的制备方法，包括如下步骤：

将产紫青霉BD-1-3或产紫青霉3-f-31进行发酵培养，获得含有所述化合物的发酵物，将发酵物进行分离纯化，得到所述的化合物；

其中所述化合物1为权利要求1的式I化合物，其中，R₁代表1-(2-甲基)辛烷基，R₂和R₄代表氢，R₃代表羟基；其中，

所述产紫青霉BD-1-3(PenicilliumpurpurogenumBD-1-3)的保藏编号为CGMCCNo.4284，保藏日期为2010年11月1日，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；

所述产紫青霉3-f-31(Penicilliumpurpurogenum3-f-31)的保藏编号为CGMCCNo.7286，保藏日期为2013年3月7日，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。

7.根据权利要求6所述的方法，包括如下步骤：

1)将所述的产紫青霉进行发酵培养，获得发酵液；

2)将发酵液过滤，得到滤液和菌体；

3)将步骤2)得到的滤液用乙酸乙酯萃取，得到滤液的乙酸乙酯萃取物；

4)将步骤2)得到的菌体悬浮于体积比为50％－95％的丙酮水溶液中，超声破碎菌体细胞，室温浸提过滤，滤液经减压浓缩至不含丙酮后用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取物；

5)将步骤3)和步骤4)得到的乙酸乙酯萃取物合并后减压浓缩至干，得到乙酸乙酯总浸膏；

6)将乙酸乙酯总浸膏直接用氯仿-甲醇体积比为1:1的混合溶剂溶解，或者将乙酸乙酯总浸膏经大量甲醇溶解除去甲醇不溶物后将所得甲醇可溶部分用二氯甲烷-甲醇体积比为1:2的混合溶剂溶解，用100-200目硅胶柱分离，以石油醚-氯仿-甲醇溶剂系统或者以石油醚-二氯甲烷-丙酮-甲醇溶剂系统为洗脱剂进行减压梯度洗脱，得到含有所述化合物的粗组分，再经对所得粗组分的两次SephadexLH-20柱层析和一次100-200目硅胶柱层析分离，或者一次SephadexLH-20柱层析和一次反相硅胶ODS柱层析分离，得到所含主要成分为所述化合物的柱层析组分；

7)将含有所述化合物的柱层析组分用HPLC分离精制，制得所述的化合物。

8.根据权利要求7所述的方法，其中步骤6)中所述两次SephadexLH-20柱层析均用氯仿-甲醇体积比为1:1的混合溶剂洗脱。

9.根据权利要求7所述的方法，其中步骤6)中所述一次100-200目硅胶柱层析用氯仿-丙酮溶剂系统梯度洗脱。

10.根据权利要求7所述的方法，其中步骤6)中所述一次SephadexLH-20柱层析用体积分数95％的乙醇洗脱。

11.根据权利要求7所述的方法，其中步骤6)中所述一次反相硅胶ODS柱层析用水-甲醇-丙酮溶剂系统梯度洗脱。

12.根据权利要求7所述的方法，其中步骤7)中所述HPLC分离精制选用C18柱，甲醇-水体积分数80:20洗脱。

13.权利要求1所述的式I化合物的制备方法，包括如下步骤：

将化合物1分别与醇、酸、酸酐、或酰氯进行衍生化反应，将反应产物进行分离纯化，得到所述式I化合物；

其中所述化合物1为权利要求1的式I化合物，其中，R₁代表1-(2-甲基)辛烷基，R₂和R₄代表氢，R₃代表羟基。

14.根据权利要求13所述的方法，其包括如下步骤：

1)将化合物1用甲醇、乙醇、丙酮、或无水吡啶溶解；

2)在室温避光和加盐酸催化或不加盐酸催化的条件下，分别与溶液中的甲醇或乙醇、或与新添加的醋酐、没食子酸、三苄基没食子酰氯、苯甲酰氯、p-硝基苯甲酰氯、p-氯苯甲酰氯、或p-氟苯甲酰氯进行衍生化反应1－48h或3－10天；

3)将反应产物用制备硅胶薄层层析进行分离纯化，制得所述的化合物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中步骤3)中制备硅胶薄层层析用氯仿-甲醇体积比80:20－99:1的混合溶剂作为展开剂。

16.组合物，其含有权利要求1至3任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐，任选地，还含有一种或多种药用载体或赋形剂。

17.权利要求1至3任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐、或者权利要求16所述的组合物在制备细胞骨架蛋白抑制剂、细胞凋亡诱导剂、肿瘤细胞增殖抑制剂、或肿瘤细胞杀伤剂中的用途。

18.根据权利要求17所述的用途，所述肿瘤细胞为白血病细胞或来源于上皮的癌细胞。

19.根据权利要求18所述的用途，所述来源于上皮的癌细胞为宫颈癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、或结肠癌细胞。

20.根据权利要求18所述的用途，所述白血病细胞为慢性髓性白血病细胞或急性早幼粒细胞白血病细胞。

21.根据权利要求17所述的用途，所述肿瘤细胞为人慢性髓性白血病K562细胞、人急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞、人子宫颈癌HeLa细胞、人胃癌BGC-823细胞、或人乳腺癌MCF-7细胞。

22.权利要求1至3任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐、或者权利要求16所述的组合物在制备杀伤肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞增殖的药物或试剂中的用途。

23.根据权利要求22所述的用途，所述肿瘤细胞为白血病细胞或来源于上皮的癌细胞。

24.根据权利要求23所述的用途，所述来源于上皮的癌细胞为宫颈癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、或结肠癌细胞。

25.根据权利要求23所述的用途，所述白血病细胞为慢性髓性白血病细胞或急性早幼粒细胞白血病细胞。

26.根据权利要求22所述的用途，所述肿瘤细胞为人慢性髓性白血病K562细胞、人急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞、人子宫颈癌HeLa细胞、人胃癌BGC-823细胞、或人乳腺癌MCF-7细胞。

27.一种非治疗目的的在体外杀伤肿瘤细胞或者抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括使用有效量的权利要求1至3任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐、或者权利要求16所述的组合物的步骤。

28.根据权利要求27所述的方法，所述肿瘤细胞为白血病细胞或来源于上皮的癌细胞。

29.根据权利要求28所述的方法，所述来源于上皮的癌细胞为宫颈癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、或结肠癌细胞。

30.根据权利要求28所述的方法，所述白血病细胞为慢性髓性白血病细胞或急性早幼粒细胞白血病细胞。

31.根据权利要求27所述的方法，所述肿瘤细胞为人慢性髓性白血病K562细胞、人急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞、人子宫颈癌HeLa细胞、人胃癌BGC-823细胞、或人乳腺癌MCF-7细胞。

32.权利要求1至3任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐、或者权利要求16所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

33.根据权利要求32所述的用途，所述肿瘤为白血病或来源于上皮的癌。

34.根据权利要求33所述的用途，所述癌为宫颈癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、或结肠癌。

35.根据权利要求33所述的方法，所述白血病为慢性髓性白血病、急性早幼粒细胞白血病。