JP2004248596A

JP2004248596A - 抗菌剤のスクリーニング方法およびそれに用いる微生物

Info

Publication number: JP2004248596A
Application number: JP2003043231A
Authority: JP
Inventors: Kaneyoshi Yamamoto; 兼由山本; Ryutaro Uchiumi; 龍太郎内海
Original assignee: Osaka Industrial Promotion Organization
Current assignee: Osaka Industrial Promotion Organization
Priority date: 2003-02-20
Filing date: 2003-02-20
Publication date: 2004-09-09

Abstract

【課題】薬剤耐性菌の出現が抑制できる抗菌剤のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】本発明の抗菌剤のスクリーニング方法は、細菌の二成分情報伝達系の阻害活性を指標にして、抗菌剤候補化合物から抗菌剤を選択する工程を含む方法である。例えば、レギュレータータンパク質ＹｙｃＦの第２１５番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がプロリン（Ｐｒｏ）に置換されている枯草菌変異株を用いれば、図１に示すように、レギュレータータンパク質がターゲット遺伝子と結合できず、この遺伝子の発現が制御され、これを指標として抗菌剤のスクリーニングが可能である。
【選択図】図１

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗菌剤（抗生物質を含む）のスクリーニング方法およびそれに使用する微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在使用されている抗生物質は、細菌特有のペプチドグリカン合成、タンパク質合成、核酸合成等のある生合成段階を阻害し、細菌増殖を抑制する。しかしながら、従来の抗生物質に対しては、自然変異により耐性菌が出現している。
【０００３】
【非特許文献１】
「Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ペプチドグリカン合成阻害剤」
Ａ．Ｆｌｅｍｉｎｇ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ．１０，２２６（１９２９）
【非特許文献２】
「Ｋａｎａｍｙｃｉｎ−蛋白質合成阻害剤」
Ｈ．Ｕｍｅｚａｗａ，Ｍ．Ｕｅｄａｅｔａｌ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１０Ａ，１８１（１９５７）
【非特許文献３】
「Ｎａｌｉｄｉｘｉｃａｃｉｄ−ＤＮＡ合成阻害剤」
Ｍ．Ｐｅｄｒｉｎｉｅｔａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５，３５９（１９７２）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、耐性菌の出現を抑制可能な抗菌剤のスクリーニング方法の提供を、その目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明の抗菌剤のスクリーニング方法は、細菌の二成分情報伝達系の阻害活性を指標にして、抗菌剤候補化合物から抗菌剤を選択する工程を含むことを特徴とする。
【０００６】
二成分情報伝達系（ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｙｓｔｅｍ，ＴＣＳ）は、細菌特有の情報伝達系である。二成分情報伝達系は、細胞膜表面にあるセンサータンパク質（ＹｙｃＦ）と、細胞内にあるレギュレータータンパク質（ＹｙｃＧ）から構成されている。センサータンパク質は、外部からの刺激（薬剤、ｐＨ，温度、酸素濃度変化等）を受けると、そのＨｉｓ部位にリン酸基を付加する自己リン酸化（ヒスチジンキナーゼ活性：ＨＫ）をおこし、このリン酸基をレギュレータータンパク質に転移させる。リン酸基の転移を受けたレギュレータータンパク質は、標的遺伝子に結合して、遺伝子の発現の制御を行う。二成情報伝達系において、センサータンパク質およびレギュレータータンパク質は、二量体を形成して、その機能を発現する。二成分情報伝達系は、細菌の病原性の制御、薬剤耐性の原因である薬剤排出ポンプ遺伝子の発現制御、細菌の増殖制御等の細菌の重要な機能を制御している。したがって、二成分情報伝達系を阻害することを指標にした本発明のスクリーニング方法によれば、病原性細菌に対する抗菌剤、薬剤耐性菌の出現が抑制された抗菌剤、細菌増殖を有効に抑制できる抗菌剤等の開発が期待できる。また、二成分情報伝達系は、細菌細胞内に複数存在するため、本発明のスクリーニング方法によれば、細菌特異的に複数の標的に作用する抗菌剤の開発が期待できる。このように、本発明のスクリーニング方法は、従来の方法とは全く異なるコンセプトに基づいたものである。また、本発明の抗菌剤の製造方法は、前記本発明の方法によるスクリーニング工程を含む方法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のスクリーニング方法において、二成分情報伝達系の阻害は、例えば、センサータンパク質の二量体化の阻害（ＨＫ−ＨＫ阻害）、センサータンパク質の自己リン酸化の阻害（ＨＫ阻害）、センサータンパク質からレギュレータータンパク質へのリン酸基の転移の阻害（ＨＫ−ＲＲ阻害）およびレギュレータータンパク質の二量体化の阻害（ＲＲ−ＲＲ阻害）がある。スクリーニングにおいては、これらの阻害の一つを対象としてもよいし、２種類以上の阻害を対象としてもよい。
【０００８】
つぎに、本発明のスクリーニング方法は、例えば、以下の２種類の微生物を用いて行うことができる。なお、以下の微生物は、枯草菌と大腸菌であるが、本発明は、これらの微生物に限定されない。なお、枯草菌と大腸菌は、安全で、よく調べられているので扱いやすく、培養等のコストが低い等の利点がある。
【０００９】
まず、一番目の微生物は、レギュレータータンパク質ＹｙｃＦの第２１５番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がプロリン（Ｐｒｏ）に置換されている枯草菌変異株である。この枯草菌変異亜株は、４７℃以上で生育不可である。この枯草菌変異株を用いれば、前述の４つの阻害を指標に、抗菌剤をスクリーニングできる。例えば、抗菌剤候補化合物を含有する培地により、枯草菌の野生株と前記変異株とを培養し、野生株が生育し、前記変異株が生育しなければ、その候補化合物は、二成分情報伝達系を阻害すると判定できる。
【００１０】
２番目の微生物は、プロモーターと、二量体を形成して前記プロモーターに結合するレプレッサーとからなる遺伝子転写制御系を有する大腸菌を、レプレッサーのＤＮＡ結合領域にセンサータンパク質細胞質内領域を結合させた融合タンパク質をコードする塩基配列および前記レプレッサーのＤＮＡ結合ドメインにレギュレータータンパク質を結合させた融合タンパク質をコードする塩基配列の少なくとも一方を含むベクターにより形質転換した大腸菌変異株である。この大腸菌変異株を用いれば、前記転写制御される遺伝子をマーカーとして、抗菌剤候補化合物から抗菌剤をスクリーニングできる。例えば、抗菌剤候補化合物を含有する培地で前記変異株を培養し、前記転写制御される遺伝子が発現すれば、前記候補化合物によって前記レプレッサー二量体化が阻止されたことになり、これは二成分情報伝達系の阻害されたことになる。したがって、前記遺伝子が発現した場合の候補化合物は、前記二成分情報伝達系を阻害すると判定できる。
【００１１】
前記転写制御を受ける遺伝子は、特に制限されず、例えば、β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（ｌａｃＺ）遺伝子等の各種代謝酵素遺伝子、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ（ｔｅｔ）耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子、ＧＦＰ等のレポーター遺伝子がある。これらの遺伝子は、単独でもよく、２種類以上で組み合わせてもよい。
【００１２】
前記２つの融合タンパク質におけるセンサータンパク質細胞内領域およびレギュレータータンパク質において、その由来は特に制限されず、例えば、枯草菌、ブドウ球菌および大腸菌等の菌由来であってもよい。
【００１３】
本発明のスクリーニング方法は、前述のような微生物を使用する方法に限定されず、ＹｙｃＦおよびＹｙｃＧのいずれか若しくは前記双方を用いたｉｎｖｉｔｒｏスクリーニングであってもよい。
【００１４】
【実施例】
つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、下記の実施例に限定されない。
【００１５】
（実施例１）
野生型枯草菌（１６８株）のＹｙｃＦのＮ末端から２１５番目のヒスチジン（ＣＡＴコドン）をプロリン（ＣＣＴコドン）に、下記の遺伝子工学の手法をもちい、変異させた結果、４７℃以上で生育不可の枯草菌温度感受性株（ＣＮＭ２０００：ＹｙｃＦＨｉｓ２１５Ｐｒｏ変異株）を作製した。枯草菌の野生株と前記変異株の二成分情報伝達系の概念図を図１に示す。図示のように、野生株（図１上）では、ＹｙｃＧ二量体が細胞膜表面に発現しており、刺激（ｓｔｉｍｕｌｉ）によって、ＡＴＰからりん酸基を受け取り、自己リン酸化し、ついで、このリン酸基をＹｙｃＦに転移し、リン酸化されたＹｙｃＦは、標的遺伝子（ｔａｒｇｅｔｇｅｎｅ）に結合して、その発現を制御する。これに対し、前記変異株（図１下）では、ＹｙｃＦに変異を生じているから、リン酸化されないか、若しくはリン酸化されても標的遺伝子に結合できないと、推察される。
【００１６】
（ＹｙｃＦＨｉｓ２１５Ｐｒｏ変異株作製法）
ＹｙｃＦを含むＤＮＡを、枯草菌１６８株ゲノムを鋳型として、ＰＣＲで増幅後、プラスミドＤＮＡへ連結した。さらに、ＹｙｃＦ遺伝子のすぐ下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍ）を挿入したプラスミドＤＮＡ（ｐＢＹＣＮ１）を作製した。部位特異的変異法によりｐＢＹＣＮ１上のＹｙｃＦのＨｉｓ２１５をＰｒｏ２１５に置換したｐＢＹＣＮＭ１（ＹｙｃＦＨｉｓ２１５Ｐｒｏ，Ｎｍ（ネオマイシン耐性遺伝子），Ｃｍ）を構築した。ｐＢＹＣＮＭ１を制限酵素により線状ＤＮＡにして、枯草菌１６８株へ導入後、クロラムフェニコール耐性、ネオマイシン感受性による選択で、枯草菌染色体ＤＮＡ上にＹｙｃＦＨｉｓ２１５Ｐｒｏを導入した変異株（ＣＮＭ２０００と命名、図３左上の図参照）を作製した。この変異株は、クロラムフェニコール耐性、ネオマイシン感受性を示し、温度感受性（４７℃以上生育不可、図３左下参照）を示した。なお、図３右は、ＹｙｃＧ、ＹｙｃＦおよびＹｙｃＦＨｉｓ２１５Ｐｒｏの分子量を示す電気泳動写真である。
【００１７】
前記枯草菌の野生株（１６８）および変異株ＣＮＭ２０００を、３７℃で培養（培地：ＬＢ培地；Ｈ２Ｏ，１Ｌ；Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ，１０ｇ；Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ，５ｇ；ＮａＣｌ５ｇ）したところ、既知の抗菌剤（セファゾリン、アミカシン、バンコマイシン、エリスロマイシン、オフロキサシン、２０ｍｉｃｒｏｇｒａｍ／ｍｌ）に対して、前記両株において感受性の差は見られなった。他方、前記既知抗生物質に代えてヒスチジンキナーゼ（ＮＨ１２７）の存在下（ＮＨ１２７：２０μｇ／ｍｌ）で前記と同様の条件で６時間培養し、前記野生株と変異株の濃度を吸光度（波長６００ｎｍ）で測定したところ、１６８株の吸光度は１．０であったのに対し、ＣＮＭ２０００では０．１であった。なお、前記ＮＨ１２７は、本発明者等が同定した物質である。
【００１８】
ＮＨ１２７（３−ベンジル−１−ラウリル−２−メチルイミダゾールヨウ化物）は、ヒスチジンキナーゼの一種であり、大腸菌ＥｎｖＺのキナーゼ活性阻害を指標としたスクリーニングの結果、多剤耐性菌（ＭＲＳＡ、ＶＲＥ）に対する抗菌活性（ＭＩＣ：２ − ０．４ｍｉｃｒｏｇｒａｍ／ｍｌ）を示すヒスチジンキナーゼ阻害剤として同定された（下記文献１参照）。ＮＨ１２７は、有機化学的に合成された。すなわち、まず、２−メチルイミダゾールと臭化ラウリルをクロロホルム中で還流し、１−ラウリル−２−メチルイミダゾールを得た。次に臭化ベンジル、ヨウ化カリウムと１−ラウリル−２−メチルイミダゾールを同様にクロロホルム中で還流し、さらにシリカゲルクロマトグラフィーによりＮＨ１２７を分離し、純化標品とした。さらに、ＮＭＲ解析、ＩＲ解析、元素分析により、純化ＮＨ１２７の構造（下記式化１）が確認された。
【００１９】
（参考文献１）
Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｋｉｔａｙａｍａ，Ｔ．，Ｉｓｈｉｄａ，Ｎ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．，Ｔａｎａｂｅ，Ｈ．，Ｔａｋａｔａｎｉ，Ｍ．，Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｔ．，ａｎｄＵｔｓｕｍｉ，Ｒ．（２０００）ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｐｏｔｅｎｔａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌａｇｅｎｔＮＨ１２５ａｇａｉｎｓｔｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔｂａｃｔｅｒｉａ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４，９１９−９２３．
【００２０】
【化１】

【００２１】
つぎに、以下のようにして、前記野性株および変異株を用いて、土壌微生物アセトン抽出物から、ヒスチジンキナーゼ阻害剤のスクリーニングを行った。
【００２２】
（土壌微生物アセトン抽出物の調製方法）
土壌微生物をＡ培地（コーンスターチ２％、グリセリン１％、シュクロース１％、グルテンミール１％、綿実粕１％，Ｔｗｅｅｎ８０，０．２％）で培養（２５℃、４日間）後、培養液（５ｍｌ）に等量のアセトンを加え、抽出後、エバポレータ―にて、溶媒相を除き濃縮した。濃縮産物にＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）０．５ｍｌを加えて溶解させ、スクリーニングに供するサンプル液を調製した。
【００２３】
（スクリーニング方法）
ＴｒｉｐｔｉｃａｓｅＳｏｙ寒天培地（ＴｒｉｐｔｉｃａｓｅＳｏｙＢｒｏｔｈ粉末、ＢＢＬ社製７．５ｇ；Ｈ２Ｏ１Ｌ；Ａｇａｒ７．５ｇ）３ｍｌに、枯草菌１６８株（野生株）およびｔｓ変異株（ＣＮＭ２０００）の一昼夜培養液（３０℃でＴｒｉｐｔｉｃａｓｅＳｏｙＢｒｏｔｈ０．０３ｍｌ）を加え、あらかじめ分注されているＴｒｉｐｔｉｃａｓｅＳｏｙ寒天培地（寒天濃度１．５％）に重層した。その後、種々の濃度のスクリーニングサンプル（上記参照）を１ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ滴下して、３７℃で２４時間、インキュベーターにて、培養した。１６８株とＣＮＭ２０００株での阻止円の直径が１０倍差のあるサンプルをＹｙｃＧ−ＹｙｃＦ（ＨＫ−ＲＲ）情報伝達阻害剤として、スクリーニングした。
【００２４】
前記スクリーニングの結果、土壌微生物アセトン抽出物の中で、３０サンプルにおいて、前記野生株と変異株との間に、１０倍の感受性の差が見られた。これらのサンプルについて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製し、以下に示すようにして、ｉｎｖｉｔｒｏでの精製野生型ＹｙｃＧの自己リン酸化活性の阻害を調べた。前記ＹｙｃＦは、枯草菌と黄色ブドウ球菌のものを使用した。その結果、３０サンプル中、２０サンプルについて、自己リン酸化阻害活性が確認できた。また、残りの１０サンプルについて、さらに調べたところ、リン酸化されたＹＹｃＧとＹＹｃＦへの相互作用を阻害し、リン酸基転移反応を阻害する活性（ＨＫ−ＲＲ阻害剤）を示した。また、これらの３０サンプルはいずれも、メチシリン耐性黄色ぶとう球菌（ＭＲＳＡ）やバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対して、生育最小阻止濃度ＭＩＣ０．１−２ｍｉｃｒｏｇｒａｍ／ｍｌの抗菌性を示した。これらのサンプルの一部について、核磁気共鳴（ＮＭＲ）および質量分析（ＭＳ）により構造解析を行った結果、下記のＡｒａｎｏｒｏｓｉｎｏｌＢ（化２）であった。
【００２５】
【化２】

【００２６】
（ＹｙｃＧセンサー蛋白質の自己リン酸化活性阻害を指標にしたｉｎｖｉｔｒｏスクリーニング）
下記組成の試薬液を調製し、これに、スクリーニングサンプル１μｌを加えた後に、１ μｌの２５ｍｉｃｒｏＭＡＴＰと１ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒのガンマー３２ＰＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，１０ｍｃｉ／ｍｌ）の１０倍希釈液を加え、室温で１０分静置する。その後１０ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒの２ｘＳＤＳサンプルバッファーを加え、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析した。電気泳動終了後、ゲルは乾燥後、ＩＰフィルムに感光させた。その後、ＩＰフィルムをＭａｃＢａｓ２．２（Ｆｕｊｉ）により解析し、放射活性を有するＹｙｃＧ自己リン酸化バンドを検出した。
【００２７】
（試薬液組成）
ＹｙｃＧ（１０ｐｍｏｌ／ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ）２ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ
１０ｘｒｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ１ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ
（ＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．５５００ｍＭ，ＫＣｌ５００ｍＭ，ＭｇＣｌ２５００ｍＭ）
蒸留水５ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ
【００２８】
つぎに、以下に示すようにして、枯草菌の野生株と変異株におけるＡｒａｎｏｒｏｓｉｎｏｌＢの感受性を調べた。すなわち、まず、ＴｒｉｐｔｉｃａｓｅＳｏｙ寒天培地（ＴｒｉｐｔｉｃａｓｅＳｏｙＢｒｏｔｈ粉末、ＢＢＬ社製７．５ｇ；Ｈ２Ｏ１Ｌ；Ａｇａｒ７．５ｇ）３ｍｌに枯草菌１６８株（野生株）およびｔｓ変異株（ＣＮＭ２０００）の一昼夜培養液（３０℃でＴｒｉｐｔｉｃａｓｅＳｏｙＢｒｏｔｈ０．０３ｍｌ）を加え、あらかじめ分注されているＴｒｉｐｔｉｃａｓｅＳｏｙ寒天培地（寒天濃度１．５％）に重層する。その後、種種の濃度のＡｒａｎｏｒｏｓｉｎｏｌＢ（１０，５，２．５，１．２５，０．６２５，０．３１３ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ滴下して、３７℃で２４時間、インキュベーターにて培養した。その結果を、図４の写真に示す。図示のように、ＡｒａｎｏｒｏｓｉｎｏｌＢに対し、ＣＮＭ２０００は、野性株と比較して、高感受性を示した。
【００２９】
（実施例２）
以下に示す方法により、大腸菌において、図２左上に示すように、二量体形成の転写制御蛋白質（レプレッサー：Ｒｅｐ：ＩｃｌＲ）のＤＮＡ結合領域にセンサータンパク質（ＨＫ）のキナーゼドメインを融合させた融合蛋白質（Ｒｅｐ−ＨＫ）と、Ｒｅｐとレギュレータータンパク質（ＲＲ）との融合蛋白質（Ｒｅｐ−ＲＲ）を個々に発現させたプラスミドＤＮＡを作成し（Ｐ−Ｒｅｐ−ＨＫ，ＰＲｅｐ−ＲＲ）、これを用いて２種類の大腸菌変異株を作製した。これらのプラスミドを保持した大腸菌変異株（Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｐ−Ｒｅｐ−ＨＫ、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｐ−Ｒｅｐ−ＲＲ）において、図２中図および左下図に示すように、これらの融合蛋白質が相互作用して、レプレッサー（Ｒｅｐ）がプロモーターに結合すると、その下流に存在する、β−ガラクトシダー（ｇａｌ）、ＧＦＰ，テトラサイクリン（ｔｅｔ）耐性遺伝子等のマーカー遺伝子の発現が抑制される。一方、ＨＫ―ＨＫ阻害剤、ＲＲ−ＲＲ阻害剤、ＨＫ−ＲＲ阻害剤が存在すると、図２右下図に示すように、Ｐ−Ｒｅｐ−ＨＫ，ＰＲｅｐ−ＲＲ間での二量体形成が阻害され、レポーター遺伝子（標的遺伝子）である、ｇａｌ，ＧＦＰ，ｔｅｔ等の薬剤耐性マーカーの発現が誘導される。これらの遺伝子発現誘導を指標にして、ＨＫ−ＨＫ、ＲＲ−ＲＲ、ＨＫ−ＲＲ間の相互作用阻害剤がスクリーニング可能となる。
【００３０】
（大腸菌変異株の作製方法）
転写抑制因子である大腸菌ＩｃｌＲはＤＮＡ結合領域（Ｎ末端）と二量体形成領域（Ｃ末端）で構成され、二量体（もしくは四量体）形成による標的プロモーター（ｉｃｌＲｐ）部位への結合によりＲＮＡポリメラーゼによる転写阻害を引き起こす。プラスミドベクターｐＴｒｃ９９Ａの高発現ｔａｃプロモーター制御下にｉｃｌＲ遺伝子のＮ末端コーディング領域（ｉｃｌＲＮ）を挿入し、更にｉｃｌＲｐプロモーター制御されるｇｆｐ（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を導入したプラスミドｐＦＩ００２を作製した。ＲＲもしくはＨＫの細胞質内領域（Ｃ末端領域）をｐＦＩ００２上ｉｃｌＲＮのＣ末端にｉｎ−ｆｒａｍｅで融合した遺伝子を有するプラスミドを作製した。すなわち、プラスミドベクターｐＴｒｃ９９Ａの高発現ｔａｃプロモーター制御下にｉｃｌＲ遺伝子の全長をマルチクローニングサイトに存在するＥｃｏＲＩ，ＫｐｎＩサイトに挿入し、更にｉｃｌＲｐプロモーター、及びその下流にｇｆｐ（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を持つインサートを、ＢａｍＨＩサイトを用いて導入した。このプラスミドの構成は、図２右上に示すとおりである。この際のＲＲおよびＨＫは、枯草菌、黄色ブドウ球菌ＹｙｃＦ、ＹｙｃＧに加え、大腸菌に於ける全てＲＲ、ＨＫについて作製した。大腸菌Ｋ−１２株に形質転換することで、二量体形成検定用の２種類の大腸菌変異株（Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｐ−Ｒｅｐ−ＨＫ、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｐ−Ｒｅｐ−ＲＲ）を作製した。大腸菌変異株Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｐ−Ｒｅｐ−ＨＫは、レプレッサーにヒスチジンキナーゼドメインが結合したものであり、大腸菌変異株Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｐ−Ｒｅｐ−ＲＲは、レプレッサーにレギュレータタンパク質が結合したものである。
【００３１】
この大腸菌変異株を用い、実施例１で調製した土壌微生物アセトン抽出物について、以下に示す手法にて、抗菌剤のスクリーニングを行った。すなわち、まず、９６ウエルのマイクロタイターウエルで培養した大腸菌変異株Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｐ−Ｒｅｐ−ＨＫに１万種類のサンプル（土壌微生物アセトン抽出物）を投与し、ｇａｌ、ＧＦＰ，テトラサイクリンｔｅｔ等の薬剤耐性マーカーの発現が誘導される薬剤をスクリーニングした結果、ｇａｌを指標に用いると、３０サンプル、ＧＦＰでは２０サンプル、ｔｅｔでは１５サンプルが選択された。
【００３２】
一方、９６ウエルのマイクロタイターウエルで培養した大腸菌変異株Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｐ−Ｒｅｐ−ＲＲに１万種類サンプルを投与し、ｇａｌ、ＧＦＰ，ｔｅｔ等の薬剤耐性マーカーの発現が誘導される薬剤をスクリーニングした結果、ｇａｌを指標に用いると、１０サンプル、ＧＦＰでは５サンプル、ｔｅｔでは７サンプルが選択された。
【００３３】
前記２種類の大腸菌変異株を用いたスクリーニングで単離された二成分情報伝達阻害剤の抗菌活性を調べた結果、メチシリン耐性黄色ぶとう球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）および病原性大腸菌Ｏ１５７に対し、生育最小阻止濃度はＭＩＣ０．１−２μｇ／ｍｌであった。
【００３４】
（スクリーニング方法）
Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｐ−Ｒｅｐ−ＨＫおよびＥ．ｃｏｌｉ／Ｐ−Ｒｅｐ−ＲＲの２種類の変異株をＬＢ培地で、２４時間しんとう培養後、ＬＢ培地で１／１００希釈した培養液０，２ｍｌを９６ウエルのマイクロタイタ―ウェルに分注後、テトラサイクリン（５ｍｉｃｒｏｇｒａｍ／ｍｌ）あるいはＸｇａｌ（０．０４％）を加え、８時間培養する。テトラサイクリン添加の時は、吸光度（ＯＤ６００）を測定し、ｔｅｔ活性を調べる。またＸｇａｌ（０．０４％）を添加するときは、青色の発色反応を指標にｇａｌ活性を調べる。ＧＦＰ活性を測定するときは、テトラサイクリン（５ｍｉｃｒｏｇｒａｍ／ｍｌ）あるいはＸｇａｌ（０．０４％）を加えずに、培養する。その後９６ウエルのマイクロタイタ―ウェル中の菌液に、励起波長４８５ｎｍで発生する蛍光波長（５３５ｎｍ）をＧＦＰ活性として測定する。
【００３５】
（抗菌性の評価）
生育最小阻止濃度（ＭＩＣ）の測定には、液体希釈法を用いた。各細菌をＬＢ培地で、一昼夜培養する。その後、ＬＢ培地に前記２種類の大腸菌変異株を用いたスクリーニングで単離された二成分情報伝達阻害剤を順次２倍希釈系列を作成し、それらの接種菌液を１０^６細胞／ｍｌになるように、植菌し、３７℃で一昼夜培養後、完全に増殖が阻止される最小濃度をＭＩＣと記録した。
【００３６】
【発明の効果】
以上のように、本発明のスクリーニング方法は、抗菌剤候補化合物から、二成分情報伝達系の阻害活性を指標として、抗菌剤を選択する方法である。この方法は、従来の抗菌剤スクリーニング方法と全く異なった原理に基づくものであり、薬剤耐性菌の出現が抑制された、抗菌剤の開発が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のスクリーニング方法の一例に使用する枯草菌の野生株および変異株の一例の二成分情報伝達系の仕組みを説明する図である。
【図２】図２は、本発明のスクリーニング方法のその他の例に使用する大腸菌変異株のレプレッサーの構成、ベクターおよび作用の仕組みを説明する図である。
【図３】図３は、前記枯草菌の野生株および変異株の変異点を示す図、温度感受性を示す写真およびレギュレータータンパク質の分子量を示す電気泳動写真である。
【図４】図４は、ＡｒａｎｏｒｏｓｉｎｏｌＢに対する枯草菌の感受性を示す写真である。

Claims

抗菌剤のスクリーニング方法であって、細菌の二成分情報伝達系の阻害活性を指標にして、抗菌剤候補化合物から抗菌剤を選択する工程を含む方法。
二成分情報伝達系の阻害が、センサータンパク質の二量体化の阻害（ＨＫ−ＨＫ阻害）、センサータンパク質の自己リン酸化の阻害（ＨＫ阻害）、センサータンパク質からレギュレータータンパク質へのリン酸基の転移の阻害（ＨＫ−ＲＲ阻害）およびレギュレータータンパク質の二量体化の阻害（ＲＲ−ＲＲ阻害）からなる群から選択される少なくとも一つの阻害である請求項１記載の方法。
請求項１または２記載のスクリーニング方法であって、レギュレータータンパク質ＹｙｃＦの第２１５番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がプロリン（Ｐｒｏ）に置換されている枯草菌変異株を用い、その抗菌剤候補化合物に対する感受性を二成分情報伝達系の阻害活性の指標とする方法。
前記枯草菌変異株が、４７℃以上で生育不可である請求項３記載の方法。
請求項１または２記載のスクリーニング方法であって、プロモーターと、二量体を形成して前記プロモーターに結合するレプレッサーとからなる遺伝子転写制御系を有する大腸菌を、前記レプレッサーのＤＮＡ結合領域にセンサータンパク質細胞質内領域を結合させた融合タンパク質をコードする塩基配列および前記レプレッサーのＤＮＡ結合ドメインにレギュレータータンパク質を結合させた融合タンパク質をコードする塩基配列の少なくとも一方の塩基配列を含むベクターにより形質転換した大腸菌変異株を用い、前記転写制御される遺伝子をマーカーとし、抗菌剤候補化合物に対する前記大腸菌変異株の感受性を二成分情報伝達系の阻害活性の指標とする方法。
前記転写制御を受ける遺伝子が、β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（ｌａｃＺ）遺伝子、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ（ｔｅｔ）耐性遺伝子およびＧｒｅｅｎＦｌｏｒｅｎｃｅＰｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）の少なくとも一つである請求項５記載の方法。
前記２つの融合タンパク質におけるセンサータンパク質細胞内領域およびレギュレータータンパク質が、枯草菌、ブドウ球菌および大腸菌からなる群から選択される少なくとも一つの菌由来である請求項５または６記載の方法。
請求項１から４のいずれかに記載のスクリーニング方法に使用する枯草菌変異株であって、レギュレータータンパク質ＹｙｃＦの第２１５番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がプロリン（Ｐｒｏ）に置換されている枯草菌変異株。
４７℃以上で生育不可である請求項８記載の枯草菌変異株。
請求項１、２、５、６または７に記載のスクリーニング方法に使用する大腸菌変異株であって、プロモーターと、二量体を形成して前記プロモーターに結合するレプレッサーとからなる遺伝子転写制御系を有する大腸菌を、前記レプレッサーのＤＮＡ結合領域にセンサータンパク質細胞質内領域を結合させた融合タンパク質をコードする塩基配列および前記レプレッサーのＤＮＡ結合ドメインにレギュレータータンパク質を結合させた融合タンパク質をコードする塩基配列の少なくとも一方を含むベクターにより形質転換した大腸菌変異株。
前記転写制御を受ける遺伝子が、β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（ｌａｃＺ）遺伝子、Ｇｒｅｅｎｆｌｏｒｏｒｅｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）およびｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ（ｔｅｔ）耐性遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１０記載の大腸菌変異株。
請求項１から７のいずれかに記載の方法によるスクリーニング工程を含む抗菌剤の製造方法。