CN102174075B

CN102174075B - 脂肽类化合物、其组合物、其制备方法和用途

Info

Publication number: CN102174075B
Application number: CN 201110033546
Authority: CN
Inventors: 崔承彬; 吴长景; 李长伟; 田从魁; 杨明; 姚志伟
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date: 2011-01-31
Filing date: 2011-01-31
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2031-01-31
Also published as: CN102174075A

Abstract

本发明属于医药化工领域，涉及脂肽类化合物、其组合物、其制备方法和用途。具体地，本发明涉及式I化合物或其药学上可接受的盐，其中，R代表羟甲基、C_1-10直链或支链烷氧基、C_2-10直链或支链烯基氧基、C_2-10直链或支链炔基氧基、C_6-10直链或支链芳基氧基、或C_2-18的饱和或不饱和脂肪酰氧甲基。本发明还涉及用于制备该化合物的产紫青霉。经实验证实，该类化合物可用于制备对肿瘤细胞的杀伤性细胞毒试剂或抗肿瘤剂。本发明的化合物具有良好的抗肿瘤活性。

Description

脂肽类化合物、其组合物、其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药化工领域，涉及脂肽类化合物、其组合物、其制备方法和用途。

背景技术

肿瘤(Tumor)是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。一般将肿瘤分为良性和恶性两大类。所有的恶性肿瘤总称为癌症(cancer)。

脂肽类化合物是指分子结构中含有脂肪酸残基的肽类化合物，目前已知有些脂肽类化合物具有抗肿瘤活性。

譬如，fellutamide A和B及其类似物为含有一个脂肪酸残基的三肽类衍生化合物，目前已知该类有些化合物具有抗肿瘤活性。例如，fellutamide A和B对小鼠白血病P388细胞、小鼠白血病L-1210细胞、人表皮样癌KB细胞等癌细胞均示有很强杀伤性细胞毒活性(Shigemori H，et al，Fellutamides A and B，cytotoxic peptides from amarine fish-possessing fungus Penicillium fellutanum，Tetrahedron，1991，47(40)：8529-8534)。抗生素1656G、抗生素3127和N-octanoylfellutamide均为fellutamide B类似物，它们也都显示出抗肿瘤活性(Mizogami K，et al，Physiologically active substance 1656G，JapanesePatent，1990，02-262591；Mizogami K，et al，Physiologically activesubstance 3127，Japanese Patent，1991，03-041089；John S S，et al，Neurotrophic peptide aidehydes：Solid phase synthesis of fellutamideB and a simplified analog，Bio.Med.Chem.Let.，2006，16：3855-3858)。Epoxomicin是一种含有环氧-β-氨基酮结构片段的三肽类化合物，对小鼠黑色素瘤B16细胞、人结肠癌HCT-116细胞、人结肠直肠癌Moser细胞、小鼠白血病P388细胞、人骨髓性粒细胞性白血病K562细胞显示有很强细胞毒活性(Minoru H，Epoxomicin，a new antitumor agentof microbial origin，J.Atibiot.，1992，45(11)：1746-1752)。YM-170320也是含有一个脂肪酸残基的三肽类衍生物，它可通过抑制麦角甾醇生物合成而显示出抗真菌活性(Takeo S，et al，YM-170320，a novellipopeptide antibiotic inducing morphological change of colonies in amutant of Candida tropicalis pK233，J.Atibiot.，1998，51(4)：435-438)，但并没有其具有抗肿瘤活性的相关报道。

Fellutamide类脂肽衍生物迄今已报道的化合物种类和数量均较少，其中已知的化合物其2位取代基均为CHO，其它类型取代基的化合物尚未见报道。

发明内容

本发明人通过创造性的劳动和不懈的努力，发现了下述式I所示的一类新的脂肽类化合物：

式I

其中，

阿拉伯数字表示相应标位，其结构特征在于，R为含氧取代基。

具体地，R代表羟甲基、羟乙基、甲氧基、乙氧基、C_1-10直链或支链烷氧基、C_2-10直链或支链烯基氧基、C_2-10直链或支链炔基氧基、C_6-10直链或支链芳基氧基、或C_2-18的饱和或不饱和脂肪酰氧基。

并且本发明人还惊奇地发现，上述的式I化合物具有抗肿瘤活性。

由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及式I化合物，或其药学上可接受的盐，

式I

其中，

R代表羟甲基、羟乙基、甲氧基、乙氧基、C_1-10直链或支链烷氧基、C_2-10直链或支链烯基氧基、C_2-10直链或支链炔基氧基、C_6-10直链或支链芳基氧基、或C_2-18的饱和或不饱和脂肪酰氧甲基。

具体地，所述C_1-10直链或支链烷氧基为甲氧基、乙氧基、C₃直链或支链烷氧基、C₄直链或支链烷氧基、C₅直链或支链烷氧基、C₆直链或支链烷氧基、C₇直链或支链烷氧基、C₈直链或支链烷氧基、C₉直链或支链烷氧基、或C₁₀直链或支链烷氧基。

具体地，所述C_2-10直链或支链烯基氧基为乙烯氧基、C₃直链或支链烯基氧基、C₄直链或支链烯基氧基、C₅直链或支链烯基氧基、C₆直链或支链烯基氧基、C₇直链或支链烯基氧基、C₈直链或支链烯基氧基、C₉直链或支链烯基氧基、或C₁₀直链或支链烯基氧基。

具体地，所述C_2-10直链或支链炔基氧基为乙炔氧基、C₃炔基氧基、C₄直链或支链炔基氧基、C₅直链或支链炔基氧基、C₆直链或支链炔基氧基、C₇直链或支链炔基氧基、C₈直链或支链炔基氧基、C₉直链或支链炔基氧基、或C₁₀直链或支链炔基氧基。

具体地，所述C_6-10芳基氧基为苯氧基、苄氧基、C₈直链或支链芳基氧基、C₉直链或支链芳基氧基、或C₁₀直链或支链芳基氧基。

具体地，C_2-18的饱和或不饱和脂肪酰氧甲基为甲酰氧甲基、乙酰氧甲基、琥珀酰氧甲基、辛烷酰氧甲基、癸烷酰氧甲基、王浆酰氧甲基、月桂酰氧甲基、3-羟基月桂酰氧甲基、肉豆蔻酰氧甲基、棕榈酰氧甲基、硬脂酰氧甲基、油酰氧甲基、或亚油酰氧甲基。

在本发明的一个实施方案中，所述的式I化合物，或其药学上可接受的盐，其中，

R代表羟甲基、羟乙基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧甲基、琥珀酰氧甲基、或亚油酰氧甲基。具体地，R代表羟甲基、羟乙基、甲氧基、或乙氧基。

R代表OCH₃、OCH₂CH₃、CH₂OH或CH₂OCOCH₃。

R代表OCH₃、OCH₂CH₃、CH₂OH。

本发明的另一方面涉及一种组合物，其含有本发明的式I化合物或其药学上可接受的盐，可选地，还含有一种或多种药用载体或赋形剂。具体地，所述组合物为药物组合物。

本发明的还一方面涉及产紫青霉(Penicillium purpurogenum)AD-2-1，其保藏编号为CGMCC No.3561，保藏日期为2009年12月30日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

该菌株是从天津塘沽驴驹河渤海湾潮间带海泥样品中分离并经分类学研究鉴定为产紫青霉(Penicillium purpurogenum)的青霉菌属的产紫青霉野生菌株G59的突变株AD-2-1。其具有如下微生物菌学特征：

菌落在查氏培养基上25℃培养12天直径达17-30mm，平坦、近于平坦或有几道同心环纹；质地绒状或兼絮状；分生孢子面暗灰绿色或暗绿色，近于橄榄柠檬色、褐橄榄色、或微暗橄榄绿色；菌丝体橘黄色、黄色或橙红色；反面暗红色、橘红色或紫红色；分生孢子梗发生于基质，发生气生菌丝者少，孢梗茎(70-)100-250(-300)×2.5-3.2(-3.5)μm，壁平滑，顶端通常膨大；帚状枝双轮生，偶有三轮生或单轮生，彼此紧贴而近于平行；梗基每轮4-8个，9.0-13(-14)×2.5-3.0μm；瓶梗每轮4-6个，9.5-13×(1.8-)2.0-2.4μm，披针形，梗茎明显；分生孢子呈椭圆形，充分成熟时部分呈近球形，2.8-3.5(-4.0)×2.2-3.0μm，壁平滑或稍粗糙；分生孢子链较疏松，叉开或近于圆柱形。

本发明的还一方面涉及本发明的式I化合物的制备方法，包括如下步骤：

将上述的产紫青霉进行发酵培养，获得含有式I化合物的发酵物，将发酵物进行分离纯化，得到式I化合物。

所述分离纯化包括利用本领域技术人员熟知的天然产物分离纯化的常规方法，如液液萃取、柱层析、薄层层析、高效液相层析等。

也可以使用青霉菌属的其它能够产生式I化合物的生产菌进行发酵培养。

在本发明的一个实施方案中，所述的制备方法，包括如下步骤：

1)将上述的产紫青霉进行发酵培养，获得发酵液；

2)将发酵液过滤，得到滤液和菌丝体；

3)将步骤2)得到的滤液用乙酸乙酯萃取，得到滤液的乙酸乙酯萃取物；

4)将步骤2)中得到的菌丝体用50％-90％(v/v)的丙酮水溶液浸提过滤，滤液经减压浓缩至不含丙酮后用乙酸乙酯萃取，得到菌丝体的乙酸乙酯萃取物；

5)将步骤3)和4)中的乙酸乙酯萃取物合并后减压浓缩至干，得到乙酸乙酯总浸膏；

6)将乙酸乙酯总浸膏依次用Sephadex LH-20柱层析(95％乙醇洗脱)和ODS柱层析(水→95％乙醇洗脱)分离，得到含有所述化合物的柱层析组分；

7)将含有所述化合物的柱层析组分经硅胶制备薄层层析分离，制得含有所述化合物的层析组分；

8)将层析组分用HPLC分离，得到所述化合物。

在本发明的一个实施方案中，所述的制备方法，其中，步骤4)中的丙酮水溶液为70％-90％(v/v)，具体地，为75％-85％(v/v)，更具体地，为80％(v/v)。

本发明的还一方面涉及本发明的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备肿瘤细胞坏死性杀伤性细胞毒试剂或肿瘤细胞增殖抑制剂中的用途。

本发明的还一方面涉及本发明的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的用途；具体地，所述肿瘤为白血病、乳腺癌、肺癌、肝癌、或肠癌等等。具体地，所述白血病为人髓性慢性白血病。

本发明采用MTT法，测试了式I化合物对人白血病K562细胞增殖的抑制作用。经实验证实，式I化合物可显著抑制K562细胞的体外增殖，因而具有抗肿瘤作用。

本发明的还一方面涉及产紫青霉AD-2-1的发酵物的提取物，其特征在于，所述提取物含有本发明的式I化合物。具体地，所述提取物为产紫青霉AD-2-1发酵物的乙酸乙酯萃取物、乙酸乙酯总浸膏、或者层析组分。所述提取物可以参照上面本发明的化合物的制备方法的相应步骤制得。具体地，所述提取物可以通过液液萃取、柱层析、薄层层析、高效液相层析得到。更具体地，如下：

乙酸乙酯萃取物可以通过上面本发明的化合物的制备方法中的步骤1)-3)，或者步骤1)、2)和4)，或者步骤1)-4)得到。

乙酸乙酯总浸膏可以通过上面本发明的化合物的制备方法中的步骤1)-5)得到。

层析组分可以通过上面本发明的化合物的制备方法中的步骤1)-6)或1)-7)得到。

本发明的还一方面涉及产紫青霉AD-2-1发酵物的提取物在制备肿瘤细胞坏死性杀伤性细胞毒试剂或肿瘤细胞增殖抑制剂中的用途。

本发明的还一方面涉及产紫青霉AD-2-1发酵物的提取物在制备抗肿瘤药物中的用途；具体地，所述肿瘤为白血病、乳腺癌、肺癌、肝癌、或肠癌等等。具体地，所述白血病为人髓性慢性白血病。

本发明的还一方面涉及上述的产紫青霉AD-2-1在制备本发明的式I化合物中或者发酵物的提取物中的用途。

本发明中的术语“药学上可接受的盐”可以是药用无机或有机盐。本发明式I中具有碱性基团的化合物可以与无机酸形成药用盐，例如硫酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐；也可与有机酸形成药用盐，例如乙酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、葡萄糖酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、马来酸盐等。本发明式I中具有酸性基团的化合物可以与碱金属或碱土金属形成药用盐，优选但不限于钠盐、钾盐、镁盐或钙盐。

本发明的式I化合物可与各种药物上可接受的载体、赋形剂或辅料配伍制成抗肿瘤药物，用于肿瘤的治疗。

本发明化合物可单独或以药物组合物的形式给药。给药途径可以是口服、非肠道或局部给药。药物组合物可根据给药途径配成各种适宜的剂型。

本发明化合物的药物组合物可以以下面的任意方式施用：口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，局部用药，非肠道用药，如皮下，静脉，肌内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中优选口服、腹膜内或静脉内给药方式。

当口服用药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊制剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。

当皮肤局部施用时，本发明化合物可制成适当的软膏、洗剂或霜剂制剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、吐温60、十六烷酯蜡、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。

本发明化合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液或无菌注射溶液。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。

另外需要指出，本发明化合物使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。优选的使用剂量介于0.01-100mg/kg体重/天。

发明的有益效果

本发明的化合物具有良好的抗肿瘤活性。

涉及保藏的生物材料

产紫青霉AD-2-1已于2009年12月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏编号为CGMCC No.3561；分类命名为Penicillium purpurogenum。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

在下面的实施例中，称为化合物I和III的本发明化合物经核磁共振等鉴定具有如下结构：式I化合物，其中R为OCH₂CH₃，二者互为碳2位差向异构体；以下称为化合物II和IV的本发明化合物经核磁共振等鉴定具有如下结构：式I化合物，其中R为OCH₃，二者互为碳2位差向异构体；以下称为化合物V的本发明化合物经核磁共振等鉴定具有如下结构：式I化合物，其中R为CH₂OH，且CH₂OH中的CH₂标位为碳1位。

阿拉伯数字表示相应标位

式I

在下面实施例的结构研究中，比旋光度用英国OA公司PolAAr3005型旋光仪测定。正负离子ESI-MS和HR-ESI-MS分别用美国AB公司API 3000型液相色谱-质谱联用仪和英国Micromass公司LCT型质谱仪测定，红外光谱用美国Bruker公司Tensor27型和HyperionATR-objective型红外光谱仪测定，核磁共振谱用日本JEOL公司JNM-ECA-400型超导核磁共振仪(400MHz ¹H-NMR，100MHz¹³C-NMR)和美国Bruker公司Varian Inova 600型超导核磁共振仪(600MHz¹H-NMR，150MHz ¹³C-NMR)测定。

实施例1：微生物发酵培养与化合物I-V的制备

1.发酵培养与发酵物的提取处理

1)生产菌株

本实施例中用于发酵生产化合物I-V的产素菌是保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)AD-2-1株，保藏编号为3561即CGMCC No.3561。

2)发酵培养

按微生物培养的常规方法，从4℃冰箱取出产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)AD-2-1试管斜面，在无菌条件下用接种环刮取适量孢子，划线接种于新配制的5个PDA固体培养基(组成：葡萄糖2％、琼脂2％、NaCl 1.5％，用20％土豆的水煮液配制)平板上，28℃培养箱中活化培养5天，分别用10ml无菌水洗取孢子，并将全部孢子合并分散于1000ml无菌水中，得到孢子悬液。取该孢子悬液200μl，至于96孔板中检测，其600nm波长下的OD值为0.12。将该孢子悬液按每瓶10ml的接种量，分别接种于装有200ml液体培养基(组成：葡萄糖2％，麦芽糖1％，甘露醇2％，谷氨酸1％，蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.3％，土豆汁20％，pH 6.0)的100个500ml三角烧瓶中，于28℃、200rpm摇床发酵培养12天，获得发酵物共计约20L。

2.提取处理与乙酸乙酯浸膏的制备

将全部发酵液(约20L)用4层纱布过滤，分为滤液和菌丝体。滤液约18L直接用等量乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩得滤液的乙酸乙酯萃取物。菌丝体用体积分数为80％的丙酮水溶液约5L混悬，超声2h，室温浸提24h后用4层纱布过滤，重复操作3次，合并滤液，减压浓缩至不含丙酮后，残余水层约3L用等体积乙酸乙酯萃取5次，得菌丝体提取物的乙酸乙酯萃取物。薄层层析结果显示，滤液乙酸乙酯萃取物与菌丝体乙酸乙酯萃取物所含主要斑点相同，因此将该两部分萃取物合并后减压浓缩至干，得到乙酸乙酯总浸膏20g。

3.乙酸乙酯浸膏的柱层析分离与含有目标化合物I-V的柱层析组分的制备

将上述乙酸乙酯总浸膏20g用95％乙醇100ml溶解，滤除不溶物，添加到用95％乙醇预装的Sephadex LH-20柱(柱床：5cm×40cm)上，用95％乙醇洗脱层析，每流分接取50ml，得到若干流分。根据硅胶薄层分析结果合并相应流分，按洗脱顺序得到5个组分：Fr-1(3.6g)、Fr-2(3.1g)、Fr-3(2.7g)、Fr-4(3.4g)、Fr-5(2.2g)。

将组分Fr-1(3.6g)用64ml甲醇溶解，加25g ODS吸附拌样，减压蒸干后添加到装有70g ODS的玻璃减压柱(柱床4.8cm×10cm)上，以含水乙醇为洗脱剂，通过逐步增加洗脱剂中乙醇的质量百分数进行梯度洗脱减压柱层析，每流分接取100ml，得到若干流分。根据薄层检测结果合并相应流分，得到5个组分：Fr-1-0(0.32g，水洗脱部分)、Fr-1-1(0.15g，20％→30％乙醇洗脱部分)，Fr-1-2(0.2g，30％乙醇洗脱部分)，Fr-1-3(2.3g，40％→50％乙醇洗脱部分)，Fr-1-4(0.6g，60％→70％乙醇洗脱部分)。经薄层检测，Fr-1-3中含有目标化合物I-V。

4.含化合物I-IV和含化合物V层析组分的分离制备

将含化合物I-V的组分Fr-1-3(0.5g)用5ml甲醇溶解，分别点样在25块预制硅胶制备薄层板上，用二氯甲烷-甲醇-氨水体积比90∶20∶2展开。展开结束后，将薄层板置于通风橱充分挥尽溶剂和氨水，喷洒蒸馏水，绘制层析条带，待薄层板干燥，分别刮取各条带，合并相同条带硅胶，用丙酮洗脱并减压浓缩干燥，制得硅胶薄层层析组分Fr-1-31(60mg，R_f≈0.7)，Fr-1-32(210mg，R_f≈0.6)，Fr-1-33(40mg，R_f≈0.5)和Fr-1-34(30mg，R_f≈0.45)。其中组分Fr-1-31(60mg，R_f≈0.7)含有化合物I-IV，组分Fr-1-33(40mg，R_f≈0.5)含有化合物V。

5.化合物I-V的分离制备

1)化合物I-IV的HPLC分离精制

将含有化合物I-IV的组分Fr-1-31(60mg)用3ml甲醇溶解，用0.45μm滤膜过滤后，用Waters 600型HPLC系统(Waters 600控制器、Waters 600泵、Waters 2414 RI检测器、Waters 2996 PDA检测器、Empower色谱工作站)，利用Clickβ-CD半制备柱(8mm×150mm)进行HPLC分离(柱温40℃，以甲醇-水体积分数42∶58为流动相，流速2ml/min，每次进样100μl，检测波长为200nm)，制得化合物I(3mg，保留时间t_R＝48min)、化合物II(5mg，保留时间t_R＝54min)、化合物III(2.5mg，保留时间t_R＝67min)和化合物IV(7mg，保留时间t_R＝76min)。

2)化合物I-IV的理化常数与波谱数据

化合物I为白色无定形粉末，易溶于二甲亚砜、甲醇，微溶于乙酸乙酯、丙酮、水，不溶于石油醚、二氯甲烷。[α]_D ²⁰7.0°(c 0.2，甲醇)。正离子ESI-MS m/z：594[M+Na]⁺；负离子ESI-MS m/z：570[M-H]^-，606[M+Cl]^-，616[M+45(HCOO)]^-，660[M+89(C₂O₄H)]^-。正离子HR-ESI-MS m/z：实测值594.3834[M+Na]⁺，计算值594.3843(C₂₈H₅₃N₅O₇Na[M+Na]⁺)。IR v_max cm^-1：3422，3283，2958，2922，2852，1663，1626，1552，1536，1516，1443，1384，1311，1261，1095，1018，928，879，833，781，738，693，650，607。¹H-NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ：8.08(1H，d，J＝7.0Hz，H-20)，8.02(1H，d，J＝9.2Hz，H-7)，7.94(1H，d，J＝7.8Hz，H-14)，7.37(1H，br s，Ha-19)，7.21(1H，br s，Ha-13)，6.90(1H，br s，Hb-19)，6.75(1H，br s，Hb-13)，5.07(1H，dt，J＝9.2，6.9Hz，H-2)，4.64(1H，d，J＝4.8Hz，23-OH)，4.49(1H，q，J＝7.0Hz，H-16)，4.13(1H，td，J＝7.8，4.6Hz，H-9)，3.82-3.75(1H，m，H-23)，3.44(1H，dq，J＝14.1，7.0Hz，OCH ₂CH₃)，3.27(1H，dq，J＝14.1，7.0Hz，OCH ₂CH₃)，2.54(1H，dd，J＝15.6，7.0Hz，Ha-17)，2.43(1H，dd，J＝15.6，7.0Hz，Hb-17)，2.26-2.16(2H，m，H-22)，2.12-2.04(2H，m，H-11)，1.99-1.89(1H，m，Ha-10)，1.78-1.68(1H，m，Hb-10)，1.65-1.57(1H，m，H-4)，1.48(1H，dt，J＝13.8，6.9Hz，Ha-3)，1.40-1.10(17H，m，Hb-3，H-24-H-31)，1.05(3H，t，J＝7.0Hz，OCH₂CH ₃)，0.86(3H，d，J＝6.7Hz，H₃-6)，0.85(3H，t，J＝7.0Hz，H₃-32)，0.83(3H，d，J＝6.8Hz，H₃-5)。¹³C-NMR(150MHz，DMSO-d₆)δ：173.75(C-12)，171.61(C-18)，171.46(C-8)，171.18(C-21)，170.98(C-15)，77.20(C-2)，67.41(C-23)，61.77(OCH₂CH₃)，52.60(C-9)，49.86(C-16)，43.44(C-22)，43.25(C-3)，36.90(C-17)，36.82(C-24)，31.38(C-11)，31.26(C-30)，29.09(C-26 or C-27)，29.06(C-27 orC-26)，28.96(C-28)，28.68(C-29)，27.60(C-10)，25.11(C-25)，23.97(C-4)，22.38(C-6)，22.33(C-5)，22.04(C-31)，15.05(OCH₂ CH₃)，13.91(C-32)。以上NMR数据根据DEPT谱以及¹H-¹H COSY、HMBC、HMQC等二维谱解析结果予以归属。

化合物II为白色无定形粉末，易溶于二甲亚砜、甲醇，微溶于乙酸乙酯、丙酮、水，不溶于石油醚、二氯甲烷。[α]_D ²⁰-23.7°(c 0.3，甲醇)。正离子ESI-MS m/z：558[M+H]⁺，580[M+Na]⁺；负离子ESI-MSm/z：592[M+Cl]^-。正离子HR-ESI-MS m/z：实测值580.3695[M+Na]⁺，计算值580.3686(C₂₇H₅₁N₅O₇Na[M+Na]⁺)。IR v_max cm^-1：3268，2934，2862，1650，1536，1418，1325，1282，1256，1196，1145，1114，1062，979，949，863，813，784，722，683，662，617。¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：8.12(1H，d，J＝6.9Hz，H-20)，8.03(1H，d，J＝9.1Hz，H-7)，8.00(1H，d，J＝8.0Hz，H-14)，7.41(1H，br s，Ha-19)，7.25(1H，br s，Ha-13)，6.93(1H，br s，Hb-19)，6.79(1H，br s，Hb-13)，4.97(1H，dt，J＝9.1，6.9Hz，H-2)，4.68(1H，d，J＝4.8Hz，23-OH)，4.49(1H，q，J＝6.9Hz，H-16)，4.18-4.08(overlapped with the signal of CH₃OH，H-9)，3.84-3.73(1H，m，H-23)，3.11(3H，s，OCH ₃)，2.54(1H，dd，J＝15.5，6.9Hz，Ha-17)，2.43(1H，dd，J＝15.5，6.9Hz，Hb-17)，2.27-2.16(2H，m，H-22)，2.14-2.03(2H，m，H-11)，2.02-1.88(1H，m，Ha-10)，1.80-1.68(1H，m，Hb-10)，1.65-1.54(1H，m，H-4)，1.49(1H，dt，J＝13.8，6.9Hz，Ha-3)，1.40-1.15(17H，m，Hb-3，H-24-H-31)，0.85(3H，d，J＝6.7Hz，H₃-6)，0.85(3H，t，J＝7.0Hz，H₃-32)，0.83(3H，d，J＝6.7Hz，H₃-5)。¹³C-NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：173.91(C-12)，171.82(C-18)，171.74(C-8)，171.34(C-15)，171.16(C-21)，78.92(C-2)，67.50(C-23)，54.33(OCH₃)，52.78(C-9)，49.97(C-16)，43.52(C-22)，43.01(C-3)，36.95(C-17)，36.92(C-24)，31.49(C-11)，31.38(C-30)，29.21(C-26)，29.18(C-27)，29.08(C-28)，28.80(C-29)，27.62(C-10)，25.23(C-25)，24.07(C-4)，22.53(C-6)，22.38(C-5)，22.17(C-31)，14.05(C-32)。以上NMR数据根据DEPT谱以及¹H-¹H COSY、HMBC、HMQC等二维谱解析结果予以归属。

化合物III为白色无定形粉末，易溶于二甲亚砜、甲醇，微溶于乙酸乙酯、丙酮、水，不溶于石油醚、二氯甲烷。[α]_D ²⁰6.0°(c 0.2，甲醇)。正离子ESI-MS m/z：594[M+Na]⁺；负离子ESI-MS m/z：570[M-H]^-，606[M+Cl]^-，616[M+45(HCOO)]^-，660[M+89(C₂O₄H)]^-。正离子HR-ESI-MS m/z：实测值594.3834[M+Na]⁺，计算值594.3843(C₂₈H₅₃N₅O₇Na[M+Na]⁺)。IR v_max cm^-1：3283，3215，2934，2862，1654，1540，1419，1320，1290，1255，1147，1122，1063，883，865，784，720，707，681，669，619。¹H-NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ：8.06(1H，d，J＝7.6Hz，H-14)，8.05(1H，d，J＝7.0Hz，H-20)，8.04(1H，d，J＝9.1Hz，H-7)，7.40(1H，br s，Ha-19)，7.20(1H，br s，Ha-13)，6.94(1H，br s，Hb-19)，6.74(1H，br s，Hb-13)，5.06(1H，dt，J＝9.1，6.9Hz，H-2)，4.62(1H，d，J＝4.8Hz，23-OH)，4.50(1H，q，J＝7.0Hz，H-16)，4.11-4.06(overlapped withthe signal of CH₃OH，H-9)，3.80-3.75(1H，m，H-23)，3.46(1H，dq，J＝14.1，7.0Hz，OCH ₂CH₃)，3.28(1H，dq，J＝14.1，7.0Hz，OCH ₂CH₃)，2.55(1H，dd，J＝15.6，7.0Hz，Ha-17)，2.43(1H，dd，J＝15.6，7.0Hz，Hb-17)，2.25-2.16(2H，m，H-22)，2.13-2.03(2H，m，H-11)，1.97-1.90(1H，m，Ha-10)，1.78-1.70(1H，m，Hb-10)，1.60-1.52(1H，m，H-4)，1.45(1H，dt，J＝13.8，6.9Hz，Ha-3)，1.40(1H，dt，J＝13.8，6.9Hz，Hb-3)，1.40-1.15(16H，m，H-24-H-31)，1.05(3H，t，J＝7.0Hz，OCH₂CH ₃)，0.86(3H，t，J＝7.2Hz，H₃-32)，0.84(3H，d，J＝6.8Hz，H₃-6)，0.81(3H，d，J＝6.6Hz，H₃-5)。¹³C-NMR(150MHz，DMSO-d₆)δ：173.72(C-12)，171.72(C-18)，171.56(C-8)，171.07(2C，C-15，21)，77.28(C-2)，67.43(C-23)，61.82(OCH₂CH₃)，52.81(C-9)，49.75(C-16)，43.38(C-22)，43.12(C-3)，36.96(C-17)，36.83(C-24)，31.44(C-11)，31.26(C-30)，29.09(C-26)，29.06(C-27)，28.96(C-28)，28.68(C-29)，27.52(C-10)，25.10(C-25)，23.90(C-4)，22.55(C-6)，22.16(C-5)，22.05(C-31)，15.05(OCH₂ CH₃)，13.91(C-32)。以上NMR数据根据DEPT谱以及¹H-¹HCOSY、HMBC、HMQC等二维谱解析结果予以归属。

化合物IV为白色无定形粉末，易溶于二甲亚砜、甲醇，微溶于乙酸乙酯、丙酮、水，不溶于石油醚、二氯甲烷。[α]_D ²⁰-24.8°(c 0.3，甲醇)。正离子ESI-MS m/z：558[M+H]⁺，580[M+Na]⁺，596[M+K]⁺；负离子ESI-MS m/z：556[M-H]^-，592[M+Cl]^-。正离子HR-ESI-MS m/z：实测值580.3684[M+Na]⁺，计算值580.3686(C₂₇H₅₁N₅O₇Na[M+Na]⁺)。IR v_max cm^-1：3274，2930，2859，1650，1632，1537，1417，1325，1281，1255，1197，1139，1112，1056，946，865，814，784，721，673，663，628，618，606。¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：8.12(1H，d，J＝7.6Hz，H-14)，8.08(1H，d，J＝8.0Hz，H-20)，8.05(1H，d，J＝9.4Hz，H-7)，7.43(1H，brs，Ha-19)，7.24(1H，br s，Ha-13)，6.97(1H，br s，Hb-19)，6.78(1H，br s，Hb-13)，4.96(1H，dt，J＝9.4，7.2Hz，H-2)，4.65(1H，d，J＝5.1Hz，23-OH)，4.50(1H，q，J＝7.0Hz，H-16)，4.13-4.05(1H，m，H-9)，3.82-3.72(1H，m，H-23)，3.12(3H，s，OCH ₃)，2.55(1H，dd，J＝15.6，7.0Hz，Ha-17)，2.42(1H，dd，J＝15.6，7.0Hz，Hb-17)，2.25-2.16(2H，m，H-22)，2.13-2.05(2H，m，H-11)，2.00-1.89(1H，m，Ha-10)，1.81-1.69(1H，m，Hb-10)，1.61-1.49(1H，m，H-4)，1.49-1.38(2H，m，H-3)，1.40-1.15(16H，m，H-24-H-31)，0.86(3H，t，J＝6.8Hz，H₃-32)，0.84(3H，d，J＝6.6Hz，H₃-6)，0.81(3H，d，J＝6.6Hz，H₃-5)。¹³C-NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：173.81(C-12)，171.91(C-18)，171.81(C-8)，171.23(C-15)，171.13(C-21)，78.94(C-2)，67.51(C-23)，54.39(OCH₃)，52.96(C-9)，49.77(C-16)，43.46(C-22)，42.87(C-3)，37.06(C-17)，36.90(C-24)，31.53(C-11)，31.36(C-30)，29.18(C-26)，29.15(C-27)，29.06(C-28)，28.78(C-29)，27.51(C-10)，25.20(C-25)，23.98(C-4)，22.68(C-6)，22.19(C-5)，22.15(C-31)，14.02(C-32)。以上NMR数据根据DEPT谱以及¹H-¹HCOSY、HMBC、HMQC等二维谱解析结果予以归属。

6.化合物V的分离制备

1)化合物V的HPLC分离精制

将含有化合物V的组分Fr-1-33(40mg)用2ml甲醇溶解，0.45μm滤膜过滤，用Waters 600型HPLC系统(Waters 600控制器、Waters 600泵、Waters 2414 RI检测器、Waters 2996 PDA检测器、Empower色谱工作站)，利用Clickβ-CD半制备柱(8mm×150mm)进行室温HPLC分离(以甲醇-水体积分数48∶52为流动相，流速2ml/min，每次进样100μl，检测波长为200nm)，制得化合物V(保留时间t_R＝42min)纯品10mg。

2)化合物V的理化常数与波谱数据

化合物V为白色无定形粉末，易溶于二甲亚砜、甲醇，微溶于乙酸乙酯、丙酮、水，不溶于石油醚、二氯甲烷。[α]_D ²⁰-3.1°(c 0.5，甲醇)。正离子ESI-MS m/z：558[M+H]⁺，580[M+Na]⁺；负离子ESI-MSm/z：592[M+Cl]^-。正离子HR-ESI-MS m/z：实测值558.3862[M+H]⁺，计算值558.3867(C₂₇H₅₂N₅O₇[M+H]⁺)；实测值580.3692[M+Na]⁺，计算值580.3686(C₂₇H₅₁N₅O₇Na[M+Na]⁺)；实测值596.3413[M+K]⁺，计算值596.3426(C₂₇H₅₁N₅O₇K[M+K]⁺)。IR v_max cm^-1：3273，2932，2859，1642，1546，1537，1463，1417，1323，1282，1156，1134，1073，909，864，783，721，707，685，662，641，617。¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：8.10(1H，d，J＝6.9Hz，H-20)，8.00(1H，d，J＝8.0Hz，H-14)，7.43(1H，d，J＝7.6Hz，H-7)，7.42(1H，br s，Ha-19)，7.20(1H，br s，Ha-13)，6.94(1H，br s，Hb-19)，6.74(1H，br s，Hb-13)，4.64(1H，br d，J＝4.8Hz，23-OH)，4.54(1H，br t，J＝4.8Hz，1-OH)，4.48(1H，q，J＝6.9Hz，H-16)，4.15-4.05(overlapped with the signal of CH₃OH，H-9)，3.84-3.72(2H，m，H-2，H-23)，3.30(1H，ddd，J＝10.6，5.6，4.8Hz，Ha-1)，3.23(1H，ddd，J＝10.6，6.0，4.8Hz，Hb-1)，2.55(1H，dd，J＝15.6，6.9Hz，Ha-17)，2.43(1H，dd，J＝15.6，6.9Hz，Hb-17)，2.25-2.17(2H，m，H-22)，2.11-2.02(2H，m，H-11)，1.97-1.85(1H，m，Ha-10)，1.78-1.65(1H，m，Hb-10)，1.63-1.52(1H，m，H-4)，1.40-1.15(18H，m，H-3，H-24-H-31)，0.86(3H，t，J＝6.8Hz，H-32)，0.86(3H，d，J＝6.4Hz，H-6)，0.82(3H，d，J＝6.4Hz，H-5)。¹³C-NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：173.95(C-12)，171.81(C-18)，171.23(C-21)，170.93(C-15)，170.56(C-8)，67.44(C-23)，63.79(C-1)，52.69(C-9)，49.91(C-16)，48.77(C-2)，43.46(C-22)，40.20(C-3)，36.95(C-17)，36.91(C-24)，31.49(C-11)，31.30(C-30)，29.14(C-26)，29.12(C-27)，29.01(C-28)，28.74(C-29)，27.77(C-10)，25.14(C-25)，24.15(C-4)，23.42(C-6)，22.11(C-5)，21.84(C-31)，13.97(C-32)。以上NMR数据根据DEPT谱以及¹H-¹H COSY、HMBC、HMQC等二维谱解析结果予以归属。

实施例2：化合物I-V的抗肿瘤活性测试

1.实验材料

1)被测样品溶液的配制

测试样品为上述实施例1中分离精制的纯品化合物I-V。精密称取适量样品，用甲醇配成所需浓度的溶液，供测试活性。

2)细胞系及细胞的继代培养

活性测试采用人髓性慢性白血病K562细胞系。K562细胞用含10％胎牛血清以及青霉素和链霉素各100μg/ml的RPMI-1640培养基常规传代，并于37℃通入5％二氧化碳的细胞培养箱中培养维护。

2.活性测试方法

样品抗肿瘤活性采用MTT法结合细胞形态学检测的方法进行测试。取对数生长期的K562细胞，用新鲜RPMI-1640培养基配制细胞密度为2×10⁵个/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200μl，37℃培养1h后样品组每孔加样品液各2μl，空白对照组则每孔加甲醇各2μl，继续于37℃培养24h。培养结束后在光学显微镜下观察细胞形态变化，判断有无细胞凋亡或细胞坏死的形态特征，必要时拍照。每孔加预冷的5mg/ml的MTT溶液(用PBS溶液配制)各20μl，37℃孵育4h后，于4℃、2000rpm离心10min，吸去上清液，每孔各加150μl DMSO，置于酶标仪上充分振荡使MTT紫色产物完全溶解，测量每孔570nm处的OD值。实验中全部测试样品和空白对照组均分别设三个平行孔，取OD平均值，以空白对照组为100％按公式IR％＝(OD_空白-OD_样品)/OD_空白×100％计算抑制率(IR％)。

3.实验结果

1)MTT法测试结果

在MTT法测试中，化合物I-V对K562细胞均显示出抑制细胞增殖的抗肿瘤活性，结果如下面的表1所示。

表1：化合物I-V对K562细胞的抑制效果

化合物(100μg/ml)	对K562细胞的抑制率
		化合物I	37.7％
化合物II	17.3％
		化合物III	34.3％
化合物IV	42.8％
		化合物V	29.2％

2)细胞形态学检测结果

在光学倒置显微镜下观察到，K562细胞分别经100μg/ml化合物I-V处理24h后，视野中部分细胞呈胞体膨大、细胞质凝集等坏死性细胞形态，表明化合物I-V主要通过对K562细胞的杀伤性细胞毒活性发挥其抑制细胞增殖的抗肿瘤作用。

4.结论

化合物I-V均具有抗肿瘤活性，主要通过杀伤性细胞毒作用发挥其抑制癌细胞增殖的抗肿瘤作用，因此化合物I-V可用作为肿瘤细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.式I化合物，或其药学上可接受的盐，

式I

其中，

R代表羟甲基、羟乙基、甲氧基、乙氧基或者C₃直链或支链烷氧基。

2.根据权利要求1所述的式I化合物，或其药学上可接受的盐，其中，R代表甲氧基、乙氧基、羟甲基或羟乙基。

3.一种组合物，其含有权利要求1或2所述的式I化合物或其药学上可接受的盐。

4.根据权利要求3所述的组合物，其还含有一种或多种药用载体或赋形剂。

5.产紫青霉AD-2-1，其保藏编号为CGMCC No.3561，保藏日期为2009年12月30日，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）。

6.权利要求1或2所述的式I化合物的制备方法，包括如下步骤：

将权利要求5所述的产紫青霉进行发酵培养，获得含有式I化合物的发酵物，将发酵物进行分离纯化，得到式I化合物。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其中，所述分离纯化包括液液萃取、柱层析、薄层层析和高效液相层析。

8.根据权利要求6或7所述的方法，包括如下步骤：

1）将权利要求5所述的产紫青霉进行发酵培养，获得发酵液；

2）将发酵液过滤，得到滤液和菌丝体；

3）将步骤2）得到的滤液用乙酸乙酯萃取，得到滤液的乙酸乙酯萃取物；

4）将步骤2）中得到的菌丝体用50％－90％（v/v）的丙酮水溶液浸提过滤，滤液经减压浓缩至不含丙酮后用乙酸乙酯萃取，得到菌丝体的乙酸乙酯萃取物；

5）将步骤3）和4）中的乙酸乙酯萃取物合并后减压浓缩至干，得到乙酸乙酯总浸膏；

6）将乙酸乙酯总浸膏依次用Sephadex LH-20柱层析和ODS柱层析分离，得到含有所述化合物的柱层析组分；

7）将含有所述化合物的柱层析组分经硅胶制备薄层层析分离，制得含有所述化合物的层析组分；

8）将层析组分用HPLC分离，得到所述化合物。

9.权利要求5所述的产紫青霉的发酵物的提取物，其特征在于，所述提取物含有权利要求1或2所述的式I化合物。

10.根据权利要求9所述的提取物，其中，所述提取物为产紫青霉AD-2-1发酵物的乙酸乙酯萃取物、乙酸乙酯总浸膏、或者层析组分。

11.权利要求1或2所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或者权利要求9或10所述的提取物在制备肿瘤细胞坏死性杀伤性细胞毒试剂或肿瘤细胞增殖抑制剂中的用途。

12.权利要求1或2所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或者权利要求9或10所述的提取物在制备抗肿瘤药物中的用途，其中，所述肿瘤为白血病。

13.根据权利要求12所述的用途，其中，所述白血病为人髓性慢性白血病。

14.权利要求5所述的产紫青霉在制备权利要求1或2所述的式I化合物或者权利要求9或10所述的提取物中的用途。