CN103992333A - 色原酮二聚体衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

色原酮二聚体衍生物及其制备方法和用途 Download PDF

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    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin

Abstract

本发明属于医药化工领域，涉及色原酮二聚体衍生物及其制备方法和用途。具体地，本发明涉及式I化合物，其中，S和R分别表示相应标位碳原子的绝对构型；R1-R3各自独立地代表各种取代基团，R3和波浪线连接的H可以取向α或β。本发明还涉及用于制备式I化合物的产紫青霉。经实验证实，式I化合物具有良好的抗肿瘤活性，可用于制备肿瘤细胞杀伤剂、肿瘤细胞增殖抑制剂、抗肿瘤剂等生物试剂，还可用于制备抗肿瘤或抗癌药物。

Description

色原酮二聚体衍生物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于医药化工领域，涉及色原酮二聚体衍生物及其制备方法和用途。
背景技术
色原酮(chromenone)系指式A所示苯并-γ-吡喃酮，而式B所示二苯并-γ-吡喃酮则称作呫吨酮(Xanthone或xanthenone)。式C所示环戊烷并色原酮和式D所示环己烷并色原酮为色原酮的衍生结构，式D所示环己烷并色原酮也可以看作是呫吨酮的四氢衍生结构。
式C和式D所示简单色原酮衍生物类化合物已知的已经较多，但该两种骨架二聚体的衍生物却非常少，仅文献(F.Kong,G.T.Carter,Remisporine B,a novel dimeric chromenone derived from spontaneousDiels–Alder reaction of remisporine A,Tetrahedron Lett.,2003,44(15),3119–3122)曾记述了命名为remisporine B的迄今为止唯一的一个已知该类二聚体衍生物。但因该文献未能阐明其绝对构型，remisporine B从物质属性上迄今仍然是一个化学结构尚未确切测定因而其物质属性尚不明确的化学物质。该文献也未曾报道该化合物有抗肿瘤活性。
发明内容
本发明人通过创造性的劳动和不懈的努力，成功获得了突变型菌株产紫青霉(Penicillium purpurogenum)AD-1-2，并从其发酵产物中分离得到下述式I所示的色原酮二聚体类化合物：
其中，
阿拉伯数字表示标位，S和R分别表示相应标位碳原子的绝对构型。其结构特征在于具有绝对构型为2S3R4S3'R(或2S3R4S3'S)的骨架结构，同时在骨架结构的碳2和2'位上连有各种取代基团。
其中，
R1-R3各自独立地代表氢、羟基、卤素、C1-10直链或支链饱和或不饱和的烃基、C1-10直链或支链饱和或不饱和的烃氧基、或C2-18直链或支链饱和或不饱和的脂肪酰氧基或芳香酰氧基，其中R3可以取向α或β。
本发明人还惊奇地发现，所述的式I化合物能够有效地杀伤多种肿瘤细胞或者抑制多种肿瘤细胞的增殖，具有良好的抗肿瘤活性，故而具备作为抗肿瘤抗癌药物的很好潜力。
由此提供了下述发明：
本发明第一方面涉及式I所示的化合物，或其药学上可接受的盐，
其中，
阿拉伯数字表示标位，S和R分别表示相应标位碳原子的绝对构型，R1-R3各自独立地代表氢、羟基、卤素、或者取代或未取代的以下基团：C1-10(例如C1-6、C1-8)直链或支链饱和或不饱和的烃基、C1-10(例如C1-6、C1-8)直链或支链饱和或不饱和的烃氧基、C2-18(例如C2-6、C2-10、C7-8、C7-12)直链或支链饱和或不饱和的脂肪酰基或芳香酰基、或C2-18(例如C2-6、C2-10、C7-8、C7-12)直链或支链饱和或不饱和的脂肪酰氧基或芳香酰氧基，
所述取代基选自羟基、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、硝基、苄氧基，所述取代基的个数为1-3个(例如1个、2个、3个)，
其中R3可以取向α或β。
在本发明中，所述式I化合物在溶液状态下，当R3为羟基时，以下面用式II所示的互变异构体IIa和IIb平衡共存的形式存在：
其中，阿拉伯数字表示相应标位。
在本发明中，所述的C1-10直链或支链饱和或不饱和的烃基为甲基、乙基、C3直链或支链烷基、C4直链或支链烷基、C5直链或支链烷基、C6直链或支链烷基、C7直链或支链烷基、C8直链或支链烷基、C9直链或支链烷基、或C10直链或支链烷基等烷烃基，或为乙烯基、C3直链或支链烯烃基、C4直链或支链烯烃基、C5直链或支链烯烃基、C6直链或支链烯烃基、C7直链或支链烯烃基、C8直链或支链烯烃基、C9直链或支链烯烃基、或C10直链或支链烯烃基等烯烃基，或为乙炔基、C3炔烃基、C4直链或支链炔烃基、C5直链或支链炔烃基、C6直链或支链炔烃基、C7直链或支链炔烃基、C8直链或支链炔烃基、C9直链或支链炔烃基、或C10直链或支链炔烃基等炔烃基，或为苯基、取代苯基、苄基、取代苄基、C8直链或支链芳烃基、C9直链或支链芳烃基、或C10直链或支链芳烃基等芳香烃基。
在本发明中，所述的C1-10直链或支链饱和或不饱和的烃氧基为甲氧基、乙氧基、C3直链或支链烷氧基、C4直链或支链烷氧基、C5直链或支链烷氧基、C6直链或支链烷氧基、C7直链或支链烷氧基、C8直链或支链烷氧基、C9直链或支链烷氧基、或C10直链或支链烷氧基等烷烃氧基，或为乙烯烃氧基、C3直链或支链烯烃氧基、C4直链或支链烯烃氧基、C5直链或支链烯烃氧基、C6直链或支链烯烃氧基、C7直链或支链烯烃氧基、C8直链或支链烯烃氧基、C9直链或支链烯烃氧基、或C10直链或支链烯烃氧基等烯烃氧基，或为乙炔烃氧基、C3炔烃氧基、C4直链或支链炔烃氧基、C5直链或支链炔烃氧基、C6直链或支链炔烃氧基、C7直链或支链炔烃氧基、C8直链或支链炔烃氧基、C9直链或支链炔烃氧基、或C10直链或支链炔烃氧基等炔烃氧基，或为苯氧基、取代苯氧基、苄氧基、取代苄氧基、C8直链或支链芳烃氧基、C9直链或支链芳烃氧基、或C10直链或支链芳烃氧基等芳香烃氧基。
在本发明中，所述的C2-18直链或支链饱和或不饱和的脂肪酰基或芳香酰基为甲酰基、乙酰基、丙酰基、丙烯酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、琥珀酰基、辛烷酰基、癸烷酰基、王浆酰基、月桂酰基、3-羟基月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、油酰基、或亚油酰基等脂肪酰基，或为苯甲酰基、取代苯甲酰基、苯乙酰基、取代苯乙酰基、2位被直链或支链C2-8烃基取代的苯乙酰基、苯丙酰基、2位被直链或支链C2-7取代的苯丙酰基、3位被直链或支链C2-7烃基取代的苯丙酰基、2位和3位同时被直链或支链C2-6烃基取代的苯丙酰基、苯丁酰基、2位被直链或支链C2-6烃基取代的苯丁酰基、3位被直链或支链C2-6烃基取代的苯丁酰基、4位被直链或支链C2-6烃基取代的苯丁酰基、2位和3位或2位和4位或3位和4位同时被直链或支链C2-5烃基取代的苯丁酰基、或2位至4位同时被直链或支链C2-4烃基取代的苯丁酰基等芳香酰基。
在本发明中，所述的C2-18直链或支链饱和或不饱和的脂肪酰氧基或芳香酰氧基为甲酰氧基、乙酰氧基、丙酰氧基、丙烯酰氧基、丁酰氧基、异丁酰氧基、戊酰氧基、异戊酰氧基、琥珀酰氧基、辛烷酰氧基、癸烷酰氧基、王浆酰氧基、月桂酰氧基、3-羟基月桂酰氧基、肉豆蔻酰氧基、棕榈酰氧基、硬脂酰氧基、油酰氧基、或亚油酰氧基等脂肪酰氧基，或为苯甲酰氧基、取代苯甲酰氧基、苯乙酰氧基、取代苯乙酰氧基、2位被直链或支链C2-8烃基取代的苯乙酰氧基、苯丙酰氧基、2位被直链或支链C2-7烃基取代的苯丙酰氧基、3位被直链或支链C2-7烃基取代的苯丙酰氧基、2位和3位同时被直链或支链C2-6烃基取代的苯丙酰氧基、苯丁酰氧基、2位被直链或支链C2-6烃基取代的苯丁酰氧基、3位被直链或支链C2-6烃基取代的苯丁酰氧基、4位被直链或支链C2-6烃基取代的苯丁酰氧基、2位和3位或2位和4位或3位和4位同时被直链或支链C2-5烃基取代的苯丁酰氧基、或2位至4位同时被直链或支链C2-4烃基取代的苯丁酰氧基等芳香酰氧基。
根据本发明的第一方面任一项所述的式I化合物，或其药学上可接受的盐，其中，
R1和R2各自独立地代表氢、羟基、或取代或未取代的以下基团：C1-10(例如C1-6、C1-8)直链或支链烷基、或C1-10(例如C1-6、C1-8)直链或支链烷氧基，优选氢、羟基、或C1-6直链或支链烷氧基，更进一步优选C1-3直链或支链烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基)；
R3代表α或β取向的氢、羟基、卤素、取代或未取代的以下基团：C1-10(例如C1-6、C1-8)直链或支链烷氧基、或C2-18(例如C2-6、C2-10、C7-8、C7-12)直链或支链饱和或不饱和的脂肪酰氧基或芳香酰氧基(例如苯甲酰氧基)，优选羟基、C1-6直链或支链烷氧基、或C1-6直链或支链脂肪酰氧基(例如乙酰氧基)。
在本发明中，所述C1-10(例如C1-6、C1-8、C1-3)直链或支链烷基是指含1-10个(例如1-6个、1-8个、1-3个)碳原子的直链或支链烷基，包括但并不局限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基等。
在本发明中，所述C1-10(例如C1-6、C1-8)直链或支链烷氧基是指C1-10(例如C1-6、C1-8)直链或支链烷基-O-，其中C1-10(例如C1-6、C1-8)直链或支链烷基的定义同上所述。
在本发明中，所述C1-6直链或支链脂肪酰氧基是指C1-6直链或支链烷基-CO-O-，其中C1-6直链或支链烷基的定义同上所述，例如乙酰氧基、正丙酰氧基、异丙酰氧基、正丁酰氧基等。
根据本发明的第一方面所述的式I化合物，或其药学上可接受的盐，其中,
R1和R2各自独立地代表甲氧基、或乙氧基；
R3代表α或β取向的羟基、甲氧基、乙氧基、或乙酰氧基。
本发明的再一方面涉及产紫青霉AD-1-2，其保藏编号为CGMCCNo.8634，保藏日期为2013年12月26日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
该菌株是将从天津塘沽驴驹河渤海湾潮间带海泥样品中分离并经分类学研究鉴定为产紫青霉(Penicillium purpurogenum)的青霉菌属的真菌野生株产紫青霉G59经硫酸二乙酯诱变所得的突变株AD-1-2。其具有如下微生物菌物学特征：
划线接种在PDA平板培养基上28℃培养3－5天后，从平板正面观察，可见到已生长形成的略偏青色的浅灰浅青色菌落，从平板反面观察，可见到渗透培养基底部的橘黄略带黄色的色素；
菌落在查氏培养基上25℃培养12天直径达17-30mm，平坦、近于平坦或有几道同心环纹；质地绒状或兼絮状；分生孢子面暗灰绿色或暗绿色，近于橄榄柠檬色、褐橄榄色、或微暗橄榄绿色；菌丝体橘黄色、黄色或橙红色；反面暗红色、橘红色或紫红色；分生孢子梗发生于基质，发生气生菌丝者少，孢梗茎(70-)100-250(-300)×2.5-3.2(-3.5)μm，壁平滑，顶端通常膨大；帚状枝双轮生，偶有三轮生或单轮生，彼此紧贴而近于平行；梗基每轮4-8个，9.0-13(-14)×2.5-3.0μm；瓶梗每轮4-6个，9.5-13×(1.8-)2.0-2.4μm，披针形，梗茎明显；分生孢子呈椭圆形，充分成熟时部分呈近球形，2.8-3.5(-4.0)×2.2-3.0μm，壁平滑或稍粗糙；分生孢子链较疏松，叉开或近于圆柱形。
本发明的还一方面涉及本发明第一方面任一项的式I化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，包括如下步骤：
将上述的产紫青霉AD-1-2进行发酵培养，获得含有式I化合物的发酵物，将发酵物进行分离纯化，得到式I化合物。
具体地，所述分离纯化包括利用本领域技术人员熟知的天然产物分离纯化的常规方法，如液液萃取、柱层析、薄层层析、高效液相层析及重结晶等。
也可以使用青霉菌属的其它能够产生式I化合物的生产菌进行发酵培养。
在本发明的一个实施方案中，所述的制备方法，包括如下步骤：
1)将上述的产紫青霉进行发酵培养，获得发酵液；
2)将发酵液过滤，得到滤液和菌体；
3)将步骤2)中得到的滤液用乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯萃取液，得到滤液的乙酸乙酯萃取浸膏；
4)将步骤2)中得到的菌体悬浮于50％－95％(v/v)的丙酮水溶液中，超声破碎菌体细胞，室温浸提过滤，滤液经减压浓缩至不含丙酮后用乙酸乙酯萃取，得菌体提取物的乙酸乙酯萃取浸膏；
5)将步骤3)和4)中得到的乙酸乙酯萃取浸膏合并，得到乙酸乙酯总浸膏；
6)将乙酸乙酯总浸膏经减压硅胶柱层析通过石油醚→二氯甲烷–甲醇体积比1:0→0:1溶剂洗脱分离分为柱层析粗组分，再经对所得粗组分的两次Sephadex LH-20柱层析(第一次用95％乙醇洗脱，第二次则用二氯甲烷–甲醇体积比1:1洗脱)分离，制得含有所述式I化合物的柱层析组分；
7)将含有所述式I化合物的柱层析组分通过两次制备型HPLC分离和精制(反相硅胶C-18柱，第一次甲醇-水体积分数85:15洗脱，第二次则用乙腈-水体积分数70:30洗脱)，制得所述式I化合物。
在本发明的一个实施方案中，所述的制备方法，其中，步骤4)中的丙酮水溶液为丙酮占55％－75％(v/v)的丙酮水溶液；具体地，为丙酮占60％－70％(v/v)的丙酮水溶液，例如丙酮占60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、或70％(v/v)的丙酮水溶液。
本发明的还一方面涉及上述的产紫青霉在制备本发明第一方面任一项的式I化合物或其药学上可接受的盐中的用途；具体地，涉及保藏编号为CGMCC No.8634的产紫青霉AD-1-2在制备本发明第一方面任一项的式I化合物或其药学上可接受的盐中的用途。
本发明的另一方面涉及一种组合物，其含有本发明的第一方面任一项的式I化合物或其药学上可接受的盐，任选地，还含有一种或多种药用载体或赋形剂。具体地，所述组合物为药物组合物。所述组合物或药物组合物能够用于抗肿瘤或抑制肿瘤细胞增殖或杀伤肿瘤细胞。
本发明的还一方面涉及本发明的第一方面的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备肿瘤细胞增殖抑制剂、或肿瘤细胞杀伤剂中的用途。
这些试剂可作为生物分子探针在肿瘤分子生物学等生命科学相关实验中使用。
本发明的再一方面涉及本发明的第一方面任一项的式I化合物或其药学上可接受的盐、或者本发明所述的组合物在制备杀伤肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞增殖的药物或试剂中的用途。
本发明的再一方面涉及一种在体内或体外杀伤肿瘤细胞或者抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括使用有效量的本发明的第一方面任一项的式I化合物或其药学上可接受的盐、或者本发明任一项所述的组合物的步骤。
本发明的再一方面涉及本发明的第一方面任一项的式I化合物或其药学上可接受的盐、或者本发明任一项所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防和/或辅助治疗肿瘤的方法，包括给予受试者有效量的本发明的第一方面任一项的式I化合物或其药学上可接受的盐、或者本发明任一项所述的组合物的步骤。
在本发明中，所述肿瘤包括但不限于，皮肤基底细胞癌，胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和CNS癌；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和/或直肠癌；结缔组织癌；消化系统的癌症；子宫内膜的癌症；食道癌；眼癌；头部和颈部的癌症；胃癌；上皮细胞内的赘生物；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小细胞和非小细胞)；淋巴瘤包括霍奇金的和非霍奇金的淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(例如，唇，舌，口腔和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；肾癌；呼吸系统的癌；肉瘤；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌；泌尿系统的癌症以及其它的癌和肉瘤等。
在本发明的实施方案中，所述肿瘤为白血病或来源于上皮的癌(例如宫颈癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、或结肠癌)；在本发明的实施方案中，所述白血病为慢性髓性白血病、急性早幼粒细胞白血病。
在本发明中，所述肿瘤细胞为来源于上述肿瘤的细胞。
在本发明的实施方案中，所述肿瘤细胞为白血病细胞或来源于上皮的癌细胞(例如为宫颈癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、或结肠癌细胞)；在本发明的实施方案中，所述白血病细胞为慢性髓性白血病细胞或急性早幼粒细胞白血病细胞。
在本发明的具体实施方案中，所述肿瘤细胞为人慢性髓性白血病K562细胞、人急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞、人子宫颈癌HeLa细胞、或人胃癌BGC-823细胞。
本发明采用MTT法，测试了所述的式I化合物对人慢性髓性白血病K562细胞、人早幼粒白血病HL-60细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人胃癌BGC-823细胞的抑制作用。并经实验证实，本发明的式I化合物可显著抑制上述各种人癌细胞的(体外)增殖，因而具有抗肿瘤作用。
本发明的式I化合物可与各种药物上可接受的载体、赋形剂或辅料配伍制成抗肿瘤药物，用于肿瘤的治疗。
本发明化合物可单独或以药物组合物的形式给药。给药途径可以是口服、非肠道或局部给药。药物组合物可根据给药途径配成各种适宜的剂型。
本发明化合物的药物组合物可以以下面的任意方式施用：口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，局部用药，非肠道用药，如皮下，静脉，肌内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中优选口服、腹膜内或静脉内给药方式。
当口服用药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊制剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。
当皮肤局部施用时，本发明化合物可制成适当的软膏、洗剂或霜剂制剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、吐温60、十六烷酯蜡、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。
本发明化合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液或无菌注射溶液。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。
另外需要指出，本发明化合物使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。优选的使用剂量介于0.01－100mg/kg体重/天。
本发明中，
术语“药学上可接受的盐”是指药用无机或有机盐。本发明式I中具有碱性基团的化合物可以与无机酸形成药用盐，例如硫酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐；也可与有机酸形成药用盐，例如乙酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、葡萄糖酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、马来酸盐等。本发明式I中具有酸性基团的化合物可以与碱金属或碱土金属形成药用盐，优选但不限于钠盐、钾盐、镁盐或钙盐。
术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
术语“受试者”可以指患者或者其它接受式I化合物或者本发明任一项所述的药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。
发明的有益效果
本发明的式I化合物能够有效地杀伤肿瘤细胞或者抑制肿瘤细胞的增殖，具有良好的抗肿瘤活性，故而具备作为抗肿瘤药物的潜力。
涉及保藏的生物材料
产紫青霉AD-1-2已于2013年12月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏编号CGMCC No.8634；分类命名为产紫青霉Penicilliumpurpurogenum。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在下面的实施例中，
以下称为化合物1的本发明化合物具有如下结构式：式I化合物，其中，R1＝R2＝OCH3，R1和R2中CH3分别标位16和16'；R3代表OH，可以取向α(2'R)，也可以取向β(2'S)；H-3'取向α(3'S)；
其中，阿拉伯数字表示标位，S和R表示相应标位碳的绝对构型。
其在溶液状态下，以下面的式III所示的互变异构体1a和1b平衡共存的形式存在：
其中，结构式上的阿拉伯数字表示标位，S和R表示绝对构型；R1代表甲氧基，其CH3标位为16，R2也代表甲氧基，其CH3标位为16'；其中，1a和1b在氯仿和DMSO溶液中的比例均约为1:0.7。
在下面的实施例中，
以下称为化合物2的本发明的化合物具有如下结构式：上述的式I化合物，其中，R1代表甲氧基，其CH3标位为16，R2代表乙氧基，其CH2和CH3标位分别为16'和17'；R3代表OH，可以取向α(2'R)，也可以取向β(2'S)；H-3'取向α(3'S)。
其在溶液状态下，以上面的式III所示的互变异构体2a和2b平衡共存的形式存在，其中，2a和2b在氯仿和DMSO溶液中的比例均约为1:0.7。
在下面的实施例中，
以下称为化合物3的本发明的化合物具有如下结构式：上述的式I化合物，其中，R1＝R2＝OCH3，R1和R2代表的甲氧基中的CH3分别标位16和16'；R3代表OH，可以取向α(2'R)，也可以取向β(2'S)；H-3'取向β(3'R)。
其在氯仿溶液中，以上面的式III所示的互变异构体3a和3b平衡共存的形式存在，其中，3a和3b的比例约为1:0.7，但在DMSO溶液中则完全以异构体3a的形式存在。
在下面的实施例中，
熔点用北京天地宇科技有限责任公司X-4型精密显微熔点测定仪，温度未校正。比旋光度用美国Rudolph Research公司Autopol II旋光仪测定。正负离子ESI-MS和HR-ESI-MS分别用美国AB公司API3000液相色谱-质谱联用仪和美国Agilent公司6520Q-TOF液相色谱-质谱联用仪测定。紫外(UV)光谱用澳大利亚GBC公司Cintra20紫外可见分光光度仪、红外(IR)光谱用美国Bruker公司Tensor-27红外光谱仪测定。核磁共振(NMR)图谱用日本JEOL公司JNM-ECA-400型或美国Bruker公司Bruker-600型超导核磁共振仪测定。园二色散(CD)光谱用法国Biologic Science公司MOS450园二色谱仪测定。ECD用Gaussian09软件，采用密度泛函理论(DFT)和含时密度泛函理论(TD-DFT)方法进行计算。计算时先用梯度校正的DFT方法和杂化的B3LYP函数，在TD-B3LYP/6-31G理论水平上，对绝对构型不同的立体分子结构进行优化，再对优化所得的立体结构进行ECD谱计算，计算采用SCRF(Self-Consistent Reaction Field)方法，所有工作均采用Gaussian09程序完成。在生物学实验中，用美国MD公司VERSAmax-BN03152酶标仪测定光密度(OD)值，用中国麦克奥迪公司AE31 EF-INV倒置显微镜检测肿瘤细胞的形态学变化。
实施例1：微生物发酵培养与化合物1-3的制备
1.发酵培养与发酵物的提取处理
1.1)生产菌株
本实施例中用于发酵生产化合物1-3的生产菌是青霉属的产紫青霉AD-1-2(Penicillium purpurogenum AD-1-2)，该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8634。
1.2)发酵培养
取4℃冰箱保存的产紫青霉AD-1-2的PDA培养基(组成：葡萄糖2％、琼脂2％、NaCl1.5％，用20％土豆的水煮液配制)试管斜面，用接种环在无菌条件下从中刮取适量菌体，划线接种在新配制的PDA固体培养基平板上，28℃培养箱中活化培养4天。从活化培养4天的PDA固体培养基平板上，收集适量新鲜孢子，悬浮于装有60ml蒸馏水和数粒玻璃珠并高压灭菌的100ml三角瓶中，充分振摇分散，配成粗制孢子悬液。取该粗制孢子悬液100μl置于96孔板中，用酶标仪测定600nm波长下的OD值，并在OD值检测下稀释孔中粗制孢子悬液，当OD值达0.35时记录稀释倍数。根据该稀释倍数，将全部粗制孢子悬液用无菌水稀释相同倍数，制得实验用孢子悬液。将该孢子悬液每份200μl分别接种于装有300ml液体发酵培养基(组成：葡萄糖2％、麦芽糖1％、甘露醇2％、谷氨酸1％、蛋白胨0.5％、酵母浸粉0.3％)的240个500ml三角烧瓶中，28℃、200rpm摇床培养12天，得发酵液共计约72L。
2.提取处理与乙酸乙酯浸膏的制备
将全部发酵液约72L用4层纱布过滤，分为滤液(约70L)和菌体。滤液(约70L)用等体积的乙酸乙酯萃取3次，得乙酸乙酯萃取浸膏13.3g。菌体用丙酮-水体积比2:1的溶液约10L混悬，超声2h破碎菌体细胞，室温浸泡提取，用4层纱布过滤，重复操作3次，合并滤液，减压浓缩至不含丙酮后，残余水层约6L用等体积乙酸乙酯萃取3次，得菌体提取物的乙酸乙酯萃取浸膏24g，合并上述滤液和菌体的乙酸乙酯萃取浸膏得菌株AD-1-2发酵提取物的乙酸乙酯萃取浸膏37.3g。
3.乙酸乙酯浸膏的柱层析分离与含有化合物1-3的柱层析组分的制备
取上述乙酸乙酯萃取浸膏37.2g，用适量氯仿–甲醇体积比1:1溶液溶解，加68g硅胶(100～200目)拌样，干燥研磨均匀后添加到用300g硅胶(100～200目)预装好的常压玻璃柱(柱床：7.5cm×20cm)上，以b.p.60–90℃石油醚(以下简称石油醚)→二氯甲烷–甲醇体积比1:0→0:1的混合溶剂系统为洗脱剂进行减压梯度洗脱柱层析分离。在层析洗脱过程中，分别各接450ml每个流份，根据薄层层析检测结果，合并相应洗脱流份，经浓缩干燥，共分为6个组分：Fr-1(3.0g，石油醚→二氯甲烷洗脱部分)、Fr-2(4.0g，二氯甲烷-甲醇体积比99:1→98:2洗脱部分)、Fr-3(7.0g，二氯甲烷–甲醇体积比98:2→96:4洗脱部分)、Fr-4(6.0g，二氯甲烷–甲醇体积比96:4→92:8洗脱部分)、Fr-5(10.0g，二氯甲烷–甲醇体积比96:4→80:20洗脱部分)、Fr-6(5.0g，甲醇洗脱部分)。
Fr-3(7.0g)用适量95％(v/v，以下同)乙醇溶解，湿法上样，添加到在95％乙醇中预装好的Sephadex LH-20柱(柱床：5.0cm×43cm)上，以95％乙醇为洗脱剂进行层析分离，收集各10ml每个洗脱流份，根据薄层检测结果合并浓缩，按洗脱先后顺序分为6个组分：Fr-3-1(0.6g)、Fr-3-2(2.0g)、Fr-3-3(1.0g)、Fr-3-4(1.0g)、Fr-3-5(2.0g)、Fr-3-6(0.4g)。
Fr-3-5(2.0g)用适量二氯甲烷–甲醇体积比1:1溶液溶解，湿法上样，添加到在二氯甲烷–甲醇体积比1:1中预装好的Sephadex LH-20柱上(柱床：1.8cm×80cm)，以二氯甲烷–甲醇体积比1:1溶液为洗脱剂进行层析分离，分别收集各5ml洗脱液为每个层析流份，根据薄层检测结果合并浓缩，按洗脱先后顺序依次分为4个组分：Fr-3-5-1(100mg)、Fr-3-5-2(800mg)、Fr-3-5-3(300mg)、Fr-3-5-4(800mg)。其中组分Fr-3-5-4为含有化合物1-3的柱层析组分。
4.化合物1-3的HPLC分离制备
将含有化合物1-3的组分Fr-3-5-4(800mg)用适量甲醇溶解并经0.22μm滤膜过滤后，用Waters600型HPLC系统(Waters600控制器、Waters600泵、Waters2998PDA检测器、Empower色谱工作站)进行制备型HPLC(HPLC柱：Capcell Pak C18，，5μm，20×250mm；柱温：室温；流动相：甲醇–水体积分数85:15，流速5.0ml/min；检测波长：210和242nm)分离，得粗品1(17.1mg，保留时间(tR)＝26.1min)、粗品2(8.0mg，tR＝28.9min)和粗品3(12.0mg，tR＝27.1min)。将粗品1–3全量再分别经制备型HPLC(HPLC柱：CapcellPak C18，MGII5μm，20×250mm；柱温：室温；流动相：乙腈–水体积分数70:30，流速8.0ml/min；检测波长：210和242nm)纯化精制，制得化合物1纯品12.5mg(tR＝38.4min)、化合物2纯品6.2mg(tR＝43.5min)和化合物3纯品5.3mg(tR＝40.6min)。
5.化合物1-3的理化常数与波谱数据
化合物1为黄色无定型粉末，易溶于氯仿，可溶于甲醇、丙酮，不溶于水，+524.4(c0.16,MeOH)。正离子ESI-MS m/z:559[M-H2O+H]+,577[M+H]+,599[M+Na]+；负离子ESI-MS m/z:575[M-H]-。正离子HR-ESI-MS m/z:实测值577.1349[M+H]+,计算值C30H25O12[M+H]+577.1346。UVλmax nm(logε)in MeOH:206.3(4.42),227.6(4.45),240.4(4.50),258.0sh(4.40),323.2(3.83)。IRνmax cm-1(DiamondATR crystal):2955,1742,1656,1626,1598,1491,1447,1364,1282,1205,1063,1027,1005,899,875,826.CDΔε(nm)in MeOH:+4.97(200.0),15.31(207.0),0(226.5),-2.50(238.0),0(241.5),+14.79(260.0),0(269.5),-7.48(281.5),0(296.5),+4.99(332.0),0.15(399.5)。1H及13C NMR数据：DMSO-d6中600MHz1H及150MHz13C NMR数据见表1；CDCl3中400MHz1H NMR数据见表2。表1中所示化合物1的1H及13C NMR数据基于1D GOESY NOE差光谱以及HMQC、HMBC、NOESY等2DNMR谱解析结果予以归属。
表1.化合物1在DMSO-d6中的600MHz1H及150MHz13C NMR数据
本表解析归纳了化合物1在DMSO-d6中的1H及13C NMR数据。如表中所示，化合物1在DMSO-d6中给出两组分别对应于上述式II中所示1a(2'β-OH，2'S)和1b(2'α-OH，2'R)两种异构体的1H及13C NMR信号，表明该化合物在DMSO-d6溶液中以1a和1b互变异构的形式存在。根据部分相关1H信号的积分比，测定1a和1b在DMSO-d6中的比例约为1:0.7。
表2.化合物1在CDCl3中的400MHz1H NMR数据
本表解析归纳了化合物1在CDCl3中的1H NMR数据。如表中所示，化合物1在CDCl3中给出两组分别对应于上述式II中所示1a(2'β-OH，2'S)和1b(2'α-OH，2'R)两种异构体的1H NMR信号，表明该化合物在CDCl3溶液中以1a和1b互变异构的形式存在。根据部分相关1H信号的积分比，测定1a和1b在CDCl3中的比例约为1:0.7。
在GOESY和NOESY谱中，化合物1在H-4与H-3以及在H-3'与H-3、H-4、H-4'、HO-2'之间该出了NOE信号。根据这些NOE确定了化合物1的相对构型，并基于CD数据和生物合成途径，确定其绝对构型为2S3R4S3'S，还根据其在理化学及现代谱学测试中所表现出的物质特性确定1在溶液状态下以上述式II所示异构体1a(2'β-OH，2'S)和1b(2'α-OH，2'R)处于互变平衡状态的形式存在。根据相关1H信号的积分比，测定1a和1b在CDCl3和DMSO-d6中存在的比例均为约1:0.7。
化合物2为黄色无定型粉末，易溶于氯仿，可溶于甲醇、丙酮，不溶于水，+531.6(c0.07,MeOH)。正离子ESI-MS m/z:573[M-H2O+H]+,591[M+H]+,613[M+Na]+,629[M+K]+；负离子ESI-MSm/z:589[M-H]-。正离子HR-ESI-MS m/z:实测值591.1497[M+H]+,计算值C30H25O12[M+H]+591.1503。UVλmax nm(logε)in MeOH:205.4(4.33),227.5(4.36),241.3(4.43),259.5sh(4.33),325.8(3.74)。IRνmax cm-1(Diamond ATR crystal):2957,2919,1748,1653,1623,1600,1490,1446,1356,1290,1200,1068,1034,1019,919,876,824。CDΔε(nm)in MeOH:+6.03(200.0),18.49(207.0),0(229.0),-2.56(235.5),0(241.0),+16.03(258.5),0(271.0),-4.38(281.5),0(296.5),+4.77(331.5),0.17(401.0)。1H及13C NMR数据：DMSO-d6中600MHz1H及150MHz13C NMR数据见表3；CDCl3中400MHz1H NMR数据见表4。表3中所示化合物2的1H NMR数据系通过解析DMSO-d6中测定的1H与13C NMR图谱以及2D NOESY图谱予以归属。
表3.化合物2在DMSO-d6中的600MHz1H及150MHz13C NMR数据
本表解析归纳了化合物2在DMSO-d6中的1H及13C NMR数据。如表中所示，化合物2在DMSO-d6中给出两组分别对应于上述式II中所示2a(2'β-OH，2'S)和2b(2'α-OH，2'R)两种异构体的1H及13C NMR信号，表明该化合物在DMSO-d6溶液中以2a和2b互变异构的形式存在。由相关部分1H信号的积分比，测定2a和2b在DMSO-d6中的比例约为1:0.7。
表4.化合物2在CDCl3中的400MHz1H NMR数据
本表解析归纳了化合物2在CDCl3中的1H NMR数据。如表中所示，化合物2在CDCl3中给出两组分别对应于上述式II中所示2a(2'β-OH，2'S)和2b(2'α-OH，2'R)两种异构体的1H NMR信号，表明该化合物在CDCl3溶液中以2a和2b互变异构的形式存在。由相关部分1H信号的积分比，测定2a和2b在CDCl3中的比例约为1:0.7。
在NOESY谱中，化合物2在H-3'与H-3、H-3'与H-4、H-3'与H-4'之间该出了NOE信号。根据这些NOE确定了化合物2的相对构型，并基于CD数据和生物合成途径，确定其绝对构型为2S3R4S3'S，还根据在理化学及现代谱学测试中所表现出的物质特性，确定其在DMSO-d6和CDCl3溶液中以上述式II所示2a(2'β-OH，2'S)和2b(2'α-OH，2'R)处于互变异构的状态存在。根据相关1H信号的积分比，测定2a和2b在CDCl3和DMSO中存在的比例均为约1:0.7。
化合物3为黄色无定型粉末，易溶于氯仿，可溶于甲醇、丙酮，不溶于水，+898.9(c0.18,MeOH)。正离子ESIMS m/z:559[M-H2O+H]+,577[M+H]+,599[M+Na]+；负离子ESI-MS m/z:575[M-H]-。UVλmax nm(logε)in MeOH:204.6(4.34),227.2(4.34),240.5(4.40),259.5sh(4.25),323.3(3.71)。CDΔε(nm)in MeOH:+2.15(200.0),13.41(207.0),0(214.5),-5.19(230.5),0(239.0),+15.46(259.5),0(271.0),-2.91(280.0),0(292.5),+5.29(332.0),0.15(399.5)。1H及13C NMR数据：DMSO-d6中400MHz1H及100MHz13C NMR数据见表5；CDCl3中400MHz1H NMR数据见表6。
表5.化合物3在DMSO-d6中的400MHz1H及100MHz13C NMR数据
此表所列化合物3在DMSO-d6中的1H及13C NMR数据为上述式II中3a所示的该化合物的2'β-OH(2'S)异构体的1H及13C NMR数据。该化合物在DMSO-d6中并没有给出任何与上述式II中3b所示的2'α-OH(2'R)异构体的1H及13C NMR信号，表明化合物3在DMSO-d6溶液中仅以3a形式存在。
表6.化合物3在CDCl3中的400MHz1H NMR数据
本表解析归纳了化合物3在CDCl3中的1H NMR数据。如表中所示，化合物3在CDCl3中给出两组分别对应于上述式II中所示3a(2'β-OH，2'S)和3b(2'α-OH，2'R)两种异构体的1H NMR信号，表明该化合物在CDCl3溶液中以3a和3b互变异构的形式存在。由相关部分1H信号的积分比，测定3a和3b在CDCl3中的比例约为1:0.7。
本发明根据ROESY谱中H-3与H-4之间的NOE测定了化合物3的相对构型，并根据其在理化学及现代谱学测试中所表现出的物质特性推知3可能是2'–OH处于α和β互变异构状态的、绝对构型为2S3R4S3'R或2R3S4R3'S的化合物中的某一个。在此基础上，本发明对绝对构型为2S3R4S3'R和2R3S4R3'S的化合物3的两种可能结构进行了ECD谱的量子力学计算，并通过将该两种化合物的计算ECD图谱与化合物3的实测CD谱进行比对分析，最终确定了3是绝对构型为2S3R4S3'R的化合物。该化合物在CDCl3溶液中以上述式II所示3a(2'β-OH，2'S)和3b(2'α-OH，2'R)互变异构的形式存在，而在DMSO-d6溶液中则仅以异构体3a的形式存在。根据相关1H信号的积分比，测定3a和3b在CDCl3中的比例约为1:0.7。
由于受化学结构方面的根本特性所限制，由半缩醛结构中的游离羟基所产生的α和β异构体(如本实施例中所示的1a和1b、2a和2b、以及3a和3b等)通常根本无法分离得到。或者，即使是分离到了，当将其溶于相应溶液中时，由于相互间的互变异构现象，很快又变为α和β两种异构体处于动态平衡的共存状态。
实施例2：化合物1-3的抗肿瘤活性测试
1.实验材料
1)被测样品溶液的配制
受试样品为上述实施例1中分离精制的纯品化合物1、2和3。三水多烯紫杉醇(北京奇米沃科技有限公司，批号20110326)用作阳性对照样品。精密称取适量样品，用甲醇配成所需浓度的溶液，供测试活性。
2)细胞系及细胞的继代培养
活性测试采用人慢性髓细胞性白血病K562细胞系、人急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞系、人宫颈癌HeLa细胞系、人胃癌BGC-823系。K562、HL-60、HeLa、BGC-823细胞分别用含10％胎牛血清以及青霉素和链霉素各100μg/ml的RPMI-1640培养基常规传代，并于37℃通入5％二氧化碳的细胞培养箱中培养维护。
2.活性测试方法
样品的抗肿瘤活性采用MTT法结合细胞形态学检测的方法进行测试。分别取对数生长期的K562、HL-60、HeLa、BGC-823，用新鲜RPMI-1640培养基配制成细胞密度为2×105个/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200μl。接种后，悬浮细胞K562和HL-60于37℃培养1h，贴壁细胞HeLa、BGC-823则于37℃培养12h。之后，样品组每孔加样品液各2μl，空白对照组则每孔加甲醇各2μl，继续于37℃培养24h。培养结束后在光学显微镜下观察细胞形态变化，判断有无细胞凋亡或细胞坏死的形态特征，必要时拍照。继而，每孔加预冷的5mg/ml的MTT溶液(用PBS溶液配制)各20μl，37℃孵育4h后4℃、2000rpm离心10min，吸去上清液，每孔各加150μl DMSO，置于酶标仪上充分振荡使MTT紫色产物完全溶解，测量每孔570nm处的OD值。实验中样品和空白对照组均分别设三个平行孔，取OD平均值，以空白对照组为100％，按IR％＝(OD空白-OD样 品)/OD空白×100％公式，计算样品对受试癌细胞的抑制率(IR％)，再由不同浓度下的抑制率求算样品对受试癌细胞的半数抑制浓度(IC50)。
3.实验结果
1)MTT法测试结果
在MTT法测试中，化合物1、2和3对受试K562、HL-60、HeLa、BGC-823细胞均显示出抑制细胞增殖的抗肿瘤活性，在100μg/ml作用浓度下对这些癌细胞的抑制率如表7中所示。
表7.化合物1、2和3对人癌细胞的抑制效果
鉴于化合物1-3在100μg/ml作用浓度下对K562和HL-60细胞的抑制率大于50％，进一步测定了1-3对该两种细胞的半数抑制浓度(IC50)。化合物1、2、3对K562细胞的IC50分别为：69.0μg/ml(119.8μM)、53.1μg/ml(90.0μM)、83.1μg/ml(144.3μM)；而对HL-60细胞的IC50则分别为：62.9μg/ml(109.2μM)、54.7μg/ml(92.7μM)、75.3μg/ml(130.7μM)。
在上述MTT法测试中，阳性对照多西紫杉醇在100μg/ml作用浓度下对受试癌细胞的抑制率见表7。
2)细胞形态学检测结果
在光学倒置显微镜下观察到，上述受试癌细胞分别经100μg/ml化合物1、2和3处理24h后，视野中部分细胞呈胞体膨大、细胞质凝集等坏死性细胞形态，表明化合物1、2和3主要通过对受试癌细胞的杀伤性细胞毒活性发挥其抑制癌细胞增殖的抗肿瘤作用。
4.结论
化合物1、2和3对人慢性髓细胞性白血病K562细胞、人急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞、人子宫颈癌HeLa细胞、人胃癌BGC-823细胞均具有抗肿瘤活性，且主要通过杀伤性细胞毒作用发挥其抑制癌细胞增殖的抗肿瘤作用，因此化合物1、2和3可用作为肿瘤细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (14)

1.式I化合物，或其药学上可接受的盐，
其中，S和R分别表示相应标位碳原子的绝对构型，波浪线连接的H可以取向α或β；R1-R3各自独立地代表氢、羟基、卤素、或者取代或未取代的以下基团：C1-10(例如C1-6、C1-8)直链或支链饱和或不饱和的烃基、C1-10(例如C1-6、C1-8)直链或支链饱和或不饱和的烃氧基、C2-18(例如C2-6、C2-10、C7-8、C7-12)直链或支链饱和或不饱和的脂肪酰基或芳香酰基、或C2-18(例如C2-6、C2-10、C7-8、C7-12)直链或支链饱和或不饱和的脂肪酰氧基或芳香酰氧基，
所述取代基选自羟基、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、硝基、苄氧基，所述取代基的个数为1-3个(例如1个、2个、3个)，
其中R3可以取向α或β。
2.根据权利要求1所述的式I化合物，或其药学上可接受的盐，
其中，
S和R分别表示相应标位碳原子的绝对构型，波浪线连接的H可以取向α或β；
R1和R2各自独立地代表氢、羟基、或取代或未取代的以下基团：C1-10(例如C1-6、C1-8)直链或支链烷基、或C1-10(例如C1-6、C1-8)直链或支链烷氧基，优选氢、羟基、或C1-6直链或支链烷氧基，更进一步优选C1-3直链或支链烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基)；
R3代表α或β取向的氢、羟基、卤素、取代或未取代的以下基团：C1-10(例如C1-6、C1-8)直链或支链烷氧基、或C2-18(例如C2-6、C2-10、C7-8、C7-12)直链或支链饱和或不饱和的脂肪酰氧基或芳香酰氧基(例如苯甲酰氧基)，优选羟基、C1-6直链或支链烷氧基(例如甲氧基、乙氧基)、或C1-6直链或支链脂肪酰氧基(例如乙酰氧基)。
3.根据权利要求1或2所述的式I化合物，或其药学上可接受的盐，
其中，
S和R分别表示相应标位碳原子的绝对构型，波浪线连接的H可以取向α或β；
R1和R2各自独立地代表甲氧基、或乙氧基；
R3代表α或β取向的羟基、甲氧基、乙氧基、或乙酰氧基。
4.产紫青霉AD-1-2，其保藏编号为CGMCC No.8634，保藏日期为2013年12月26日，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。
5.权利要求1至3任一项所述的式I化合物的制备方法，包括如下步骤：
将权利要求4所述的产紫青霉进行发酵培养，获得含有式I化合物的发酵物，将发酵物进行分离纯化，得到式I化合物；
具体地，所述分离纯化包括液液萃取、柱层析、薄层层析、高效液相层析。
6.根据权利要求5所述的方法，包括如下步骤：
1)将上述的产紫青霉进行发酵培养，获得发酵液；
2)将发酵液过滤，得到滤液和菌体；
3)将步骤2)中得到的滤液用乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯萃取液，得到滤液的乙酸乙酯萃取浸膏；
4)将步骤2)中得到的菌体悬浮于50％－95％(v/v)的丙酮水溶液中，超声破碎菌体细胞，室温浸提过滤，滤液经减压浓缩至不含丙酮后用乙酸乙酯萃取，得菌体提取物的乙酸乙酯萃取浸膏；
5)将步骤3)和4)中得到的乙酸乙酯萃取浸膏合并，得到乙酸乙酯总浸膏；
6)将乙酸乙酯总浸膏经减压硅胶柱层析通过石油醚→二氯甲烷–甲醇体积比1:0→0:1溶剂洗脱分离分为柱层析粗组分，再经对所得粗组分的两次Sephadex LH-20柱层析(第一次用95％乙醇洗脱，第二次则用二氯甲烷–甲醇体积比1:1洗脱)分离，制得含有所述式I化合物的柱层析组分；
7)将含有所述式I化合物的柱层析组分通过两次制备型HPLC分离和精制(反相硅胶C-18柱，第一次甲醇-水体积分数85:15洗脱，第二次则用乙腈-水体积分数70:30洗脱)，制得所述式I化合物。
7.组合物，其含有权利要求1至3任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐，任选地，还含有一种或多种药用载体或赋形剂。
8.权利要求1至3任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐、或者权利要求7所述的组合物在制备肿瘤细胞杀伤剂或肿瘤细胞增殖抑制剂中的用途。
9.权利要求1至3任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐、或者权利要求7所述的组合物在制备杀伤肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞增殖的药物或试剂中的用途。
10.一种在体内或体外杀伤肿瘤细胞或者抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括使用有效量的权利要求1至3任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐、或者权利要求7所述的组合物的步骤。
11.权利要求1至3任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐、或者权利要求7所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
12.权利要求8-11任一项的用途，其中所述肿瘤包括但不限于，皮肤基底细胞癌，胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和CNS癌；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和/或直肠癌；结缔组织癌；消化系统的癌症；子宫内膜的癌症；食道癌；眼癌；头部和颈部的癌症；胃癌；上皮细胞内的赘生物；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小细胞和非小细胞)；淋巴瘤包括霍奇金的和非霍奇金的淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(例如，唇，舌，口腔和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；肾癌；呼吸系统的癌；肉瘤；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌；泌尿系统的癌症以及其它的癌和肉瘤等。
13.权利要求8-11任一项的用途，其中所述肿瘤为白血病(例如慢性髓性白血病、急性早幼粒细胞白血病)或来源于上皮的癌(例如宫颈癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、或结肠癌)。
14.权利要求4所述的产紫青霉在制备权利要求1至3任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐中的用途。
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