CN1676521B

CN1676521B - 苦参酮及其衍生物、类似物在制备抗肿瘤药物中的用途

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Publication number: CN1676521B
Application number: CN 200410030938
Authority: CN
Inventors: 严孝强; 崔玉敏; 颜建华; 潘柯; 张维汉; 黄伟晖; 洪建荣; 段继峰; 左剑
Original assignee: Hutchison Whampoa Ltd
Current assignee: Hutchison Whampoa Ltd
Priority date: 2004-04-01
Filing date: 2004-04-01
Publication date: 2010-04-28
Anticipated expiration: 2024-04-01
Also published as: CN1676521A

Abstract

本发明涉及一种苦参酮及其衍生物、类似物的制药用途，具体涉及苦参黄酮及其衍生物、类似物在制备抗肿瘤药物中的用途。本发明开发了苦参酮及其衍生物、类似物新的医药用途。

Description

苦参酮及其衍生物、类似物在制备抗肿瘤药物中的用途

技术领域

本发明涉及一种苦参酮及其衍生物、类似物的制药用途，具体涉及苦参酮、槐黄烷酮G和2’-甲氧基-苦参酮在制备抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

传统中药苦参(Sophora flavescens Ait)为豆科槐属植物，其性寒味苦，有清热解毒、明目止泪、祛风杀虫、安五脏、转身定志的作用。从中分离出的主要化学成分可分为两大类，即苦参生物碱和苦参黄酮。有人已从苦参根、茎、叶和花中共分离出23种生物碱及32种黄酮与异黄酮类化合物(苗抗立，张建中等，天然产物研究与开发，2000，13(2)：69～73)。其中，对于苦参生物碱如苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱和槐定碱等的抗肿瘤作用已有了较为广泛的研究。体外研究结果表明：苦参生物碱对白血病及表皮癌具有较强的抑制作用(王秀坤，李家实等，中华血液学杂志，1991，12(1)：89～90)。而对苦参黄酮在抗肿瘤方面的研究尚有限。韩国的Shi Yong Ryu于1997年首次报道了其分离的15种苦参黄酮类单体化合物(包括苦参酮和槐黄烷酮G)对非小细胞肺癌、卵巢癌、皮肤癌，中枢神经系统肿瘤和结肠癌细胞株具有不同程度的抑制作用(Shi Yong Ryu，Sang Un Choi，et al.，Phytotherapy Research，11：51～53，1997)。2000年W.G.KO等进一步报道了苦参黄酮类化合物(lavandulyflavonoids)(包括苦参酮和2’-甲氧基-苦参酮)可诱导白血病细胞HL-60及肝癌细胞Hep-G2的凋亡(W.G.Ko，T.H.Kang，et al.，Toxicology inVitro，14：429～433，2000)。

苦参酮(Kurarinone)的主要植物来源为豆科的苦参(Sophora flavescensAit)和龙胆科的秦艽(Gentiana macrophylla Pall)，其化学结构式为：

分子式C₂₆H₃₀O₆，分子量438.52，熔点121～123℃

2’-甲氧基-苦参酮(2’-methoxy-Kurarinone)又名异苦参酮(Isokurarinone)，为黄色晶体，其化学结构式为：

分子式C₂₇H₃₂O₆，分子量438，熔点102-104℃

槐黄烷酮G(Sophoraflavanone G)又名降苦参酮(Norkurarinone)，为无色针晶(苯)，其化学结构式为：

分子式C₂₅H₂₈O₆，分子量424.49，熔点173-175℃

苦参酮、2’-甲氧基-苦参酮及槐黄烷酮G对其他癌株的抑制作用或临床应用未见有文献报道。

发明内容

本发明的目的旨在寻找并开发苦参酮、其衍生物、类似物以及它们的前药、可药用盐的新的医药用途，提供一种苦参酮及其衍生物、类似物以及它们的前药、可药用盐在制备抗肿瘤药物中的用途。

本发明涉及下列通式(I)所示的苦参酮、其衍生物、类似物以及它们的前药、可药用盐在制备抗肿瘤药物中的用途：

其中，R₁、R₂、R₃、R₄代表OR₆，R₆为氢、C1～C6烷基、C1～C6烯基、C1～C6炔基或C1～C6苯烷基；

R₅代表C1～C5直链或支链的烷基、烯基、炔基或苯烷基。

本发明还涉及包含上述化合物的药物组合物。

本发明人经研究发现，下述通式(I)的化合物或其前药、可药用盐可明显抑制多种肿瘤细胞的活性，故可用于制备抗肿瘤药物：

其中，R₁、R₂、R₃、R₄代表OR₆，R₆为氢、C₁～C₆烷基、C₁～C₆烯基、C₁～C₆炔基或C₁～C₆苯烷基；

R₅代表C₁～C₁₅直链或支链的烷基、烯基、炔基或苯烷基。

优选R₆代表氢、C₁～C₆烷基；R₅代表C₁～C₁₅直链或支链的烷基、烯基、炔基。最优选R₆代表氢、-CH₃；R₅代表

当R₁代表-OH、R₂代表-OH、R₃代表-OCH₃、R₄代表-OH、R₅代表时，所述化合物为苦参酮，所述肿瘤不是非小细胞肺癌、卵巢癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤、结肠癌、白血病或肝癌；

当R₁代表-OH、R₂代表-OH、R₃代表-OH、R₄代表-OH、R₅代表

时，所述化合物为槐黄烷酮G，所述肿瘤不是非小细胞肺癌、卵巢癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤或结肠癌；

当R₁代表-OCH₃、R₂代表-OH、R₃代表-OCH₃、R₄代表-OH、R₅代表时，所述化合物为2’-甲氧基-苦参酮，所述肿瘤不是白血病或肝癌。

特别是，当所述化合物为苦参酮(R₁代表-OH、R₃代表-OCH₃、R₅代表

)时，所述肿瘤包括但不限于：食管癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、淋巴瘤或恶性黑色素瘤。

当所述化合物为槐黄烷酮G(R₁代表-OH、R₃代表-OH、R₅代表)时，所述肿瘤包括但不限于：食管癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、淋巴瘤或恶性黑色素瘤。

当所述化合物为2’-甲氧基-苦参酮(R₁代表-OCH₃、R₃代表-OCH₃、R₅代表-

)时，所述肿瘤包括但不限于：食管癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、淋巴瘤、结肠癌、肺癌或恶性黑色素瘤。

这些化合物均可按本领域的常规方法从苦参中提取或者通过商业途径获得。

本发明的化合物的可药用盐包括各种无机或有机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、扁桃酸盐和草酸盐；各种无机或有机碱盐如氢氧化钠、三羟甲基氨基甲烷(TRIS，tromethane)和N-甲基-葡萄糖胺。

本发明的化合物的前药包括含有该化合物的羧酸酯(可按本领域的常规方法用C_1-4的醇浓缩制得)、含有该化合物的羟基酯(可按本领域的常规方法用C_1-4的羧酸，C_3-6的二羧酸或其酸酐，如马来酸酐，富马酸酐等浓缩制得)、含有该化合物的烯胺(可按本领域的常规方法用C_1-4的醛或酮浓缩制得)或含有该化合物的缩醛或者缩酮(可按本领域的常规方法用氯甲基甲醚或氯甲基乙醚浓缩制得)等(Albert S.KearneyAdvancedDrug Reviews.19(1996)：229-234).。

本发明的苦参酮、2’-甲氧基-苦参酮或槐黄烷酮G可以单独使用或以药物组合物的形式使用。药物组合物包括作为活性成份的苦参酮、2’-甲氧基-苦参酮或槐黄烷酮G及可药用载体。

所述可药用载体为各种常用的药物辅料如填充剂(无水乳糖、淀粉、乳糖珠粒、葡萄糖)、粘合剂(微晶纤维素)、崩解剂(交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素、交联PVP)、润滑剂(硬酯酸镁)以及吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、稀释剂、赋形剂、润湿剂等。

所述药物组合物可按本领域常规方法制备并可以通过肠道或非肠道或局部途径给药。口服制剂包括片剂、颗粒剂、胶囊、悬浮液、溶液等，非肠道给药制剂包括注射液；局部给药制剂包括如霜剂、软膏剂、贴剂、喷雾剂等。

所述药物的给药途径可以为口服、舌下、皮下、肌肉、粘膜、尿道、阴道、静脉等。

本发明的苦参酮、2’-甲氧基-苦参酮、槐黄烷酮G或其药物组合物的用量可根据给药途径，患者的年龄和体重，所治疗肿瘤的类型及严重程度的不同而不同，其日剂量可以是0.001～100mg/kg，可一次或多次给药。

附图说明

图1苦参酮(K1)、2’-甲氧基-苦参(K2)、槐黄烷酮G(K3)对胃腺癌细胞(AGS)增殖的抑制作用。

图2苦参酮(K1)、2’-甲氧基-苦参(K2)、槐黄烷酮G(K3)对肺腺癌细胞(SPC-A-1)增殖的抑制作用。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。但并不意味着本发明仅限于此。

实施例1三种单体的分离与鉴定。

苦参酮的分离与鉴定

500克的苦参干药材用3000毫升95％的乙醇室温浸提3次，提取液合并，经真空浓缩蒸干，得粗提物65克。提取物经水和乙酸乙酯分配三次，合并乙酸乙酯溶液，浓缩蒸干得30克浸膏。浸膏经LH-20柱层析，以甲醇为洗脱剂，得10克的粗品。粗品依次用硅胶柱层析，洗脱剂丙酮/石油醚＝1∶2，及反相材料(RP-18)柱层析，以甲醇/水＝65∶35洗脱得2克的苦参酮(得率0.4％)。

经波谱鉴定所得化合物为苦参酮：C₂₆H₃₀O₆(T₁₅)

¹H NMR(DMSO-d6，400MHz)：10.2(2’-OH)，9.4(4’-OH)，9.2(7-OH)，7.4(1H，d，J＝8.4Hz，H-6’)，6.32(1H，d，J＝2.28Hz，H-3’)，6.25(1H，dd，J＝8.2，2.4Hz，H-5)，6.12(1H，s，H-6)，5.4(1H，dd，J＝2.6，13.1Hz，H-2)，4.9(1H，q，J＝6.7，1.4Hz)，4.55(1H，brs)，4.47(1H，brs)，3.7(3H，s)，2.8(1H，dd，J＝13.1，16.3Hz，H-3a)，2.4(3H，m)，1.9(2H，m)，1.6(3H，s)，1.57(3H，s)，1.42(3H，s)。

¹³C NMR(DMSO-d6，75MHz)：188.5，162.1，161.7，159.2，157.7，154.9，147.6，130.3，127.0，123.1，116.1，110.5，106.7，106.0，104.1，102.1，92.3，73.4，55.2，46.3，44.3，30.7，26.9，25.5，18.6，17.6。

ESIMS(m/z)：439。

2’-甲氧基-苦参酮的分离与鉴定

500克的苦参干药材用3000毫升95％的乙醇室温浸提3次，提取液合并，经真空浓缩蒸干，得粗提物65克。提取物经水和乙酸乙酯分配三次，合并乙酸乙酯溶液，浓缩蒸干得30克浸膏。12克浸膏经LH-20柱层析，以甲醇为洗脱剂，得50毫克的粗品。粗品依次用硅胶柱层析，洗脱剂丙酮/石油醚＝1∶3，及反相材料(RP-18)柱层析，以甲醇/水＝75∶25洗脱得20mg的2’-甲氧基苦参酮(得率0.01％)。

经波谱技术鉴定所得化合物为2’-甲氧基-苦参酮：C₂₇H₃₂O₆

¹H NMR(CDCl3，400MHz)：7.4(1H，d，J＝8.2Hz，H-6’)，6.48(1H，dd，J＝8.21，2.34Hz，H-5’)，6.44(1H，d，J＝2.35Hz，H-3’)，6.08(1H，s，H-6)，5.62(1H，m，H-2)，5.0(1H，m)，4.72(1H，brs)，4.66(1H，brs)，3.8(3H，s)，3.76(3H，s)，2.84(1H，m，H-3a)，2.4(3H，m)，1.67(3H，s)，1.63(3H，s)，1.6(2H，m)，1.52(3H，s)。

ESIMS(m/z)：451(M-1)。

为黄色晶体，mp 102-104℃，

UV(MeOH)λ_max(logε)286(4.3)nm，

IR(KBr)v_max 3291，2955，2920，1650，1590，1500，1465，1410，1280cm^-1。

槐黄烷酮G的分离与鉴定：

500克的苦参干药材用3000毫升95％的乙醇室温浸提3次，提取液合并，经真空浓缩蒸干，得粗提物65克。提取物经水和乙酸乙酯分配三次，合并乙酸乙酯溶液，浓缩蒸干得30克浸膏。浸膏经LH-20柱层析，以甲醇为洗脱剂，得15克的总黄酮。粗品依次用硅胶柱层析，洗脱剂丙酮/石油醚＝1∶3，得到Norkurarinone粗品500mg，接着反相材料(RP-18)柱层析，以甲醇/水＝70∶30洗脱得300mg的槐黄烷酮G(Norkurarinone，得率0.06％)。

经波谱技术鉴定所得化合物为槐黄烷酮G：C₂₅H₂₈O₆

¹H NMR(DMSO-d6，400MHz)：12.1(s，5-OH)，9.6(4’-OH)，9.4(7-OH)，7.22(1H，d，J＝8.4Hz，H-6’)，6.33(1H，d，J＝2.3Hz，H-3’)，6.26(1H，dd，J＝8.4，2.5Hz，H-5’)，5.92(1H，s，H-6)，5.50(1H，dd，J＝2.8，13.3Hz，H-2)，4.89(1H，t，J＝6.8Hz，H-4”)，4.55(1H，brs)，4.47(1H，brs)，3.1(1H，dd，J＝13.3，17.2Hz，H-3a)，2.62(1H，dd，J＝2.9，17.2Hz，H-3b)，2.4(3H，m)，1.9(2H，m)，1.56(3H，s)，1.52(3H，s)，1.43(3H，s)。

ESIMS(m/z)：423。

实施例2在细胞水平上检测苦参酮、2’-甲氧基-苦参酮、槐黄烷酮G对多种肿瘤细胞的生长抑制作用。

实验材料：

人肿瘤细胞株及其培养：食管癌(Eca-109)、胃腺癌(AGS和BGC-823)、乳腺癌细胞(MCF-7和Bcap-37)、前列腺癌细胞(PC3和DU145)、肺癌(A549)、肺腺癌(SPC-A-1)、宫颈癌细胞(Hela)、恶性黑色素瘤(A375)、结肠腺癌(Caco-2)、Burkitt’s淋巴瘤(Raji)、肝癌(Bel-7402)及白血病(K562和U937)细胞均购自中科院生化细胞研究所。细胞于含10％胎牛血清(Gibco)的RPMI-1640(Gibco)培养基中，在37℃，5％CO₂条件下培养。

其他试剂：MTT及DMSO均为Sigma公司产品。

样品：自制苦参酮、2’-甲氧基-苦参酮、槐黄烷酮G分别溶解在DMSO中，分别得到10mg/ml贮存液。

实验方法：

苦参酮、2’-甲氧基-苦参酮、槐黄烷酮G对上述肿瘤细胞株的细胞毒性分别通过MTT法测得。具体步骤如下：

1.细胞经胰酶消化并洗涤后悬浮于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，经胎盘蓝染色排除法计活细胞数，并调节细胞悬浮液密度至1×10⁵细胞/ml。

2.在平底96孔板中，每孔加入100微升细胞，每孔中细胞总数为1×10⁴。于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养过夜。

3.将10mg/ml样品贮存液以细胞生长培养基稀释为以下浓度系列：32，62，125，250，500，1000和2000ug/ml。每孔加入5微升以细胞生长培养基稀释的样品，使反应终浓度分别为1.6、3.1、6.25、12.5、25、50、和100μg/ml。将相应量的DMSO加入不加药的细胞中作为对照，不加药物及DMSO的含细胞孔作为背景。每点作三个平行测试。

4.将加药细胞在37℃，5％CO₂细胞培养箱中保温48小时。

5.每孔中加入10μl5mg/ml MTT溶液，继续在培养箱中保温3～4小时。

6.将细胞板于1000rpm离心15分钟，真空吸去培养液，加入150μl PBS洗涤后离心并小心地吸去溶液。

7.每孔加入150μlDMSO，置于摇床上以150rpm摇动15分钟，使生成的甲簪晶体充分溶解。测定492nm光吸收值。

8.根据光吸收值计算苦参酮、2’-甲氧基-苦参酮、槐黄烷酮G处理后细胞相对存活率。计算公式如下：

9.

10.通过XLfit软件计算苦参总黄酮及苦参酮对各肿瘤细胞的IC₅₀。

实验结果：

1.苦参酮、2’-甲氧基-苦参酮、槐黄烷酮G对肿瘤细胞的毒性呈剂量依赖关系；(见图1、2)

2.苦参酮、2’-甲氧基-苦参酮、槐黄烷酮G对各种肿瘤细胞的生长抑制IC₅₀测定。

三种化合物对各种肿瘤细胞的生长抑制IC₅₀测定(μg/ml)

实施例3苦参酮在小鼠体内对几种肿瘤株的抑制作用

实验材料：

肿瘤株：小鼠肝癌(H22)、小鼠肉瘤(S180)、小鼠肺癌(Lewis肺癌)，均由上海医药工业研究院药理室传代维持。

动物：昆明种小鼠，由上海医药工业研究院动物房提供，合格证号：沪动合证字107号。

C57BL/6小鼠，由中科院上海实验动物中心提供，合格证号：中科动管会第005号。

其他试剂：DMSO(批号：20030415)为上海化学试剂公司产品。CremophorEL(批号：082K0173)为SIGMA公司产品。

样品：自制苦参酮用DMSO和Cremophor EL助溶后，加蒸馏水配成溶液。

实验方法：

取生长良好的腹水，用生理盐水以1∶4稀释(H22和S180)，或者取生长良好的瘤块，制成单细胞悬液(1×10⁷/ml)(Lewis肺癌)，每只小鼠腋皮下接种0.2ml，随机分组，接种后次日起给药，给药体积为0.5ml/20g体重。接种后10日脱颈处死动物，解剖取瘤块，称瘤重。结果判定根据以下公式：

实验结果

苦参酮在剂量200、50和12.5mg/kg腹腔注射时，对小鼠肝癌H22的生长有明显的抑制作用，抑瘤率分别为48.64、70.91、64.09％；口服200mg/kg抑瘤率达87.37％。试验结果见表1。

样品苦参酮在剂量200、50和12.5mg/kg，腹腔注射时，对小鼠S180肉瘤的生长有一定的抑制作用，抑瘤率分别为26.54、20.85、42.60％；口服200mg/kg抑瘤率达60.51％。试验结果见表2。

样品苦参酮在剂量200、50和12.5mg/kg，腹腔注射时，对小鼠Lewis肺癌的生长有明显的抑制作用，抑瘤率分别为53.57、30.36和39.88％；口服200mg/kg抑瘤率达42.86％。试验结果见表3。

表1.苦参酮对小鼠肝癌H22的抑瘤作用

与对照组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01。

表2.苦参酮对小鼠S180肉瘤的抑瘤作用

与对照组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01。

表3.苦参酮对小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用

与对照组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01。

Claims

1.下述通式(I)的化合物或其可药用盐在制备抗肿瘤药物中的用途：

其中，R₁代表-OH、R₂代表-OH、R₃代表-OCH₃、R₄代表-OH、R₅代表

或者R₁代表-OCH₃、R₂代表-OH、R₃代表-OCH₃、R₄代表-OH、R₅代表

或者R₁代表-OH、R₂代表-OH、R₃代表-OH、R₄代表-OH、R₅代表

所述肿瘤选自食管癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、淋巴瘤或恶性黑色素瘤。