CN101565443B - 新冷杉三萜内酯类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了新三萜内酯类化合物新冷杉三萜内酯化合物A、B、C、D、E、F(Neoabieslactone A、B、C、D、E、F)。它们从植物秦岭冷杉中分离，通过硅胶柱层析得到。本发明的化合物经体外细胞毒、活性实验，结果显示，6个新冷杉三萜内酯化合物对人肺癌细胞，人肠癌细胞，人小细胞肺癌细胞，人乳腺癌细胞均有较好的抑制活性，对小鼠S180肉瘤(实体型)的疗效实验，有显著的抑瘤作用，具有良好的临床应用价值。本发明的化合物可作为活性成分与药用辅料制成治疗肿瘤的药物组合物。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物，具体涉及一种从植物秦岭冷杉中分离得到的新三萜内酯类化合物新冷杉三萜内酯A、B、C、D、E、F(Neoabieslactone A、B、C、D、E、F)，以及该类化合物的制备方法和应用。
背景技术
冷杉属(Abies)是松科(Pinaceae)的一个重要属，约有50种，分布于亚洲、欧洲、北美、中美及非洲北部的高山地带。中国有19种3变种。分布于东北、华北、西北、西南及浙江、台湾各省区的高山地带。其中的有些植物在一些地区当作民间药，用于感冒、胃痛、消化不良及血管、肺和性病等的治疗。现代研究表明，从该属植物中分离得到的一些化合物及其衍生物具有多种生物活性，包括：昆虫保幼、抗肿瘤、抗菌、抗溃疡、抗炎、抗高血压、止咳以及治疗中枢神经系统方面的一些疾病。由于该属植物大多具有广泛的生理活性，从1938年至今，国外对该属植物的研究比较多。
秦岭冷杉(A.chensiensis)系松科(Pinaceae)冷杉属(Abies)植物，又名枞树。乔木，为中国特有树种，产于陕西南部、湖北西部及甘肃南部海拔2300-3000米地带。《中国植物志》对秦岭冷杉的形态特征进行了详细的描述。本发明人对采集自陕西太白山的秦岭冷杉进行了系统的化学成分研究，发现其具有良好活性，进一步探索在临床的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于研究设计秦岭冷杉植物提取物及其在医药上的应用。
本发明提供了新冷杉三萜内酯类化合物。
本发明是从秦岭冷杉(生长于陕西太白山)中提取分离得到的六个新的三萜内酯类化合物，分别命名为新冷杉三萜内酯A、B、C、D、E、F(NeoabieslactoneA、B、C、D、E、F)，其化学结构式如下：
本发明的化合物新冷杉三萜内酯A为无色针状结晶，高分辨质谱得该化合物精密质量数为469.3315[M-H]-，推算其分子式为C30H46O4；新冷杉三萜内酯B为白色无定形粉末，高分辨质谱得该化合物精密质量数为495.3463[M+Na]+，推算其分子式为C30H48O4；新冷杉三萜内酯C为白色无定形粉末，高分辨质谱得该化合物精密质量数为491.3154[M+Na]+，推算其分子式为C30H44O4；新冷杉三萜内酯D为白色无定形粉末，高分辨质谱得该化合物精密质量数为465.2988[M-H]-，推算其分子式为C30H42O4；新冷杉三萜内酯E为白色无定形粉末，高分辨质谱得该化合物精密质量数为465.3032[M-H]-，推算其分子式为C30H42O4；新冷杉三萜内酯F为白色无定形粉末，高分辨质谱得该化合物精密质量数为467.3183[M-H]-，推算其分子式为C30H44O4。以上化合物的结构通过13CNMR、1HNMR及其它光谱手段确定。1H和13C核磁共振数据见表1和表2.
表1 6个化合物的13C核磁共振数据
表2 6个化合物的1H核磁共振数据
本发明的另一目的是提供了上述新冷杉三萜内酯类化合物的制备方法，该方法包括下列步骤：
(1)提取：将秦岭冷杉干燥枝叶粉碎，以75～95％乙醇(8～20倍体积W/V)回流提取1～3次，每次2～3小时，合并提取液，提取液减压浓缩成流浸膏，流浸膏相当于1ml含秦岭冷杉0.8-1.2g，流浸膏加水1～3倍量W/V稀释后，以氯仿0.5～2倍量V/V萃取3～5次，得到氯仿部位；
(2)分离：将上述氯仿部位应用硅胶柱层析，以体积比为100∶0～1∶1的石油醚/乙酸乙酯系统梯度洗脱，薄层层析检测，分别收集含有以上化合物的流分，再经葡聚糖凝胶层析，以体积比为1∶1的氯仿/甲醇洗脱，最后经C18反相柱层析，以体积比6∶4～10∶0的甲醇/水进行洗脱，薄层层析检测，分别得到新冷杉三萜内酯A、B、C、D、E、F。
本发明采用的秦岭冷杉可以通过市售得到。
本发明的又一目的是提供了上述新冷杉三萜内酯类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的化合物经体外细胞毒活性实验，结果显示，新冷杉三萜内酯A、B、C、D、E、对人肺癌细胞，人肠癌细胞，人小细胞肺癌细胞，人乳腺癌细胞均有较好的抑制活性，新冷杉三萜内酯A、新冷杉三萜内酯B、新冷杉三萜内酯C、新冷杉三萜内酯D、新冷杉三萜内酯E和新冷杉三萜内酯F有很好的抗肿瘤作用。对小鼠S180肉瘤(实体型)的疗效实验，结果说明新冷杉三萜内酯A、新冷杉三萜内酯B、新冷杉三萜内酯C、新冷杉三萜内酯D、新冷杉三萜内酯E和新冷杉三萜内酯F有显著的抑瘤作用，具有良好的临床应用价值。
本发明的化合物可作为活性成分与药用辅料按常规方法制成治疗肿瘤的药物组合物。
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明：
实施例1：
将秦岭冷杉干燥枝叶17Kg粉碎，以80％乙醇200L回流提取3次，每次3小时，合并提取液，提取液减压浓缩成流浸膏，流浸膏相当于1ml含秦岭冷杉0.8g，加水20L稀释后以氯仿萃取，每次20L，共4次，得到氯仿部位800g。将上述氯仿部位应用硅胶柱层析，以体积比为100∶0～1∶1的石油醚/乙酸乙酯系统梯度洗脱，薄层层析检测，分别收集含有以上化合物的流分，再经葡聚糖凝胶层析，以体积比为1∶1的氯仿/甲醇洗脱，最后经C18反相柱层析，以体积比6∶4～10∶0的甲醇/水进行洗脱，薄层层析检测，得到新冷杉三萜内酯A 121mg、新冷杉三萜内酯B 86mg、新冷杉三萜内酯C 77mg、新冷杉三萜内酯D 146mg、新冷杉三萜内酯E 58mg、新冷杉三萜内酯F 91mg。
实施例2：
将秦岭冷杉干燥枝叶5Kg粉碎，以95％乙醇100L回流提取2次，每次2小时，合并提取液，提取液减压浓缩成流浸膏，流浸膏相当于1ml含秦岭冷杉1.2g加水15L稀释后以氯仿萃取，每次10L，共5次，得到氯仿部位250g。将上述氯仿部位应用硅胶柱层析，以体积比为100∶0～1∶1的石油醚/乙酸乙酯系统梯度洗脱，薄层层析检测，分别收集含有以上化合物的流分，再经葡聚糖凝胶层析，以体积比为1∶1的氯仿/甲醇洗脱，最后经C18反相柱层析，以体积比6∶4～10∶0的甲醇/水进行洗脱，薄层层析检测，得到新冷杉三萜内酯A45mg、新冷杉三萜内酯B 30mg、新冷杉三萜内酯C 29mg、新冷杉三萜内酯D 48mg、新冷杉三萜内酯E 19mg、新冷杉三萜内酯F 33mg。
实施例3：
将秦岭冷杉干燥枝叶15Kg粉碎，以75％乙醇120L回流提取1次，每次3小时，合并提取液，提取液减压浓缩成流浸膏，流浸膏相当于1ml含秦岭冷杉1.0g，加水40L稀释后以氯仿萃取，每次40L，共3次，得到氯仿部位730g。将上述氯仿部位应用硅胶柱层析，以体积比为100∶0～1∶1的石油醚/乙酸乙酯系统梯度洗脱，薄层层析检测，分别收集含有以上化合物的流分，再经葡聚糖凝胶层析，以体积比为1∶1的氯仿/甲醇洗脱，最后经C18反相柱层析，以体积比6∶4～10∶0的甲醇/水进行洗脱，薄层层析检测，得到新冷杉三萜内酯A 113mg、新冷杉三萜内酯B 94mg、新冷杉三萜内酯C 97mg、新冷杉三萜内酯D 135mg、新冷杉三萜内酯E 64mg、新冷杉三萜内酯F 102mg。
实施例4：化合物的细胞毒活性实验
1、实验材料
1.1、受试样品
Neoabieslactone A、B、C、D、E、F分别用DMSO(Merck)溶解后，加入PBS(-)配成1000μg/ml的溶液或均匀的混悬液，然后用含DMSO的PBS(-)稀释。
1.2、细胞株
A549(人肺癌细胞)
Colo 205(人肠癌细胞)
NCI-H446(人小细胞肺癌细胞)
MDA-MB-435(人乳腺癌细胞)
1.3、培养液
RPMI1640+15％NBS+双抗
1.4、其他材料
全自动酶标仪：型号：WellscanMK-2，生产厂商：Labsystems进口96孔培养板等。
2、试验方法
MTT法：96孔板每孔加入浓度为4～6×104个/ml的细胞悬液100μl，置37℃，5％CO2培养箱内。24h后，加入样品液，10μl/孔，设双复孔，37℃，5％CO2作用72h。每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，作用4h后加入溶解液，100μl/孔，置培养箱内，溶解后用MK-2全自动酶标仪测570nm OD值。
3、试验结果
结果见表3，结果显示，6个新冷杉三萜内酯化合物对人肺癌细胞，人肠癌细胞，人小细胞肺癌细胞，人乳腺癌细胞均有较好的抑制活性，新冷杉三萜内酯A、新冷杉三萜内酯B、新冷杉三萜内酯C、新冷杉三萜内酯D、新冷杉三萜内酯E和新冷杉三萜内酯F有很好的抗肿瘤作用，具有良好的开发前景。
实施例5：化合物对小鼠S180肉瘤(实体型)的疗效实验
1、实验材料
1.1受试样品
NeoabieslactoneA、B、C、D、E、F分别用少量吐温-80助溶后用0.5％CMC配成溶液。
1.2动物
品系：昆明种小鼠
来源：第二军医大学实验动物中心提供。
合格证号：沪动合证字107号
体重：18-20g
性别：雌性。
1.3移植性肿瘤
小鼠S180肉瘤，由上海医药工业研究院传代维持。
2、实验方法
取生长良好的小鼠S180肉瘤腹水，用生理盐水以1∶4稀释，每只小鼠腋皮下接种0.2ml，随机分组，分为对照组，环磷酰胺组(CTX组，20mg/kg，ip×7)、给药(5mg/kg)组，接种后次日起给药，给药体积为0.5ml/20g体重，连续灌胃7天。接种后10日脱颈处死动物，称动物体重后解剖取瘤块，称瘤重。结果判定根据以下公式：
3、实验结果
新冷杉三萜内酯A、新冷杉三萜内酯B、新冷杉三萜内酯C、新冷杉三萜内酯D、新冷杉三萜内酯E和新冷杉三萜内酯F有显著的抑瘤作用。实验结果见表4。
表3 6个化合物对人体肿瘤细胞的体外增殖抑制作用
表4 6个化合物对小鼠S180肉瘤的抑制作用
与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。
Claims (5)
1.新冷杉三萜内酯类化合物，其特征在于所述化合物为新冷杉三萜内酯A、B、C、D、E或F，分别具有如下结构式：
新冷杉三萜内酯A 新冷杉三萜内酯B 新冷杉三萜内酯C
新冷杉三萜内酯D 新冷杉三萜内酯E 新冷杉三萜内酯F
2.根据权利要求1所述的新冷杉三萜内酯类化合物，其特征在于所述化合物新冷杉三萜内酯A、B、C、D、E、F，分别具有如下性状：
化合物新冷杉三萜内酯A为无色针状结晶，高分辨质谱得该化合物精密质量数为469.3315[M-H]-，分子式为C30H46O4；
新冷杉三萜内酯B为白色无定形粉末，高分辨质谱得该化合物精密质量数为495.3463[M+Na]+，分子式为C30H48O4；
新冷杉三萜内酯C为白色无定形粉末，高分辨质谱得该化合物精密质量数为491.3154[M+Na]+，分子式为C30H44O4；
新冷杉三萜内酯D为白色无定形粉末，高分辨质谱得该化合物精密质量数为465.2988[M-H]-，分子式为C30H42O4；
新冷杉三萜内酯E为白色无定形粉末，高分辨质谱得该化合物精密质量数为465.3032[M-H]-，分子式为C30H42O4；
新冷杉三萜内酯F为白色无定形粉末，高分辨质谱得该化合物精密质量数为467.3183[M-H]-，分子式为C30H44O4。
3.如权利要求1所述的新冷杉三萜内酯类化合物的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)提取：将秦岭冷杉干燥枝叶粉碎，以75～95％乙醇8～20倍体积W/V 回流提取1～3次，每次2～3小时，合并提取液，提取液减压浓缩成流浸膏，流浸膏相当于1ml含秦岭冷杉0.8-1.2g，流浸膏加水1～3倍量W/V稀释后，以氯仿0.5～2倍量V/V萃取3～5次，得到氯仿部位；
(2)分离：将上述氯仿部位应用硅胶柱层析，以体积比为100∶0～1∶1的石油醚/乙酸乙酯系统梯度洗脱，薄层层析检测，分别收集含有以上化合物的流分，再经葡聚糖凝胶层析，以体积比为1∶1的氯仿/甲醇洗脱，最后经C18反相柱层析，以体积比6∶4～10∶0的甲醇/水进行洗脱，薄层层析检测，分别得到新冷杉三萜内酯A、B、C、D、E、F。
4.如权利要求1所述的新冷杉三萜内酯类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.如权利要求4的应用，其特征在于所述药物为新冷杉三萜内酯类化合物作为活性成分与药用辅料制成的药物组合物。
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