CN101773495B - 抗肿瘤药物组合物及其应用和制备方法 - Google Patents

Abstract

一种由治疗肿瘤疾病有效量的从植物贡山三尖杉中提取的活性成分化合物SHC-10和可药用载体组成的抗肿瘤药物组合物，其制备方法，以及化合物SHC-10及其药物组合物在制备抑制肿瘤疾病药物中的应用，特别是在制备抗胃癌、肝癌、乳腺癌的药物中的应用。

Description

抗肿瘤药物组合物及其应用和制备方法

所属领域：

本发明属于天然药物领域，具体地，涉及一种由治疗肿瘤疾病有效量的从植物贡山三尖杉中提取的活性成分化合物SHC-10和可药用载体组成的抗肿瘤药物组合物，其制备方法，以及化合物SHC-10及其药物组合物在制备抑制肿瘤疾病药物中的应用，特别是在制备抗胃癌、肝癌、乳腺癌的药物中的应用。

背景技术：

三尖杉科系单属科，仅有三尖杉属(Cephalotaxus)，是裸子植物中的一个比较小的属；该科一共有9种和1变种植物。我国为三尖杉属植物主产区，有8种，而云南的分布最为集中，有6种(见傅立国；三尖杉属的研究[J]，植物分类学报，1984，22(4)：277-288)。三尖杉属植物多数用作民间药物，如三尖杉的种子“性平，味甘、涩，可驱虫消积、润肺止咳”；粗榧的枝叶“味苦、涩，性寒，主治白血病、恶性淋巴瘤”，其根“味淡涩，性平，主治风湿痹痛”等(见国家中医药管理局《中华本草》编委会；中华本草(第二册)[M]，上海科学技术出版社，1999，335-342)。1954年发现三尖杉属植物中含有生物碱，1958年报道有双黄酮类化合物(见朱太平；三尖杉属植物的生物碱研究及其化学分类问题[J]，植物分类学报，1979，17(4)：7-20)。但直到1960年代末，才发现了三尖杉脂碱类生物碱，能够抑制小鼠的白血病细胞生长。这一发现对三尖杉生物碱成分研究的备受关注，而三尖杉属植物中抗肿瘤生物碱成分的研究，一直是天然产物研究热点之一。迄今为止，从三尖杉(C.fortunei Hook.f)、海南粗榧(C.hainanensis Li)、粗榧(C.sinensis(Rehd.et Wils.)Li)、篾子三尖杉(C.oliveri Mast.)、台湾三尖杉(C.wilsoniana Hayata)、高山三尖杉(C.fortunei Hook.f.var.alpnia Li)、C.harringtonia Hook.f.var.harringtonia、C.harringtonia(Forbes)K.Koch.var.drupacea Koidz.、C.harringtonia var.nana(Nakai)Rehder等7种植物中分离得到生物碱76个，双黄酮16个。1999年，杜江，邱明华等从高山三尖杉(C.fortuneivar.alpnia)中分离得到了Hainanolidol，还发现了两个这类新化合物fortunolides A、B(见Du Jiang，Chiu Ming-Hua，Nie Rui-Lin.Twonew lactones from Cephalotaxus fortunei var.alpnia.Journal of NaturalProducts，1999，62(12)：1664-1665)。由于这类化合物种类和数量少，没有引起足够重视，Hainanolidol(海南粗榧内酯醇)的生物活性鲜有报道。Hainanolidol对肿瘤细胞抑制活性，也未见文献报道。

发明内容：

本发明旨在提供由治疗肿瘤疾病有效量的从植物贡山三尖杉中提取的活性成分化合物SHC-10和可药用载体组成的抗肿瘤药物组合物，其制备方法，以及化合物SHC-10及其药物组合物在制备抑制肿瘤疾病药物中的应用，特别是在制备抗胃癌、肝癌、乳腺癌的药物中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

抗肿瘤药物组合物，其中由治疗肿瘤疾病有效量的从植物贡山三尖杉中提取的活性成分化合物SHC-10和可药用载体组成。

化合物SHC-10在制备抑制肿瘤疾病药物中的用途。

所述的用途，其肿瘤为胃癌、肝癌、乳腺癌，特别指胃癌。

本发明药物组合物在制备抑制肿瘤疾病药物中的用途。

所述的用途，其肿瘤为胃癌、肝癌、乳腺癌，特别指胃癌。

本发明还提供了药物组合物的制备方法，取贡山三尖杉(C.lanceolata)植物枝叶干燥，粉碎后用95％的乙醇加热回流，提取3次，每次4h，过滤除渣，减压回收乙醇并浓缩成浸膏，加1∶1甲醇/水溶液，静置过夜，过滤除去沉淀；甲醇/水溶液部分减压回收甲醇，直至甲醇基本蒸除完全，余下水溶液先用正己烷萃取，分液，回收正己烷，得正己烷提取物；然后再用氯仿萃取，分液，回收氯仿，得氯仿提取物；再用乙酸乙酯萃取，分液，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯提取物；水层溶液用NaOH调节pH＝10，再用氯仿萃取，分液，回收氯仿，得氯仿提取物；随后再用正丁醇萃取，分液，回收正丁醇，得正丁醇提取物；氯仿提取物用5％HAc溶解，过滤得到不溶于酸液SC部位；而酸水部分用1N NaOH中和，再用氯仿萃取，分液，回收氯仿，得SHC部位；SHC部位用50g硅胶柱层析分离，得化合物SHC-10，加入可药用载体配制而成。

具体实施方式：

下面结合本发明的实施例子来对本发明做进一步的说明，但并不以此限定本发明的内容。

实施例1：

贡山三尖杉(Cephalotaxus lanceolata K.M.Feng ex Cheng et L.K.Fu)植物特征：贡山三尖杉(C.lanceolata)产云南贡山独龙江沿岸，海拔1900米的阔叶林中，散生少见。贡山三尖杉为乔木，高可达20米，胸径40公分，皮紫色，平滑；小枝下垂。叶薄革质，排成两列，披针，长4.5-10公分，宽4-7毫米，先端长尖头，基部最宽，圆形；叶面深绿色，中脉隆起，叶下面气孔带白色。种子倒卵状椭圆形，长3.5-4.5厘米，假种皮成熟时绿褐色，种梗长1.5-2.0厘米。果期11月。贡山三尖杉与三尖杉近似，但三尖杉叶革质，披针状条形，基部稧形，叶中下部最宽；种子较小，椭圆形卵圆形，长约2.5厘米，易于区别。

贡山三尖杉(C.lanceolata)植物枝叶样品采集于云南怒江。生药凭证标本存放于中国科学院昆明植物所标本馆。

化合物SHC-10的制备：

取贡山三尖杉(C.lanceolata)植物干燥枝叶样品1000g，粉碎后用95％的乙醇加热回流，提取3次，每次4h，过滤除渣，减压回收乙醇并浓缩成浸膏得264g，加1∶1甲醇/水溶液2400ml，静置过夜，过滤除去沉淀；甲醇/水溶液部分减压回收甲醇，直至甲醇基本蒸除完全，余下水溶液先用300ml x 2的正己烷萃取，分液，回收正己烷，得正己烷提取物1.0g(Hex-ext)；然后再用300ml x 2的氯仿萃取，分液，回收氯仿，得氯仿提取物4.9g(CHCl₃-ext)；再用300ml x 2的乙酸乙酯萃取，分液，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯提取物22.4g(EtOAc-ext)；水层溶液用NaOH调节pH＝10，再用300ml x 2的氯仿萃取，分液，回收氯仿，得氯仿提取物1.5g(NaOH-CHCl₃-ext)；随后再用300ml x2的正丁醇萃取，分液，回收正丁醇，得正丁醇提取物28.0g(BuOH-ext)。氯仿提取物4.9g(CHCl₃-ext)用5％HAc100ml溶解，过滤得到不溶于酸液SC部位(SC)1.5g；而酸水部分用1N NaOH中和，再用氯仿萃取，分液，回收氯仿，得SHC部位(SHC)0.86g。SHC部位用50g硅胶柱层析分离，得到化合物SHC-10 65mg。

化合物SHC-10的结构表征：

SHC-10化合物：黄色粉末，分子式C₁₉H₂₀O₄，HR-ESIMS(m/z)：313.1422[M+H]⁺；mp 226～227℃；[α]^16.2D+57.03°(c 0.297，C₂H₅OH)；IR(KBr)V_max：3500-3100(w)，2944，2921，1749，1639，1613，1587，1546，1517，1429，1378，1294，1048，890cm^-1；UV(CH₃OH)λ：241，322nm；ESI-MS(m/z)：313[M+H]⁺，149，121。¹H-NMR(MeOD)δ：7.02(1H，s，H-2)，6.95(1H，s，H-7)，4.58(1H，dd，J＝4.0，4.0Hz，H-15)，3.69(1H，brs，H-11)，3.63(1H，m，H-12)，3.56(1H，d，J＝11.2Hz，H-14)，3.28(1H，m，H-9α)，3.14(1H，m，H-13β)，2.93(1H，m，H-8β)，2.75(1H，m，H-8α)，2.37(1H，m，H-13α)，2.29(3H，s，H-19)，1.89(1H，m，H-17)，1.42(1H，m，H-9α)，0.98(3H，d，J＝5.6Hz，H-18)；¹³C-NMR(MeOD)δ：186.6(C-1)，176.1(C-16)，149.3(C-3)，148.5(C-4)，147.6(C-5)，144.0(C-6)，139.2(C-2)，136.7(C-7)，78.3(C-15)，74.9(C-14)，51.3(C-11)，44.3(C-10)，37.2(C-12)，37.0(C-13)，34.3(C-13)，30.1(C-8)，24.0(C-19)，21.2(C-9)，15.7(C-18)。

SHC-10化合物的化学结构：

实施例2：

本发明化合物SHC-10的肿瘤细胞毒活性：

本发明发现从贡山三尖山中分离得到的化合物SHC-10具有显著的肿瘤细胞抑制活性，特别是对胃癌SGC7901细胞毒活性，与治疗胃癌临床化疗药物顺铂和著名天然治疗胃癌药物10-羟基喜树碱的阳性对照药物比较，抑制活性更为显著(见表1)。

表1  化合物SHC-10的细胞毒活性(IC₅₀ in μM)

从表1中数据可以看出：化合物SHC-10对肿瘤细胞系HepG2(肝癌细胞株)、MCF7(乳腺癌细胞株)和SGC7901(胃癌细胞株)的细胞毒生物活性(IC₅₀inμM)十分明显：化合物SHC-10对上述三种肿瘤细胞系的抑制活性IC₅₀，分别为1.16，＞40，0.66μM；而阳性对照化合物顺铂和10-羟基喜树碱对上述三种肿瘤细胞系的抑制活性IC₅₀，为：顺铂4.58，57.25，5.79μM；10-羟基喜树碱11.90，-，19.80μM。阳性对照顺铂(Cisplatin)和10-羟基喜树碱是目前广泛应用于临床的抗肿瘤化疗药物，表明化合物SHC-10对肿瘤细胞系HepG2(肝癌细胞株)、SGC7901(胃癌细胞株)的细胞毒生物活性(IC₅₀ in μM)十分明显，具有显著的治疗肝癌、胃癌肿瘤药物的药理作用。

本发明采用体外抗肿瘤细胞毒性的MTT生物活性测定方法为：

1.MTT法检测细胞活性原理：

MTT全称为3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-di-phenytetr-azoliumromide，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色(或蓝紫色)不溶于水的甲臜(Formazan)，甲臜的含量可以用酶标仪在570nm处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT不会有颜色反应。

2.实验方法：

1)接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液(DMEM或者RMPI1640)配成单个细胞悬液，以每孔10000-20000个细胞接种到96孔板，每孔体积100ul。贴壁细胞提前12小时接种培养。

2)加入待测化合物溶液(固定浓度40uM初筛，5个浓度梯度复筛)，每孔终体积200ul，每种处理均设3个复孔。

3)显色：37摄氏度培养48小时后，每孔加MTT溶液20ul。继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液100ul以避免细胞丢失，每孔加20％的SDS100ul，过夜孵育(温度37℃)，使结晶物充分融解。

4)比色：选择595nm波长，酶联免疫检测仪(Bio-Rad 680)读取各孔光吸收值，记录结果，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(Reed and Muench法)计算化合物的IC₅₀值。

实施例3：

片剂：实施例1所得化合物SHC-10 10mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸镁5mg；

制备方法：将化合物、乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，化合物含量为10mg。

实施例4：

安瓿剂：实施例1所得化合物SHC-10 2mg，氯化钠10mg；

制备方法：将化合物和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。

实施例5：

胶囊剂：实施例1所得化合物SHC-10 10mg，乳糖187mg，硬脂酸镁3mg；

制备方法：将化合物与助剂混合，过筛，均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。

Claims (3)

1.如下述结构式(I)所示的化合物SHC-10在制备抑制胃癌疾病的药物中的应用，

2.由权利要求1所述的结构式(I)所示的化合物SHC-10和可药用载体组成的药物组合物的制备方法，取贡山三尖杉Cephalotaxuslanceolata K.M.Feng植物枝叶干燥，粉碎后用95％的乙醇加热回流，提取3次，每次4h，过滤除渣，减压回收乙醇并浓缩成浸膏，加1∶1甲醇/水溶液，静置过夜，过滤除去沉淀；甲醇/水溶液部分减压回收甲醇，直至甲醇基本蒸除完全，余下水溶液先用正己烷萃取，分液，回收正己烷，得正己烷提取物；然后再用氯仿萃取，分液，回收氯仿，得氯仿提取物；再用乙酸乙酯萃取，分液，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯提取物；水层溶液用NaOH调节pH＝10，再用氯仿萃取，分液，回收氯仿，得氯仿提取物；随后再用正丁醇萃取，分液，回收正丁醇，得正丁醇提取物；氯仿提取物用5％HAc溶解，过滤得到不溶于酸液SC部位；酸水部分用1N NaOH中和，再用氯仿萃取，分液，回收氯仿，得SHC部位；SHC部位用50g硅胶柱层析分离，得化合物SHC-10，加入可药用载体配制而成。

3.由权利要求1所述的结构式(I)所示的化合物SHC-10和可药用载体组成的药物组合物在制备抑制胃癌疾病的药物中的应用。