CN103214497B - 酸浆苦素a提取工艺及医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及酸浆苦素A（physalin A）提取工艺及其医药用途，具体涉及酸浆苦素A在制备抗肿瘤药物中的新用途，尤其是治疗人纤维肉瘤和人恶性黑色素瘤中的使用。经过工艺优化后，酸浆苦素A提取得率为0.2133%。酸浆苦素A可抑制多种肿瘤细胞生长，尤其对人纤维肉瘤和人黑色素瘤细胞生长抑制明显，但对人正常细胞活力影响不明显。其机制通过激活Fas死亡受体途径，进而激活下游caspase家族相关蛋白，诱导肿瘤细胞发生凋亡；同时，酸浆苦素A可诱导肿瘤细胞发生自噬，在HT1080及A375-S2细胞中自噬拮抗凋亡；p53蛋白及MAPKs家族p38蛋白起到关键性调节作用。酸浆苦素A可制备消化道及非消化道给药剂型，用于人纤维肉瘤及黑色素瘤等肿瘤的治疗。

Description

酸浆苦素A提取工艺及医药用途

技术领域

    本发明属于医药技术领域，涉及酸浆苦素A的提取工艺及其医药用途，具体涉及其在制备治疗肿瘤药物中的新用途。

背景技术

    恶性肿瘤（通称癌症）是当前危害人类生命健康的重要疾病之一。近20年来，在世界范围内或中国范围内，肿瘤的发病率与死亡率均呈上升的趋势。据WHO统计，2008年全世界约有1270万癌症新增患者，死亡人数达760万。我国2000年癌症发病人数180-200万，死亡140-150万。

    纤维肉瘤（fibrosarcoma）是一种成纤维细胞和胶原纤维细胞形成的恶性软组织肉瘤，曾一度被误以为是成人软组织肉瘤中发病率最高的一种，随着免疫组织化学及分子诊断学等新技术的应用以及软组织肉瘤分类的细化，最新的数据显示纤维肉瘤在软组织肉瘤中只占到10%（Am J Surg Pathol, 2010, 34: 1504-1513）。虽然其发病率不高，但由于其对常规化疗药物的反应率不高，其预后也不容乐观，易出现无法控制的全身转移。这就需要有新药的研究与开发应用于纤维肉瘤的治疗之中。

    恶性黑色素瘤（melanoma）是一种恶性程度相当高的恶性肿瘤，又称恶性黑瘤，黑色素瘤多数是在色素病变的基础上发生，少数发生于正常皮肤或粘膜的色素细胞。具体原因不明，多数认为与内分泌因素有关。恶性黑色素瘤的发生率在皮肤癌里占不到5%，但是每年的死亡率却是其他皮肤癌的3倍，因此对于黑色素瘤的治疗越来越成为研究的热点。黑色素瘤的早期治疗主要是手术广泛切除原发病源，由于黑色素瘤对放疗不敏感，晚期不能手术的或扩散性病变采用化疗联合细胞因子和肿瘤基因疫苗等进行治疗，即药物治疗联合免疫治疗（N Eng J Med, 2004, 351: 998-1012）。因此药物治疗对于晚期的恶性黑色素瘤的治疗起着至关重要的作用，急需有新药的研究与开发应用于恶性黑色素瘤的治疗之中。

死亡受体（death receptors）是一类受体超家族，包括Fas/CD95、TNFR （tumor necrosis factor receptor）、DR-3（death receptor 3）、DR-4和DR-5。当相应的配体与其结合以后，其通过在胞内的死亡结构域（death domain, DD）启动细胞内在一系列的机制，诱导细胞凋亡。其中Fas信号途径是最具代表性的死亡受体途径。当相应的配体与Fas受体结合后，膜上的受体就会发生二聚化，存在于胞浆中的结构域就会发生改变，之后募集细胞内的接头蛋白FADD（Fas-associated death domain），进而使FADD的另一端死亡效应结构域（death effector domain，DED）结构发生变化，继而募集procaspase-8，共同形成死亡诱导信号复合物（death inducing signaling complex, DISC），DISC形成后，可诱导procaspase-8自身激活，产生活性的caspase-8，活化的caspase-8则进一步激活下游的caspase-3，从而诱导凋亡（Science, 1998, 281: 1305-1308）。

p53基因家族调控着多种基因的表达，在阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、维持基因组稳定和抑制肿瘤血管生成等方面具有重要的作用。野生型p53能够引导或促进细胞凋亡；与野生型 p53相反，突变型 p53 则对细胞凋亡有抑制作用。p53在细胞中的半衰期很短，主要是通过转录后的磷酸化和乙酰化使蛋白稳定。p53可在多个位点发生磷酸化，磷酸化还可促进 p53转位到细胞核内。细胞损伤较大、不能够被修复时，p53蛋白会促使细胞进行凋亡。Bcl-2家族中p53的靶基因主要有Bax，Noxa，PUMA和Bid。近期研究表明，p53可直接转位到线粒体上与线粒体膜上的Bcl-xL和Bcl-2 结合，增加线粒体膜通透性。此外，p53也可不通过转录途径，直接促进胞浆中的Bax转位到线粒体上，改变线粒体膜通透性。Noxa通过p53依赖和非依赖两条通路诱导凋亡，是p53诱导细胞凋亡的下游靶基因，通过线粒体定位域定位于线粒体外膜，置换出促凋亡Bax亚家族，Bax亚家族转位并嵌入到线粒体，使线粒体膜的通透性增强，而使线粒体内的细胞色素c释放入胞浆，细胞色素c能与凋亡蛋白酶活化因子Apaf-l及caspase-9形成复合体，进一步激活caspase-3，启动caspase级联反应，诱导细胞凋亡（Science, 2003, 302: 1036-1038）。

通过对肿瘤细胞的研究发现，肿瘤细胞的抗凋亡机制对肿瘤的发生及发展有着重要的意义。凋亡过程是一个细胞复杂的调控过程，其中起着至关重要作用的是半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白（cysteine aspartic specific protease, caspase），它也是多条凋亡通路的汇聚点和执行凋亡的最终途径。正常细胞中以无活性的前体形式（procaspase）存在，当凋亡信号表达，procaspase被激活转化为caspase，最终导致细胞凋亡。细胞的凋亡过程并不是一个简单线性通路，其中细胞凋亡过程中的信号分子相互影响，从而构成了一个细胞凋亡的环形通路。在这个环形通路中，caspase酶家族、Bcl-2蛋白家族相互影响，Bcl-2蛋白家族能够激活或者抑制procaspase转化为caspase来调控细胞的凋亡，激活的caspase又能反过来影响Bcl-2家族蛋白的表达（Nature, 1998, 391: 441-442）。

酸浆又名锦灯笼、灯笼草、红姑娘、挂金灯（Physalis alkekengi L. var. franchetii (Mast.) Makino）为茄科（solanaceace）酸浆属植物，其干燥宿萼或带果实的宿萼作为锦灯笼药用（中国药典2010版I部，337-338）。酸浆始载于《神农本草经》，其中记载“酸浆，味酸平，主热烦满，定志益气，利水道，产难，吞其实，立产”，《本草纲目》中也记载“酸浆利湿除热，除热故清肺止咳，利湿故能化痰治疽”。其味苦、酸，性寒，具有清热解毒、利咽、化痰、利尿作用，在抗癌、抗炎方面有着独特的疗效（《中华本草》7册，上海科学技术出版社，286-290）。酸浆苦素A（Physalin A）为酸浆宿萼中的主要成分之一，白色晶体，分子量526，目前对酸浆的药理作用研究较多，但是对酸浆苦素A药理作用机制的研究极少，仅有一篇文献报道其对前列腺癌细胞有诱导凋亡作用（Biol Pharm Bull, 2011, 34: 1584-1588），而对酸浆苦素A在其它肿瘤中的应用及具体作用机制均未见报道。对酸浆苦素A（Physalin A）这一酸浆中的主要药效成分的提取制备工艺未见文献报道。

发明内容

本发明首次发现了酸浆苦素A对多种肿瘤细胞有生长抑制作用，并且对正常细胞活力影响极小，优于已上市的抗肿瘤药物紫杉醇（paclitaxel）和5-氟尿嘧啶（5-Fu），小鼠急性毒性实验表明，1.0g/kg酸浆苦素A灌胃剂量下未见毒副作用和不良反应。本发明还首次涉及了酸浆苦素A在人纤维肉瘤细胞及人黑色素瘤细胞中的作用机制，可制备用于治疗肿瘤的药物。

本发明的首要目的在于提供一种酸浆苦素A的提取工艺。

本发明的另一目的在于提供酸浆苦素A在制备抗肿瘤药物方面的新用途。     

本发明所使用酸浆苦素A由本课题组从酸浆（Physalis alkekengi L. var. franchetii (Mast.) Makino）中提取分离得到，为白色晶体（Acetone），核磁数据与文献（Journal of Natural Product, 2008, 71:642-646）对照一致，确定其结构为酸浆苦素A（Physalin A），纯度>98%。

酸浆苦素A

    本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

    以酸浆药材为原料，通过单因素考察和正交设计实验，确定酸浆苦素A最佳的提取工艺组合，即通过30%～90% 乙醇进行回流提取，液料比为10:1～70:1，每次回流提取0.5～2小时，提取次数为一次或多次；所得到的提取物，用乙酸乙酯萃取，萃取次数为一次或多次；将所得萃取物蒸干，用丙酮溶解，放置，隔夜后，丙酮溶液中有晶体产生，然后按照同样方法，用丙酮多次重结晶，得酸浆苦素A。

    酸浆苦素A体外可诱导十种肿瘤细胞（HT1080，A375-S2，HepG2，HeLa，A549，U937，HCT116，A431，MCF7，HL60）产生生长抑制作用。酸浆苦素A体外对HT1080细胞和A375-S2细胞的生长抑制作用明显优于临床常用抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶，接近于紫杉醇效果，同时，相对于阳性对照药紫杉醇（paclitaxel）和5-氟尿嘧啶（5-Fu），酸浆苦素A在体外对人外周血单核细胞（human Peripheral Blood Mononuclear Cells, hPBMC）活力影响不明显；小鼠急性毒性实验表明，1.0g/kg酸浆苦素A灌胃剂量下未见毒副作用和不良反应。酸浆苦素A能够在体外通过激活Fas死亡受体途径，进而激活下游caspase家族相关蛋白，诱导人纤维肉瘤HT1080细胞凋亡，也能够激活p53蛋白并诱导活性氧的产生促进人恶性黑色素瘤A375-S2细胞发生凋亡；同时能够诱导HT1080细胞和A375-S2细胞发生自噬，自噬拮抗凋亡，有丝分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）家族p38蛋白在其中起到关键性调节作用。

    酸浆苦素A可单独作为有效成分或者与其它化合物组合应用，同时可配以临床上接受的赋形剂，制备成口服剂型（片剂，酊剂，可分散性粉剂，颗粒剂，乳剂，糖浆剂，硬胶囊，软胶囊等）或者非口服剂型（注射剂，喷雾剂，贴剂等）用于肿瘤的治疗。

附图说明

图1为经过工艺优化后的酸浆提取物液相色谱图；

图2为酸浆苦素A的液相分析色谱图；

图3为酸浆苦素A体外对十种肿瘤细胞的生长抑制作用；

图4为酸浆苦素A体外对人外周血单核细胞（hPBMC）生长的影响；

图5为酸浆苦素A体外可诱导HT1080细胞与A375-S2细胞发生凋亡；

图6为酸浆苦素A体外诱导HT1080细胞发生凋亡相关蛋白的表达；

图7为酸浆苦素A体外诱导A375-S2细胞发生凋亡相关蛋白的表达；

图8为酸浆苦素A体外可诱导HT1080细胞与A375-S2细胞发生自噬；

图9为酸浆苦素A体外诱导HT1080和A375-S2细胞发生自噬相关蛋白的表达；

图10在HT1080细胞和A375-S2细胞中加入自噬抑制剂3MA和自噬诱导剂Rapamycin后，酸浆苦素A诱导的生长抑制作用发生变化；

图11在HT1080细胞中加入自噬抑制剂3MA和自噬诱导剂Rapamycin后，酸浆苦素A诱导凋亡相关蛋白发生变化；

图12在HT1080细胞中加入p38抑制剂SB203580后，酸浆苦素A诱导的生长抑制作用发生变化；

       图13在A375-S2细胞中加入p53抑制剂PFT-α，p38抑制剂SB203580和NF-κB抑制剂PDTC后，酸浆苦素A诱导的生长抑制作用发生变化；

       图14为酸浆苦素A体外可诱导A375-S2细胞产生活性氧；

       图15在A375-S2细胞中加入活性氧抑制剂NAC和GSH，酸浆苦素A诱导的生长抑制作用发生变化。

具体实施方式

本发明可通过下面的实施例加以说明。

实施例1：酸浆苦素A提取工艺的优化

1 实验方法

    酸浆苦素A为从酸浆（Physalis alkekengi L. var. franchetii (Mast.) Makino）中提取分离得到。对酸浆苦素A提取条件进行优化，通过单因素考察（提取方式、溶剂、时间、浓度、液料比）和正交设计实验，确定了最佳的工艺组合。

2 实验结果

 提取方式选择（提取时间均为60 min）：

由提取方式和溶剂选择，最后确定选用70%乙醇回流提取。

单因素实验主要考察了提取时间、液料比、乙醇浓度对提取率的影响。

因素和水平确定：

正交实验结果如下：

注：K代表因素水平和；k为平均因素水平

由极差R分析，三种因素对酸浆苦素A的提取影响程度顺序：乙醇浓度>时间>液料比，并且由正交表可以看出A₁B₃C₂为最优实验组合。

优化以后，能够最大量的提取酸浆苦素A，而且经平行实验验证此工艺的真确性。如图1所示，最高峰面积的为酸浆苦素 A，且杂质含量较少，色谱条件如下：色谱柱：Inertsil ODS-3分析色谱柱（4.6 × 200 mm），10 μm，日本GL.Sciences Inc.公司，流速：1.0 ml/min，检测波长：220 nm，流动相：40%甲醇/水。根据平行实验所得的酸浆苦素A的浓度平均值为0.4267 mg/ml，最后计算得酸浆苦素A提取得率为0.2133%。

实施例2：酸浆苦素A粗提物的精制工艺

1 实验方法

根据以上正交实验所得结果，采用最优组合工艺进行提取，具体为：用植物酸浆（Physalis alkekengi L. var. franchetii (Mast.) Makino）的市售成品药材1 kg为原料，通过70%乙醇进行回流提取，液料比为60:1，回流提取40分钟，总共提取三次；所得提取物浓缩后得到浸膏约160 g，分散至10倍量水中，用同体积乙酸乙酯进行萃取，萃取三次；将乙酸乙酯层萃取物蒸干，得到浸膏约34 g，缓慢加入适量丙酮，使其恰好完全溶解，静置，隔夜后，丙酮溶液中有晶体产生，然后按照同样方法，用丙酮重结晶三次，最后得到酸浆苦素A 1.05 g。

所得酸浆苦素A采用高效液相色谱检验纯度，色谱条件如下：色谱柱：Aglient ZORBAX SB-C18（4.6 ×150 mm）5 μm，流速：1.0 ml/min，检测波长：220 nm，柱温：30 ℃，流动相：60%甲醇/水。

2 实验结果

酸浆苦素A高效液相色谱检验纯度的液相图谱如图2所示，出峰时间26 min，纯度达到98%以上。

所得酸浆苦素A为白色晶体（Acetone），核磁数据如下：¹H-NMR(DMSO-d ₆ ，300MHz)：δ 5.84(1H，dd，J=10.1，2.0Hz，H-2)，6.93(1H，m，H-3)，3.23(1H，br.d，J = 22.0Hz，H-4)，2.93(1H，m，H-4)，5.69(1H，d，J = 6.0Hz，H-6)，4.46(1H，br.t，J = 4.9Hz，H-7)，5.02(1H，d，J = 4.0Hz，7-OH)，1.80(1H，br.d，J = 12.1Hz，H-8)，3.00(1H，dd，J = 12.1，9.0Hz，H-9)，2.05(1H，m，H-11)，1.15(1H，m，H-11)，2.22(1H，m，H-12)，1.93(1H，m，H-12)，5.61(1H，s，13-OH)，6.42(1H，s，14-OH)，3.08(1H，s，H-16)，1.02(3H，s，H-19)，1.70(3H，s，H-21)，4.59(1H，br.s，H-22)，2.03(1H，m，H-23)，2.06(1H，m，H-23)，5.59(1H，br.s，H-27)，6.43(1H，br.s，H-27)，1.55(3H，s，H-28)。¹³C-NMR(DMSO-d ₆ , 75MHz)：δ 202.1(C-1)，δ 126.9(C-2)，δ 146.7(C-3)，δ 32.1(C-4)，δ 139.4(C-5)，δ 127.3(C-6)，δ 61.4(C-7)，δ 46.4(C-8)，δ 29.1(C-9)，δ 54.0(C-10)，δ 23.3(C-11)，δ 29.7(C-12)，δ 82.1(C-13)，δ 100.8(C-14)，δ 213.8(C-15)，δ 52.7(C-16)，δ 79.4(C-17)，δ 171.9(C-18)，δ 14.1(C-19)，δ 82.1(C-20)，δ 21.3(C-21)，δ 75.6(C-22)，δ 30.7(C-23)，δ 35.6(C-24)，δ 138.0(C-25)，δ 161.9(C-26)，δ 132.3(C-27)，δ 26.4(C-28)。核磁数据与本实验室之前所分离得到的酸浆苦素A（Journal of Natural Product, 2008, 71:642-646）对照一致，确定其结构为酸浆苦素A（Physalin A）。

实施例3：酸浆苦素A体外对十种肿瘤细胞的生长抑制作用

1 实验方法

十种肿瘤细胞中八种（HT1080，A375-S2，HepG2，HeLa，A549，HCT116，A431，MCF7）贴壁，两种（U937，HL60）悬浮生长于含10% 胎牛血清，100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI-1640培养液中，置于含5% CO₂，37 ℃培养箱里培养。

对于贴壁细胞，取对数生长期细胞配制成6×10⁴ 个/ml浓度细胞悬液，每孔100 μl接种于96孔板中培养过夜，待细胞充分贴壁后，除去原有培养液，加入不同浓度的酸浆苦素A或DMSO（终浓度小于0.1%，阴性对照），每孔100 μl。37℃培养24小时，培养结束后每孔加入5 mg/ml的MTT 10 μl继续培养2小时后弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μl，微量振荡器振荡10分钟以充分溶解结晶物。利用酶标仪在 492 nm 波长下测定各孔吸光值（A值），按以下公式计算药物对肿瘤细胞体外增殖的抑制率（inhibitory ratio，IR）。

IR(%)=[A₄₉₂(control)-A₄₉₂(sample)]/[A₄₉₂(control) -A₄₉₂(blank)]×100%

对于悬浮细胞，取对数生长期细胞配制成2×10⁵个/ml浓度细胞悬液，每孔50 μl接种于96孔板中，之后加入不同浓度的酸浆苦素A或DMSO（终浓度小于0.1%，阴性对照），每孔50 μl。37℃培养24小时，培养结束后每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl继续培养2小时后，每孔加入三联液 100 μl，孵育18小时后，用微量振荡器振荡10分钟以充分溶解结晶物。利用酶标仪在 630 nm 波长下测定各孔吸光值（A值），利用上述公式计算药物对肿瘤细胞体外增殖的抑制率。

2 实验结果

    由图3可见，酸浆苦素A在0-80 μM浓度范围内作用24小时对体外培养的十种肿瘤细胞的增殖有不同程度抑制作用，且其生长抑制作用呈剂量依赖性。半数抑制浓度（IC₅₀）如下表所示：

实施例4：酸浆苦素A、5-氟尿嘧啶和紫杉醇体外对HT1080细胞和A375-S2细胞的生长抑制作用

    1 实验方法

    将不同浓度的酸浆苦素A、5-氟尿嘧啶和紫杉醇加入接种完HT1080细胞或A375-S2细胞的96孔板中，作用24 h后采用MTT法测定结果，具体同实施例3。

    2 实验结果

    酸浆苦素A、5-氟尿嘧啶和紫杉醇作用于HT1080细胞和A375-S2细胞24 h后，会不同程度诱导肿瘤细胞生长抑制，具体IC₅₀值如下表所示：

由此可见酸浆苦素A体外对HT1080细胞和A375-S2细胞有不同程度的细胞毒作用，效果明显优于临床常用抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶，接近于紫杉醇体外抗肿瘤效果。

    实施例5：酸浆苦素A体外对人外周血单核细胞（hPBMC）生长的影响

    1 实验方法

    人外周血采集自三名健康受试者，采集的新鲜血液按照3:1比例加入淋巴细胞分离液后，离心分离 （2500 rpm，30 min），用移液枪从中移出所需的单核细胞至离心筒中，PBS洗涤三次，得到的细胞用含人血清的 RPMI-1640培养液重悬，计数，以2×10⁴个/孔接种于96孔板，至培养箱培养。6小时后弃去上清液，按浓度梯度加入酸浆苦素A及阳性对照药5-氟尿嘧啶和紫杉醇，培养24，48小时，以MTT法测定细胞存活率。

    2 实验结果

    由图4可见，作用24，48小时后，相比阳性对照药5-氟尿嘧啶和紫杉醇，酸浆苦素A对hPBMC的细胞活力影响较小，细胞存活率高于阳性对照药组。

    实施例6：酸浆苦素A体外可诱导HT1080细胞与A375-S2细胞发生凋亡

    1 实验方法

    为确认酸浆苦素A体外诱导肿瘤细胞的死亡方式，采用流式细胞术考察了酸浆苦素A对HT1080细胞和A375-S2细胞作用情况。HT1080细胞和A375-S2细胞以1×10⁵ 个/ml的密度种在培养瓶中，培养过夜，待充分贴壁后加入不同浓度的酸浆苦素A，24小时后收集细胞，1000 rpm离心10分钟，弃上清，用500 μl PBS重悬细胞，逐滴加入10 ml 70%的冰乙醇，-20℃固定过夜。上流式细胞仪检测前，1000 rpm离心10分钟，弃上清，加入500 μl的含有RNAase的PI（0.1 mg/ml），4 ℃避光作用30分钟，之后上机检测。

    2 实验结果

    由图5可见，在作用浓度下，酸浆苦素A可时间依赖性诱导HT1080细胞和A375-S2细胞发生凋亡，说明凋亡是酸浆苦素A诱导肿瘤细胞产生生长抑制的主要方式之一。

    实施例7：酸浆苦素A体外诱导HT1080细胞和A375-S2细胞发生凋亡与Fas死亡受体途径和caspase家族相关蛋白的表达的关系

    1 实验方法

    为考察酸浆苦素A诱导人纤维肉瘤HT1080细胞和A375-S2细胞发生凋亡的机制，采用Western blot方法检测酸浆苦素A作用后凋亡相关蛋白的表达情况。HT1080细胞和A375-S2细胞以1×10⁵个/ml的密度种在培养瓶中，培养过夜，待充分贴壁后加入酸浆苦素A，作用6，12，18，24小时后收集细胞，使用蛋白裂解液冰浴裂解30分钟，离心，收集上清液，用考马斯亮蓝测定样品蛋白浓度，计算上样量。上样后，稳压160 V电泳，之后稳流100 mA将蛋白转移至PVDF膜。一抗孵育过夜，用PBST洗涤3次后，二抗孵育2小时，后ECL发光底物显色，医用X射线胶片曝光。

    2 实验结果

    如图6所示，酸浆苦素A作用于HT1080细胞后，可时间依赖性的上调Fas死亡受体相关蛋白Fas和FADD的表达，提示Fas死亡受体途径被激活；caspase家族相关蛋白procaspase 3和procaspase 8均被剪切，成为具活性的caspase 3和caspase 8，进而影响下游的ICAD和PARP等蛋白，诱导细胞发生凋亡。

       如图7所示，酸浆苦素A作用于A375-S2细胞后，除可激活Fas死亡受体通路相关蛋白外，还可促进Bax转位至线粒体膜上，引起细胞色素c的释放，进而与caspase 9结合激活下游caspase 3蛋白诱导细胞发生凋亡。

    实施例8：酸浆苦素A体外可诱导HT1080细胞与A375-S2细胞发生自噬

    1 实验方法

    采用流式细胞术考察了酸浆苦素A对HT1080细胞和A375-S2细胞作用情况。上机检测前48小时将HT1080细胞和A375-S2细胞以1×10⁵个/ml的密度种在培养瓶中，培养过夜，加入不同浓度的酸浆苦素A，作用24小时至上机检测前收集细胞，1000 rpm离心10分钟，弃上清，加入500 μl 0.05 mM的MDC，于37 ℃避光染色30分钟后上机检测。

    同时还采用Western blot法考察了HT1080细胞中自噬相关蛋白的表达情况，Western blot实验方法具体同实施例7。

    2 实验结果

由图8可见，在作用浓度下，酸浆苦素A可时间依赖性诱导HT1080细胞和A375-S2细胞发生自噬，说明自噬在酸浆苦素A诱导的肿瘤细胞生长抑制作用中发挥了重要作用。

由图9可见，在作用浓度下，酸浆苦素A可时间依赖性诱导HT1080和A375-S2细胞自噬相关蛋白发生变化，提示酸浆苦素A在HT1080细胞和A375-S2细胞中诱导了自噬的发生。

    实施例9：在HT1080细胞和A375-S2细胞中加入自噬抑制剂3MA和自噬诱导剂Rapamycin后，酸浆苦素A诱导的生长抑制作用发生变化

    1 实验方法

    取对数生长期HT1080细胞和A375-S2细胞配制成6×10⁴ 个/ml浓度，每孔100 μl接种于96孔板中培养过夜，待细胞充分贴壁后，除去原有培养液，加入不同浓度的自噬抑制剂3MA和自噬诱导剂Rapamycin，每孔50 μl，作用1小时后，直接加入酸浆苦素A或DMSO（终浓度小于0.1%，阴性对照），每孔50 μl。37 ℃培养24小时，培养结束后利用MTT法测定细胞存活率。

    2 实验结果

    如图10所示，单加入自噬抑制剂3MA和自噬诱导剂Rapamycin，对HT1080细胞和A375-S2细胞生长无明显抑制作用；加入自噬抑制剂3MA作用后再加入酸浆苦素A，与单加酸浆苦素A作用相比，细胞生长抑制率明显升高；加入自噬诱导剂Rapamycin作用后再加入酸浆苦素A，与单加酸浆苦素A作用相比，细胞生长抑制率明显降低；这些结果提示在酸浆苦素A诱导的生长抑制作用中，一定程度的自噬可能起到保护作用。

    实施例10：在HT1080细胞中加入自噬抑制剂3MA和自噬诱导剂Rapamycin后，酸浆苦素A诱导凋亡相关蛋白发生变化

    1 实验方法

    Western blot法，具体同实施例7，但需先加入自噬抑制剂3MA和自噬诱导剂Rapamycin作用1小时后，再加入酸浆苦素A。

2 实验结果

如图11所示，先加入自噬抑制剂3MA作用后，Fas死亡受体相关蛋白Fas和FADD的表达较单加酸浆苦素A明显上调，caspase家族相关蛋白caspase 3和caspase 8以及下游的ICAD和PARP蛋白也出现同样趋势的结果，提示在自噬被抑制后，细胞凋亡更加明显；先加入自噬诱导剂Rapamycin作用后，Fas死亡受体相关蛋白Fas和FADD的表达较单加酸浆苦素A明显下调，caspase家族相关蛋白caspase3和caspase8以及下游的ICAD和PARP蛋白也出现同样趋势的结果，提示在促进自噬后，细胞凋亡得到一定程度抑制。

实施例11：在HT1080细胞中加入p38蛋白抑制剂SB203580，酸浆苦素A诱导的生长抑制作用发生变化

1 实验方法

    MTT法（同实施例9方法）

    2 实验结果

    如图12所示，单加入p38抑制剂SB203580，对HT1080细胞生长无明显抑制作用；加入p38抑制剂SB203580作用后再加入酸浆苦素A，与单加酸浆苦素A作用相比，细胞生长抑制率显著性升高，这提示在酸浆苦素A诱导的生长抑制作用中，p38蛋白在其中起着重要作用。    

实施例12：在A375-S2细胞中加入p53蛋白抑制剂PFT-α，p38蛋白抑制剂SB203580和NF-κB蛋白抑制剂PDTC，酸浆苦素A诱导的生长抑制作用发生变化

1 实验方法

    MTT法（同实施例9方法）

    2 实验结果

    如图13所示，单加入p53抑制剂PFT-α，p38抑制剂SB203580和NF-κB抑制剂PDTC对A375-S2细胞生长无明显抑制作用；加入p53抑制剂PFT-α作用后再加入酸浆苦素A，与单加酸浆苦素A作用相比，细胞生长抑制率显著性降低；加入p38抑制剂SB203580和NF-κB抑制剂PDTC作用后再加入酸浆苦素A，与单加酸浆苦素A作用相比，细胞生长抑制率显著性升高；这些提示在酸浆苦素A诱导的生长抑制作用中，p53蛋白在其中起着促进生长抑制的作用，而p38和NF-κB蛋白则有保护细胞的作用。

实施例13：酸浆苦素A体外可诱导A375-S2细胞产生活性氧

    1 实验方法

    采用流式细胞术考察了酸浆苦素A对A375-S2细胞作用情况。上机检测前48小时将A375-S2细胞以1×10⁵个/ml的密度种在培养瓶中，培养过夜，加入不同浓度的酸浆苦素A，作用24小时至上机检测前收集细胞，1000 rpm离心10分钟，弃上清，加入500 μl 10 μM的DCF-DA，于37 ℃避光染色30分钟后上机检测。

   2 实验结果

由图14可见，在作用浓度下，酸浆苦素A可时间依赖性诱导A375-S2细胞产生活性氧，说明酸浆苦素A诱导的肿瘤细胞生长抑制作用中活性氧发挥了作用。

实施例14：在A375-S2细胞中加入活性氧抑制剂NAC（N-乙酰半胱氨酸）和GSH（谷胱甘肽），酸浆苦素A诱导的生长抑制作用发生变化

1 实验方法

    MTT法（同实施例9方法）

    2 实验结果

    如图15所示，单加入活性氧抑制剂NAC和GSH对A375-S2细胞生长无明显抑制作用；加入活性氧抑制剂NAC和GSH作用后再加入酸浆苦素A，与单加酸浆苦素A作用相比，细胞生长抑制率显著性降低；提示在酸浆苦素A诱导的生长抑制作用中，活性氧在其中起着杀伤细胞作用。

Claims (3)

1. 酸浆苦素A在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为人纤维肉瘤，人黑色素瘤，人肝癌，人组织细胞淋巴瘤，人表皮癌，人乳腺癌。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：酸浆苦素A通过激活Fas死亡受体途径，进而激活下游caspase家族相关蛋白，诱导肿瘤细胞发生凋亡；同时，酸浆苦素A可诱导肿瘤细胞发生自噬，自噬和凋亡存在相互关系。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：酸浆苦素A通过激活p53蛋白并诱导线粒体活性氧的产生进而诱导肿瘤细胞发生凋亡，同时酸浆苦素A可激活p38蛋白诱导肿瘤细胞发生自噬，自噬和凋亡存在相互关系。