CN106674241A - 三尖杉降二萜类化合物及其药物组合物和其在制药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及式(I)所示的三尖杉降二萜类化合物及其药学上可接受的盐，以其为活性成分的药物组合物，其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明从三尖杉属植物中发现一系列新的三尖杉二萜类化合物，并通过体外活性筛选发现该类化合物具有显著细胞毒活性和抗炎活性；机制研究表明其和含环庚烯酮的秋水仙碱体不同，不影响微管聚合，而和抑制NF‑κB信号通路相关；体内移植瘤活性评价发现具有显著抗肿瘤活性，展示了该类化合物良好的成药前景。

Description

三尖杉降二萜类化合物及其药物组合物和其在制药中的应用

技术领域：

本发明属于医药技术领域，具体涉及以三尖杉降二萜类化合物、其衍生物、有机和无机酸盐、含有他们的药物组合物及三尖杉属植物提取物为活性成分的抗肿瘤药物，以及它们在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。

背景技术：

恶性肿瘤(癌症)是当前危害人类健康的严重疾病，在中国每年新增160万肿瘤病患者，每年有130万肿瘤病患者死亡。目前癌症治疗的手段主要有手术治疗、化疗、放疗、肿瘤生物免疫治疗、中医治疗等。局部癌症虽然可以成功地运用外科手术和放射疗法治疗，但化学疗法仍是常规治疗晚期或转移性肿瘤的首选。由于化疗药物存在选择性低、不良反应大、多药耐药等缺陷，很大程度上限制了其使用。从天然产物中寻找高效低毒，不易产生耐药性的新型抗肿瘤活性先导分子一直是新药研究的热点。

三尖杉属(Cephalotaxus Sieb.et Zucc.ex Endl)隶属于裸子植物三尖杉科(Cephalotaxaceae)。对三尖杉生物碱成分的研究始于上个世纪50年代。1969年，美国科学家Powell等发现三尖杉属植物中的三尖杉酯碱类化合物具有抑制小鼠白血病细胞P‐388生长作用，从而引起人们对其生物碱类成分的广泛重视和研究。1977年9月三尖杉酯碱(harringtonine)和高三尖杉酯碱(homoharringtonine)通过全国会议正式鉴定，成为我国首创推荐应用于临床的抗白血病新药。2012年10月，高三尖杉酯碱被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准用于治疗慢性髓性白血病。

三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱——这两个抗肿瘤的明星分子，其显著的抗肿瘤活性吸引了一大批学者(Nat.Prod.Rep.2012,29,845–869)，过多关注生物碱的同时，忽略了其他抗肿瘤分子。本发明在寻找活性较好的生物碱的同时，也关注另一类抗肿瘤分子——三尖杉降二萜。三尖杉降二萜是三尖杉属植物中另一类具有显著抗肿瘤活性的成分，目前仅在三尖杉属植物中发现，并且数量较少，对该化合物的活性挖掘、作用机制等方面的研究较少。

发明内容：

本发明的目的旨在提供三尖杉降二萜类化合物，以及其有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，氢溴酸，硝酸，硫酸，磷酸等)制成的盐；其制备方法；其作为有效成分与可药用载体或赋形剂组成的药物组合物；以及该类化合物或其药用盐在制备预防或治疗肝癌、白血病、胰腺癌、乳腺癌及肺癌的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

如式(I)所示的三尖杉降二萜类化合物及其药学上可接受的盐，

其中：R₁、R₂和R₉独立的为氢、羟基、C_0–10烷氨基、C_1–10烷氧基、C_2–10烯基氧基、C_2–10炔基氧基、C_6–10芳基氧基或C_1–10酰氧基；R₃和R₄独立的为氢、羟基、C_0–10烷氨基、酮羰基、C_1–10烷氧基、C_2–10烯基氧基、C_2–10炔基氧基、C_6–10芳基氧基、C_1–10酰氧基；R₅和R₈独立的为氢、羟基、C_0–10烷氨基、C_1–10烷氧基、C_2–10烯基氧基、C_2–10炔基氧基、C_6–10芳基氧基、C_1–10酰氧基，或者R₅(R₈)形成酮羰基；R₆和R₇独立的为氢、羟基、C_0–10烷氨基、酮羰基、C_1–10烷氧基、C_2–10烯基氧基、C_2–10炔基氧基、C_6–10芳基氧基、C_1–10酰氧基，或者R₆与R₇之间通过氧或氮原子形成呋喃环或吡咯环；R₉为独立的为氢、羟基、C_0–10烷氨基、C_1–10烷氧基、C_2–10烯基氧基、C_2–10炔基氧基、C_6–10芳基氧基或C_1–10酰氧基，或R₈为羟基或氨时可与R₉形成酯或酰胺。

针对上述的式(I)化合物，本发明优先的技术方案是，R₁为羟基，R₂、R₃、R₄和R₅为各自独立的氢，R₆与R₇通过氧原子形成呋喃环，R₉为甲酰氧基并与R₈形成六元内酯，即化合物fortunolide B。

针对上述的式(I)化合物，本发明优先的技术方案是，R₁、R₂、R₃和R₅为各自独立的氢，R₄为羟基，R₆与R₇通过氧原子形成呋喃环，R₉为甲酰氧基并与R₈形成六元内酯，即化合物贡山三尖杉内酯III。

针对上述的式(I)化合物，本发明优先的技术方案是，R₁和R₂为各自独立的羟基，R₃、R₄和R₅为各自独立的氢，R₆与R₇通过氧原子形成呋喃环，R₉为甲酰氧基并与R₈形成六元内酯，即化合物高山三尖杉内酯VI。

针对上述的式(I)化合物，本发明优先的技术方案是，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆和R₇为各自独立的氢，R₉为甲酰氧基并与R₈形成六元内酯，即化合物贡山三尖杉内酯I。

针对上述的式(I)化合物，本发明优先的技术方案是，R₁为羟基，R₂、R₃、R₄、R₅、R₆和R₇为各自独立的氢，R₉为甲酰氧基并与R₈形成六元内酯，即化合物高山三尖杉内酯I。

针对上述的式(I)化合物，本发明优先的技术方案是，R₁、R₃、R₅、R₆和R₇为各自独立的氢，R₂为羟基，R₄为酮羰基，R₉为甲酰氧基并与R₈形成六元内酯，即化合物贡山三尖杉内酯II。

针对上述的式(I)化合物，本发明优先的技术方案是，其中R₁、R₃、R₄、R₅、R₆和R₇为各自独立的氢，R₂为羟基，R₉为甲酰氧基并与R₈形成六元内酯，即化合物fortunolide A。

针对上述的式(I)化合物，本发明优先的技术方案是，其中R₁和R₇为各自独立的羟基，R₂、R₃、R₄、R₅和R₆为各自独立的氢，R₉为甲酰氧基并与R₈形成六元内酯，即化合物高山三尖杉内酯II。

针对上述的式(I)化合物，本发明优先的技术方案是，其中R₁、R₃、R₄、R₅和R₆为各自独立的氢，R₂和R₇独立的各自为羟基，R₉为甲酰氧基并与R₈形成内酯，即化合物10‐Hydroxyhainanolidol(或者11‐hydroxyhainanolidol)(J.Nat.Prod.2007,70,2029–2032,Nat.Prod.Rep.2012,29,845–869)。

针对上述的式(I)化合物，本发明优先的技术方案是，其中R₁、R₃、R₄、R₅和R₇为各自独立的氢，R₂和R₆为各自独立的羟基，R₉为甲酰氧基并与R₈形成内酯，即化合物高山三尖杉内酯III。

针对上述的式(I)化合物，本发明优先的技术方案是，其中R₁、R₂、R₅和R₆各自独立的氢，R₇为羟基，R₃和R₄之间形成双键，R₉为甲酰氧基并与R₈形成六元内酯，即化合物高山三尖杉内酯IV。

针对上述的式(I)化合物，本发明优先的技术方案是，其中R₁、R₂、R₃、R₄和R₅各自独立的氢，R₆为酮羰基，R₇为羟基，R₉为甲酰氧基并与R₈形成六元内酯，即化合物高山三尖杉内酯V。

针对上述的式(I)化合物，本发明优先的技术方案是，其中其中R₁、R₃、R₄、R₅和R₆各自独立的氢，R₂、R₇和R₈各自独立的羟基，R₉为甲酸甲酯基，即化合物高山三尖杉内酯VII

本说明书中，术语“烷基“是指饱和的直链或支链烃基，优选具有1–10个碳原子，更优选具有1–6个碳原子，更优选具有1–4个碳。代表性的例子包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基等。

“烯基”是指具有至少一个碳碳双键，直链或支链的脂族烃基，优选具有2–10个碳原子，更优选具有2–6个碳原子，更优选具有2–4个碳。代表性的例子包括乙烯基、丙烯基、烯丙基、丁烯基、戊二烯基等。

“炔基”是指具有至少一个碳碳三键，直链或支链的脂族烃基，优选具有2–10个碳原子，更优选具有2–6个碳原子，更优选具有2–4个碳。代表性的例子包括乙炔基、丙炔基、丁炔基等。

“酰基”是指饱和的或不饱和的，直链或支链的，环状或无环的脂族或芳香族羧酸去掉羧基上的羟基形成的基团，优选具有1–10个碳原子，更优选具有1–6个碳原子，更优选具有1–4个碳，代表性的例子包括甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、苯甲酰基、萘甲酰基。

“芳基”是指具有单环或双环的芳香性基团，它具有6–14个碳原子，优选具有6–10个碳原子，可以含有0–3个选自O、S、N、S(O)、S(O₂)的杂原子，并且可与其他环稠合。代表性的例子包括苯基、萘基、呋喃基、喹啉基等。

本发明还提供式(I)所示三尖杉降二萜类化合物的制备方法：

从三尖杉属植物，例如三尖杉Cephalotaxus fortunei、贡山三尖杉C.lanceolata、篦子三尖杉C.oliveri、台湾三尖杉C.wilsoniana、粗榧C.sinensis、海南粗榧C.hainanensis、西双版纳粗榧C.manni等植物原料中用水或有机溶剂提取，优选回流提取或浸提，经分离纯化而得。所述的有机溶剂选自醇类溶剂、酮类溶剂、酯类溶剂、醚类溶剂或卤代烷类溶剂，例如C_1–6醇、C_3–6酮、C_3–6酯、C_2–6醚或C_1–6卤代烷。其中所述的C_1–6醇包括例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇、环戊醇、正己醇、环己醇等。所述的C_3–6酮包括例如丙酮、甲乙酮、甲基异丁酮等。所述的C_2–6醚包括例如甲醚、乙醚等。所述的C_3–6酯包括例如甲酸乙酯、乙酸乙酯丙酸乙酯等。所述的C_1–6卤代烃包括例如二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷等。

如果有必要的话，可对式(I)化合物进一步分离纯化，其中包括将提取物经酸化，优选pH＝1.0–4.5，用有机溶剂分配，分离有机溶剂层可得；水层碱化，优选pH＝8.0–11.0，再用有机溶剂萃取，分离有机溶剂层而得。

如果有必要的话，还可包括用柱层析进一步提高纯度。所述的柱层析可以是硅胶柱层析、C₁₈柱层析、离子交换树脂柱层析、葡聚糖凝胶层析等。例如经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇梯度洗脱，分配比例为氯仿/甲醇10∶0、20∶1、10∶1，8∶1、5∶1、3∶1、1∶1。

具体地，取三尖杉属植物茎叶粉碎，甲醇提取，调节pH＝1.0–4.5，乙酸乙酯萃取，萃取物浓缩，氯仿/甲醇洗脱，得粗产物，甲醇重结晶得纯品；水层调节至pH＝8.0–11.0,乙酸乙酯萃取，萃取物浓缩，经硅胶柱层析，氯仿/甲醇洗脱，得粗产物，甲醇重结晶得纯品。

本发明同时提供一种三尖杉属植物提取物，以及其在制备治疗或预防增生性疾病或病症中的应用，所述的疾病或病症指癌症，优选肝癌、白血病、胰腺癌、乳腺癌及肺癌。所述的三尖杉属植物提取物是从三尖杉属植物，例如三尖杉Cephalotaxus fortunei、贡山三尖杉C.lanceolata、篦子三尖杉C.oliveri、台湾三尖杉C.wilsoniana、粗榧C.sinensis、海南粗榧C.hainanensis、西双版纳粗榧C.manni等植物原料中用水或有机溶剂提取，优选回流提取或浸提，经分离纯化而得。如果有必要，与适当的有机酸或无机酸成盐，形成药学上可接受的盐。所述的有机酸选自甲酸、乙酸、乙二酸、丙酸、丁酸、己酸、己二酸、草酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、延胡索酸、柠檬酸、樟脑酸、樟脑磺酸、乳酸、苦味酸、藻酸、天冬氨酸、苯磺酸、二葡糖酸、环戊烷丙酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、葡庚糖酸、甘油磷酸、半硫酸、庚酸、2‐羟基乙磺酸、甲磺酸、烟酸、2‐萘磺酸、扑酸、果胶脂酸、3‐苯基甲酸、新戊酸、硫代氰酸、对甲苯磺酸，所述的无机酸选自盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸、硝酸。

本发明还提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防增生性疾病或病症的药物中的应用。所述的增生性疾病或病症为癌症，更具体地为肝癌、白血病、胰腺癌、乳腺癌及肺癌。

所述的有机溶剂选自醇类溶剂、酮类溶剂、酯类溶剂、醚类溶剂或卤代烷类溶剂，例如C_1‐6醇、C_3‐6酮、C_3‐6酯、C_2‐6醚或C_1‐6卤代烷。其中所述的C_1‐6醇包括例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇、环戊醇、正己醇、环己醇等。所述的C_3‐6酮包括例如丙酮、甲乙酮、甲基异丁酮等。所述的C_2‐6醚包括例如甲醚、乙醚等。所述的C_3‐6酯包括例如甲酸乙酯、乙酸乙酯丙酸乙酯等。所述的C_1‐6卤代烃包括例如二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷等。

本发明还提供抗肿瘤的药物组合物，其包含根据上述任一项的三尖杉降二萜类化合物和至少一种药学上可接受的载体。

本发明另外还提供了抗肿瘤药物组合物，其包括下述的三尖杉降二萜类化合物和至少一种药学上可接受的载体，

以及，上述三尖杉降二萜类化合物fortunolide B、fortunolideA、10‐hydroxyhainanolidol在制备预防或治疗人或动物增生性疾病或病症的药物中的应用，其中所述的增生性疾病或病症为白血病、肝癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌。

本发明的三尖杉降二萜类化合物及其组合物可以是任何形式的，例如固体、半固体、液体、或者气溶胶形式。一般情况下，药物含有本发明的化合物或者提取物作为活性成分，与适合外部、肠道、或肠胃外给药的有机或者无机载体或斌形剂混合。活性成分可以是复方的，例如，与常规五毒药学可接受载体和/或斌形剂制成片剂、小药丸、胶囊、栓剂、阴道溶液、乳液、混悬液和适合使用的其他形式。在组合物中使用的药学可接受载体包括，例如，水、葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖、甘露糖醇、明胶、玉米淀粉、马铃薯淀粉、角蛋白、三硅酸镁、滑石粉和胶态二氧化硅，和适合在制备固体、半固体、液体和气溶胶形式的酯基中使用的其他载体。组合物可以另外含有稳定剂、增稠剂和/或着色剂和香料。

本发明的式(I)化合物或其盐可经口或不经过口给药，给药量因药物不同而各有不同，对成人来说，每天1–100mg比较合适。

经口服给药时，首先使化合物与常规的药用辅剂如赋形剂、崩解剂、黏合剂、润滑剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂、芳香剂、表面活性剂等混合，将其制成颗粒剂、胶囊、片剂等形式给药；非经口给药时可以注射液、输液剂或栓剂等形式给药。制备上述制剂时，可使用常规的制剂技术。

附图说明：

图1本发明三尖杉降二萜类化合物的微管蛋白聚合检测试验结果示意图；

图2本发明三尖杉降二萜类化合物结构示意图；

图3本发明所述三尖杉降二萜类化合物

图4三尖杉降二萜类化合物化学转化流程示意图。

具体实施方式：

下面结合附图，以本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，这些实例仅是对本发明优选方案的说明，而并不以任何方式限制本发明的保护范围。制备实施例1：

提取分离

干燥的高山三尖杉(39kg)和贡山三尖杉枝叶(19kg)，粉碎后用甲醇浸泡3次，每次2天，提取液合并，减压蒸馏除去溶剂，提取物加水稀释。加入1％(v/v)的盐酸水溶液调节pH2–3并搅拌，用石油醚萃取除去叶绿素和脂肪酸等杂质，水层用乙酸乙酯萃取分别得到粗提物A₁(510g)和B₁(292g)，用10％氨水(v/v)溶液将水层的酸碱度调节至pH 7–8，再用乙酸乙酯萃取得分别得到粗提物A₂(198g)和B₂(39g)。

取高山三尖杉粗提物A₁的(252g)用250g正相硅胶拌样，3kg硅胶柱层析，氯仿–甲醇(1:0–1:1,v/v)梯度洗脱，用薄层色谱进行检测，用Dragendorff试剂显色，合并相同组份，得到5(I–V)个组份。第II组份(29g)在C₁₈中压液相上经甲醇–水(30:70–100:0,v/v)得到II‐1–II‐5。II‐1(7.6g)于C₁₈中压液相上经甲醇–水(20:80–90:10,v/v)得到组分II‐1‐1–II‐1‐3。化合物fortunolide B(27mg)从组分II‐1‐2(4g)中析出，其母液以甲醇–水(30:70,v/v)在C₁₈中压液相上洗脱后，得到高山三尖杉内酯IV(6mg)和海南粗榧内酯醇(hainanolidol,13mg)。第III组份(17g)在MCI柱上以甲醇–水(70:30,v/v)洗脱除去色素后，在C₁₈中压液相上经甲醇–水(30:70–100:0,v/v)得到III‐1–III‐5。III‐2(4.3g)于C₁₈中压液相上经甲醇–水(30:70–60:40,v/v)得到组分III‐2‐1–III‐2‐5。组分III‐2‐3(0.8g)以甲醇–水(30:70,v/v)在C₁₈中压液相上进一步分离后，得到高山三尖杉内酯VII(3.3mg)。

高山三尖杉粗提物A₂(198g)用200g正相硅胶拌样，2kg硅胶柱层析，氯仿–甲醇(1:0–1:1,v/v)梯度洗脱，用薄层色谱进行检测，用Dragendorff试剂显色，合并相同组份，得到6(I–VI)个组份。第II组份(43g)在C₁₈中压液相上经甲醇–水(30:70–100:0,v/v)得到II‐1–II‐9。II‐5(11g)用11g正相硅胶拌样，110g硅胶柱层析，氯仿–丙酮(20:1–5:1,v/v)梯度洗脱，再经C₁₈中压液相(乙腈–水,10:90–30:70,v/v)纯化后得到fortunolide A(12mg)。II‐6(8g)于C₁₈中压液相上经甲醇–水(20:80–60:40,v/v)后，得到fortunolide B(48mg)，进一步在高压液相甲醇–水(40:70–50:50,v/v)上以纯化得到6‐en‐harringtonnolide(7mg)和10‐hydroxyharringtonnolide(10mg)。海南粗榧内酯(harringtonnolide,50mg)从第II‐7(4g)组分中析出。组分II‐8(7g)经C₁₈中压液相(甲醇–水,30:70–70:30,v/v)分离后，得到组分II‐8‐1–II‐8‐4。组分II‐8‐1(1.2g)进一步在C₁₈中压液相(甲醇–水,10:90–30:70,v/v)上纯化，得到高山三尖杉内酯V(23mg)。海南粗榧内酯醇(hainanolidol,243mg)从第II‐9(6g)组分中析出，其母液经C₁₈中压液相(甲醇–水,30:70–50:50,v/v)分离后，进一步在C₁₈高效液相(乙腈–水,14:86–24:76,v/v)上纯化，得到高山三尖杉内酯I(12mg)。第III组份(41g)在C₁₈中压液相上经甲醇–水(20:80–100:0,v/v)得到III‐1–III‐5。III‐4(9g)于C₁₈中压液相上经甲醇–水(30:70–70:30,v/v)分离得到高山三尖杉内酯III(13mg)。高山三尖杉内酯VI(22mg)从第III‐5(13g)组分中析出。第IV组份(31g)在C₁₈中压液相上经甲醇–水(10:90–100:0,v/v)得到IV‐1–IV‐9。IV‐4(5g)于C₁₈中压液相上经甲醇–水(20:80–50:50,v/v)分离后，进一步在高压液相(乙腈–水10:90–20:80,v/v)上纯化得到10‐hydroxyhainanolidol(或者11‐hydroxyhainanolidol,12mg)(J.Nat.Prod.2007,70,2029–2032,Nat.Prod.Rep.2012,29,845–869)和高山三尖杉内酯II(8mg)。

贡山三尖杉粗提物B₁(292g)用300g正相硅胶拌样，3kg硅胶柱层析，氯仿–甲醇(1:0–1:1,v/v)梯度洗脱，用薄层色谱进行检测，用Dragendorff试剂显色，合并相同组份，得到7(I–VII)个组份。组分IV(16g)经MCI柱层析，以甲醇洗脱，除去色素后，得到3个(IV‐1–IV‐3)组分，组分IV‐3(0.7g)析出化合物海南粗榧内酯(harringtonnolide,576mg)。第V组份(19g)在C₁₈中压液相上经甲醇–水(50:50–90:10,v/v)得到V‐1–V‐4。V‐1(3.4g)于C₁₈中压液相上经甲醇–水(30:70–60:40,v/v)得到组分V‐1‐1–V‐1‐6。组分V‐1‐5(224mg)以甲醇–水(45:65,v/v)在葡聚糖凝胶LH‐20洗脱后，得到高山三尖杉内酯IV(15mg)。第V‐1‐6组分(334mg)经C₁₈中压液相纯化后(甲醇–水，30:70–70:30,v/v)，得到海南粗榧内酯醇(hainanolidol,11.6mg)和高山三尖杉内酯V(1.2mg)。第VI组份(10.6g)在MCI凝胶上经甲醇洗脱除去色素后，于C₁₈中压液相上经甲醇–水(30:70–100:0,v/v)得到VI‐1–VI‐5。VI‐3(0.7g)于C₁₈中压液相上经甲醇–水(30:70–50:50,v/v)得到10‐dydroxyharringtonnolide(38mg)，fortunolide A(3.8mg)和贡山三尖杉内酯II(3.3mg)。

贡山三尖杉粗提物B₂(39g)用40g正相硅胶拌样，400g硅胶柱层析，氯仿–甲醇(1:0–1:1,v/v)梯度洗脱，用薄层色谱进行检测，用Dragendorff试剂显色，合并相同组份，得到4(I–IV)个组份。第II组份(15g)在C₁₈中压液相上经甲醇–水(20:80–100:0,v/v)得到II‐1–II‐4。II‐1(3.4g)于C₁₈中压液相上经甲醇–水(10:90–30:70,v/v)分离后，进一步在C₁₈高效液相上进一步纯化(甲醇–水,22:78–32:68,v/v)得到高山三尖杉内酯VII(1.5mg)。海南粗榧内酯醇(hainanolidol,50mg)从第II‐2(4g)组分中析出，其母液经C₁₈中压液相(甲醇–水,20:80–70:30,v/v)分离后，进一步在C₁₈高效液相(甲醇–水,43:57–53:47,v/v)上纯化，得到高山三尖杉内酯III(8mg)，fortunolide A(6mg)和6‐en‐harringtonnolide(2mg)。海南粗榧内酯(harringtonnolide,60mg)从第II‐3(3g)组分中析出，其母液经C₁₈中压液相(甲醇–水,30:70–60:40,v/v)分离后，进一步在C₁₈高效液相(乙腈–水,25:75–35:65,v/v)上纯化，得到贡山三尖杉内酯III(3mg)和贡山三尖杉内酯I(9mg)。

三尖杉降二萜类化合物结构如下所示：

制备实施例2：

化学转化：

在碱性条件下，内酯环可以打开如：将含有内酯环的三尖杉降二萜类化合物加入甲醇钠/甲醇溶液中，室温下搅拌，过滤，干燥，制成内酯环打开的类似化合物。

通过脱羟基反应获得没有取代的二萜如：将含有羟基取代的三尖杉降二萜类化合物荣誉N,N‐二甲基亚酰胺(DMF)中，加入吡啶和硫代氯甲酸苯酯(PhOCSCl)反应7–14小时后，加入三正丁基氢锡(n‐Bu₃SnH)搅拌4小时后，纯化，干燥得到脱羟基三尖杉降二萜。三尖杉降二萜类化合物化学转化流程如下所示。

贡山三尖杉内酯I(1)化学结构为：

贡山三尖杉内酯I的理化性质如下：淡黄色粉末；分子式C₁₉H₂₀O₃；紫外(MeOH)λ_max243，325nm；氢谱¹H和碳谱¹³C NMR数据(DMSO‐d₆)表1和表2；能溶于氯仿、丙酮、甲醇，难溶于水。

贡山三尖杉内酯II(2)化学结构为：

贡山三尖杉内酯II的理化性质如下：淡黄色粉末；分子式C₁₉H₁₈O₅，分子量326；UV(MeOH)λ_max(logε)238(4.03)，335(3.87)nm；氢谱¹H和碳谱¹³C NMR数据(丙酮‐d₆)见表1和表2；能溶于氯仿、丙酮、甲醇，难溶于水。

贡山三尖杉内酯III(3)化学结构为：

贡山三尖杉内酯III的理化性质如下：淡黄色粉末；分子式C₁₉H₁₈O₅；紫外(MeOH)λ_max：244，320nm；核磁氢谱¹H和核磁碳谱¹³C NMR数据(acetone‐d₆)见表1和表2；能溶于氯仿，丙酮，甲醇，难溶于水。

高山三尖杉内酯I(4)化学结构为：

高山三尖杉内酯I的理化性质如下：淡黄色粉末；分子式C₁₉H₂₀O₄，分子量312；UV(MeOH)λ_max(logε)240(3.88)，323(3.84)nm；氢谱¹H和碳谱¹³C NMR数据(DMSO‐d₆)见表1和表2；能溶于氯仿、丙酮、甲醇，难溶于水。

高山三尖杉内酯II(5)化学结构为：

高山三尖杉内酯II的理化性质如下：淡黄色粉末；分子式C₁₉H₂₀O₆，分子量344；UV(MeOH)λ_max：240，321nm；氢谱¹H和碳谱¹³C NMR数据(DMSO‐d₆)见表1和表2；微易溶于氯仿、丙酮、甲醇，难微溶于水。

高山三尖杉内酯III(6)化学结构为：

高山三尖杉内酯III的理化性质如下：淡黄色粉末；分子式C₁₉H₂₀O₅，分子量328；紫外(MeOH)λ_max：241，320nm；氢谱¹H和碳谱¹³C NMR数据(DMSO‐d₆)见表1和表2；能溶于氯仿、丙酮、甲醇，难溶于水。

高山三尖杉内酯IV(7)化学结构为：

高山三尖杉内酯IV的理化性质如下：淡黄色粉末；分子式C₁₉H₁₈O₄，分子量310；紫外(MeOH)λ_max：232，278，330nm；氢谱¹H和碳谱¹³C NMR数据(甲醇‐d₄)见表1和表2；能溶于氯仿、丙酮、甲醇，难溶于水。

高山三尖杉内酯V(8)化学结构为：

高山三尖杉内酯V的理化性质如下：淡黄色粉末；分子式C₁₉H₁₈O₅；紫外(甲醇)λ_max：239，337nm；氢谱¹H和碳谱¹³C NMR数据(DMSO‐d₆)见表1和表2；能溶于氯仿、丙酮、甲醇，难溶于水。

高山三尖杉内酯VI(9)化学结构为：

高山三尖杉内酯VI的理化性质如下：淡黄色粉末；分子式C₁₉H₁₈O₆，分子量342；紫外(MeOH)λ_max 240，323nm；¹H和¹³C NMR数据(DMSO‐d₆)见表1和表2；能溶于氯仿、丙酮、甲醇，难溶于水。

高山三尖杉内酯VII(10)化学结构为：

高山三尖杉内酯VII的理化性质如下：淡黄色粉末；分子式C₁₉H₂₄O₆；紫外(甲醇)λ_max：249，327nm；氢谱¹H和碳谱¹³C NMR数据(甲醇‐d₄)见表1和表2；能溶于氯仿、丙酮、甲醇，难溶于水。

Fortunolide B化学结构为：

Fortunolide B的理化性质如下：淡黄色粉末；分子式C₁₉H₁₈O₅；紫外(MeOH)λ_max248，320nm；核磁氢谱(¹H NMR 600MHz,DMSO‐d₆)δ:6.85(1H,d,J＝5.4Hz,H‐13),6.84(1H,d,J＝5.4Hz,H‐15),6.35(1H,s,10‐OH),6.08(1H,d,J＝6.0Hz,H‐2),5.05(1H,s,H‐20),4.03(1H,d,J＝6.0Hz,H‐3),3.30(1H,s,H‐10),2.28(1H,m,H‐7b),2.60(1H,dd,J＝15.0,6.0Hz,H‐7a),2.60(1H,dd,J＝14.4,6.0Hz,H‐6b),2.28(3H,s,H‐16),1.61(1H,q,J＝7.2Hz,H‐4),1.24(1H,m,H‐6a),0.72(3H,d,J＝7.2Hz,H‐18)；¹³C NMR(150MHz,DMSO‐d₆)δ:185.3(s,C‐14),172.9(s,C‐19),145.7(s,C‐9),145.7(s,C‐11),145.0(s,C‐12),143.9(s,C‐8),140.5(d,C‐13),138.6(d,C‐15),88.2(d,C‐20),83.2(d,C‐3),80.9(s,C‐1),80.2(d,C‐2),56.5(d,C‐10),46.6(s,C‐5),40.7(d,C‐4),31.4(t,C‐7),23.3(q,C‐16),21.7(t,C‐6),14.2(q,C‐18)；能溶于氯仿、丙酮、甲醇，难溶于水。

海南粗榧内酯(harringtonolide)化学结构为：

海南粗榧内酯的理化性质如下：淡黄色粉末；分子式C₁₉H₁₈O₄；紫外(MeOH)λ_max：240，323nm；¹H NMR(400MHz,丙酮‐d₆)δ:6.82(1H,s,H‐13),6.81(1H,s,H‐15),5.25(1H,m,H‐3),5.36(1H,d,J＝5.4Hz,H‐20),3.94(1H,m,H‐2),3.37(1H,overlap,H‐7b),2.74(1H,d,J＝6.6Hz,H‐10),2.58(1H,overlap,H‐7a),2.56(1H,overlap,H‐6b),2.36(3H,s,H‐16),1.75(1H,m,H‐4),1.23(1H,overlap,H‐6a),1.22(1H,overlap,H‐1),0.72(3H,d,J＝7.2Hz,H‐18)；¹³C NMR(100MHz,acetone‐d₆)δ:185.4(s,C‐14),173.6(s,C‐19),146.4(s,C‐11),145.8(s,C‐9),145.7(s,C‐8),143.9(s,C‐12),140.5(d,C‐13),138.4(d,C‐15),85.8(d,C‐2),79.7(d,C‐3),78.8(d,C‐20),49.0(d,C‐10),47.2(d,C‐4),43.9(s,C‐5),41.4(d,C‐1),31.5(t,C‐7),23.3(q,C‐16),21.1(t,C‐6),14.5(q,C‐18)；能溶于氯仿，丙酮，甲醇，难溶于水。

10‐Hydroxyharringtonolide化学结构为：

10‐Hydroxyharringtonolide的理化性质如下：淡黄色粉末；分子式C₁₉H₁₈O₅；紫外(MeOH)λ_max：242，310nm；氢谱¹H NMR(600MHz,DMSO‐d₆)δ:6.86(1H,s,H‐15),6.78(1H,s,H‐13),6.40(1H,brs,10‐OH),5.38(1H,d,J＝5.4Hz,H‐20),5.26(1H,t,J＝5.4Hz,H‐3),3.94(1H,d,J＝5.4Hz,H‐3),3.14(1H,t,J＝6.0Hz,H‐1),2.56(2H,overlap,H‐7),2.48(2H,overlap,H‐6),2.23(3H,s,H‐16),1.37(1H,q,J＝7.2Hz,H‐4),0.75(3H,d,J＝7.2Hz,H‐18)；碳谱¹³C NMR(150MHz,DMSO‐d₆)δ:185.5(s,C‐14),171.6(s,C‐19),146.8(s,C‐12),145.8(s,C‐11),144.9(s,C‐9),143.9(s,C‐8),141.0(d,C‐15),139.1(d,C‐13),86.7(s,C‐10),82.0(d,C‐20),79.0(d,C‐2),78.4(d,C‐3),51.4(s,C‐5),48.9(d,C‐1),41.3(d,C‐4),30.0(t,C‐7),23.1(q,C‐16),20.0(t,C‐6),15.0(q,C‐18)；能溶于氯仿、丙酮、甲醇，难溶于水。

6‐En‐harringtonolide化学结构为：

6‐En‐harringtonolide的理化性质如下：淡黄色粉末；分子式C₁₉H₁₆O₄；UV(MeOH)λ_max：234，275，330nm；氢谱¹H NMR(600MHz,acetone‐d₆)δ:6.71(1H,d,J＝2.4Hz,H‐13),6.68(1H,d,J＝2.4Hz,H‐15),6.62(1H,d,J＝9.6Hz,H‐6),6.58(1H,d,J＝9.6Hz,H‐7),5.37(1H,d,J＝9.0Hz,H‐20),5.32(1H,t,J＝5.4Hz,H‐2),4.03(1H,d,J＝5.4Hz,H‐3),3.68(1H,d,J＝9.0Hz,H‐10),3.25(1H,overlap,H‐1),1.97(1H,m,H‐4),2.27(1H,s,H‐16),0.81(3H,d,J＝7.8Hz,H‐18)；碳谱¹³C NMR(150MHz,acetone‐d₆)δ:186.7(s,C‐14),171.3(s,C‐19),144.7(s,C‐12),143.9(s,C‐11),143.2(s,C‐8),139.3(s,C‐9),139.2(d,C‐13),135.3(d,C‐15),133.3(d,C‐6),131.0(d,C‐7),86.1(d,C‐20),80.3(d,C‐2),79.2(d,C‐3),51.4(d,C‐10),47.5(s,C‐5),41.4(d,C‐4),29.5(d,C‐4),39.2(d,C‐1),22.8(q,C‐16),15.5(q,C‐18)；能溶于氯仿、丙酮、甲醇，难溶于水。

Fortunolide A化学结构为：

Fortunolide A的理化性质如下：淡黄色粉末；分子式C₁₉H₂₀O₄，分子量312；紫外(MeOH)λ_max：252，320nm；氢谱¹H NMR(400MHz,acetone‐d₆)δ:6.76(1H,s,H‐13),6.68(1H,s,H‐15),5.19(1H,s,10‐OH),4.72(1H,t,J＝4.2Hz,H‐2),3.27(1H,m,H‐20b),3.15(1H,m,H‐7b),2.74(1H,m,H‐20a),2.69(1H,m,H‐6b),2.60(1H,m,H‐6a),2.24(3H,s,H‐16),2.10(1H,m,H‐1),1.80(1H,m,H‐3b),1.56(1H,m,H‐3a),1.34(1H,m,H‐4),0.87(3H,d,J＝7.0Hz,H‐18)；碳谱¹³C NMR(100MHz,acetone‐d₆)δ:186.0(s,C‐14),173.8(s,C‐19),146.5(s,C‐12),146.54(s,C‐11),145.2(s,C‐9),143.8(s,C‐8),141.2(d,C‐13),139.2(d,C‐15),87.5(s,C‐10),78.0(d,C‐2),50.3(s,C‐5),46.5(d,C‐1),36.0(t,C‐20),29.5(d,C‐4),29.2(t,C‐3),28.7(t,C‐7),24.3(q,C‐16),19.5(q,C‐18),18.8(t,C‐6)；能溶于氯仿、丙酮、甲醇，难溶于水。

海南粗榧内酯醇(hainanolidol)化学结构为：

海南粗榧内酯醇的理化性质如下：淡黄色粉末；分子式C₁₉H₂₀O₄；紫外(MeOH)λ_max：243，325nm；氢谱¹H NMR(400MHz,DMSO‐d₆)δ:6.78(1H,s,H‐13),6.71(1H,s,H‐15),5.58(1H,m,3‐OH),4.50(1H,t,J＝4.1Hz,H‐3),3.45(1H,overlap,H‐2),3.44(1H,overlap,H‐20b),3.43(1H,overlap,H‐10),3.10(1H,m,H‐20a),2.97(1H,s,H‐1),2.77(1H,m,H‐7b),2.58(1H,m,H‐7a),2.12(3H,s,H‐16),1.72(1H,q,J＝7.1Hz,H‐6b),1.32(1H,m,H‐6a),0.83(3H,d,J＝6.9Hz,H‐18)；碳谱¹³C NMR(100MHz,DMSO‐d₆)δ:184.7(s,C‐14),175.1(s,C‐19),147.3(s,C‐11),145.8(s,C‐8),144.7(s,C‐12),142.3(s,C‐9),139.5(d,C‐13),137.0(d,C‐15),77.7(d,C‐3),74.5(d,C‐2),50.6(d,C‐10),43.9(s,C‐5),37.0(d,C‐4),36.8(t,C‐20),33.6(d,C‐1),29.7(t,C‐7),24.3(q,C‐16),21.3(t,C‐6),16.7(q,C‐18)；能溶于氯仿、丙酮、甲醇，难溶于水。

10‐Hydroxyhainanolidol(Nat.Prod.Rep.2012,29,845–869)(或者11‐hydroxyhainanolidol)(J.Nat.Prod.2007,70,2029–2032)，化学结构为：

10‐Hydroxyhainanolidol的理化性质如下：淡黄色粉末；分子式C₁₉H₂₀O₅；紫外(MeOH)λ_max：243，325nm；氢谱¹H NMR(400MHz,DMSO‐d₆)δ:6.81(1H,s,H‐15),6.71(1H,s,H‐13),6.06(1H,s,10‐OH),5.64(1H,d,J＝4.2Hz,3‐OH),4.60(1H,d,J＝4.2Hz,H‐2),3.46(1H,overlp,H‐3),3.32(1H,overlp,H‐20b),3.10(1H,dd,J＝18.5,10.1Hz,H‐20a),2.97(1H,m,H‐7b),2.64(1H,m,H‐1),2.51(1H,m,H‐7a),2.33(1H,m,H‐6a),2.15(3H,s,H‐16),1.66(1H,m,H‐6a),1.25(1H,m,H‐4),0.88(3H,d,J＝6.9Hz,H‐18)；碳谱¹³C NMR(100MHz,DMSO‐d₆)δ:185.0(s,C‐14),173.5(s,C‐19),147.2(s,C‐12),145.7(s,C‐11),144.8(s,C‐9),142.7(s,C‐8),140.0(d,C‐13),138.0(d,C‐15),85.2(s,C‐10),77.4(d,C‐2),74.2(d,C‐3),48.7(s,C‐5),44.2(d,C‐1),37.6(d,C‐4),34.3(t,C‐20),27.5(t,C‐7),23.9(q,C‐16),17.6(t,C‐6),16.6(q,C‐18)；能溶于氯仿、丙酮、甲醇，难溶于水。

活性试验实施例1：

肿瘤细胞毒活性评价

1.样品及制备：

样品呈淡黄色，二甲亚砜(DMSO)溶解配制为10mg/mL浓度的贮存液避光保存备用。MTT法检测细胞活性，活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色(或蓝紫色)不溶于水的甲臜(formazan)，甲臜的含量可以用酶标仪在570nm处进行测定，根据光密度OD值推测出活细胞的数目。阳性对照为喜树碱(camptothecin)。细胞株包括：

A549，人肺癌细胞株

HeLa，人宫颈癌细胞

SGC‐7901，人胃癌细胞株

MCF‐7,人乳腺癌细胞株

HL‐60,人白血病细胞株

2.实验方法

(1)接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液(DMEM或者RMPI1640)配成单个细胞悬液，以每孔10000–20000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μL，贴壁细胞提前12小时接种培养。(2)加入待测化合物溶液(化合物单体固定浓度20μM初筛，在该浓度对肿瘤细胞生长抑制在50％附近的化合物设5个浓度进入梯度复筛)，每孔终体积200μL，每种处理均设3个复孔。(3)显色：37摄氏度培养48小时后，每孔加MTT溶液20μL。继续孵育4小时，终止培养，小心吸取孔内培养上清液100μL以避免细胞丢失，每孔加20％的SDS 100μL，过夜孵育(温度37℃)，使结晶物充分融解。(4)比色：选择595nm波长，酶联免疫检测仪读取各孔光吸收值，记录结果，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(Reed andMuench法)计算化合物的IC₅₀值。

3.实验结果：

表3.三尖杉降二萜类化合物细胞毒活性(IC₅₀,μM)

在本实验条件下，对以上人肺癌细胞株(A549)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人胃癌细胞株(SGC‐7901)、人乳腺癌细胞株(MCF‐7)，人白血病细胞株(HL‐60)生长的半数抑制浓度(IC₅₀)在0.1–20μM之间，显示了显著的抑制癌症的作用。

活性试验实施例2：

微管蛋白聚合检测(按照试剂盒说明书进行如下操作：)

三尖杉降二萜和秋水仙碱同有的环庚稀酮结构，秋水仙碱的主要作用机制是抑制微管的聚合，因此我们也探讨此类成分抗肿瘤活性是否与抑制微管的聚合有关。

按照试剂盒说明书进行分装。

1.实验：

选择活性最好的三个成分进行试验。打开仪器预热至37℃，设置仪器参数Ex360nm，Em 420nm，将96孔板放置于酶标仪预热10min。将5μL Taxol储存液加入325μL的去离子水，得到30μM的工作液(10×)；将待测化合物稀释成100μM工作液(10×)。溶解1.5mLBuffer 1并置于冰上；溶解20μL GTP stock并置于冰上；取出Tubulin Glycerol Buffer并置于冰上；在常温水中溶解88μL蛋白至液态并马上置于冰上。按下表立即加入相应反应组分：

在96孔板上，对照孔中加入5μL去离子水，其他孔中分别加入5μL 10×的工作液。将96孔板放入酶标仪中预热1min。将D中混合好的反应物加入96孔板的相应位置，每孔50μL。开始读数，1次/min。

试验结果：

如图1所示，3个活性成分均不能抑制、促进微管蛋白的聚合。推测此类成分不能影响微管聚合。

活性试验实施例3：

NF‐κB信号通路抑制活性评价：

核转录因子NF‐κB通过调控多种基因的表达，参与免疫反应、炎症反应、细胞凋亡、肿瘤发生与转移等多种生物进程。细胞中的NF‐κB与抑制性蛋白IκBα结合形成复合物，并被滞留于细胞质而处于非活化状态，当细胞受到各种胞内外刺激时，IκBα被迅速地降解，NF‐κB得以释放并进入细胞核。从而发挥其转录调节功能。NF‐κB信号通路与免疫应答和肿瘤的发生发展密切相关，是重要的抗炎抗肿瘤药物作用靶点。试验表明α,β‐不饱和酮，是典型的迈克尔加成反应受体分子，是许多化合物的抗肿瘤和抗炎活性中心。通过α,β‐不饱和酮与蛋白中半胱氨酸残基的巯基发生迈克尔加成反应形成共价键，从而发挥其抗肿瘤与抗炎活性。三尖杉降二萜也具有α,β‐不饱和酮结构，所以推测其可能具有抑制NF‐κB信号通路的活性，因此对该类化合物进行NF‐κB信号通路的初步探究。

1.样品：试验实施例1所述贮备液；细胞株：HEK 293细胞(Human EmbryonicKidney293cells)。除试验实施例1中细胞毒活性评价所需试剂与耗材外，另需κB依赖的荧光素酶(5×κB‐luciferase)、持续激活的海肾荧光素酶(pTK‐Renilla Luciferase)(Promega)，肿瘤坏死因子‐α(TNF‐α,peproteck)，此外还需要萤光素酶双报告基因检测试剂盒(Dual Luciferase Reporter Assay System,Promega)。

2.实验方法：将HEK 293细胞接种于24孔板中，待贴壁后使用Lipofectamine 2000转染5×κB‐luciferase和pTK‐Renilla，培养18h后，针对不同样品，以不同浓度对细胞进行处理，再以10ng/mL TNF‐α刺激4h，细胞裂解后取裂解液测定萤光素酶活性。

3、实验结果：

表4.三尖杉降二萜类化合物抑制NF‐κB通路和NO释放活性(IC₅₀,μM)

三尖杉降二萜类化合物均有良好的NF‐κB信号通路抑制活性，提示该类化合物的抗肿瘤机制可能与NF‐κB信号通路有关。

活性试验实施例4：

抗炎活性筛选(抑制一氧化氮NO生成)：

三尖杉降二萜类化合物对NF‐κB信号通路有很强的抑制活性，而转录抑制NF‐κB是细胞应对损伤、应激和炎症反应的一个核心组件，因此对该类化合物进行抗炎活性评价。

1.材料：实施例1所述化合物以DMSO溶解，至浓度为10mM(Fig.2‐3)。

2.实验方法：将RAW264.7细胞接种至96孔板，用1μg/ml LPS进行诱导刺激，同时加入待测化合物处理，不用化合物稀释不同的浓度，设置不含药物组和MG132阳性药物组做对照。细胞过夜培养后取培养基检测NO生成，在570nm处测定吸光值。在剩余培养基中加入MTS进行细胞存活率检测，排除化合物对细胞的毒性影响。NO生成抑制率(％)＝(非药物处理组OD570nm‐样品组OD570nm)/非药物处理组OD570nm×100％。IC₅₀(50％concentration ofinhibition)按Reed&Muench法计算。

3、实验结果(表4)表明三尖杉降二萜类化合物有较好活性，提示该类化合物有良好的抗炎活性。

活性试验实施例5：

肿瘤移植瘤模型筛选：

根据肿瘤细胞毒活性、Nf‐kB活性、抑制NO生成的试验结果，进行了构效规律分析，发现极性的降低有助于提高活性，因此寻找了活性最强的新化合物1作为进一步体内研究。

野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。共150尾，年龄为受精后2天(2dpf)。饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为480–510μS/cm；pH为6.9–7.2；硬度为53.7–71.6mg/L CaCO₃)，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2012‐0171。饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。用红色荧光染料(CM‐Dil)标记人非小细胞肺癌细胞(A549)，以显微注射的方式移植到2dpf斑马鱼卵黄囊内，每尾移植约200个细胞，建立斑马鱼非小细胞肺瘤移植模型。

根据浓度摸索试验在0.5μg/mL及以下浓度未见死亡和明显畸形，因此，确定“贡山三尖杉内酯I”最大耐受浓度(MTC)为0.6μg/mL。采用0.06μg/mL(1/10MTC)、0.018μg/mL(1/30MTC)和0.006μg/mL(1/90MTC)三个浓度作为抗肿瘤作用评价实验浓度。在显微镜下挑选出移植肿瘤一致性较好的斑马鱼，随机分配至6孔板中，每孔30尾。以水溶给药方法分别给予三个浓度，每孔5mL药液，连续处理2d。实验结束后，每个实验组随机选择10尾斑马鱼在荧光显微镜下进行观察、拍照并保存图片；利用尼康NIS‐Elements D 3.10高级图像处理软件进行图像分析，计算肿瘤细胞荧光强度(S)，以荧光强度评价“贡山三尖杉内酯I”对斑马鱼非小细胞肺瘤移植瘤的抑制作用，并用以下公式计算肿瘤抑制率：

根据移植瘤的生长抑制百分率绘制剂量效应曲线；统计学分析采用方差分析和Dunnett’s T‐检验，p<0.05为显著性差异；提供具有代表性的实验图谱。

表5.斑马鱼A549移植瘤的荧光强度汇总(n＝10)

与模型对照组比较，**p<0.01，***p<0.001

制剂实施例1：

按制备实施例1的方法制备得到本发明的上述化合物，以及利用乙醇、甘油、聚乙二醇等助溶剂溶解，做成口服制剂；或按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

制剂实施例2：

按实施例1的方法制备得到本发明的上述化合物，与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。

制剂实施例3：

按实施例1的方法制备得到本发明的上述化合物，按其与赋形剂重量比为1:5‐1:10的比例加入赋形剂，制粒压片。

制剂实施例4：

按实施例1的方法制备得到本发明的上述化合物，按其与赋形剂重量比为1:10～100的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。

Claims (12)

1.式(I)所示的三尖杉降二萜类化合物及其药学上可接受的盐，

其中：R₁、R₂和R₉独立的为氢、羟基、C_0–10烷氨基、C_1–10烷氧基、C_2–10烯基氧基、C_2–10炔基氧基、C_6–10芳基氧基或C_1–10酰氧基；

R₃和R₄独立的为氢、羟基、C_0–10烷氨基、酮羰基、C_1–10烷氧基、C_2–10烯基氧基、C_2–10炔基氧基、C_6–10芳基氧基、C_1–10酰氧基；

R₅和R₈独立的为氢、羟基、C_0–10烷氨基、C_1–10烷氧基、C_2–10烯基氧基、C_2–10炔基氧基、C_6–10芳基氧基、C_1–10酰氧基，或者R₅(R₈)形成酮羰基；

R₆和R₇独立的为氢、羟基、C_0–10烷氨基、酮羰基、C_1–10烷氧基、C_2–10烯基氧基、C_2–10炔基氧基、C_6–10芳基氧基、C_1–10酰氧基，或者R₆与R₇之间通过氧或氮原子形成呋喃环或吡咯环；

R₉为独立的为氢、羟基、C_0–10烷氨基、C_1–10烷氧基、C_2–10烯基氧基、C_2–10炔基氧基、C_6–10芳基氧基或C_1–10酰氧基，或者R₈为羟基或氨时可与R₉形成酯或酰胺，

排除下列化合物：

2.根据权利要求1所述的式(I)所示的三尖杉二萜类化合物，其特征在于其为下述化合物：

3.根据权利要求1或2所述的三尖杉降二萜类化合物及其药学上可接受的盐，其特征在于所述的药学上可接受的盐是指与有机酸或无机酸形成的盐，所述的有机酸为甲酸、乙酸、乙二酸、丙酸、丁酸、己酸、己二酸、草酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、延胡索酸、柠檬酸、樟脑酸、樟脑磺酸、乳酸、苦味酸、藻酸、天冬氨酸、苯磺酸、二葡糖酸、环戊烷丙酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、葡庚糖酸、甘油磷酸、半硫酸、庚酸、2‐羟基乙磺酸、甲磺酸、烟酸、2‐萘磺酸、扑酸、果胶脂酸、3‐苯基甲酸、新戊酸、硫代氰酸、对甲苯磺酸，所述的无机酸为盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸、硝酸。

4.制备权利要求1或2所述的三尖杉降二萜类化合物的方法，其特征在于从三尖杉属植物中用水或有机溶剂提取分离而得，如果有必要，与适当的酸成盐，所述的三尖杉属植物为三尖杉Cephalotaxus fortunei、贡山三尖杉C.lanceolata、篦子三尖杉C.oliveri、台湾三尖杉C.wilsoniana、粗榧C.sinensis、海南粗榧C.hainanensis、西双版纳粗榧C.manni；所述的有机溶剂为C_1‐6醇、C_3‐6酮、C_3‐6酯、C_2‐6醚或C_1‐6卤代烷；其中所述的C_1‐6醇为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇、环戊醇、正己醇、环己醇，所述的C_3‐6酮为丙酮、甲乙酮、甲基异丁酮，所述的C_3‐6酯为甲酸乙酯、乙酸乙酯丙酸乙酯，所述的C_2‐6醚为甲醚、乙醚，所述的C_1‐6卤代烃为二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷。

5.如权利要求4所述的三尖杉降二萜类化合物的制备方法，其特征在于三尖杉属植物的茎叶粉碎，甲醇或乙醇或丙酮或乙酸乙酯或氯仿或石油醚提取，调节PH＝1.0–4.5，乙酸乙酯萃取，水层调节至PH＝7.0–11.0,乙酸乙酯萃取，萃取物浓缩，经硅胶柱层析，氯仿‐甲醇洗脱，得粗产物，丙酮重结晶得纯品。

6.一种三尖杉属植物提取物，其特征在于其由下述方法制备而得：三尖杉属植物的茎叶粉碎，甲醇或乙醇或丙酮或乙酸乙酯或氯仿或石油醚提取，调节PH＝1.0–4.5，乙酸乙酯萃取，水层调节至PH＝7.0–11.0,乙酸乙酯萃取，萃取物浓缩，经硅胶柱层析，氯仿‐甲醇洗脱，得提取物。

7.三尖杉属植物提取物在制备预防或治疗白血病、肝癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌的药物中的应用，其特征在于所述的三尖杉属植物提取物由下述方法制备而得：三尖杉属植物的茎叶粉碎，甲醇或乙醇或丙酮或乙酸乙酯或氯仿或石油醚提取，调节PH＝1.0–4.5，乙酸乙酯萃取，水层调节至PH＝7.0–11.0,乙酸乙酯萃取，萃取物浓缩，经硅胶柱层析，氯仿‐甲醇洗脱，得提取物。

8.抗肿瘤药物组合物，其包括权利要求1或2所述的三尖杉降二萜类化合物和至少一种药学上可接受的载体。

9.权利要求1或2所述的三尖杉降二萜类化合物或其药用盐或权利要求7所述的三尖杉属植物提取物在制备预防或治疗人或动物增生性疾病或病症的药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其中所述的增生性疾病或病症为白血病、肝癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌。

11.抗肿瘤药物组合物，其包括下述的三尖杉降二萜类化合物和至少一种药学上可接受的载体，

12.三尖杉降二萜类化合物fortunolide B、fortunolide A、10-hydroxyhainanolidol在制备预防或治疗人或动物增生性疾病或病症的药物中的应用，其中所述的增生性疾病或病症为白血病、肝癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌。