CN107629104A

CN107629104A - 三萜皂苷药物化合物及其制剂和应用

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Publication number: CN107629104A
Application number: CN201710843845.0A
Authority: CN
Inventors: 刘海洋; 何黎; 郭振宇; 倪伟; 马骁
Original assignee: Kunming Beitaini Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Kunming Beitaini Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-09-18
Filing date: 2017-09-18
Publication date: 2018-01-26

Abstract

本发明的三萜皂苷药物化合物物及其制剂和应用，属于药物技术领域。三萜皂苷药物化合物包括云南山茶三萜皂苷化合物1或化合物2或化合物3或化合物4或化合物5或化合物6或化合物7。化合物1‑7的单个化合物、或七个化合物相互组合后分别与糊精、或乳糖、或淀粉、或硬脂酸镁、注射用水，按重量比分别为9:1、1:5‑1:10、5:1、3:1的比例及常规的制备方法制成常规使用的制剂。三萜皂苷化合物在制备治疗或预白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌的药物制剂中的应用。本发明的有益效果在于：对白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌5种肿瘤株具有显著的抑制活性，为云南山茶的综合利用，治疗和预防上述癌症药物开发方面，提供了新药物和新的途径。

Description

三萜皂苷药物化合物及其制剂和应用

技术领域

本发明涉及三萜皂苷药物组合物及其制剂和应用，属于药物技术领域。

背景技术

云南山茶(Camellia reticulata Lindl.)为山茶科山茶属常绿乔木植物，又名滇山茶、南山茶，灌木至小乔木，有时高达15米，嫩枝无毛。叶阔椭圆形，先端尖锐或急短尖，基部楔形或圆形，上面干后呈深绿色，发亮，下面深褐色，无毛；叶柄长8-13毫米，无毛；花顶生，红色，无柄。其主要分布于我国云南省，已有1000多年的栽培历史，是云南“八大名花”中最享有盛名的一种。其味甘，性凉。归肝、胃、大肠经。具有凉血止血，解毒止痢之功效。主要用于治疗吐血，便血，刀伤出血，月经过多，痢疾，烫火伤等症。

文献报道从云南山茶的花中分离鉴定出的一系列酚性化合物，如山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1→6)-2″′,3″′-O-二乙酰基-α-L-鼠李糖基-(1→4)-α-L-鼠李糖苷；山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1→6)-2″′,3″′-O-二乙酰基-α-L-鼠李糖基-2″′,3″′-O-二乙酰基-α-L-鼠李糖苷；山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1→6)-2″′,3″′-O-二乙酰基-α-L-鼠李糖基-2″′-O-乙酰基-α-L-鼠李糖苷；山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1→6)-2″′,3″′-O-二乙酰基-α-L-鼠李糖基-2″′,3″′，4″′-O-三乙酰基-α-L-鼠李糖苷；1,2,3,6-四氧-没食子酰基-β-D-葡萄糖苷；1,6-二氧-没食子酰基-2,3-六-羟基-联二苯-β-D-葡萄糖苷；没食子酸；没食子酸甲酯；没食子酸没食子酯；槲皮素和山萘酚等化合物。迄今为止，未见从云南山茶枝叶发现具有抗肿瘤活性的三萜皂苷，更没有以其为有效成分制成的抗肿瘤药物报道。

发明内容：

本发明目的旨在于提供三萜皂苷药物化合物及其制剂和应用。

本发明的三萜皂苷药物化合物包括云南山茶三萜皂苷化合物1或化合物2或化合物3或化合物4或化合物5或化合物6或化合物7，其结构式如下：

云南山茶三萜皂苷化合物的制备方法同现有技术，即：用50-80％的甲醇或乙醇溶剂，冷浸或热回流提取云南山茶(Camellia reticulate Lindl.)枝叶得到总浸膏，总浸膏用水分散后用有机溶剂正丁醇萃取得到萃取物，或通过大孔吸附树脂得到70％乙醇或甲醇洗脱物，正丁醇萃取物或洗脱物经过各种正反相柱层析、制备及半制备HPLC分离得到所述化合物；其具体步骤如下：

取干燥云南山茶(Camellia reticulata)枝叶，粉碎，用75％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩回收，得到粗提物。粗提物用温水溶解后，加入正丁醇萃取三次，减压浓缩正丁醇层，得到正丁醇萃取物。正丁醇萃取物用硅胶拌样，用300-400目硅胶进行干法装柱上样，氯仿-甲醇-水系统进行梯度洗脱(1:0:0→100:1:0→40:1:0→20:1:0→10:1:0→8:2:0.2→7:3:0.5→1:1:0.5)。以TCL薄层板进行检测，最终得到3个部分Fr.1-3。Fr.2反复经过硅胶柱层析(氯仿-甲醇-水10:1:0→7:3:0.5,v/v)，反相Rp-18柱层析(甲醇-水30:70→80:20)，Sephadex LH-20柱层析(氯仿-甲醇1:1，甲醇)，和高效液相半制备(MeCN-MeOH-1‰CF₃COOH)，得到化合物1-4,6和7。Fr.3经过MCI gel柱层析，甲醇-水系统进行梯度洗脱，得到60％、65％和70％甲醇洗脱部分，65％甲醇洗脱部分经过中压MPLC反相柱层析(甲醇-水30:70→80:20)，硅胶柱层析(氯仿-甲醇-水10:1:0→8:2:0.2→7:3:0.5→1:1:0.5)，以及HPLC等分离纯化方法得到化合物5。

本发明的三萜皂苷药物化合物制剂为：

云南山茶三萜皂苷化合物1或化合物2或化合物3或化合物4或化合物5或化合物6或化合物7的单个化合物与乳糖、或淀粉，或七个化合物相互组合后与赋形剂乳糖、或淀粉，按重量比为9:1的比例混合制成粉剂；

云南山茶三萜皂苷化合物1或化合物2或化合物3或化合物4或化合物5或化合物6或化合物7的单个化合物与糊精、或乳糖、或淀粉、或硬脂酸镁，或七个化合物相互组合后与糊精、或乳糖、或淀粉、或硬脂酸镁，按重量比为1:5-1:10的比例混合后制粒压片；

云南山茶三萜皂苷化合物1或化合物2或化合物3或化合物4或化合物5或化合物6或化合物7的单个化合物与糊精、或乳糖、或淀粉、或硬脂酸镁，或七个化合物相互组合后与糊精、或乳糖、或淀粉、或硬脂酸镁，按重量比为5:1的比例制成胶囊或颗粒剂或冲剂；

云南山茶三萜皂苷化合物1或化合物2或化合物3或化合物4或化合物5或化合物6或化合物7的单个化合物与注射用水、或七个化合物相互组合后与注射用水，按重量比为3:1的比例制成注射液；

云南山茶三萜皂苷化合物1或化合物2或化合物3或化合物4或化合物5或化合物6或化合物7的单个化合物与注射用水、或七个化合物相互组合后与注射用水，按重量比为3:1的比例制成粉针剂。

上述制剂的具体制备方法同现有技术使用的常规方法。

本发明的三萜皂苷药物化合物在制备治疗或预防白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌的药物制剂中的应用。

本发明的有益效果在于：对白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌5种肿瘤株具有显著的抑制活性，其IC₅₀分别为0.93，0.78，0.54，0.70，0.70，0.54，0.54μM。为云南山茶的综合利用，治疗癌症药物开发方面，提供了新药物和新的途径。

具体实施方式：

下面用本发明实施例来进一步说明本发明的实质内容，但本发明的内容并不局限于此。

下述试验中，ESI-MS和HRESI-MS由Agilent 1290UPLC/6540Q-TOF质谱仪测定，其中EI-MS在70eV下测定；¹H,¹³C NMR和2D NMR谱在Bruker Avance III-600核磁共振仪上测定(TMS为内标)；柱层析用硅胶G(200–300目)及薄层层析均为青岛海洋华工工厂产品。薄层层析通过10％三氯化铁-乙醇溶液观察其斑点。Saphadex LH-20为GE Healthcare公司产品。反相材料Rp-18及Rp-18薄层板为Merck公司产品。分析和半制备用Agilent 1260型高效液相色谱仪，半制备色谱柱为Agilent公司的ZORBAX-SB-C18column(5μm；250×9.4mm)

实施例1：

云南山茶中抗肿瘤活性三萜皂苷化合物的制备及结构鉴定：

采集自云南、及各地栽培云南山茶(Camellia reticulata)枝叶，干燥粉碎后(5.0kg)，用75％乙醇回流提取3次，合并提取液，减压浓缩回收，得到粗提物。粗提物用温水溶解后，加入正丁醇萃取三次，减压浓缩正丁醇层，得到正丁醇萃取物500g。用700g硅胶(80-100目)拌样，2kg硅胶(200-300目)装柱，氯仿-甲醇-水系统进行梯度洗脱(1:0:0→100:1:0→40:1:0→20:1:0→10:1:0→8:2:0.2→7:3:0.5→1:1:0.5)。以TCL薄层板进行检测，最终得到3个部分：Fr.1(90g)、Fr.2(110g)和Fr.3(70g)。Fr.2反复经过硅胶柱层析(氯仿-甲醇-水10:1:0→7:3:0.5,v/v)，反相Rp-18柱层析(甲醇-水30:70→80:20)，SephadexLH-20柱层析(氯仿-甲醇1:1，甲醇)，和高效液相半制备(MeCN-MeOH-1‰CF₃COOH)，得到1(6.2mg),2(6.7mg),3(21mg),4(54.7mg),6(15mg)和7(40.8mg)。Fr.3经过MCI gel柱层析，甲醇-水系统进行梯度洗脱(MeOH-H₂O 30:70→80:20)，得到60％甲醇洗脱部分10g，65％甲醇洗脱部分4.3g，70％甲醇洗脱部分2.1g；65％甲醇洗脱部分经过中压MPLC反相柱层析(甲醇-水30:70→80:20)，硅胶柱层析(氯仿-甲醇-水10:1:0→8:2:0.2→7:3:0.5→1:1:0.5v/v)，以及HPLC等分离纯化方法得到化合物5(8.0mg)。

云南山茶三萜皂苷化合物1或化合物2或化合物3或化合物4或化合物5或化合物6或化合物7的结构式与发明内容部分描述的相同。

(1)新化合物1-3的结构鉴定和表征：

云南山茶皂苷B(Dianshanchaoside B,1)的物理常数和波谱数据：白色无定型粉末；(c 0.08,MeOH)；IR(KBr)ν_max 3426,1629,1077cm^–1；HR-ESI-MS m/z1195.5898[M+Na]⁺(calcd for C₅₈H₉₂O₂₄Na,1195.5871)；¹H和¹³C NMR数据见表一和表二。其结构鉴定为：22-O-angeloylcamelliagenin A3-α-L-rhamnopyranosyl-L-(1→2)-α-L-arabinopynosyl-(1→3)-[β-D-galactopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside。

云南山茶皂苷C(Dianshanchaoside C,2)的物理常数和波谱数据：白色无定型粉末；(c 0.10,MeOH)；IR(KBr)ν_max 3430,1629cm^–1；HR-ESI-MS m/z1195.5815[M+Na]⁺(calcd for C₅₈H₉₂O₂₄Na,1195.5871)；¹H和¹³C NMR数据见表一和表二。其结构鉴定为：22-O-angeloylcamelliagenin A3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopynosyl-(1→3)-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside。

云南山茶皂苷D(Dianshanchaoside D,3)的物理常数和波谱数据：白色无定型粉末；(c 0.10,MeOH)；IR(KBr)ν_max 3429,1703,1631cm^–1；HR-ESI-MS m/z1323.6323[M+Na]⁺(calcd for C₆₄H₁₀₀O₂₇Na,1323.6344)；¹H和¹³C NMR数据见表一和表二。其结构鉴定为：21,22-di-O-angeloylbarringtogenol C3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranosyl-(1→3)-[β-D-glucopyranosy-l-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside。

表一、化合物1-3苷元部分的¹H(600MHz)和¹³C NMR(150MHz)数据(δin ppm,J inHz)^a

^a Overlapped and multiple signals were reported without designatingmultiplicity；^b Measured in CD₃OD；^c Measured in C₅D₅N；^dNot detected。

表二、化合物1-3糖基部分的¹H(600MHz)和¹³C NMR(150MHz)数据(δin ppm,J inHz)^a

^a Overlapped and multiple signals were reported without designatingmultiplicity；^b Measured in CD₃OD；^c Measured in C₅D₅N。

(2)化合物4-7的结构鉴定及表征：

Sasanquasaponin III(4)的物理常数和波谱数据：C₅₉H₉₄O₂₆；白色无定型粉末；positive ESI-MS m/z 1241[M+Na]⁺；¹H-NMR数据(C₅D₅N,600MHz):δ_H 0.81,1.02,1.07,1.08,1.13,1.29,1.88(3H,all s,Me-25,26,29,24,23,30,27),3.55,3.79(2H,both d,J＝10.4Hz,H₂-28),4.24(1H,d-like,H-15),4.84(1H,d,J＝7.0Hz,H-1'),5.85(1H,d,J＝7.7Hz,H-1”),6.22(1H,dd,J＝11.7,5.9Hz,H-22),6.24(1H,d,J＝7.0Hz,H-1”'),6.26(1H,br s,H-1””)；¹³C-NMR数据(C₅D₅N,150MHz)见表三和表四。

Maetenoside B(5)的物理常数和波谱数据：C₅₉H₉₄O₂₅；白色无定型粉末；positiveESI-MS m/z 1225[M+Na]⁺；¹H-NMR数据(CD₃OD,600MHz):δ_H 0.81,1.01,1.05,1.09,1.18,1.48,1.90(3H,all s,Me-25,26,29,24,23,30,27),3.87(2H,both d,J＝11.9Hz,H₂-28),4.87(1H,br s,H-16),5.29(1H,br s,H-12),3.22(1H,dd,J＝11.6,4.9Hz,H-3),4.87(1H,d,J＝8.7Hz,H-1'),6.05(1H,d,J＝7.0Hz,H-1”),6.09(1H,d,J＝7.6Hz,H-1”'),6.20(1H,br s,H-1””)；¹³C-NMR数据(CD₃OD,150MHz)见表三和表四。

Sanchakasaponin F(6)的物理常数和波谱数据：C₆₄H₁₀₀O₂₈；白色无定型粉末；positive ESI-MS m/z 1339[M+Na]⁺；¹H-NMR date(CD₃OD,600MHz):δ_H 0.85,0.97,0.99,1.02,1.07,1.40,1.82(3H each,all s,Me-25,26,24,29,23,30,27),3.20(3H,dd-like,H-3),3.52(1H,d,J＝10.7Hz,H-28a),3.74(1H,d,J＝7.0Hz,H-28b),4.84(1H,d-like,J＝8.1Hz,H-1′),5.46(1H,br s,H-12),5.15(1H,d-like,J＝6.2Hz,H-1″),5.59(1H,d-like,J＝12.3Hz,H-1″′),5.92(1H,br s,H-1″″)；¹³C-NMR数据(CD₃OD,150MHz)见表三和表四。

Sanchakasaponin E(7)的物理常数和波谱数据：C₆₁H₉₆O₂₇,白色无定型粉末；positive ESI-MS m/z 1283[M+Na]⁺；¹H-NMR date(C₅D₅N,600MHz):δ_H 0.74,0.79,1.10,1.14,1.32,1.85,1.88(3H each,all s,Me-25,26,24,29,23,30,27),1.42(3H,d,J＝5.3Hz,H-6″″),2.03(3H,s,H-5″″′),2.12(3H,d,J＝6.9Hz,Ang-H-4),3.21(3H,d-like,J＝7.9Hz,H-3),3.39(1H,d,J＝10.6Hz,H-28a),3.63(1H,d,J＝14.0Hz,H-28b),4.45(1H,m,H-16),4.92(1H,d-like,J＝8.1Hz,H-1′),5.40(1H,br s,H-12),5.96(1H,d,J＝7.7Hz,H-1″),6.23(1H,d-like,J＝9.9Hz,H-1″′),6.40(1H,br s,H-1″″),6.63(1H,d,J＝12.3Hz,H-21)；¹³C NMR数据(C₅D₅N,150MHz)见表三和表四。

表三、化合物4-7苷元部分的¹³C NMR数据(δin ppm)

^a Measured in C₅D₅N on 150MHz；^b Measured in CD₃OD on 150MHz。

表四、化合物4-7糖基部分的¹³C NMR数据(δin ppm)

^a Measured in C₅D₅N on 150MHz；^b Measured in CD₃OD on 150MHz。

实施例2：

三萜皂苷药物化合物制剂为：

云南山茶三萜皂苷化合物1或化合物2或化合物3或化合物4或化合物5或化合物6或化合物7的单个化合物与糊精、或乳糖、或淀粉、或硬脂酸镁，或七个化合物相互组合后与糊精、或乳糖、或淀粉、或硬脂酸镁，按重量比为5:1或8:1或10:1的比例混合后制粒压片；

上述制剂的具体制备方法同现有技术使用的常规方法。

实施例3：

(1)本发明化合物1-7的细胞毒活性实验方法：

实验方法：采用MTS法。

接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液(DMEM或者RMPI1640)配成单个细胞悬液，以每孔3000～15000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μL，贴壁细胞提前12～24小时接种培养。

加入待测化合物溶液：化合物用DMSO溶解，化合物以40μM、8μM、1.6μM、0.32μM、0.064μM浓度复筛，每孔终体积200μL，每种处理均设3个复孔。

显色：37摄氏度培养48小时后，贴壁细胞弃孔内培养液，每孔加MTS溶液20μL和培养液100μL；悬浮细胞弃100μL培养上清液，每孔加20μL的MTS溶液；设3个空白复孔(MTS溶液20μL和培养液100μL的混合液)，继续孵育2～4小时，使反应充分进行后测定光吸收值。

比色：选择492nm波长，多功能酶标仪(MULTISKAN FC)读取各孔光吸收值，记录结果，数据处理后以浓度为横坐标，五种人肿瘤细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(Reed and Muench法)计算化合物的IC₅₀值。

阳性对照化合物：每次实验均设顺铂(DDP)和紫杉醇(Taxol)两个阳性化合物，以浓度为横坐标，五种人肿瘤细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(Reed&Muench法)计算化合物的IC₅₀值。

(2)本发明化合物1-7的肿瘤细胞抑制活性实验结果：

表五、化合物1-7对不同细胞株的细胞毒活性IC₅₀(μM)

从表无中数据可知：在对肿瘤细胞株HL-60(人白血病)、A-549(人肺癌)、SMMC-7721(人肝癌)、MCF-7(人乳腺癌)和SW480(人结肠癌)的细胞毒活性筛选试验中，化合物1-7的活性均强于阳性对照药顺铂(DDP)，如化合物1对上述5种肿瘤株具有显著的抑制活性，其IC₅₀分别为0.93，0.78，0.54，0.70，0.70，0.54，0.54μM。

上述试验结果证明本发明化合物1-7具有很好的抗肿瘤生物活性，为云南山茶的综合利用，治疗癌症药物开发方面，提供了新药物和新的途径。

Claims

1.三萜皂苷药物化合物，其特征在于三萜皂苷药物化合物包括云南山茶三萜皂苷化合物1或化合物2或化合物3或化合物4或化合物5或化合物6或化合物7，其结构式如下：

2.三萜皂苷药物化合物制剂，其特征在于三萜皂苷药物化合物制剂为：

a.云南山茶三萜皂苷化合物1或化合物2或化合物3或化合物4或化合物5或化合物6或化合物7的单个化合物与乳糖、或淀粉，或七个化合物相互组合后与乳糖、或淀粉，按重量比为9:1的比例混合制成粉剂；

b.云南山茶三萜皂苷化合物1或化合物2或化合物3或化合物4或化合物5或化合物6或化合物7的单个化合物与糊精、或乳糖、或淀粉、或硬脂酸镁，或七个化合物相互组合后与糊精、或乳糖、或淀粉、或硬脂酸镁，按重量比为1:5-1:10的比例混合后制粒压片；

c.云南山茶三萜皂苷化合物1或化合物2或化合物3或化合物4或化合物5或化合物6或化合物7的单个化合物与糊精、或乳糖、或淀粉、或硬脂酸镁，或七个化合物相互组合后与糊精、或乳糖、或淀粉、或硬脂酸镁，按重量比为5:1的比例制成胶囊或颗粒剂或冲剂；

d.云南山茶三萜皂苷化合物1或化合物2或化合物3或化合物4或化合物5或化合物6或化合物7的单个化合物与注射用水、或七个化合物相互组合后与注射用水，按重量比为3:1的比例制成注射液；

e.云南山茶三萜皂苷化合物1或化合物2或化合物3或化合物4或化合物5或化合物6或化合物7的单个化合物与注射用水、或七个化合物相互组合后与注射用水，按重量比为3:1的比例制成粉针剂。

3.三萜皂苷化合物在制备治疗或预白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌的药物制剂中的应用。