CN100479811C - 包含补骨脂酚的用于治疗妇女乳癌的医药组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种单一补骨脂酚化合物或者含补骨脂酚的萃取物用于治疗或防治乳癌的新用途。此用途的一具体例子为治疗或预防乳癌的医药组合物。本发明的医药组合物其剂型可以是经皮吸收、口服剂型、注射剂型或缓释剂型。本发明同时亦揭示补骨脂酚化合物或者含补骨脂酚的萃取物用于治疗或防治骨质疏松的新用途。

Description

包含补骨脂酚的用于治疗妇女乳癌的医药组合物

技术领域

本发明是有关一种含有补骨脂酚作为有效成分以作预防或治疗妇女乳癌及妇女停经后骨质疏松症的医药组合物。本发明亦有关一种可预防或治疗妇女乳癌及骨质疏松症的补骨脂萃取物。

背景技术

补骨脂为豆科植物Psoralea corilifolia成熟果实，在传统中医药，其用途归类为补药(Tonic)。补骨脂有许多化学成分及具有许多药理作用被文献记载。化学主成分中，除脂肪类外，尚有补骨脂素(Psoralen)，异补骨脂素(Isopsoralen)及补骨脂酚(Bakuchiol)，其它成分则为微量成分。其中具有酚帖类结构的补骨脂酚受到重视，因此有相当多的文献说明其药理作用，例如：抗突变性(antimutation)，保护肝细胞(Hepatoprotection)，抗氧化作用(antioxidation)，弱的雌激素作用(weak estrogen like effect)，细胞毒性作用(cytotoxic effect)，核酸聚合酶抑制作用(DNA polymerase inhibitor)，抗发炎作用(anti-inflammation)，治糖尿病作用(antihyperglycemic effect)。

在专利方面，日本专利第11-71231号揭示补骨脂酚能够抑制酪氨酸酶(Tyrosinase)，因此用来作美白化妆品用。日本专利第2000-327581号及第2001-233707号则揭示其抑菌作用，因此分别用来作口腔杀菌剂(sterilizingoral cavity)及退伍军人症病原菌(anti-legionella agent)和抗药性葡萄球菌(anti-MRSA agent)的治疗剂。日本第3-20218号则揭示其具有细胞毒性，因此用来作鸡眼(anti-corn agent)治疗剂。日本专利第7-109225号揭示补骨脂内的脂肪类成分(lipids)有骨强度增强及骨钙化作用(bone calcification)。

目前有数据显示以雌激素(estrogen)治疗妇女停经后因缺乏雌激素所引起的骨质疏松症，会使接受治疗的妇女比未接受治疗的妇女有更高的机率罹患乳癌。因此有一迫切需要来开发出一种医药能治疗妇女停经后因缺乏雌激素所引起的骨质疏松症，同时不会使接受治疗的妇女比未接受治疗的妇女有更高的机率罹患乳癌。当然，一种能治疗妇女乳癌，同时治疗妇女停经后因缺乏雌激素所引起的骨质疏松症的医药也是有用的。

发明内容

本发明的主要目的在提供一种单一补骨脂酚化合物或者含补骨脂酚的萃取物用于治疗或防治乳癌的新用途。此用途的一具体例子为治疗或预防乳癌的医药组合物。本发明的医药组合物可含单一补骨脂酚或含补骨脂酚萃取物，可使用于乳癌治疗或预防用途，而且其剂型可以是经皮吸收、口服剂型、注射剂型或缓释剂型。

本发明的另一主要目的在提供一种单一补骨脂酚化合物或者含补骨脂酚的萃取物，用于治疗或防治骨质疏松的新用途。此用途的一具体例子为治疗或预防骨质疏松的医药组合物。本发明的医药组合物可含单一补骨酚或含补骨脂酚萃取物，可使用于骨质疏松治疗或预防用途，而且，其剂型可以是经皮吸收、口服剂型、注射剂型或缓释剂型。

本发明以体外细胞培养试验，发现补骨脂酚具有在低剂量下即有抑制人乳癌细胞增殖情形，此结果显示补骨脂酚对某些人乳癌细胞有选择性抑制作用而适合作乳癌治疗或防治剂，也显示补骨脂酚对人乳癌细胞作用不同于从前韩国学者发现：补骨脂酚对五种不同人癌细胞(肺(A549)、卵巢(SK-OV-3)、皮肤(SK-MEL-2)、中枢神经(XF498)、大肠(HCT))的毒性作用，其抑制浓度(ED₅₀)均介于10～15μg/cc之间(Arch.Pharm.Res.15，356～359(1992))，此抑制浓度相近显示补骨脂酚对这些癌细胞毒性不具选择性，且此项研究并未对人乳癌细胞进行研究。

另外本发明以动物试验方式，将雌鼠卵巢摘除模拟妇女停经后因缺乏雌激素(estrogen)所引起的骨质疏松症，结果发现补骨脂酚在低剂量下(5mg/kg)有治疗骨质疏松症效果，其作用机转为抑制骨质吸收(boneresorption)。此项发现不同于从前日本学者发现：即补骨脂内的脂肪类成分(lipids)只有增强骨钙化作用(bone calcification)但对骨质(bone mass)并无任何增加作用(日本专利第7-109225号及Planta med.62，150-153(1996))。骨质疏松症的治疗最理想状况是药物能促进骨形成(bone formation)作用或/及骨吸收(bone resorption)抑制作用。补骨脂酚的作用类似雌激素(estrogen)，能够预防及治疗骨质吸收，显然优于该脂肪类的骨钙化作用。

从另一角度来看，妇女停经后使用雌激素治疗骨质疏松，有机会患乳癌风险，补骨脂酚具有治疗或预防骨质疏松，兼具乳癌细胞毒性作用。因此，对妇女易患的乳癌/骨质疏松而言，补骨脂酚是相当具有潜力的治疗和预防药物。

许多从前文献数据可说明补骨脂萃取物能够利用硅胶柱层析法(Silicagel column chromatography)分离脂肪类成分(lipids)和补骨脂酚。由于二者化学性质不同，很容易利用薄层析法(TLC)检测，前者无法由紫外光灯检测器(UV lamp)检测到但可用碘(I2)试剂检测，后者则很易使用紫外灯检测。因此在实施例1中使用单一溶媒混合液，即可纯化分离脂肪类和/或补骨脂酚化合物。

本发明的用于治疗妇女乳癌的医药组合物，包含一妇女乳癌治疗有效量的作为有效成分的具有下式(I)的补骨脂酚或其医药容许酯或盐，及与该有效成分共同使用的医药容许载体或稀释剂：

所述的医药组合物含有1～300mg的补骨脂酚(I)。

所述的医药组合物为口服、注射、经皮吸收剂型或缓释剂型。

所述的医药组合物是由补骨脂制备。

所述的医药组合物含有5％～95％的补骨脂酚(I)，且实质上不含补骨脂素及异补骨脂素。

所述的医药组合物是由下列步骤制备：

i)以有机溶媒萃取已磨成粉状的补骨脂；

ii)浓缩萃取液；及

iii)将步骤ii)所得到的浓缩物以硅胶层析法分离，而得到含有补骨脂酚(I)，且实质上不含补骨脂素及异补骨脂素的萃取物。

所述的医药组合物可同时用于治疗该妇女的骨质疏松症。

一种使用具有下式(I)的补骨脂酚或其医药容许酯或盐来制备用于治疗妇女乳癌的医药的用途：

所述的医药含有1～300mg的补骨脂酚(I)。

所述的医药为口服、注射、经皮吸收剂型或缓释剂型。

所述的补骨脂酚(I)是由补骨脂制备。

所述的医药含有5％～95％的补骨脂酚(I)，且实质上不含补骨脂素及异补骨脂素。

所述的医药是由包含下列步骤的方法制备：

i)以有机溶媒萃取已磨成粉状的补骨脂；

ii)浓缩萃取液；及

iii)将步骤ii)所得到的浓缩物以硅胶层析法分离，而得到含有补骨脂酚(I)，且实质上不含补骨脂素及异补骨脂素的萃取物。

所述的医药同时用于治疗该妇女的骨质疏松症。

实施方式

依本发明的一较佳具体实施例所完成的一种制备含补骨脂酚萃取物的方法包含下列步骤：

a)以有机溶媒，正己烷、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇或上述有机溶媒混合物萃取已磨成粉状的补骨脂(Psoralea corilifolia)；

b)浓缩萃取液，再将所得浓缩物以硅胶层析法分离，并以正己烷：乙酸乙酯(9：1)的混合溶液作为洗提液进行洗提，可依序得(1)含脂肪类成分及(2)含补骨脂酚的洗出液(eluate)，或合并收集得同时含(1)脂肪类成分及(2)补骨脂酚的洗出液。浓缩洗出液即得含补骨脂酚的萃取物，或同时含(1)脂肪类成分及(2)补骨脂酚的萃取物。

其中步骤b)所得洗出液是以薄层析法分析鉴定，含脂肪类成分的洗出液其层析值(Rf)>0.29。而含补骨脂酚化合物的洗出液，其层析值(Rf)＝0.29。成分是以紫外灯或碘作检测，而层析展开液则为正己烷：乙酸乙酯＝9：1

本发明可借助以下实施例被进一步了解，这些实施例仅作为说明之用，而非用于限制本发明范围。

实施例1说明利用补骨脂作材料，经萃取及层析可分离得到脂肪类物质和补骨脂酚。实施例2说明利用人二种乳癌细胞(一种为雌激素依赖型，另一种为雌激素非依赖型)，以体外细胞培养方式证明补骨脂酚抑制人乳癌细胞生长情形。实施例3说明利用摘除动物卵巢进行补骨脂酚拮抗骨质疏松症情形。

具体实施方式

实施例1

以市售补骨脂磨成粉后，取300克利用丙酮2.4升萃取，过滤分离固液相。重复前述萃取及固液相分离三次，合并滤液，并将丙酮萃取液浓缩得油状萃取物72.11克，利用硅胶管柱层析法对该浓缩物22克进行分离，该硅胶管柱(9.6×25cm)填充有300g硅胶，硅胶是购自Merck公司，代号Silicagel60，粒径70～230网目(mesh)。以正己烷/乙酸乙酯(9：1)、丙酮、甲醇依序作洗提液(eluent)，每300毫升收集一瓶，洗出液(eluate)以硅胶薄层析法(展开液为正己烷/乙酸乙酯(9：1))，检测器为紫外光灯或碘试剂，检测成分，将相同成分的溶离液合并。

以正己烷/乙酸乙酯(9：1)混合液进行硅胶管柱层析25瓶(1～25瓶)；第1瓶至第7瓶在薄层析上不呈现紫外光吸收点迹，显然为脂肪类成分，合并浓缩可得6.116克油状物，第8瓶至第20瓶在薄层析上仅含单一紫外光吸收点迹(层析值(Rf)为0.29)，合并浓缩后可得油状物的补骨脂酚4.543克。另以丙酮洗提液可得10瓶(26～35瓶)，甲醇洗提液得10瓶(36～45瓶)。合并不含补骨脂酚溶离液(21～45瓶)，经浓缩可得11.04克。由上述试验可得如下的结果：每公斤补骨脂药材可得240.36g萃取物，萃取率为24.04％。每公斤药材可得脂肪类成分66.82g，含量为6.68％。每公斤药材可得补骨脂酚49.64g，含量为4.96％，而其它补骨脂成分有123.9g，含量为12.4％。

所得到的补骨脂酚由下列物化性质确认：

24°(C 1.0，CHCl3)；EI-MS m/z(rel.int.％)：256([m]+，24)，173(100)；UV(EtoH)λmax(log ε)：260nm(4.26)；IR(KBr)ν max 3350，1650，1530，1245，1010，980，922cm^-1；13C-NMR(δ，CDCl3)：C-1(25.6)，C-2(131.2)，C-3(124.8)，C-4(23.2)，C-5(41.2)，C-6(42.5)，C-7(135.7)，C-8(126.5)，C-9(130.7)，C-10(127.3)，C-11(115.4)，C-12(154.6)，C-13(115.4)，C-14(127.3)，C-15(23.3)，C-16(145.9)，C-17(111.8)，C-18(17.6).1H-NMR(δ mult.(J in Hz)，CDCl3)：H-1(1.61，S)，H-3(5.15，t(7.3))，H-4(1.99，q(7.3))，H-5(1.53，m)，H-7(6.08，d(16.2))，H-8(6.28，d(16.2))，H-10(7.26，d(8.5))，H-11(6.80，d(8.5))，H-13(6.80，d(8.5))，H-14(7.26，d(8.5))，H-15(1.23，S)，H-16(5.91，dd(10.7，17.4))，H-17(5.06，m)，H-18(1.71，S)

实施例2

体外细胞毒性实验：

材料：DMEM，RPMI培养基，L-谷氨酰胺(L-glutamine)，盘尼西林(Penicillin)，链霉素(Streptomycin)，胎牛血清(fetal-bovine serum，FBS)是购自Gibco公司。培养塑料品是购自Corning公司。Tamoxifon购自Sigma-Aldrich公司。CCK-8试剂(Cell Counting Kit-8，新的水溶性Tetrazolium盐类)是购自Dojindo Moleaular Technologies公司。其它试剂是试药级，是购自Sigma公司或E.Merck公司。

细胞/细胞培养：

人乳癌细胞株T47D或MDA-MB231是购自ATCC(American TypeCulture Collection)，T47D细胞株是雌激素依赖型(ER-Positive)，而MDA-MB231细胞株为非雌激素依赖型(ER-negative)。T47D细胞培养于RPMI培养基，内含10％活性炭-葡聚糖脱除胎牛血清(Charcoal-dextranstripped fetal bovine serum，CD-FBS)而MDA-MB231细胞则培养于DMEM培养基，内含10％CD-FBS二种细胞均于37℃含5％CO₂培养箱中培养。有关细胞增生测定则借助加入锥虫蓝(trypan blue)试剂于培养基中，利用血球计数仪测定活细胞数量。

细胞毒性试验：

在每盘有96个槽上，加入细胞悬浮液198微升(含T47D 20,000个细胞或MDA-MB231 10,000个细胞)，将盘子放在培养箱中(37℃，5％CO₂)培养24小时后，加入2微升不同浓度药物(对照组则为药物溶媒DMSO)于槽内，每一个浓度或对照溶媒作6次(n＝6)。于培养箱中培养48小时后，吸除培养基，加入新的培养基100微升，培养箱中培养1小时后，每一个槽加入5微升CC-K-8试剂，在培养箱中4小时后，利用ELISA Reader仪器测450nm的吸光值(Absorbance)(吸光值为6次总和的平均值)。利用浓度及吸光值可制得细胞存活数(吸光值)对应各药物浓度(取对数值)的曲线图，由图可得到抑制细胞50％存活数(对照组为100％)的浓度(IC₅₀)，结果如表一所示。

结果：

由表一中可以看出，补骨脂酚对人的乳癌细胞T47D及MDA-MB-231的IC₅₀分别为5.00及0.62μg/cc。如前述发明内容所引用的先前技艺所揭示，补骨脂酚对其他人癌细胞(如卵巢、皮肤、中枢神经、大肠、肺)的IC₅₀为10-15μg/cc，相对于对人乳癌细胞均高2～3倍浓度(对T47D细胞)或16～24倍(对MDA-MB-231细胞)。故显示补骨脂酚对人的乳癌有效且具有选择性作用。另外如以临床使用的Tamoxifen做比较，亦显示补骨脂酚优于Tamoxifen的功效。

表一、补骨脂酚对人癌细胞毒性作用

实施例3

补骨脂酚防治骨质疏松症老鼠实验

一、动物及卵巢切除手术：以16周龄的Wistar处女母鼠作试验，分成五组如下：

第一组基线对照组(Baseline组)：有8只老鼠，喂食饲料。

第二组假性手术组(Sham组)：有10只老鼠，喂食不加药物的饲料。

第三组去卵巢对照组(OVA组)：有8只老鼠，喂食不加药物的饲料。

第四组去卵巢实验A组(OVA+A组)：有9只老鼠，喂食加药物(5mg/kg)的饲料。

第五组去卵巢实验B组(OVA+B组)：有9只老鼠，喂食加药物(15mg/kg)的饲料。

卵巢切除术参考Wronski方法(Wronski et al.，Endocrinology，123(2)，681-686(1988))，将母鼠卵巢切除；假性手术组老鼠同上述方法进行，但无切除卵巢；基线对照组老鼠不作手术。

二、含药物饲料的制备：将粉碎的饲料与试验药物、淀粉及适量水混合均匀后，并压制成内径1.5cm x 长5.0cm的含药饲料块(美国purina公司生产的标准老鼠饲料，内含1％钙质及1.2％磷酸盐)，风干后备用。不加药物饲料也以上述方法制备，仅不加试验药物。并以单盲方式喂给老鼠。

三、试验过程：以配对喂食方式，即实验组、对照组，与假性手术组喂食等量饲料，连续投予二个月，饮水无限制，且实验在21℃及12小时日夜周期的实验室进行，二个月后动物牺牲后测量骨组织形态及骨质密度。骨组织的形态测量：所有骨组织及形态是依国际惯用的测量方式进行(Lin et al，Calcif Tissue Int，67，373-377(2000))，组织先以Villanueva染色，再以伦敦树脂(London resin)包埋处理后，以切片机(Jung-Kmicrotome，Leica Ltd.，USA)将未脱钙骨骼切成7μm薄片，以荧光显微镜及光显微镜测量骨体积(BV/TV)及蚀骨表面百分比(ES/BS％)等，并以Osteomeasures软件(3.0 version，Atlanta，USA)分析(如表二及三所示)。骨质密度(Apparent bone density)测试：将老鼠牺牲后，取出胫骨及股骨，以阿基米得漂浮原理测试其骨质密度(Danielsen et al.，Calcif Tissue Int，52，26-33(1993))；在空气中测量骨骼重量为W-air，在水中测水中骨骼重量为W-water，骨质密度＝[W-air/(W-air—W-water)]g/cm³(如表三所示)。

四、数据分析：数据所表示的平均值(mean)及标准误差(SD)是经由SPSS8.0(SPSS Inc，Chicago，USA)所计算，先以one-way ANOVA再以Bonferronni test进行多组间比较。

五、实验结果：借助骨体积(表二)及骨质密度(表三)变化情形可以看出给补骨脂酚的去卵巢大鼠(OVX+A，OVX+B)较不给药物去卵巢大鼠(OVX)的骨体积及骨密度均有统计上意义增加，显示补骨脂酚能有效防止雌激素丧失所造成的骨质疏松症。补骨脂酚作用机转则可借助蚀骨表面百分比(表四)变化看出，给补骨脂酚的老鼠主要是经由阻止蚀骨细胞(Osteoclast)的蚀骨作用(骨吸收)而实现防止骨质流失。

表二 补骨脂酚对近侧胫骨内小梁骨的骨体积影响

^*平均值(mean)

表三 补骨脂酚对胫骨及股骨的骨质密度的影响

^*平均值(mean)

表四 补骨脂酚对近侧胫骨内小梁骨的蚀骨表面百分比(ES/BS，％)的影响)

^*平均值(mean)

Claims (8)

1.一种用于治疗妇女乳癌的医药组合物，由有效成分和与该有效成分共同使用的医药容许载体或稀释剂组成，所述有效成分是具有下式(I)的补骨脂酚或者是来源于补骨脂的含有式(I)所示补骨脂酚但不含补骨脂素及异补骨脂素的补骨脂萃取物，

其中该医药组合物含有1～300mg的补骨脂酚(I)。

2.如权利要求1所述的医药组合物，其中该医药组合物是由补骨脂制备。

3.如权利要求2所述的医药组合物，其含有5重量％～95重量％的补骨脂酚(I)。

4.如权利要求3所述的医药组合物，其中该有效成分由下列步骤制备：

i)以有机溶媒萃取已磨成粉状的补骨脂；

ii)浓缩萃取液；及

iii)将步骤ii)所得到的浓缩物以硅胶层析法分离，而得到含有补骨脂酚(I)，但不含补骨脂素及异补骨脂素的补骨脂萃取物。

5.一种使用具有下式(I)的补骨脂酚或者是来源于补骨脂的含有式(I)所示补骨脂酚但不含补骨脂素及异补骨脂素的补骨脂萃取物来制备用于治疗妇女乳癌的医药的用途：

其中该医药含有1～300mg的补骨脂酚(I)。

6.如权利要求5所述的用途，其中该补骨脂酚(I)是由补骨脂制备。

7.如权利要求6所述的用途，其中该医药含有5重量％～95重量％的补骨脂酚(I)。

8.如权利要求7所述的用途，其中该含有式(I)所示补骨脂酚但不含补骨脂素及异补骨脂素的补骨脂萃取物由下列步骤制备：

i)以有机溶媒萃取已磨成粉状的补骨脂；

ii)浓缩萃取液；及

iii)将步骤ii)所得到的浓缩物以硅胶层析法分离，而得到含有补骨脂酚(I)，但不含补骨脂素及异补骨脂素的补骨脂萃取物。