KR20110087395A

KR20110087395A - 푸슈로틴 디를 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20110087395A
Application number: KR1020100006790A
Authority: KR
Inventors: 김동규; 강새로미; 조정; 정지형; 손병화
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2010-01-26
Filing date: 2010-01-26
Publication date: 2011-08-03
Also published as: KR101134796B1

Abstract

본 발명은 암질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 푸슈로틴(pseurotin) D를 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 세포사멸(apoptosis)의 유도와 DNA 손상에 의한 세포성장의 저해를 나타냄으로서, 암 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

푸슈로틴 디를 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 조성물{A Composition comprising pseurotin D as an active ingredient for treating and preventing cancer disease}

본 발명은 암질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 푸슈로틴(pseurotin) D를 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

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[문헌 3] Barry, M.A., et al., Biochem Pharmacol , 40, pp 2353-2362, 1990;

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세포사멸(apoptosis)은 세포 내부에 프로그램된 신호를 따라 여러 유전자 및 단백질들의 발현과 활성이 조절되어 일어나는 능동적인 죽음이며, 그 과정을 통해 생성된 아포토소체(apoptosome)들은 주변의 세포들이나 대식세포(macrophage) 등의 식세포 작용에 의해 제거됨으로서, 염증을 유발하지 않는다. 세포사멸의 형태적, 생리적 특징으로는 세포질 축소(cytoplasm shrinkage), 세포막(membrane blebbing), 염색체의 응축(chromatin condensation), DNA의 분절(DNA fragmentation), 세포막을 이루는 지질인 포스파티딜세린(phosphatidylserine)의 세포 외부로의 노출, 아포토소체(apoptosome)의 형성 등이 보고되고 있다. 반면에 세포괴사는 외부적 환경의 변화에 의해 급격히 일어나는 수동적 죽음이며, 염색사의 다형태적 덩어리(irregular clumping)와 세포질의 팽창(swelling of cytoplasm) 과정을 거치게 되고, 최종적으로 세포들의 분해를 통해 세포 파편(cell debris)이 생성되고, 이들이 염증을 유발하게 된다(Barry, M.A. et al., Activation of programmed cell death (apoptosis) by cisplatin, other anticancer drugs, toxins and hyperthermia. Biochem Pharmacol 40, pp 2353-2362, 1990; Hickman et al., Apoptosis induced by anticancer drugs. Cancer Metastasis Rev . 11, pp121-129, 1992).

세포사멸은 생명체의 여러 정상적인 생리적 현상에서 쉽게 관찰된다. 예를 들면 세포사멸은 생명체의 초기 발생단계에서 관찰되는 여러 형태적 변화과정(morphogenesis)과 면역계 또는 신경계의 기능적 자가 조직화(functional self-organization)과정에서 중요한 역할을 담당한다. 또한, 성인이 된 이후에도 조직 항상성(tissue homeostasis), 세포 수의 조절, 손상된 세포의 제거, 감염에 대한 방어 기작으로서 필수적으로 작용한다. 세포사멸은 여러 질환들의 발병과정에도 깊이 관여하는데 비정상적인 세포사멸의 발생은 퇴행성뇌신경질환(neurogegenerative disorder), 면역계 이상(immune disorder), 그리고 심장 혈관계질환(cardiovascular disease) 등의 원인이 될 수 있으며, 세포사멸의 비정상적인 억제는 암의 원인이 될 수 있다. 세포사멸이 정상적인 조절과정에서 벗어나 비정상적으로 발행하거나 억제되어 나타나는 질병을 좀 더 자세히 살펴보면, p53, p16와 bcl-2 등의 유전자의 이상 발현에 의해 유도되는 암들, HIV Herpes 및 독감(influenza) 바이러스들에 의한 감염증, 그리고 당뇨(Type 1 diabetes), 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis), 다발성 경화증(multiple sclerosis)과 근무력(Myasthenia gravis) 등과 같은 자가면역 질환들이 있다. 이와 같이, 세포사멸은 생명체의 다양한 생리작용을 정상적으로 유지하는데 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 여러 질병들의 발병과정에도 밀접한 관련이 있다. 개체를 구성하는 각 세포의 세포사멸은 유전적으로 손상을 입은 세포나 분화 자극제에 의해 부적절한 분화의 유도에 의한 종양의 발달을 막기 위해 이들 비정상적인 세포를 개체에서 제거하기 위한 수단, 즉 회복 불가능한 유전적 상처를 지닌 세포들을 개체에서 제거하기 위한 일반적인 수단이다. 이 개념은 일반적으로 사용되는 항암제가 암세포의 증식억제와 연관된 세포사멸 과정을 통해 암세포의 사멸을 유도한다는 사실에 의해 뒷받침되고 있다(Barry, M.A., et al., Biochem Pharmacol , 40, pp 2353-2362, 1990; Hickman, J.A., Cancer Metastasis Rev . 11, pp 121-129, 1992). 따라서 세포사멸 과정의 교란은 손상되거나 손상이 시작된 세포의 생존과 그들 세포의 성장을 유도하기 때문에 세포사멸의 억제는 암화과정에서 중요한 역할을 한다. 아울러 암예방 효과가 있는 물질들은 이러한 비정상적인 세포의 세포사멸을 유도하며, 이들에 의한 세포사멸의 유발은 최소한 그들의 암예방 활성과 연관되어 있음이 보고되었다(Fesus, L., J Cell Biochem. 22, pp 151-161, 1995; Reddy, B.S. Cancer Res . 57, pp 420-425, 1997).

육지의 환경과 물리적으로나 화학적으로 현저히 다른 해양의 환경은 생물학적 활성과 독특한 구조를 지닌 자연산물의 무한한 보고이다. 이는 최근 항암, 항염증, 무통증, 알레르기 등등의 주목할 만한 활성을 지닌 무한한 자원들이 밝혀지며 입증되고 있다. 지금까지 해양으로부터 얻어 이미 널리 시판되고 있는 3가지의 의약인 세팔로스포린(cephalosporins), 시타라빈(cytarabine), 비다라빈(vidarabine)을 제외하고 브리오스타틴-1(bryostatin-1), 스퀄아민(squalamine), ET743이 지난 2년 동안 희귀성 의약품으로 인정되었다(Haefner, B. Drug Discov . Today 8(12), pp 536-544, 2003). 그리고 열두 가지 이상의 해양화합물이나 그의 유도체들이 최근 임상 연구 중에 있으며 해양천연물은 의약 개발에 있어 유망한 미래를 가져다줄 것이다.

바다에 사는 균은 구조적으로 새로우면서도 생물학적 활성을 지닌 이차대사산물의 풍부한 원천임이 증명되어지고 있으며, 이러한 이차대사산물은 의약품 개발에 있어 획기적인 화학자원으로 떠오르고 있다(Blunt, J.W., et al., J. Nat . Prod . Rep. 20, pp 1, 2003; Faulkner, D. J. Nat . Prod . Rep . 19, pp 1-48, 2002).

푸슈로틴(pseurotin) D 화합물은 황색포도상구균에 대하여 항균활성을 가지고 있으며 키틴 합성효소의 저해활성도 가지고 있다고 보고되었다(Y. Igarashi et al., J. Antibiotics . 57 (11), 748-754, 2004).

그러나 상기문헌의 어디에도 푸슈로틴(pseurotin) D가 세포사멸(apoptosis)의 유도와 DNA 손상에 의한 세포성장을 저해한다는 암질환의 치료 및 예방 약제로서 개발에 대한 개시 또는 교시된 바는 없다.

본 발명자는 푸슈로틴(pseurotin) D가 세포사멸(apoptosis)의 유도와 DNA 손상에 의한 세포성장의 저해를 나타냄을 확인함으로서, 암질환의 치료 및 예방 약제로서 개발가능성이 높음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 푸슈로틴(pseurotin) D를 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 구조식 (1)로 표기되는 푸슈로틴(pseurotin) D를 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다.

푸슈로틴(pseurotin) D의 구조

또한 본 발명은 푸슈로틴(pseurotin) D를 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 “암질환”의 구체적 암은 자궁경부암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문암, 식도암, 췌장암, 위암, 신장암, 자궁암, 유방암, 폐암, 임파선암, 갑상선암, 전립선암, 백혈병, 피부암, 결장암, 뇌종양, 방광암, 난소암, 담낭암 등, 바람직하게는, 자궁경부암, 자궁암, 유방암, 폐암, 또는 백혈병을 포함하며, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 화합물은, 이미 당업계에 잘 알려진 제조방법 및 분리 방법에 의하여 제조 및 분리가 가능하나,하기 방법에 의하여 분리 가능하다.

예를 들어, 야키시리 구멍쇠 미역 (Agarum cribrosum)의 공생균주, Aspergillus fumigatus 균류 등의 갈조류를 SWS 배지 등의 배지에서 배양한 후 여과하여 균사체를 분리하고 상기 배양액을 EtOAc 등의 추출용매로 추출하여 얻은 배양액 엑스를 실리카 겔 칼럼 크로마토그라피를 이용한 분획방법으로 수득한 푸슈로틴 D 다량 함유 분획을 중간압 액체 컬럼크로마토그래피법 (medium pressure liquid chromatogrhy; MPLC)에 이어 HPLC 등의 정제방법을 반복 수행하여 본 발명의 푸슈로틴 D를 분리 가능하다.

상기 제조방법으로 얻어진 본 발명의 화합물은 세포사멸(apoptosis)의 유도와 DNA 손상에 의한 세포성장의 저해를 나타내므로 암질환의 치료 및 예방에 효과적임을 확인하였다.

따라서 본 발명에서는 상기 푸슈로틴(pseurotin) D을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 함유하는 암질환의 치료 및 예방을 위한 약학 조성물을 제공한다.

상기 화합물은 조성물 총 중량에 대하여 0.02 내지 50% 중량백분율로 포함됨을 특징으로 한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 0.0001 ~ 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 ~ 100mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 조성물에서 본 발명의 화합물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 10 중량%, 바람직하게는 0.001 ~ 1 중량%의 양으로 존재하여야 한다.

또한, 본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 푸슈로틴(pseurotin) D을 유효성분으로 함유하는 암질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 암질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 상기 화합물은 암질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 화합물은 세포사멸(apoptosis)의 유도와 DNA 손상에 의한 세포성장의 저해를 나타냄으로서, 암 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 푸슈로틴(pseurotin) D의 화학적 구조를 나타낸 도이고,
도 2는 사람의 자궁경부암 HeLa 세포주의 생존에 미치는 푸슈로틴(pseurotin) D 의 독성효과를 나타낸 도이며,
도 3a, 3b는 세포의 DNA single strand가 끊어지면서 나타나는 변화를 Comet assay의 방법을 이용하여 관찰한 도이고,
도 4는 유세포 분석기를 이용한 푸슈로틴(pseurotin) D의 세포사멸의 발생 및 세포주기를 분석한 도이며,
도 5는 유세포 분석기를 이용하여 푸슈로틴(pseurotin) D의 조기 세포사멸 유도효과를 분석한 도이다.
도 6은 Hela 자궁암 세포에서 푸슈로틴(pseurotin) D가 DNA 합성을 얼마나 저해시키는지 [³H]Thymidine incorporation 측정법에 의한 결과도이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 제한되는 것은 아니다.

참고예 1. 실험 준비 및 기기

1-1. 분석기기

본 실험에서 얻은 생성물의 구조 확인을 위해 사용된 기기는 하기와 같다. 핵자기 공명 스펙트럼 (¹H NMR, ¹³C NMR) 은 400 MHz를, 용매는 CDCl₃, DMSO-d₆를 사용하였다. 짝지음(Coupling) 상수 (J)는 Hz 로 표시하였다. 질량(Mass) 스펙트럼을 사용하였으며 m/z 형태로 표시하였다.

1-2. TLC 및 관크로마토그래피

TLC (Thin layer chromatography)는 E. Merck사 제품인 실리카겔(Merck 60F₂₅₄)을 사용하였으며 관크로마토그래피(Column chromatography)를 위해서는 실리카(Merck EM9385, 230-400 mesh)를 사용하였다. 또한, TLC 상에서 분리된 물질을 확인하기 위해서 UV 램프(= 254 nm)를 이용하거나 아니스알데히드(Anisaldehyde), 과망간산칼륨(KMnO₄), 황산세륨 [10% Ce(SO₄)₂] 발색 시약에 담근 후, 플레이트를 가열하여 확인하였다.

1-3. 사용 시약

본 실험에서 사용된 시약은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 란캐스터(Lancaster), 플루카(Fluka) 제품을 구입하여 사용하였으며, 반응에 사용된 용매는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 머크(Merck), 준세이 화학(Junsei Chemical Co.) 제품의 1급 시약을 정제 없이 사용하였다. 용매에 사용한 THF 는 아르곤 기류에서 Na 금속과 벤조페논(Benzophenone)을 넣고 가열환류하여 청색으로 되었을 때 사용하였다. 또한, 디클로로메탄(CH₂Cl₂) 은 아르곤 기류에서 CaH₂ 를 넣고 가열환류하여 사용하였다. 에틸아세테이트와 헥산은 아르곤 기류에서 가열환류하여 정제하여 사용하였다.

실시예 1. 푸슈로틴(pseurotin) D 화합물의 분리 및 정제

본 발명품의 화합물은, 갈조류 야키시리 구멍쇠 미역 (Agarum cribrosum)의 공생균주, Aspergillus fumigatus 균류의 배양액 엑스에서 분리되었다. 즉, Aspergillus fumigatus 균류를 SWS 배지 [조성: soytone (0.1%), soluble starch (1.0%), and seawater (100%)]에서 배양한 후 여과하여 균사체를 분리하고 배양액을 EtOAc로 추출하여 배양액 엑스 (0.9 g)를 제조하였다. 배양액 엑스 (0.9 g)를 실리카겔 칼럼 크로마토그라피로 분획하여 얻은 푸슈로틴(pseurotin) D 분획을 중간압 액체 크로마토그래피법 (medium pressure liquid chromatography; MPLC) [ODS, H₂O-MeOH (from 0 to 100% MeOH, 30 min gradient)]에 이어 HPLC [ODS, H₂O-MeOH (from 50% to 100%)]로 분리 및 정제공정을 거쳐 하기 물성치를 갖는 본 발명의 푸슈로틴(pseurotin) D (7.5 mg)을 분리하였다.

푸슈로틴(pseurotin) D:

- 수득율: 0.8%

- 무색유상물질

- ¹H NMR (400 MH_Z, CDCl₃) δ 9.93 (1H, s, 7-NH), 3.24 (3H, s, 8-OMe), 4.38 (1H, d, J = 8.6 Hz, H-9), 6.37 (1H, dd, J = 8.6, 2.7 Hz, 9-OH), 3.88 (1H, t, J = 5.9 Hz, H-10), 5.91 (1H, d, J = 5.4 Hz, 10-OH), 5.69-5.83 (1H, m, H-11), 5.69-5.83 (1H, m, H-12), 5.05 (1H, dd, J = 5.9, 5.4 Hz, H-13), 4.72 (1H, d, J = 5.4 Hz, 13-OH), 1.38 (2H, m, H₂-14), 0.79 (3H, t, J = 7.5 Hz, H₃-15), 1.63 (3H, s, H₃-16), 8.25 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-19), 7.52 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-20), 7.68 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-21), 7.52 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-22), 8.25 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-23);

- ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 187.0 (s, C-2), 109.5 (s, C-3), 196.6 (s, C-4), 92.5 (s, C-5), 166.4 (s, C-6), 91.4 (s, C-8), 51.7 (q, 8-OMe), 74.9 (d, C-9), 71.3 (d, C-10), 126.2 (d, C-11), 136.5 (d, C-12), 67.8 (d, C-13), 29.9 (t, C-14), 9.7 (q, C-15), 5.3 (q, C-16), 196.4 (s, C-17), 133.4 (s, C-18), 130.3 (d, C-19), 128.4 (d, C-20), 133.9 (d, C-21), 128.4 (d, C-22), 130.3 (d, C-23);

- LREIMS m/z 454 [M+Na]⁺ , 432 [M+H]⁺;

- HREIMS m/z 454.1477 [M+Na]⁺ (calcd for C₂₂H₂₅NO₈Na, 454.1478), 432.1658 [M+H]⁺ (calcd for C₂₂H₂₆NO₈, 432.1658);

상기에서 수득한 화합물을 DMSO에 용해시킨 후 4℃에 보관하여 사용하였다. 그리고 모든 실험이 수행되기 전 샘플은 즉시 희석하여 사용하였다.

참고예 1. 세포배양

본 실험에 사용된 우 태아 혈청(fetal bovine serum; FBS), 100% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)은 하이크론 연구소(Hyclone Laboratories, Logan, UT)에서 구입하였고, EMEM 배지(Eagle's minimum essential medium)는 Gibco-BRL(Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였으며 CCK-8은 도찐 연구소(Dojin Laboratories, Osaka, Japan)로부터 구입하였다. 본 실험에 사용된 TBRL주로 자궁경부암(cervical carcinoma)RLbo HeLa BRL는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양 받아 사용하였다. HeLa는 10% FBS와 1% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)을 EMEM 배지(Eagle's minimum essential medium)에 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기(incubator; Forma Co., U.S.A.)에서 배양하였다.

실험예 1. 세포독성 측정

상기 실시예에서 수득한 본 발명의 화합물의 HeLa 자궁경부암세포에서의 세포독성을 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 개시된 실험방법을 응용하여 실험하였다(Tominaga H., Anal . Commun ., 36, pp47-50, 1999).

1-1. 실험준비

5x10⁴ 세포/ml의 세포부유물을 96-웰(well) 바닥이 평편한 마이크로타이터 판(flat-bottom microtiter plates; Nalgen Nunc International, Tokyo)의 각 웰(well)에 100 μl씩 접종하고 24 시간 동안 배양시킨 후, 여러 가지의 농도의 푸슈로틴(pseurotin) D를 포함하고 있는 배지로 교체한 후, 다시 48 시간 배양시켰다. 그 후 살아있는 세포를 측정하기 위하여 수용성 테트라졸리움 염에 기초한 독성 분석(a water-soluble tetrazolium salt based cytotoxic assay)을 수행하였다. 10μl의 세포 카운팅 키트 용액(Cell Counting Kit solution; WST-8)을 각각의 웰(well)에 첨가한 후 3시간 동안 37℃에서 배양하였다. 살아있는 세포의 경우 노란색을 나타내는 2-(2-메톡시(methoxy)-4-니트로페닐(nitrophenyl))-3-(4-니트로페닐(nitrophenyl))-5-(2,4-디설포페닐(disulfophenyl))-2H-테트라졸리움(tetrazolium) (WST-8)을 오렌지색의 포마쟌 염색시약(formazan dye)으로 색을 변화시키며 이를 450 nm에서 멀티 마이크로플레이트 판독기(multi microplate reader; synergy HT, BIO-TEK^®)를 이용하여 흡광도를 측정한다.

1-2. 실험결과

HeLa 자궁경부암세포를 여러 가지 농도의 푸슈로틴(pseurotin) D 로 처리한 후, CCK-8을 이용하여 WST-8의 흡광도를 측정하고, 대조군의 흡광도를 100%로 하여 각각의 농도에 대한 세포의 생존율을 측정한 결과, 도 2에서 나타내는 바와 같이, 농도 의존적으로 세포의 생존율을 감소시켰다. 50%의 세포독성을 보이는 농도인 IC₅₀(50% Inhibition concentration)은 300μM을 나타내었다.

실험예 2. 세포의 DNA single strand 가 끊어지면서 나타나는 DNA 손상 정도

상기 실시예에서 수득한 본 발명의 화합물의 세포의 DNA 단일 쇄(single strand)가 끊어지면서 나타나는 DNA 손상정도를 확인하기 위하여 유전독성학 등의 생물학 관련분야에 널리 사용되며 생물검정법(bioassay)으로도 사용이 되고 있는 혜성 어세이법(Comet assay; Single cell gell electrophoresis - 전기영동 시 손상되어진 DNA 부분이 혜성의 꼬리와 같이 보이는 것으로부터 붙여진 이름)을 하기와 같이 문헌에 개시된 실험방법을 응용하여 실험하였다(Singh NP: Microgels for estimation of DNA strand breaks, DNA protein crosslinks and apoptosis, Mutant Res 455 : 111-127, 2000).

2-1. 실험준비

0.5% low-melting point agrarose gel(A9414, sigma)로 슬라이드를 일차 코팅 시킨 후 1% normal-melting agarose gel(03435, Pharmacica)로 2차 코팅 시킨 다음 커버슬라이드를 덮어 3분간 얼음 위에서 응고시켰다. 그 다음 아가로스(agarose)와 푸슈로틴(pseurotin) D 로 활성을 가진 cell(자궁암 세포, HeLa cell)을 섞어 코팅시켜 젤이 굳도록 했다. 후에 용해물(lysis) 용액(Tris, NaCl, EDTA, TritonX-100, DMSO)이 담긴 코플린 자(coplin jar)에 넣고 2시간 이상 냉장 보관한 후 Neutralising 용액(T1503, Sigma)에 옮겨 2~3회에 걸쳐 5분간 담가둔다. 이 슬라이드 글라스를 전기영동하고 Neutralising 용액에 다시 담근 다음 EtBr(2mg/ml)을 3~4방울 첨가 후 커버슬라이드를 덮고 형광현미경(Komet 5.x, Kinetic Imageing LTD)으로 측정하였다.

2-2 실험결과

도 3a와 3b에서 보이는 바와 같이, 시간에 따라 푸슈로틴(pseurotin) D 300μM을 가하였을 때 DNA 손상정도가 심해지는 경향을 나타냈으며 꼬리쪽 DNA%를 비교했을 때, 24시간보다 48시간에서 더 큰 DNA 손상정도를 발견할 수 있었다.

실험예 3. 세포주기 및 세포사멸의 백분율 분석

상기 실시예에서 수득한 본 발명의 화합물의 세포주기저해와 세포사멸을 유도하는지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 개시된 실험방법을 응용하여 실험하였다(Kalejta, R.F., T.Shenk, and A.J.Beavia. 1997. Use of a membrane-localized green fluorescent protein allows simultaneous identification of transfected cells and cell cycle analysis by flow cytometry. Cytometry 29:286-291).

3-1. 실험준비

60 mm-dish에 5x10⁵ 세포/ml의 농도로 24 시간 배양된 HeLa 세포에 300μM의 푸슈로틴(pseurotin) D를 포함하는 새로운 배지로 교체한 후 각기 다른 시간대에 트립신 처리(trypsinization)를 이용하여 세포를 모았다. 그리고 원심분리를 이용하여 세포 부유액을 차가운 인산 완충용액(PBS)으로 3회 세척한 후 4℃에서 70% 에탄올(v/v)에 1시간 이상 고정하였다. 그리고 다시 차가운 인산 완충용액(PBS)으로 원심분리를 통하여 세척된 세포는 PI/RNase 염색 완충제(550825, staining buffer; BD PharMingen)로 15분 동안 4℃에서 배양하였다. 이를 세포주기에 따른 DNA의 함량을 알아보기 위하여 FACScalibur (Becton Dickinson) 유세포 분석 시스템(flow cytometry system)의 CellQuest 소프트웨어를 사용하여 20000개의 세포를 각각 측정하였다. 그리고 그 결과는 ModFit LT 2.0 소프트웨어(verity Software House, Topsham, ME, USA)를 이용하여 분석되었다.

3-2. 실험결과

푸슈로틴(pseurotin) D로 처리된 HeLa 암세포의 DNA를 프로피디움 요오드화물(propidium iodide, PI)로 염색을 하여 유세포분석기(flow cytometry)로 확인, 분석하였다. 도4는 푸른색인 잘려진 DNA를 나타내는 세포사멸 피크(apoptotic peak)와 세포주기인 G0/G1, S, 그리고 G2/M기를 %로 나타내어졌으며 이 결과들은 각각 20000개의 세포에 대한 분석결과이다. 도 4에서 보이는 바와 같이, 300μM의 푸슈로틴 D를 처리하였을 때, 48h 에서 S phase arrest가 관찰되었으며 HeLa 세포의 세포사멸 피크(apoptotic peak)가 대조군에 비하여 증가한 것으로 보아 이 화합물은 세포주기저해와 세포사멸을 유도하는 것을 알 수 있다.

실험예 4. 아넥신 V와 PI 염색을 이용한 세포사멸( apoptosis ) 분석

상기 실시예에서 수득한 본 발명의 화합물의 아넥신 V와 PI염색을 이용한 세포사멸(apoptosis) 분석을 위하여 하기와 같이 문헌에 개시된 실험방법을 응용하여 실험하였다(Koopman G., Blood, 84, pp1415-1420, 1994).

4-1. 실험준비

60 mm-dish에 2x10⁵ 세포/ml의 농도로 24 시간 배양된 HeLa세포에 300μM의 푸슈로틴(pseurotin) D를 포함한 새로운 배지로 각각 교체한 후 각기 다른 시간대에 따라 트립신 처리(trypsinization)를 이용하여 세포를 모았다. 그리고 원심분리를 이용하여 세포 부유액을 인산 완충용액(PBS)으로 세척한 후 세포 펠렛(pellet)을 100μl의 결합완충용액(binding buffer)에 부유시킨 다음 5μl의 annexin V-FITC (BD PharMingen)와 10μl의 PI (50μg/ml)를 가한 후 실온(15-25 ℃)의 어두운 곳에서 15분간 염색한다. 그리고 이 세포들은 488 nm의 여기파장의 FACScalibur 유세포분석기(FACScalibur-기기모델, BD Bioscience)를 이용하여 측정하고 이(BD Instruments)에 제공된 프로그램에 의하여 분석되었다.

4-2. 실험결과

세포사멸의 특징 중의 하나는 세포막을 이루는 지질인 포스파티딜세린(phosphatidylserine)의 세포 외부로의 노출이다. 이는 세포사멸 과정 중에서 DNA의 단편화 이전에 일어나는 현상이므로 조기 세포사멸(early apoptosis)을 알아내는 지표로 이용된다. 푸슈로틴(pseurotin) D 으로 처리된 HeLa 암세포주의 DNA를 프로피디움 요오드화물 (propidium iodide, PI)과 annexin V-FITC(556419, BD PharMingen) 로 염색을 하여 유세포분석기 (FACScalibur, BD Bioscience)(flow cytometry)로 확인, 분석하였다. 이 결과들은 각각 10000개의 세포에 대한 분석결과이다. 그림 5에서 보는 바와 같이, 300μM의 푸슈로틴(pseurotin) D 를 처리하였을 때, 48h 후의 결과를 통해 현저하게 조기 세포사멸이 증가하는 것으로 보아 이 화합물은 세포사멸을 유도한다는 것을 알아내었다.

실험예 5. [ ³ H] Thymidine incorporation 측정법

상기 실시예에서 수득한 본 발명의 화합물의 DNA 합성에 이 화합물이 미치는 영향을 확인하기 위하여 [³H]Thymidine incorporation 측정법을 하기와 같이 문헌에 개시된 실험방법을 응용하여 실험하였다(Lin SY, Liu JD, Chang HC, Yeh SD, Lin CH and Lee WS: Magnolol suppresses proliferation of cultured human colon and liver cancer cells by inhibiting DNA Sythesis and activating apoptosis. J Cell Biochem 84: 532-544, 2002).

5-1. 실험준비

0.5x10⁵ 세포를 12-웰(well)의 바닥이 평편한 마이크로타이터 판(flat-bottom microtiter plates; Nalgen Nunc International, Tokyo)에 각 각 분주하여 24 시간 동안 배양시킨 후, 200μM, 400μM의 푸슈로틴(pseurotin) D 를 포함하는 새로운 배지로 교체한 후, 48 시간동안 각각 배양시켰다. 그 후 각 웰에 있는 세포의 복제능을 알아보기 위하여 살아있는 세포에 동위원소인 삼중수소로 대체되어있는 티미딘(3589178 Perkin Elmer[³H]dTTP)을 1μCi/ml로 가한 후, 3시간을 더 배양하였다. 그리고 각 웰에 있는 세포들은 트립신 처리에 의하여 모아졌으며, 차가운 인산 완충용액(PBS)으로 세척되었다. 원심분리를 통하여 모아진 세포는 5% TCA(tricholoracetic acid)로 다시 부유시켜 얼음에 30분 동안 놓아둔 후 다시 인산 완충용액(PBS)으로 세척하였다. 중수소의 티미딘과 복제에 의해 새로이 결합한 DNA는 세포용해 완충용액에 의하여 추출된 후, 산-불용성 방사능(acid-insoluble radioactivity)측정법에 의하여 Tri-carb 2000CA scintillation counter(Tri-carb 2000CA scintillation counter, Packard, Groningen, The Netherlands)(Packard, Groningen, The Netherlands)로 측정되었다.

5-2. 실험결과

앞의 세포주기 실험의 결과, 푸슈로틴(pseurotin) D 로 처리된 HeLa 암세포가 48h에서 S phase일으킨다는 것을 관찰한 우리는 DNA 복제에 푸슈로틴(pseurotin) D 가 미치는 영향을 알아보았다. 도6 에서 보이는 바와 같이, HeLa 암세포의 DNA 복제는 200μM 의 푸슈로틴(pseurotin) D 를 48h 시간 배양하였을 때 20%의 저해를 보였으나 400μM를 가하였을 때는 약 50% 의 복제 저해 활성을 나타냈다.

실험예 6. 급성독성실험

상기 실시예에서 얻은 PSRT의 약물 투여에 의한 독성을 확인하기 위하여 기존문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같은 실험을 하였다 .

6 주령의 특정병원체부재 (Specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 각 그룹당 2마리씩의 동물에 본 발명의 PSRT을 500 ㎎/㎏의 용량으로 1회 경구투여 하였다. 실험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상 및 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 강장기와 흉강 장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 실험 물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사 및 부검 소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았으며, 본 발명의 PSRT은 래트에서 각각 500 ㎎/㎏ 까지도 독성변화를 나타내지 않았고, 경구투여 최소치사량 (LD₅₀)은 500 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

하기에 본 발명의 PSRT을 함유하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

PSRT 300 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

PSRT 300 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

PSRT 300 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

PSRT 300 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

PSRT 300 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

PSRT 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B₁0.13 ㎎

비타민 B₂0.15 ㎎

비타민 B₆0.5 ㎎

비타민 B₁₂0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

PSRT 300 ㎎

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B₁ 0.25 g

비타민 B₂ 0.3g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

푸슈로틴(pseurotin) D를 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 암질환은 자궁경부암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문암, 식도암, 췌장암, 위암, 신장암, 자궁암, 유방암, 폐암, 임파선암, 갑상선암, 전립선암, 백혈병, 피부암, 결장암, 뇌종양, 방광암, 난소암, 또는 담낭암인 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 화합물은 조성물 총 중량에 대하여 0.02 내지 50% 중량백분율로 포함됨을 특징으로 하는 약학조성물.
푸슈로틴(pseurotin) D를 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품.
제 4항에 있어서, 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제인 건강기능식품.