KR20070080329A

KR20070080329A - 어성초 추출물을 함유한 암 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20070080329A
Application number: KR1020060011544A
Authority: KR
Inventors: 김동규; 안은영; 장연군; 류승희; 이범종
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2006-02-07
Filing date: 2006-02-07
Publication date: 2007-08-10
Also published as: KR100769654B1

Abstract

본 발명은 암 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 어성초(Houttuynia cordata)추출물을 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 세포사멸(apoptosis)의 유도에 의한 항암활성을 나타냄으로써, 암 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

어성초 추출물, 항암, 세포사멸

Description

어성초 추출물을 함유한 암 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising the extract of Houttuynia cordata for treating or prevening cancer disease}

도 1은 어성초 추출물의 제조방법을 나타낸 도이며,

도 2는 사람의 자궁경부암 HeLa 세포주의 생존에 미치는 어성초 분획물들의 영향을 나타낸 도이고,

도 3는 어성초 분획물이 처리된 Hela 암세포주를 광학현미경으로 관찰한 도이며,

도 4은 어성초 분획물이 처리된 Hela 암세포주 DNA를 형광현미경으로 관찰한 도이고,

도 5는 유세포 분석기를 이용한 세포사멸의 발생 및 세포주기를 분석한 도이며,

도 6는, 아넥신 V(annexin V)와 프로피디움 요오드화물 (propidium iodide, PI)염색을 이용한 세포사멸(apoptosis)을 분석한 도이다.

본 발명은 암질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 어성초(Houttuynia cordata) 추출물을 유효성분으로 포함하는 암질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

세포사멸 (apoptosis)은 세포 내부에 예정된 신호를 따라 여러 유전자 및 단백질들의 발현과 활성이 조절되어 일어나는 능동적인 죽음이며, 그 과정을 통해 생성된 아포토소체 (apoptosome)들은 주변의 세포들이나 대식세포 (macrophage) 등의 식세포 작용에 의해 제거됨으로서, 염증을 유발하지 않는다. 세포사멸의 형태적, 생리적 특징으로는 세포질 축소 (cytoplasm shrinkage), 세포막 (membrane blebbing), 염색체의 응축 (chromatin condensation), DNA의 분절 (DNA fragmentation), 세포막을 이루는 지질인 포스파티딜세린 (phosphatidylserine)의 세포 외부로의 노출, 아포토소체 (apoptosome)의 형성 등이 보고되고 있다. 반면에 세포괴사는 외부적 환경의 변화에 의해 급격히 일어나는 수동적 죽음이며, 염색사의 다형태적 덩어리(irregular clumping)과 세포질의 팽창 (swelling of cytoplasm) 과정을 거치게 되고, 최종적으로 세포들의 분해를 통해 세포 파편 (cell debris)이 생성되고, 이들이 염증을 유발하게 된다.

세포사멸은 생명체의 여러 정상적인 생리적 현상에서 쉽게 관찰된다. 예를 들면 세포사멸은 생명체의 초기 발생단계에서 관찰되는 여러 형태적 변화과정 (morphogenesis)과 면역계 또는 신경계의 기능적 자가 조직화 (functional self-organization)과정에서 중요한 역할을 담당한다. 또한, 성인이 된 이후에도 조직 항상성 (tissue homeostasis), 세포 수의 조절, 손상된 세포의 제거, 감염에 대한 방어 기작으로서 필수적으로 작용한다. 세포사멸은 여러 질환들의 발병과정에도 깊 이 관여하는데 비정상적인 세포사멸의 발생은 퇴행성뇌신경질환 (neurogegenerative disorder), 면역계 이상 (immune disorder), 그리고 심장 혈관계질환 (cardiovascular disease) 등의 원인이 될 수 있으며, 세포사멸의 비정상적인 억제는 암의 원인이 될 수 있다. 세포사멸이 정상적인 조절과정에서 벗어나 비정상적으로 발행하거나 억제되어 나타나는 질병을 좀 더 자세히 살펴보면, p53, p16와 Bcl-2 등의 유전자의 이상 발현에 의해 유도되는 암들, HIV Herpes 및 독감 (influenza) 바이러스들에 의한 감염증, 그리고 당뇨 (Type 1 diabetes), 류마티스 관절염 (Rheumatoid arthritis), 다발성 경화증 (multiple sclerosis)과 근무력증(Myasthenia gravis) 등과 같은 자가면역 질환들이 있다. 이와 같이, 세포사멸은 생명체의 다양한 생리작용을 정상적으로 유지하는데 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 여러 질병들의 발병과정에도 밀접한 관련이 있다. 개체를 구성하는 각 세포의 세포사멸은 유전적으로 손상을 입은 세포나 분화 자극제에 의해 부적절한 분화의 유도에 의한 종양의 발달을 막기 위해 이들 비정상적인 세포를 개체에서 제거하기 위한 수단, 즉 회복 불가능한 유전적 상처를 지닌 세포들을 개체에서 제거하기 위한 일반적인 수단이다. 이 개념은 일반적으로 사용되는 항암제가 암세포의 증식억제와 연관된 세포사멸 과정을 통해 암세포의 사멸을 유도한다는 사실에 의해 뒷받침되고 있다(Barry, M.A., et al., Biochem Pharmacol, 40, pp 2353-2362, 1990; Hickman, J.A., Cancer Metastasis Rev. 11, pp 121-129, 1992). 따라서 세포사멸 과정의 교란은 손상되거나 손상이 시작된 세포의 생존과 그들 세포의 성장을 유도하기 때문에 세포사멸의 억제는 암화과정에서 중요한 역할을 한다. 아울러 암예방 효과가 있는 물질들은 이러한 비정상적인 세포의 세포사멸을 유도하며, 이들에 의한 세포사멸의 유발은 최소한 그들의 암예방 활성과 연관되어 있음이 보고 되어져왔다(Fesus, L., J Cell Biochem. 22, p 151-161, 1995; Reddy, B.S. Cancer Res. 57, pp 420-425, 1997).

한편, 어성초 (Houttuynia cordata)는 삼백초과 (Saururaceae)에 속하는 다년생 초본으로써, 잎과 줄기에서 '생선비린내'가 난다하여 어성초 (漁腥草)라 불리게 되었다. 중국에서는 어성초가 민간약재로서 보다는 한방약재로 널리 알려져 있으며, 폐형초 (肺形草), 호두초 (好頭草) 및 구자이 (拘子耳)라고도 한다(김근영, 대산논총, 3집, pp 188-196, 1995). 본초강목에 따르면 어성초는 사열, 해독, 이뇨, 화농, 해독, 소염 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있고, 임상에서 백일해, 기관지염, 폐렴, 편도선염 등에 응용되고 있고, 한방에서는 만성 피부질환, 이뇨, 소염의 목적으로 사용되고 있다(Yoo HT., et al., Haenglim Publishing Co., Seoul, pp 717-718, 1977). 주요성분으로는 쿼세틴 (quercitrin)이 함유되어 있고, 근래 연구에 의해 어성초 추출물의 혈압강하작용과 혈당강하작용, 항균작용, 항바이러스작용, 항염증작용 및 항 알레르기성 작용, 항산화 작용(Wang YS., Peking. p, pp 709-710, 1983; Song JH et al., J Korean Soc Food Sci Nutr. 32, pp 1053-1058, 2003; Chung CK et al., J Korean Soc Food Sci Nutr. 28, pp 205-211, 1999; Choi YH et al., J Korean Soc Food Sci Nutr. 23, pp 916-921, 1994)효과는 보고된 바 있으나 항암효과에 대한 자세한 연구는 이루어 지지 않고 있다. 이에 본 발명에서는 자궁경부암 세포를 이용하여 어성초가 항암활성을 지니고 있으며 이는 새로운 화학 치료제로서의 가치가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 어성초 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 어성초 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 암 질환의 예방 및 치료효과를 갖는 어성초 조추출물, 극성용매 또는 비극성용매 가용추출물을 유효성분으로 포함하는 암 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물을 제공한다.

상기 조추출물은 물, 메탄올, 에탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 극성용매 및 비극성 용매에 가용한 추출물인 약학조성물을 제공한다.

상기 극성용매 가용추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매, 바람직하게는 부탄올에 가용된 추출물이고, 비극성용매 가용추출물은 헥산, 염화메틸렌, 클로로포름, 에틸아세테이트 등과 같은 비극성 용매, 바람직하게는 헥산, 염화메틸렌에 가용한 추출물을 의미한다.

상기 암 질환은 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 비소세포성폐암, 간암, 결장암, 골암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부 갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 바람직하게는 자궁경부암을 포함하며, 본 발명의 조성물은 암 질환 및 전이 치료에도 사용가능하다.

이하, 상기 어성초 추출물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 어성초 추출물은, 음건한 잎, 뿌리를 세절하여 무게(kg)의 약 1배 내지 40배, 바람직하게는 약 5배 내지 30배의 유기용매, 바람직하게는 물, 메탄올, 염화메틸렌, 헥산, 부탄올, 또는 이들의 혼합용매, 더욱 바람직하게는 메탄올 등의 극성용매 및 염화 메틸렌 등의 비극성 용매를 전개 용매로 하고, 10℃ 내지 50℃, 바람직하게는 15℃ 내지 30℃ 추출온도에서 약 1시간 내지 10일, 바람직하게는 약 2시간 내지 2일 동안 교반하여 추출하고, 상기 용량을 1회 내지 5회, 바람직하게는 3회 반복하여 얻은 추출액을 여과, 감압농축 또는 건조하여 본 발명의 어성초 조추출물을 수득할 수 있다.

이하 구체적으로 어성초 극성용매 및 비극성용매 가용추출물의 분리공정을 설명하면,

예를 들어 어성초를 분쇄하고 물, 메탄올 또는 에탄올과 같은 극성용매 또는 헥산 또는 염화 메틸렌과 같은 비극성 용매로 초음파추출한 후에 여과하고, 감압농축 및 동결 건조하여 극성용매에 가용한 조추출물을 수득하는 제 1단계;

상기 극성 및 비극성 용매에 가용한 조추출물을 혼합한 후 물에 현탁하여 순차적으로 헥산, 염화 메틸렌의 비극성 용매로 녹여 현탁 시킨 후, 분획 및 여과하여 헥산 가용추출물, 염화메틸렌 등의 비극성 용매 가용추출물을 수득하는 제 2단 계;

이어서 순차적으로 수층을 부탄올, 물과 같은 극성 용매를 사용하여 분획 및 여과하고, 부탄올 가용추출물, 물 가용추출물 등의 극성용매 가용추출물 및 헥산 가용추출물, 염화 메틸렌 가용추출물 등의 비극성 용매 가용추출물을 수득하는 제 3계;

상기의 극성 용매 및 비극성 용매 가용추출물을 감압 농축하여 건조하는 제 4단계로 구성된 분리공정을 포함한다.

본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 어성초 조추출물, 극성용매 및 비극성 용매 가용추출물을 유효성분으로 함유하는 암질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 어성초 추출물을 0.01 ~ 99.9% 함유하는 것이 바람직하고, 0.1 ~ 90% 함유하는 것이 더욱 바람직하다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 어성초 추출물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 어성초 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명은 암 질환 예방 및 개선의 효과를 나타내는 어성초 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 어성초 추출물을 포함하는 조성물은 암 질환의 예방 및 개선에 효과적인 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 어성초 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 어성초 추출물 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 상기 추출물은 암 질환의 예방을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가 될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.02내지 30 g, 바람직하게는 0.3 내지 10 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합 하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시 예 및 실험 예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시 예 및 실험 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예 및 실험 예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 어성초 추출물의 제조

1-1. 어성초 조추출물의 제조

대풍농산에서 구입한 어성초의 음건한 잎 100g과 뿌리 100g을 잘게 썰어 5L 비이커에 99% 이상의 메탄올 4L를 넣고 상온에서 24시간동안 교반한 후 추출하였다. 이와 같이 3회 반복하여 얻은 추출물을 0.4 μm 필터로 여과한 후, 진공농축기 (Buchi, Rotavapor R-205V)로 35-40℃에서 감압 농축시켜 메탄올 조추출물 20.35g을 얻었으며 동일한 방법을 이용하여 염화 메틸렌으로 추출한 조추출물 15.96g을 얻었다.

1-2. 극성용매 및 비극성용매의 가용 추출물의 분획물 제조

메탄올 조추출물과 염화메틸렌 조추출물을 섞어 도 1과 같이 물과 에테르를 이용하여 분획한 후 여과, 감압 농축을 이용하여 헥산(n-Hex) 분획물 0.98g, 염화메틸렌(CH₂Cl₂) 분획물 1.25g, 60% 메탄올(60% MeOH) 분획물 0.63g, 부탄올(BuOH) 분획물 2.08g 및 물(dH₂O) 분획물 10.14g 로 극성에 따른 5개의 분획물을 얻었다. 제조된 5개의 분획물 들은 DMSO에 용해시킨 후 -20℃에 보관하여 사용하였다. 그리고 모든 실험이 수행되기 전 샘플은 즉시 희석하여 사용하였으며 각 실험에서 DMSO의 최종농도는 0.5%를 초과하지 않았다.

참고예 1. 세포배양

본 실험에 사용된 RPMI-1640 배지(medium), 우 태아 혈청(fetal bovine serum; FBS), 100% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)은 하이크론 연구소(Hyclone Laboratories, Logan, UT)에서 구입하였고, EMEM 배지(Eagle's minimum essential medium)는 Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였으며 CCK-8은 도찐 연구소(Dojin Laboratories, Osaka, Japan)로부터 구입하였다. 본 실험에 사용된 암 세포주로 자궁경부암(cervical carcinoma)세포인 HeLa 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양 받아 사용하였다. HeLa는 10% FBS와 1% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)을 EMEM 배지(Eagle's minimum essential medium)에 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기(incubator; Forma Co., U.S.A.)에서 배양하였다.

실험예 1. 세포독성 및 성장곡선 측정

1-1. 실험준비

5x10⁴ 세포/ml의 세포부유물을 96-웰(well) 바닥이 평편한 마이크로타이터 판(flat-bottom microtiter plates; Nalgen Nunc International, Tokyo)의 각 웰(well)에 100 μl씩 접종하고 24 시간 동안 배양시킨 후, 여러 가지의 농도로 어성초의 분획물들이 각각 단계 희석되어있는 새로운 배지로 교체한 후 다시 48 시간 배양시켰다. 그 후 살아있는 세포를 측정하기 위하여 수용성 테트라졸리움 염에 기초한 독성 분석(a water-soluble tetrazolium salt based cytotoxic assay)을 수행하였다. 10 μl의 세포 카운팅 키트 용액(Cell Counting Kit solution; WST-8)을 각각의 웰(well)에 첨가한 후 3시간 동안 37℃에서 배양하였다. 살아있는 세포의 경우 노란색을 나타내는 2-(2-메톡시(methoxy)-4-니트로페닐(nitrophenyl))-3-(4-니트로페닐(nitrophenyl))-5-(2,4-디설포페닐(disulfophenyl))-2H-테트라졸리움(tetrazolium) (WST-8)을 오렌지색의 포마쟌 염색시약(formazan dye)으로 색을 변화시키며 이를 450 nm에서 멀티 마이크로플레이트 판독기(multi microplate reader; synergy HT, BIO-TEK®)를 이용하여 흡광도를 측정한다. 세포의 성장곡선을 확인하기 위하여 위와 동일한 방법으로 같은 농도에 대한 시간대별 흡광도를 측정하였다.

1-2. 실험결과

HeLa 자궁경부암세포를 여러 농도의 5가지 어성초 분획물들로 처리한 후, CCK-8을 이용하여 WST-8의 흡광도를 측정하고, 대조군의 흡광도를 100%로 하여 각 각의 농도에 대한 세포의 생존률을 측정한 결과, 도 2a에서 나타내는 바와 같이, 농도 의존적으로 세포의 생존률을 감소시켰다. 50%의 세포독성을 보이는 농도인 IC₅₀ (50% Inhibition concentration)의 경우, 염화 메틸렌 분획은 53 μg/ml, 부탄올 분획은 121 μg/ml, 60% 메탄올 분획은 113 μg/ml, 헥산 분획은 161 μg/ml, 물 분획은 266 μg/ml으로 염화 메틸렌 분획이 가장 강한 세포독성을 보였다. 그리고 같은 HeLa 세포에 염화메틸렌, 부탄올, 그리고 60% 메탄올 분획을 IC₅₀ 농도로 처리한 후, 살아있는 세포에 대한 흡광도를 이용하여 시간에 따른 성장곡선을 알아본 결과, 도 2b에서 보는 바와 같이, 세 가지 분획 모두 36 시간 까지는 암세포의 증식능을 저해하며 그 중 염화메틸렌 분획이 가장 강한 암세포 증식능의 저해를 보였으며, 세 가지 분획 모두 36시간 이후로 세포사멸의 경향을 보였다.

실험예 2. 세포의 현미경 관찰

2-1. 실험준비

5x10⁴ 세포/ml의 세포부유물을 지름이 10-mm인 멸균된 유리 커버슬립 (coverslips)이 놓인 24-well 바닥이 평편한 마이크로타이터 판(flat-bottom microtiter plates; Nalgen Nunc International, Tokyo)의 각 웰(well)에 1ml씩 접종하고 24 시간 동안 배양시킨 후, 각각의 어성초의 분획물들이 50%의 세포독성을 가지는 농도를 포함한 새로운 배지로 교체한 후 다시 24, 48 시간 각각 배양시켰다. 시간에 따른 세포의 변화를 관찰하기 위하여 위상차 현미경 (Nikon TM Phase Contrast-2, ELWD 0.3 inverted microscope)을 이용하여 관찰하였다. 세포주 핵의 관찰을 위해 인산완충액(phosphate buffered saline, PBS)를 이용하여 각각의 웰(well)을 세척한 후 메탄올과 아세트산이 3:1로 섞여있는 고정용액 200 μl로 4℃에서 15분 동안 세포를 고정시킨다. 그리고 PBS로 2회 세척한 다음 DNA 염색시약( Hoechst 33342, 5μg/ml) 500 μl를 첨가하여 10분간 어두운 실온에서 염색시킨 후 다시 멸균된 증류수를 이용하여 2회 세척한 다음 DAPI 필터를 가진 형광현미경 (AxioCam HRC, ZEISS)으로 관찰하였다.

2-2. 실험결과

HeLa 암세포주의 위상차 광학현미경적 관찰에서는 대조군을 배양 시, 도 3에서 보이는 바와 같이 시간에 따른 세포수의 증가와 바닥에 대한 세포막 점착력의 유지를 확인 할 수 있었으나 IC₅₀의 각각의 어성초 분획물로 처리된 HeLa 세포의 경우 시간이 지남에 따른 현저한 세포수의 감소 경향을 보였으며, 세포사멸의 특징인 세포막 형태의 축소와 아포토소체의 형성을 확인할 수 있었다. 이들 분획 중, 부탄올 분획의 경우 더 많은 아포토소체가 확인되었다.

IC₅₀의 어성초 분획물들로 처리된 HeLa 암 세포주의 세포사멸을 확인하기 위하여 HeLa 암세포주의 DNA를 Hoechst 33342로 염색을 하여 형광현미경으로 관찰하였다. 도 4에서 보이는 바와 같이, 어성초 분획들로 처리된 자궁경부암 세포에서 세포사멸 특징의 하나인 핵 내 염색체의 응축과 세포 및 DNA의 단편화를 확인 할 수 있었다. 시간이 지남에 따라 더 많은 DNA의 단편화와 응축을 관찰 할 수 있었으며, 특히 부탄올 분획이 처리된 HeLa 암세포에서 더 많은 사포사멸의 현상을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 세포주기분석

3-1. 실험준비

60 mm-dish에 2x10⁵ 세포/ml의 농도로 24 시간 배양된 HeLa 세포에 각각의 어성초의 분획물들이 50%의 세포독성을 가지는 농도를 포함한 새로운 배지로 교체한 후 각기 다른 시간대에 트립신 처리(trypsinization)를 이용하여 세포를 모았다. 그리고 원심분리를 이용하여 세포 부유액을 차가운 PBS로 3회 세척한 후 4℃에서 70% 에탄올(v/v)에 1시간이상 고정되었다. 그 후 다시 차가운 PBS로 원심분리를 통하여 세척된 세포는 PI/RNase 염색 완충제(staining buffer; BD PharMingen)로 15분 동안 4℃에서 배양하였다. 이를 세포주기에 따른 DNA의 함량을 알아보기 위하여 FACScalibur (Becton Dickinson) 유세포분석 시스템(flow cytometry system)의 CellQuest 소프트웨어를 사용하여 20000개의 세포를 각각 측정하였다. 그리고 그 결과는 ModFit LT 2.0 소프트웨어(verity Software House, Topsham, ME, USA)를 이용하여 분석되었다.

3-2. 실험결과

어성초 분획물들로 처리된 HeLa 암세포주의 DNA를 프로피디움 요오드화물 (propidium iodide, PI)로 염색을 하여 유세포분석기(flow cytometry)로 확인, 분석하였다. 도 5은 푸른색을 나타내고 있는 잘려진 DNA인 세포사멸 피크 (apoptotic peak)와 세포주기인 G0/G1, S, 그리고 G2/M기를 %로 나타내어졌으며 이 결과들은 각각 20000개의 세포에 대한 분석결과이다. 도 5에서 보이는 바와 같이, 각각의 어성초 분획물들을 IC₅₀으로 처리하였을 때, 시간이 지남에 따라 세포사멸 피크 (apoptotic peak)가 증가하였다. 이때 부탄올 분획물로 처리된 HeLa 세포의 경우 더 큰 세포사멸 피크를 확인할 수 있었다. 부탄올, 60% 메탄올, 염화메틸렌 분획물로 처리된 HeLa 암세포주는 모두 G2/M기를 저해하였으며, 염화메틸렌 분획물의 경우에 G2/M기를 가장 많이 저해하였다.

실험예 4. 아넥신 V와 PI염색을 이용한 세포사멸 (apoptosis) 분석

4-1. 실험준비

60 mm-dish에 2x10⁵ 세포/ml의 농도로 24 시간 배양된 HeLa 세포에 각각의 어성초의 분획물들이 50%의 세포독성을 가지는 농도를 포함한 새로운 배지로 교체한 후 각기 다른 시간대에 트립신 처리(trypsinization)를 이용하여 세포를 모았다. 그리고 원심분리를 이용하여 세포 부유액을 PBS로 세척한 후 세포 펠렛 (pellet)을 100 μl의 결합 완충용액 (binding buffer)에 부유시킨 다음 5 μl의 annexin V-FITC (BD PharMingen)와 10 μl의 PI (50 μg/ml)를 가한 후 실온 (15~25 ℃)의 어 두운 곳에서 15분간 염색한다. 그리고 이 세포들은 488 nm의 여기파장의 FACScalibur 유세포분석기를 이용하여 측정하고 이(BD Instruments)에 제공된 프로그램에 의하여 분석되었다.

4-2. 실험결과

세포사멸의 특징중의 하나는 세포막을 이루는 지질인 포스파티딜세린(phosphatidylserine)의 세포 외부로의 노출이다. 이는 세포사멸 과정 중에서 DNA의 단편화 이전에 일어나는 현상이므로 조기 세포사멸 (early apoptosis)을 알아내는 지표로 이용된다. 본 연구에서는 포스파티딜세린과 결합하는 아넥신-V (annexin V)와 프로리디움 요오드화물 (propidium iodide, PI)을 이용하여 부탄올, 60%메탄올, 염화메틸렌 분획물로 처리된 HeLa 암세포주의 세포사멸을 분석하였다.

도 6에서 보는 바와 같이, 어성초 분획물들이 처리된 경우 시간이 지남에 따른 조기 세포사멸의 백분율(%)이 증가함을 확인 할 수 있었으며 부탄올 분획물의 경우 12시간과 48시간의 결과에서 각각 12.06%와 32.4%로 가장 높은 세포사멸 백분율을 보였다.

제제예 1. 산제의 제조

실시예 1의 어성초 부탄올 분획물...................20 ㎎

유당.............................................100 ㎎

탈크..............................................10 ㎎

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 1의 어성초 부탄올 분획물..................200 ㎎

옥수수전분.......................................100 ㎎

유당.............................................100 ㎎

스테아린산 마그네슘................................2 ㎎

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캡슐제의 제조

실시예 1의 어성초 부탄올 분획물...................10 ㎎

결정성 셀룰로오스..................................3 ㎎

락토오스........................................14.8 ㎎

마그네슘 스테아레이트............................0.2 ㎎

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

실시예 1의 어성초 부탄올 분획물..................10 ㎎

소디운 메타비설파이트............................3.0mg

메틸파라벤.......................................0.8mg

프로필파라벤.....................................0.1mg

주사용 멸균증류수.................................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 2ml로 한 후, 2ml 용량의 앰플에 충전하고 멸균항 주사제를 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

실시예 1의 어성초 부탄올 분획물................1000 ㎎

설탕...............................................20g

이성화당...........................................20g

레몬향............................................적량

정제수를 가하여 전체 1000ml로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

실시예 1의 어성초 부탄올 분획물................1000㎎

비타민 혼합물....................................적량

비타민 A 아세테이트.............................70 ㎍

비타민 E.......................................1.0 ㎎

비타민 B1.....................................0.13 ㎎

비타민 B2 ....................................0.15 ㎎

비타민 B6......................................0.5 ㎎

비타민 B12.....................................0.2 ㎍

비타민 C........................................10 ㎎

비오틴..........................................10 ㎍

니코틴산아미드.................................1.7 ㎎

엽산............................................50 ㎍

판토텐산 칼슘 .............................0.5 ㎎

무기질 혼합물 ...............................적량

황산제1철.....................................1.75 ㎎

산화아연......................................0.82 ㎎

탄산마그네슘..................................25.3 ㎎

제1인산칼륨.....................................15 ㎎

제2인산칼슘.....................................55 ㎎

구연산칼륨......................................90 ㎎

탄산칼슘.......................................100 ㎎

염화마그네슘..................................24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무 방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

실시예 1의 어성초 부탄올 분획물................100㎎

비타민 C........................................15 g

비타민 E(분말).................................100 g

젖산철.......................................19.75 g

산화아연.......................................3.5 g

니코틴산아미드.................................3.5 g

비타민 A.......................................0.2 g

비타민 B1.....................................0.25 g

비타민 B2.......................................0.3g

물..............................................정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 어성초 추출물은 세포사멸의 유도에 의한 뛰어난 항암활성을 나타내는 바, 암 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

어성초(Houttuynia cordata) 조추출물을 유효성분으로 함유하는 암 질환 예방 및 치료용 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조추출물은 물, 메탄올, 에탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 극성용매 및 헥산 또는 염화 메틸렌으로부터 선택되어진 비극성 용매에 가용한 추출물인 약학조성물.
어성초 극성용매 가용추출물을 포함하는 암 질환 예방 및 치료용 약학조성물.
제 3항에 있어서, 상기 극성용매 가용추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매에 가용한 추출물인 약학조성물.
어성초 비극성 용매 가용추출물을 포함하는 암 질환의 예방 및 치료용약학조성물.
제 5항에 있어서, 상기 비극성용매 가용추출물은 헥산 또는 염화메틸렌으로부터 선택되어진 용매에 가용한 추출물인 약학조성물.
제 1항, 제 3항 또는 제5항에 있어서, 상기 암 질환은 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 비소세포성폐암, 간암, 결장암, 골암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암인 약학조성물.
암 질환 예방 및 치료효과를 나타내는 어성초(Houttuynia cordata) 추출물 을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품.
제 8항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 건강기능식품