CN104829679B - 一类水溶性南蛇藤素衍生物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类水溶性南蛇藤衍生物及其用途，其化学结构式如（I）式所示，其中R为C2‑C12酰基，M为Na、K、NH4或Ca等。该衍生物与药学上可接受的载体或辅料可制成药学上的各种剂型，包括注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂和搽剂，特别适合于制备注射剂。本发明所述衍生物具有良好的抗肿瘤活性，可用于制备治疗抗肿瘤药物，尤其是制备治疗结肠癌药物，

Description

一类水溶性南蛇藤素衍生物及其用途

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体涉及一类水溶性南蛇藤素衍生物及其用途。

背景技术

南蛇藤素是一个具有多种生物活性的天然产物，尤其以抗癌、抗炎活性最为显著。特别是自从2006年发现它是一种新型的蛋白酶体抑制剂以来，引起了药物化学界的广泛关注，后续的研究发现南蛇藤素能作用于多种分子靶点，如Hsp90，NF-κB/IKKβ，VEGFR1，VEGFR2等等，是非常具有开发潜力的活性天然产物。

对南蛇藤素的结构修饰大多数集中在羧基上，这些化合物和南蛇藤素一样水溶性均较差，不易制成注射液剂型。专利CN101434635B报道了一类具抗肿瘤活性的水溶性酚性三萜化合物,是在南蛇藤素及类似物的6位引入磺酸基并成盐，增加了水溶性，动物实验显示具有抗肿瘤活性。这类化合物由于具有类似表面活性剂的性质，物理性状不够理想，流动性差，且具有一定毒性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一类水溶性南蛇藤素衍生物及其用途，特别是该衍生物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，尤其是在制备治疗结肠癌药物中的应用。

本发明的目的之一，在于提供一类水溶性南蛇藤素衍生物，其化学结构式如（I）所示：

R为C2-C12酰基；

M为Na，K，NH₄或Ca。

本发明如上述结构式（I）的水溶性南蛇藤素衍生物，选自但不限于以下化合物：

本发明的目的之二，在于提供一种药用组合物，该组合物包含有效剂量的通式如（I）所示的水溶性南蛇藤素衍生物和药学上可接受的载体或辅料。所述药用组合物制成的剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂或搽剂。

本发明的目的之三，在于本发明提供通式如（I）所示的水溶性南蛇藤素衍生物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，特别是在制备治疗结肠癌药物中的应用。

本发明如通式（I）所示的衍生物在中国专利CN101434635B的基础上制备得到，具体反应式为：

具体制备过程为：将中国专利CN101434635B制备的化合物1在搅拌下加至吡啶中，溶解后，加入酸酐，室温下搅拌1.5～5小时，45℃度水浴减压浓缩，加无水乙醇反复带除溶剂，蒸干后，加丙酮，超声数分钟，抽滤，滤饼加丙酮洗涤2-3次，抽干，干燥即得本发明的衍生物（I），也可经层析或重结晶纯化得到本发明的衍生物（I）。本发明制备的化合物（I）为白色或类白色粉末，流动性良好。

本发明的通式如（I）所示的水溶性南蛇藤素衍生物具有很好的水溶性和流动性，与药学上可接受的载体或辅料组成可以制成的剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂或搽剂，优选注射剂。

经细胞水平筛选显示：本发明如通式（I）所示的衍生物对多种肿瘤细胞，特别是H522、COLO205、HepG2和MDA-MB-468增殖有抑制作用；动物实验显示：对人结肠癌COLO205裸小鼠移植瘤有显著抑制作用；毒性试验显示：相比于相应羟基未酯化的化合物，毒性明显降低。

本发明的有益效果：

1、本发明如结构式（I）所示的衍生物具有良好的抗肿瘤活性，且其水溶性良好，易于制成注射剂剂型。

2、本发明如结构式（I）所示的衍生物的毒性大大降低，应用具有更高的安全性。

3、本发明将中国专利CN101434635B中的化合物1的两个羟基酯化后，得到如结构（I）所示的衍生物，大大改善了衍生物（I）的物理性状，具有很好的流动性，可更便利地应用。

附图说明

图1为本发明实施例7中化合物NST001A对裸鼠体重的影响结果。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。应当说明的是，所述实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

实施例1：化合物NST001A的制备。

取1g按照中国专利CN101434635B实施例2中的方法用南蛇藤素和亚硫酸氢钠制备得到的化合物A，于50ml茄形瓶中，加15ml吡啶溶解(磁力搅拌下)，加1ml乙酸酐，室温下搅拌3小时，45度水浴减压浓缩，反复加无水乙醇带除溶剂，蒸干。加丙酮，超声数分钟，抽滤，加丙酮洗涤2-3次，抽干，鼓风干燥，得化合物NST001A，白色粉末状固体，822mg。

分析结果：

化合物A和化合物NST001A的化学结构式如下：

化合物NST001A的核磁共振氢谱数据：

¹HNMR(DMSO,300M),δ7.01(1H,s,H-1)，5.84(1H,d,J=6.2Hz,H-7)，4.60(1H,d,J=6.2Hz,H-6)，2.29,2.25,2.23(each3H，eachs,CH₃CO-×2,23-CH₃),1.67(3H,s,25-CH₃),1.20(3H,s,26-CH₃)，1.09(3H,s,30-CH₃)，1.05(3H,s,28-CH₃)，0.61(3H,s,27-CH₃)。

实施例2：化合物NST001B的制备。

取100mg按照中国专利CN101434635B实施例2中的方法用南蛇藤素和亚硫酸氢钠制备得的化合物A（其结构式参见实施例1），加3ml吡啶溶解，搅拌下滴加120μl的丙酸酐，滴加完后室温搅拌2小时。45度水浴减压浓缩，反复用乙醇带干溶剂，加丙酮超声1～2min，抽滤，滤饼滴加丙酮洗涤2～3次，室温鼓风干燥，得化合物NST001B，类白色粉末，92mg。堆密度1.46克/毫升，流动性与NST001A近似。

分析结果：

化合物NST001B的分子结构式如下：

化合物NST001B的核磁共振氢谱数据：

¹HNMR(DMSO,300M),δ7.01(1H,s,H-1)，5.83(1H,d,J=6.2Hz,H-7)，4.60(1H,d,J=6.2Hz,H-6)，2.57～2.63,2.51～2.57(each2H,eachq,CH₃ CH₂ CO-×2),2.24(3H,s,23-CH₃),1.68(3H,s,25-CH₃),1.20(3H,s,26-CH₃)，1.16,1.09(each3H,eachs,CH₃ CH₂CO-×2)，1.05(6H,s,30-CH₃,28-CH₃)，0.64(3H,s,27-CH₃)。

实施例3：化合物NST001C1-K的制备。

取502mg南蛇藤素(Celastrol)用10ml乙醇溶解后，向其中加入5ml亚硫酸氢钾水溶液(含亚硫酸氢钾148mg)，搅拌下反应1小时，溶液变为近无色澄清的溶液。40℃下减压浓缩至干，得白色粉末。加无水乙醇使溶解，过滤，滤液40℃以下减压浓缩至干，用乙醇-水于0～4℃重结晶，析出白色结晶，减压过滤，得535mg化合物A-K，白色针状结晶。取500mg化合物A-K，于25ml茄形瓶中，加8ml吡啶溶解，加0.5ml丁酸酐，室温下搅拌2.5小时，45度水浴减压浓缩，反复加无水乙醇带除溶剂，蒸干。用乙醇-水混合溶剂溶解，过凝胶柱sephadex LH20纯化，得化合物NST001C1-K，487mg，为流动性好的类白色粉末状固体。堆密度1.53克/毫升，流动性与NST001A近似。

化合物A-K和化合物NST001C1-K的化学结构式如下：

实施例4：用相同的方法还可以制备如下的化合物：

实施例5：化合物NST001A与化合物A流动性比较

取适量化合物NST001A与化合物A均过80目筛，测定休止角和堆密度。

测定休止角：采用固定漏斗法，将漏斗固定在适宜高度（H）,粉末置漏斗中，自然流下成堆，直到圆锥体的尖端将要接触到漏斗的出口为止，然后测出圆锥底面的半径r，休止角：α=arctg（H/r）。结果见表1。

测定堆密度：精密称取样品2.0g，用5ml量筒量取体积，计算堆密度。结果见表1。

表1化合物NST001A和化合物A流动性比较结果

由表1中的结果知，化合物NST001A的流动性明显优于化合物A。

实施例6：化合物NST001A对四种肿瘤细胞的增殖抑制作用。

受试样品：化合物NST001A，化合物A

实验方法：体外培养人肿瘤细胞株H522、COLO205、HepG2和MDA-MB-468，细胞生长至对数生长期后，收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清，适量培养基悬浮，调整细胞浓度至3.5×104/ml。将细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔100μl，放置细胞培养箱（37℃，5％CO₂）中培养24h后，加入待测药物，阴性对照组加入终浓度为0.5%DMSO，各组均设3个复孔。培养箱中培养72h后，每孔加入5mg/ml的MTT20μl，于培养箱（37℃，5%CO₂）放置4h。每孔加入150μlDMSO，37℃摇床振荡5min，492nm/620nm测吸光度（OD）。运用PrismGraphpad统计软件计算IC50值，具体实验结果参见表2。

表2化合物NST001A和化合物A对四株肿瘤细胞增殖的影响

由表1的实验结果表明：化合物NST001A对四株肿瘤细胞的增殖均有显著的抑制作用，且作用均强于化合物A，尤其对肿瘤细胞COLO205的增殖抑制作用极显著，比化合物A对肿瘤细胞COLO205的增殖抑制活性提高了近8倍。

实施例7：化合物NST001B对肿瘤细胞COLO205增殖的影响。

受试样品：化合物NST001B

实验方法：体外培养人结肠癌细胞株COLO205，细胞生长至对数生长期后，收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清，适量培养基悬浮，调整细胞浓度至3.5×104/ml。将细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔100μl，放置细胞培养箱（37℃，5％CO₂）中培养24h后，加入待测药物，阴性对照组加入终浓度为0.5%DMSO，各组均设3个复孔。培养箱中培养72h后，每孔加入5mg/ml的MTT20μl，于培养箱（37℃，5%CO₂）放置4h。每孔加入150μlDMSO，于37℃摇床振荡5min，492nm/620nm测吸光度（OD）。运用PrismGraphpad统计软件计算IC50值，具体实验结果参见表3。

表3化合物NST001B对COLO205细胞增殖的影响

由表3的实验结果表明：化合物NST001B对肿瘤细胞COLO205的增殖有显著抑制作用。

实施例8：化合物NST001A对人结肠癌COLO205裸鼠体内移植瘤的抑制作用

受试样品：化合物NST001A

阳性对照药物：顺铂，齐鲁制药有限公司生产，批号：1070212DB。

阴性对照：氯化钠注射液，江苏四环生物股份有限公司生产，批号：1201032-2。

治疗组：NST001A低剂量组（给药剂量6mg/kg）、NST001A中剂量组（给药剂量12mg/kg）、NST001A高剂量组（给药剂量24mg/kg）

动物和移植瘤：BALB/c裸鼠，雌性，4-6周龄，体重16-17g。人结肠癌COLO205裸小鼠移植瘤，由COLO205细胞接种于裸小鼠皮下而建立。

给药方法：给药方案见表4，药物配制见表5。

表4动物分组和给药方案

表5药物配制表

实验步骤：在无菌条件下，取处于生长增殖期的COLO205细胞，消化后调整细胞到一定的浓度，接种于裸鼠皮下，每只接种体积为0.1mL。用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至约100-150mm³时选取荷瘤鼠36只，根据肿瘤大小随机分成5组。各组按设定实验方案给药，给药当天记为d1，阴性对照组给予等量溶媒，以后每周测量2次肿瘤长径和短径，同时称量小鼠体重。

评价方法：于首次给药当天开始观察、测量并记录相关指标，实验中用游标卡尺测量肿瘤尺寸以观察瘤块体积变化和生长速度。实验终点时处死荷瘤小鼠，并解剖分离瘤块称重。肿瘤体积（tumor volume，TV）的计算公式为：TV=1/2×a×b²，其中a、b分别表示肿瘤长径和短径。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积（relative tumor volume，RTV），计算公式为：RTV=TV_t/TV₀。其中TV₀为给药前测量的肿瘤体积，TV_t为给药后每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(%)，计算公式如下：T/C(%)=(T_RTV/C_RTV)×100%，T_RTV为治疗组RTV；C_RTV为阴性对照组RTV，T/C（%）≤40%，并经统计学处理P<0.05为有效。或者瘤重（tumorweight，TW）低于阴性对照组，并经统计学处理P<0.05为有效。肿瘤的抑制率IR(%)=(1-T_TW/C_TW)×100%，T_TW为治疗组TW；C_TW为阴性对照组TW。药理试验结果参见表5。

由表6的药效实验结果表明，化合物NST001A的3个治疗组的肿瘤明显小于阴性对照组，肿瘤抑制率分别为44.66%、31.82%和50.96%，说明化合物NST001A对肿瘤的生长具有明显抑制作用。

实施例9：化合物NST001A和A的动物体内安全性初步考察。

受试样品：化合物NST001A，化合物A

实验方法：雌性裸鼠，体重17-18克，分为四组：阴性对照组（每天注射等量生理盐水）、化合物A组（每天注射化合物A剂量为20mg/kg）、化合物NST001A低剂量组（每天注射化合物NST001A剂量为20mg/kg），化合物NST001A高剂量组(每天注射化合物NST001A剂量为40mg/kg)，每组3只裸鼠。化合物A和化合物NST001A用生理盐水溶解，每天配制后尾静脉给药，注射体积为0.1ml每10g体重，观察药物对裸鼠的影响。

实验结果：给药后，化合物A组裸鼠出现体重下降，尾巴注射部位先后出现红肿，断裂。化合物NST001A低剂量组动物平均体重下降1g，下降幅度明显低于化合物A，动物状态良好；化合物NST001A高剂量组动物体重下降较低剂量组明显，具体可参见图1，有一只动物在给药后出现呼吸急促等症状。化合物NST001A高、低剂量组动物尾静脉注射给药后，尾巴注射部位均没有出现红肿和断裂，动物给药7天后，处死，解剖大体观察动物的脏器，未发现明显的组织病变。结论：化合物NST001A在动物体内安全性显著高于化合物A。

Claims (5)

1.一类水溶性南蛇藤素衍生物，其化学结构式如（I）所示：

R为C2-C12酰基；

M为Na或K或NH₄或Ca。

2.一种药用组合物，该组合物包含有效剂量的权利要求1所述化学结构式如（I）所示的水溶性南蛇藤素衍生物和药学上可接受的载体或辅料。

3.根据权利要求2所述的药用组合物，其特征在于，所述药用组合物制成的剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂或搽剂。

4.如权利要求1所述的水溶性南蛇藤素衍生物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。

5.如权利要求1所述的水溶性南蛇藤素衍生物在制备治疗结肠癌药物中的应用。