CN100422189C - 塔斯品碱的制备方法以及在制备治疗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

一种塔斯品碱的制备方法以及在制备治疗肿瘤药物中的应用，塔斯品碱的制备方法包括步骤配置溶解液、溶解红毛七总碱、吸附分离、配置洗脱液、洗脱、减压浓缩、重结晶、检验步骤。塔斯品碱制备治疗肿瘤药物中的应用。塔斯品碱制备方法具有工艺步骤简单、产品纯度高等优点，可进行中间放大试验。塔斯品碱经体外试验和体内试验，试验结果表明塔斯品碱有抑制血管生成的作用，明显抑制血管内皮细胞增殖，抑制血管内皮细胞迁移，抑制主动脉环血管生成，并抑制鸡胚尿囊膜血管生成。通过体外及体内试验表明塔斯品碱抑制血管生成的多个过程，而显示明显的抑制血管生成的药理作用及治疗肿瘤的作用。

Description

塔斯品碱的制备方法以及在制备治疗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于一种药物化合物的制备方法技术领域，具体涉及到一种具有抑制血管生成、抗肿瘤作用的塔斯品碱的制备方法以及以该活性成分在制备治疗肿瘤药物中的应用。

背景技术

红毛七(Radix et Rhizoma Leonticis)为小檗科植物类叶牡丹Leonticerobustum(Maxim.)Diels.的根及根茎，产于秦岭和大巴山区，原苏联、日本也有分布，属于非药典收录天然药物，含木兰花碱、塔斯品碱、N-甲基金雀花碱、右旋羽扇豆碱等生物碱，已在宋立人，洪恂等主编的《现代中药学大辞典》(934-935页)和国家医药管理局中草药情报中心站编的《植物药有效成分手册》678-679，692-693，1055-1056页中公开。

塔斯品碱(1-[2-(Dimethylamino)ethyl]-3，8-dimethoxy[1]benzopyrano[5，4，3-cde][1]benzopyran-5，10-dione，Taspine)是一种阿朴菲类生物碱，含有两个内酯环结构，分子式为C₂₀H₁₉NO₆，分子量369.36，结构式如图1-1，熔点为372-374℃，已在J.Pham.Sci杂志1979年第68卷第1期124-125页公开。

塔斯品碱是从红毛七总碱中分离出来的一种化合物，其制备方法是使用硅胶为固定相，氯仿∶甲醇∶氨水的体积比(15∶1∶0.1)为流动相，按每体积100mL收集，减压浓缩，薄层硅胶板检测，合并55-76份，甲醇重结晶，得塔斯品碱纯品。该方法较复杂、繁琐，费时，不适合工业制备生产。

目前发现塔斯品碱的主要药理作用如下：

抑菌作用：塔斯品碱具有显著的抑菌作用，1∶1,000,000对结核杆菌(H27及Academia株)具有显著活性，对小鼠实验性结核病有治疗作用，已在宋立人，洪恂等主编的《现代中药学大辞典》935页中公开。

抗炎作用：Perdue GP等用角叉菜胶导致的大鼠足踝肿、棉球导致的肉芽肿、关节炎三个模型考察了塔斯品碱盐酸盐的抗炎活性，发现20mg/kg塔斯品碱盐酸盐抑制大鼠角叉菜胶足踝肿、棉球导致的肉芽肿和关节炎的作用与1mg/kg的消炎痛效力相当，且具有剂量依赖关系，口服半数有效浓度(ED50)为58mg/kg，效力是保泰松的3～4倍。且各治疗组的大鼠体重没有发现有明显差别，已在J.Pham.Sci杂志1979年第68卷第1期124-125页公开。

促进伤口愈合作用：Vaisberg AJ等研究了塔斯品碱促进伤口愈合的药理作用，并对其作用机理进行了研究。动物实验表明塔斯品碱具有促进伤口愈合的活性，并与剂量相关，半数有效浓度(ED₅₀)为0.375mg/kg，体外细胞实验表明塔斯品碱盐酸盐在浓度低于150ng/mL时对人的纤维母细胞无毒性，也不能促进细胞增殖，但它能够促进人纤维母细胞的迁移，这可能就是塔斯品碱促进伤口愈合的机理。治疗17个月后，未发现塔斯品碱盐酸盐有致癌作用，已在Proc Soc Exp Biol Med杂志1993年第203卷第1期18-25页中公开。

细胞毒性作用：塔斯品碱具有较强的细胞毒性，对口腔癌细胞(KB)细胞的半数抑制浓度为(IC₅₀)0.39μg/mL，对V-79细胞的半数抑制浓度为0.17μg/mL，已在Chem.Pharm.Bull.杂志1991年第39卷第4期1041-1042页中公开。

抗病毒作用：塔斯品碱还具有抑制RNA肿瘤病毒的作用，已在国家医药管理局中草药情报中心站编的《植物药有效成分手册》1055-1056页中公开。

肿瘤是人体细胞异常分化增殖的恶性疾病。肿瘤在表现其生长、转移等生物学行为时与其中的微血管增生有密切的关系。无论原发性或转移性肿瘤，其持续性生长都必须依赖于新生血管的形成。肿瘤的生长大致可分为两个时期：即血管前期，为无血管生长期，肿瘤增殖到大约直径2mm后，进人血管期，此期以肿瘤组织中毛细血管的进行性生长为标志。新生的毛细血管为迅速增长的肿瘤组织运送氧气和养料，并将代谢产物运走。此期肿瘤组织增殖迅速，这一理论在乳腺癌、宫颈癌等的发病过程中已得到明确的证实。肿瘤的转移及在转移部位的生长也依赖于新生血管的形成。原发肿瘤的生长和转移依赖于源自既存血管的新生血管的生长。肿瘤既可通过肿瘤血管从宿主获取营养和氧气，又可通过肿瘤血管源源不断地向宿主输送转移细胞，并在机体的其他部位继续生长和诱导血管形成，导致肿瘤转移。因此，肿瘤的血管系统已成为一个崭新的、有希望的抗肿瘤治疗靶点。

至今未发现塔斯品碱的有关抑制血管生成的作用以及在制备治疗肿瘤药物中的应用报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述塔斯品碱制备方法的缺点，提供一种塔斯品碱的制备方法。

本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种塔斯品碱在制备抗肿瘤药物中的应用。

解决上述技术问题所采用的技术方案是它包括下述步骤：

1、配制溶解液

按常规方法配制浓度为0.5％～2％的盐酸溶液，作为溶解液。

2、溶解红毛七总碱

塔斯品碱的制备原料为红毛七总碱，红毛七总碱的制备原料以及制备方法已在专利号为200410073122.X、发明名称为《一种红毛七总碱的制备工艺》的中国申请专利中公开。取红毛七总碱装入反应釜内，加入红毛七总碱重量10～12倍浓度为0.5％～2％的盐酸溶液，用搅拌机搅拌使其充分溶解，制成红毛七总碱溶液。

3、吸附分离

将步骤2制备的红毛七总碱溶液上红毛七总碱1倍重量的树脂柱，柱径与柱高比为1∶3，吸附流速为每小时1.0～1.2倍柱体积，在常温常压下进行吸附分离。

4、配制洗脱液

将氨水与甲醇按体积比为2∶98配制成洗脱液。

5、洗脱

将步骤4配制的洗脱液20倍柱体积以流速为每小时0.5～0.6倍柱体积洗脱，按每倍柱体积分别收集洗脱液。

6、减压浓缩

合并3～10倍柱体积洗脱液，45℃、0.08MPa减压浓缩至不含洗脱液，得分离物。

7、重结晶

先进行结晶，将步骤6制备的分离物放入容器内，加入分离物20倍量的甲醇，80℃加热溶解，趁热抽滤，室温静置24小时，再进行抽滤，得塔斯品碱粗品。按上述方法重结晶，置于干燥器中，110℃、烘1小时，得塔斯品碱纯品。

本发明塔斯品碱制备方法中所用优选的溶解液是浓度为1.0％～1.5％盐酸溶液。

本发明塔斯品碱制备方法中所用最佳的溶解液是浓度为1.0％的盐酸溶液。在溶解红毛七总碱的工艺步骤中，加入与红毛七总碱最佳重量比为10倍的浓度为1.0％的盐酸溶液，用搅拌机搅拌使其充分溶解，制成红毛七总碱溶液。在吸附工艺步骤中，最佳吸附流速为每小时1.2倍柱体积，在常温常压下进行吸附分离。

本发明塔斯品碱制备方法的吸附分离步骤中，所用的优选树脂柱为阳离子交换树脂柱。

本发明塔斯品碱制备方法的吸附分离步骤中，所用的最佳树脂柱为LSD001型阳离子交换树脂柱。

本发明的药物组合物含有治疗有效量的塔斯品碱为活性成份，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。

塔斯品碱在制备治疗肿瘤药物中的应用。

有效成分塔斯品碱制备治疗肿瘤的药物用常规药用制剂的形式来使用。所述的常规药用制剂含作为活性成分的塔斯品碱，该活性成分在制剂中与药学上可接受的载体如适宜于胃肠内给药的有机或无机的固体或液体赋形剂混合。该药用制剂可以是固体形式如片剂、颗粒剂、胶囊剂；也可以是液体形式如悬浮剂、糖浆剂、乳剂等。

上述制剂中可含有辅助物质、稳定剂、润湿剂、增溶剂和其它常用的添加剂，如乳糖、滑石粉、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、果胶、吐温-80、聚乙烯醇等。

上述制剂可按照各种制剂常规的制备工艺制成。

含有塔斯品碱治疗肿瘤的药物中塔斯品碱含有重量比为0.1％～99.5％的活性成分，优选含有重量比为0.5％～95％的活性成分。

本发明的活性成分塔斯品碱制成各种剂型的口服药物，成人口服，常用剂量一次25mg，1日3次，最大剂量的塔斯品碱含量应为每天75mg，饭后服用，儿童用药酌情减量。

本发明的适应症：肿瘤。

本发明塔斯品碱的制备方法与现有的制备方法相比，具有工艺步骤简单、产品纯度高等优点，可进行中间放大试验。

发明人采用本发明塔斯品碱制备方法制备的塔斯品碱进行了抑制血管生成的体外和体内试验。体外试验包括血管内皮细胞增殖试验、血管内皮细胞迁移试验和主动脉环血管生成试验，体内试验采用鸡胚尿囊膜血管生成试验。利用小鼠肉瘤S₁₈₀移植试验证实塔斯品碱治疗肿瘤的用途。试验结果表明塔斯品碱有抑制血管生成的作用，明显抑制血管内皮细胞增殖，抑制血管内皮细胞迁移，抑制主动脉环血管生成，并抑制鸡胚尿囊膜血管生成。通过体外及体内试验表明塔斯品碱抑制血管生成的多个过程，而显示明显的抑制血管生成的药理作用及治疗肿瘤的作用。

附图说明

图1是塔斯品碱抑制大鼠胸主动脉环血管生成曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1

以制备塔斯品碱的所用原料红毛七总碱100g为例其制备方法步骤如下：

1、配制溶解液

按常规方法配制浓度为1％的盐酸溶液1000g，作为溶解液。

2、溶解红毛七总碱

取红毛七总碱100g装入反应釜内，加入浓度为1％的盐酸溶液1000g，用搅拌机搅拌使其充分溶解，制成红毛七总碱溶液。

3、吸附分离

将步骤2制备的红毛七总碱溶液上100g的LSD001型阳离子交换树脂装柱，柱径与柱高比为1∶3，吸附流速为每小时1.2倍柱体积，在常温常压下进行吸附分离。

4、配制洗脱液

将氨水与甲醇按体积比为2∶98配制成洗脱液。

5、洗脱

将步骤4配制的洗脱液20倍柱体积以流速为每小时0.5～0.6倍柱体积洗脱，按每倍柱体积分别收集洗脱液。

6、减压浓缩

合并3～10倍柱体积洗脱液，45℃、0.08MPa减压浓缩至不含洗脱液，得分离物。

7、重结晶

先进行结晶，将步骤6制备的分离物放入容器内，加入分离物20倍量的甲醇，80℃加热溶解，趁热抽滤，室温静置24小时，再进行抽滤，得塔斯品碱粗品。按上述方法重结晶，置于干燥器中，110℃、烘1小时，得塔斯品碱纯品。

8、按塔斯品碱的质量标准进行检验，检验合格后包装入库。

实施例2

以制备塔斯品碱的所用原料红毛七总碱100g为例其制备方法步骤如下：

本实施例在配制溶解液工艺步骤中，按常规方法配制浓度为2％的盐酸溶液1000g，作为溶解液。在溶解红毛七总碱工艺步骤中，取红毛七总碱100g装入反应釜内，加入浓度为2％的盐酸溶液1000g，用搅拌机搅拌使其充分溶解，制成红毛七总碱溶液。在吸附分离工艺步骤中，吸附流速为每小时1.1倍柱体积，在常温常压下进行吸附分离。其他工艺步骤与实施例1相同。

实施例3

以制备塔斯品碱的所用原料红毛七总碱100g为例其制备方法步骤如下：

本实施例在配制溶解液工艺步骤中，按常规方法配制浓度为0.5％的盐酸溶液1200g，作为溶解液。在溶解红毛七总碱工艺步骤中，取红毛七总碱100g装入反应釜内，加入浓度为0.5％的盐酸溶液1200g，用搅拌机搅拌使其充分溶解，制成红毛七总碱溶液。在吸附分离工艺步骤中，吸附流速为每小时1.0倍柱体积，在常温常压下进行吸附分离。其他工艺步骤与实施例1相同。

实施例4

以制备塔斯品碱的所用原料红毛七总碱100g为例其制备方法步骤如下：

本实施例在配制溶解液工艺步骤中，按常规方法配制浓度为0.5％的盐酸溶液1000g，作为溶解液。在溶解红毛七总碱工艺步骤中，取红毛七总碱100g装入反应釜内，加入浓度为0.5％的盐酸溶液1000g，用搅拌机搅拌使其充分溶解，制成红毛七总碱溶液。在吸附分离工艺步骤中，吸附流速为每小时1.0倍柱体积，在常温常压下进行吸附分离。其他工艺步骤与实施例1相同。

实施例5

以制备塔斯品碱的所用原料红毛七总碱100g为例其制备方法步骤如下：

本实施例在配制溶解液工艺步骤中，按常规方法配制浓度为2％的盐酸溶液1200g，作为溶解液。在溶解红毛七总碱工艺步骤中，取红毛七总碱100g装入反应釜内，加入浓度为2％的盐酸溶液1200g，用搅拌机搅拌使其充分溶解，制成红毛七总碱溶液。在吸附分离工艺步骤中，吸附流速为每小时1.2倍柱体积，在常温常压下进行吸附分离。其他工艺步骤与实施例1相同。

实施例6

以制备塔斯品碱的所用原料红毛七总碱100g为例其制备方法步骤如下：

本实施例在配制溶解液工艺步骤中，按常规方法配制浓度为0.5％的盐酸溶液1200g，作为溶解液。在溶解红毛七总碱工艺步骤中，取红毛七总碱100g装入反应釜内，加入浓度为0.5％的盐酸溶液1200g，用搅拌机搅拌使其充分溶解，制成红毛七总碱溶液。在吸附分离工艺步骤中，吸附流速为每小时1.2倍柱体积，在常温常压下进行吸附分离。其他工艺步骤与实施例1相同。

实施例7

以制备塔斯品碱的所用原料红毛七总碱100g为例其制备方法步骤如下：

本实施例在配制溶解液工艺步骤中，按常规方法配制浓度为2％的盐酸溶液1000g，作为溶解液。在溶解红毛七总碱工艺步骤中，取红毛七总碱100g装入反应釜内，加入浓度为2％的盐酸溶液1000g，用搅拌机搅拌使其充分溶解，制成红毛七总碱溶液。在吸附分离工艺步骤中，吸附流速为每小时1.0倍柱体积，在常温常压下进行吸附分离。其他工艺步骤与实施例1相同。

实施例8

以制备塔斯品碱的所用原料红毛七总碱100g为例其制备方法步骤如下：

本实施例在配制溶解液工艺步骤中，按常规方法配制浓度为0.5％的盐酸溶液1000g，作为溶解液。在溶解红毛七总碱工艺步骤中，取红毛七总碱100g装入反应釜内，加入浓度为0.5％的盐酸溶液1000g，用搅拌机搅拌使其充分溶解，制成红毛七总碱溶液。在吸附分离工艺步骤中，吸附流速为每小时1.2倍柱体积，在常温常压下进行吸附分离。其他工艺步骤与实施例1相同。

实施例9

以制备塔斯品碱的所用原料红毛七总碱100g为例其制备方法步骤如下：

本实施例在配制溶解液工艺步骤中，按常规方法配制浓度为2％的盐酸溶液1200g，作为溶解液。在溶解红毛七总碱工艺步骤中，取红毛七总碱100g装入反应釜内，加入浓度为2％的盐酸溶液1200g，用搅拌机搅拌使其充分溶解，制成红毛七总碱溶液。在吸附分离工艺步骤中，吸附流速为每小时1.0倍柱体积，在常温常压下进行吸附分离。其他工艺步骤与实施例1相同。

实施例10

以制备含有活性成分塔斯品碱片剂1000片为例所用的原料和辅料及其配比如下：

塔斯品碱 25g

淀粉     300g

采用常规片剂的制备工艺制成，每片重0.3g，含塔斯品碱25mg。用法：成人一日3次，一次1片，一日最大剂量为75mg，饭后服用，儿童酌情减量。

实施例11

以制备含有活性成分塔斯品碱胶囊剂1000粒为例所用的原料和辅料及其配比如下：

塔斯品碱  25g

淀粉     加至300g

采用常规胶囊剂的制备工艺制成，每粒重3g，含塔斯品碱25mg。用法：成人1日3次，一次一粒，一日最大剂量为75mg，饭后服用，儿童酌情减量。

实施例12

以制备含有活性成分塔斯品碱口服液1000ml为例所用的原料和辅料及其配比如下：

塔斯品碱    25g

甜菊糖      50g

蒸镏水      加至1000ml

采用常规口服液的制备工艺制成，每支10ml，含塔斯品碱25mg。用法：成人一日3次，一次10ml，一日最大剂量为75mg，饭后服用，儿童酌情减量。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明而并非限制，尽管参照以上较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明进行修改、变形或等同替换，而不脱离本发明的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

为了确定本发明塔斯品碱最佳的工艺步骤，发明人进行了大量的实验室研究试验，各种试验情况如下：

实验仪器与设备：LC-10ATvp型色谱泵，SPD-10Avp紫外检测器，由日本岛津公司生产；ANASTAR色谱工作站，由中国奥泰科技有限公司生产；酶联免疫检测仪，由美国伯乐公司生产。

1、盐酸溶液的浓度以及用量对红毛七总碱溶解的影响

(1)盐酸的浓度对红毛七总碱溶解的影响

取红毛七总碱5g共5份，分别加入10倍量的0.1％、0.5％、1％、2％、4％盐酸溶液，20℃搅拌2小时，抽滤，沉淀经干燥后，称重。

实验结果见表1。

表1盐酸浓度对红毛七总碱溶解的影响结果表

实验结果表明，随着盐酸溶液浓度由0.1％增加到1％时，沉淀重量逐渐减少，盐酸溶液浓度由1％增加到4％时，沉淀重量逐渐增加，1％盐酸沉淀量最小为0.08g，能很好地溶解红毛七总碱，在本法明的工艺步骤中选择10倍量的1％盐酸溶液溶解红毛七总碱。

(2)1％盐酸溶液的用量对红毛七总碱溶解的影响

取红毛七总碱5g共5份，分别加入8、9、10、11、12倍量的1％盐酸溶液，20℃搅拌2小时，抽滤，沉淀经干燥后，称重。实验结果见表2。

表21％盐酸溶液用量对红毛七总碱溶解的影响结果表

结果表明，随着1％盐酸溶液用量增加，沉淀重量减少，10倍量1％盐酸溶液已能很好地溶解红毛七总碱，在本发明的工艺步骤中选择10倍量的1％盐酸溶液。

2、树脂对塔斯品碱吸附性能的影响

取LSD001型阳离子交换树脂、LSD113型阳离子交换树脂、XDA-1型树脂、D101型大孔吸附树脂各20g，各加入同一批的1％盐酸溶液600mL，25℃静态吸附24小时后，

采用岛津Shimadzu高效液相色谱仪，包括LC-10ATvp型色谱泵、SPD-10Avp紫外检测器，ANASTAR色谱工作站测定1％盐酸溶液中塔斯品碱含量。HPLC条件：色谱柱为Planetsil C18(150mm×4.6mm，5μm)；流动相为甲醇-20mmol/L NaH₂PO₄溶液-三乙胺，体积比为45∶55∶0.2，冰醋酸调pH值5.0；流速为1.0mL/min，检测波长为260nm，灵敏度为0.1AUFs。

试验结果见表3。

表3四种树脂静态吸附后酸水中塔斯品碱含量表

结果表明，四种树脂中LSD001阳离子交换树脂对塔斯品碱的吸附性能最好，而其它树脂对塔斯品碱的吸附性能较差。在本发明的工艺步骤中选择LSD001阳离子交换树脂对塔斯品碱进行分离制备。

3、上样流速对阳离子交换树脂柱吸附量的影响

用1％盐酸溶解红毛七总碱的红毛七总碱溶液上样于LSD001型阳离子交换树脂柱，树脂重80g，阳离子交换树脂柱体积100mL，阳离子交换树脂柱径与柱高比为1∶3，分别采用红毛七总碱溶液的不同流速上样，以改良碘化铋钾试剂检测流出液中生物碱，实验了上样流速对阳离子交换树脂柱吸附量的影响，

实验结果见表4。

表4上样流速对LSD001型阳离子交换树脂柱吸附量的影响结果表

结果表明：上样液流速与上样量呈负相关，流速越大，吸附量越小。考虑到1mL/min流速太小，耗时较长，而流速大于3mL/min时，吸附量又偏低，耗用阳离子交换树脂量大，在本发明的工艺步骤中采用2mL/min的流速上样，即上样流速为每小时1.2倍阳离子交换树脂柱体积。

4、洗脱液的选择

将已吸附样品的LSD001型阳离子交换树脂柱，树脂重80g，树脂柱体积100ml，柱径∶柱高为1∶3，分别用氨水与甲醇的体积比为0.5∶99.5、2∶98、10∶90洗脱液以流速为每小时0.5～0.6倍柱体积洗脱，按每倍柱体积等体积收集，采用岛津Shimadzu高效液相色谱仪，包括LC-10ATvp型色谱泵，SPD-10Avp紫外检测器，测定洗脱液中塔斯品碱含量；采用ANASTAR色谱工作站测定洗脱液中塔斯品碱含量。HPLC条件：色谱柱为Planetsil C18(150mm×4.6mm，5μm)；流动相为甲醇-20mmol/LNaH₂PO₄溶液-三乙胺，体积比为45∶55∶0.2，冰醋酸调pH值5.0；流速为1.0mL/min，检测波长为260nm，灵敏度为0.1AUFs。

测试结果见表5。

表5洗脱液中塔斯品碱的含量

结果表明，氨水与甲醇的体积比为0.5∶99.5洗脱液不能完全洗脱塔斯品碱，氨水与甲醇的体积比为2∶98、10∶90洗脱液洗脱曲线对称，均能较好地洗脱出塔斯品碱，考虑氨水与甲醇的体积比为10∶90洗脱液中氨水用量较大，造成浪费，所以确定洗脱液为氨水与甲醇的体积比2∶98。

5、塔斯品碱的纯度测试

发明人采用本发明方法实施例1制备的塔斯品碱高效液相色谱仪进行了纯度测试，纯度为99.85％。

6、塔斯品碱的结构鉴定

发明人采用本发明方法实施例1制备的塔斯品碱进行了结构鉴定，测定了分离化合物的熔点、紫外光谱、红外光谱、¹HNMR、¹³CNMR和MS。

结果表明，分离化合物的熔点为372-374℃，紫外光谱为UV(λ_max ^methanol)245(ε25800)，285(4200)，333(3100)，348(3800)。红外光谱为IR(KBr)v：3066，2941，2764，1730，1597，1472，1436，1288，1136，1092cm-1。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.21(d，J＝8.8Hz，1H)，7.31(d，J＝8.8Hz，1H)，7.20(s，1H)，4.10(s，6H)，3.53(t，J＝7.6Hz，2H)，2.68(t，J＝7.6Hz，2H)，2.41(s，6H)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ158.7，157.7，151.2，151.0，144.3，137.9，136.8，126.9，119.1，118.5，116.5，113.6，111.6，109.2，60.3，56.6，56.5，45.3，33.0。MS C₂₀H₂₀NO₆(M+H)370.1291。

以上结果与文献报道的塔斯品碱的熔点、紫外光谱、红外光谱、¹HNMR、¹³CNMR和MS完全相同。确定分离化合物为塔斯品碱。

为了验证本发明的有益效果，发明人采用本发明方法实施例1制备的塔斯品碱进行了药效试验，各种试验情况如下：

一、塔斯品碱抑制血管生成的体外试验

1、塔斯品碱对人脐静脉血管内皮细胞增殖抑制实验

取对数生长期的人脐静脉血管内皮细胞，用0.25％的胰酶消化3～5分钟，吹打成均匀的单个细胞悬液后，血球计数板计数，并稀释成浓度为2.5×10⁴个/mL的单细胞悬液，每孔200μL平行接种于96孔培养板，37℃、5％CO₂培养箱中湿化培养24小时，吸弃培养液，每孔200μL加入含系列浓度药物的培养基，分别是1.50μg/mL、1.00μg/mL、0.75μg/mL、0.50μg/mL、0.38μg/mL、0.25μg/mL、0.13μg/mL，每个药物浓度设5复孔，培养72小时后加入5mg/mL的噻唑蓝工作液8μL，混匀，37℃、5％CO₂培养箱孵育4小时，取出，小心吸弃培养液，每孔加入200μL二甲基亚砜，振荡10分钟，在波长为490nm处用酶联免疫检测仪测量各孔的光吸收值(OD值)，计算抑制率，绘制药物浓度-抑制率曲线，求出半数抑制浓度IC₅₀。试验结果见表6。

抑制率％＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％

表6塔斯品碱抑制血管内皮细胞增殖MTT试验结果

结果显示，塔斯品碱各浓度组的OD值显著低于空白对照组(p＜0.05)，抑制率有明显的剂量依赖关系，显示塔斯品碱明显抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖，半数抑制浓度(IC₅₀)在0.55～0.60μg/mL的范围内。

2、塔斯品碱对人脐静脉血管内皮细胞迁移作用实验

取对数生长期的人脐静脉血管内皮细胞，用0.25％的胰酶消化3～5分钟，吹打成均匀的单个细胞悬液后，血球计数板计数，并稀释成浓度为2.5×10⁴个/mL的单细胞悬液，每孔200μL平行接种于Transwell中，上层加入含塔斯品碱的培养基，终浓度为0.1μg/mL、0.5μg/mL、0.9μg/mL，每个药物浓度设5复孔，培养48小时后，倒置显微镜下每孔计10个视野的位于Transwell背面的细胞数，比较各浓度组与空白对照组血管内皮细胞迁移的数量。试验结果见表7。

表7塔斯品碱抑制人脐静脉血管内皮细胞迁移作用结果表

*与阴性对照组比较，经t检验，p＜0.05

结果显示，各浓度组迁移细胞数与对照组比较有显著差异(p＜0.05)，塔斯品碱对人脐静脉血管内皮细胞迁移抑制率与塔斯品碱的浓度有明显的剂量关系，表明塔斯品碱显著抑制人脐静脉血管内皮细胞的迁移。

3、大鼠胸主动脉环血管生成试验

腹腔注射过剂量戊巴比妥钠处死大鼠，切取主动脉，立即放入MCDB131无血清培养液中清洗，在解剖显微镜观察下，用眼科手术剪辑镊子小心的去除脉管外纤维性和脂肪性组织。切取1mm的动脉环，用MCDB131无血清培养液冲洗10次。将琼脂培养圈放入100mm大小的培养皿中，每皿3个，使之与平皿的底部贴紧。琼脂圈内加入正在凝结的纤维蛋白溶液4滴，使凝成纤维蛋白胶。在琼脂圈内加满正在凝结的纤维蛋白溶液，立即放入动脉环，使沉于底部正中部位。加入不同浓度塔斯品碱的MCDB131无血清培养液于培养皿中，各组浓度为0.10μg/mL、0.50μg/mL、0.90μg/mL、1.30μg/mL，每天观察新生血管数量，见图1。记录第7天的各浓度组的新生血管数量，与生理盐水阴性对照组比较。试验结果见表8。

表8塔斯品碱抑制大鼠胸主动脉环血管生成实验(第7天)表

*与阴性对照组比较，经t检验，p＜0.05

结果显示，塔斯品碱各浓度组的新生血管数量显著低于空白对照组，(p＜0.05)，有明显的剂量依赖关系，显示塔斯品碱明显抑制体外培养的大鼠胸主动脉环的血管新生。

二、塔斯品碱抑制血管生成的体内试验

鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验：取受精鸡蛋，经新洁尔灭液消毒后，置二氧化碳培养箱培养。孵蛋第6～7天，制备假气室，并暴露尿囊膜，置培养箱中培养1天后，以生理盐水为阴性对照，加入不同浓度的塔斯品碱，继续培养3天，然后由观察窗加入甲醇∶丙酮为1∶1的固定液预固定15分钟，去掉鸡胚，取下尿囊膜并与蛋皮分离，完成后固定，将尿囊膜平铺在载波片上，显微镜下观察计血管数。试验结果见表9。

表9鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验结果表

*与阴性对照组比较，经t检验，p＜0.05

结果显示，塔斯品碱各组微血管数与阴性对照组比较，有显著性差异(p＜0.05)，随着给药浓度的增加，微血管数减小，抑制率增大，表明塔斯品碱对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成有明显的抑制作用。

三、塔斯品碱抑制肿瘤作用试验

取接种6～8天的小鼠肉瘤S₁₈₀瘤源小鼠，颈椎脱臼致死，消毒后剪开并剥去皮肤，用无菌注射器穿过腹壁肌层抽取腹水，放入无菌小瓶。按1∶2～1∶4加入无菌生理盐水，将腹水加以稀释。接种时吸取肿瘤细胞稀释液于注射器，刺入小鼠腋下皮下组织，注入悬液0.2mL，接种24小时后将小鼠编号，并随机分为6组，每组12只。环磷酰胺组各鼠腹腔注射环磷酰胺25mg·kg^-1，塔斯品碱各组各鼠腹腔注射10mg/kg、1mg/kg、0.1mg/kg，每天1次，连续10天。阴性对照组各鼠以相同途径给予相应量的生理盐水。给药期间注意观察小鼠有无排稀便、拒食等现象。

疗程结束后之次日，将各组小鼠逐个称体重，拉断脊椎处死，分别排列于磁盘中。逐只剥取肿瘤，称记瘤重，并检查肿瘤有无坏死、感染等情况。如阴性对照组小鼠的平均瘤重大于1g，或80％以上小鼠的瘤重大于0.4g，表示该次实验肿瘤生长正常，可计算药物的肿瘤抑制率。

肿瘤抑制率(％)＝(C-T)/C×100％

式中C为阴性对照组平均瘤重，T为实验组平均瘤重。

试验结果见表10。

表10塔斯品碱抑制小鼠肉瘤S₁₈₀作用试验结果表

*与阴性对照组比较，经t检验，p＜0.05

结果显示，塔斯品碱各组的平均瘤重均小于阴性对照组，塔斯品碱大剂量组平均瘤重与阴性对照组比较，有显著性差异(p＜0.05)，随着给药浓度的增加，抑瘤率增大，表明塔斯品碱对小鼠肉瘤S₁₈₀有明显的治疗作用。

Claims (6)

1. 一种塔斯品碱的制备方法，其特征在于它包括下列步骤：

(1)配制溶解液

按常规方法配制浓度为0.5％～2％的盐酸溶液，作为溶解液；

(2)溶解红毛七总碱

取红毛七总碱装入反应釜内，加入红毛七总碱重量10～12倍浓度为0.5％～2％的盐酸溶液，用搅拌机搅拌使其充分溶解，制成红毛七总碱溶液；

(3)吸附分离

将步骤(2)制备的红毛七总碱溶液上红毛七总碱1倍重量的树脂柱，柱径与柱高比为1∶3，吸附流速为每小时1.0～1.2倍柱体积，在常温常压下进行吸附分离；

(4)配制洗脱液

将氨水与甲醇按体积比为2∶98配制成洗脱液；

(5)洗脱

将步骤(4)配制的洗脱液20倍柱体积以流速为每小时0.5～0.6倍柱体积洗脱，按每倍柱体积分别收集洗脱液；

(6)减压浓缩

合并3～10倍柱体积洗脱液，45℃、0.08MPa减压浓缩至不含洗脱液，得分离物；

(7)重结晶

先进行结晶，将步骤(6)制备的分离物放入容器内，加入分离物20倍量的甲醇，80℃加热溶解，趁热抽滤，室温静置24小时，再进行抽滤，得塔斯品碱粗品；按上述方法重结晶，置于干燥器中，110℃、烘1小时，得塔斯品碱纯品。

2. 按照权利要求1所述的塔斯品碱的制备方法，其特征在于：其中所用溶解液是浓度为1.0％～1.5％的盐酸溶液。

3. 按照权利要求1所述的塔斯品碱的制备方法，其特征在于：其中所用溶解液是浓度为1.0％的盐酸溶液，在溶解红毛七总碱的工艺步骤中，其中加入与红毛七总碱重量比为10倍浓度为1.0％的盐酸溶液，用搅拌机搅拌使其充分溶解，制成红毛七总碱溶液，在吸附工艺步骤中，其中吸附流速为每小时1.2倍柱体积，在常温常压下进行吸附分离。

4. 按照权利要求1所述的塔斯品碱的制备方法，其特征在于：所说的树脂柱为阳离子交换树脂柱。

5. 按照权利要求4所述的塔斯品碱的制备方法，其特征在于：所说的阳离子交换树脂柱为LSD001型阳离子交换树脂柱。

6. 含有塔斯品碱的组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

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