CN102603847A

CN102603847A - 人参皂苷Rh2脂肪酸酯类化合物制备方法及其医药用途

Info

Publication number: CN102603847A
Application number: CN2010105489711A
Authority: CN
Inventors: 郑毅男; 刘发贵; 张成中; 李伟
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2010-11-18
Filing date: 2010-11-18
Publication date: 2012-07-25

Abstract

本发明公开两种人参皂苷Rh₂脂肪酸酯类化合物。所制的化合物具有以下结构式，其中，R为C₄-C₂₂的脂肪酸酰基。同时提供了人参皂苷Rh₂脂肪酸酯类化合物的化学合成和酶催化合成方法，以该化合物为活性成分的药物组合物，以及本发明化合物和药物组合物在制备抗癌药物中的应用。

Description

人参皂苷Rh2脂肪酸酯类化合物制备方法及其医药用途

1技术领域

本发明涉及人参皂苷Rh₂脂肪酸酯类化合物，并公开了该化合物的分子结构、合成方法和以该化合物为活性成分的药物组合物，属于中药化学成分的半合成技术。

2背景技术

本发明所涉及制备的化合物为人参皂苷Rh₂的脂肪酸酯类物质，其先导化合物人参皂苷Rh₂是日本学者1983年首次在红参中分离得到，它属原人参二醇组皂苷，20位碳原子显手性。Rh₂同时是人参皂苷Rg₃脱一个配糖基的次级苷，是Rg₃体内的最主要代谢产物。Rg₃已被开发成中药一类抗癌新药参一胶囊成功上市，但药代动力学研究发现Rg₃的口服生物利用度小于3％，提示Rg₃有可能在体内生物转化成代谢物产生抗肿瘤药效。对Rh₂的药理研究发现它确实呈现出显著的抑制癌细胞的增殖和诱导凋亡的作用，甚至部分作用强于Rg₃，并且药代动力学研究发现Rh₂的口服生物利用度明显优于Rg₃，约为16％。因此，开发研究人参皂苷Rh₂成为一条合理的现代化中药新药开发思路。

人参皂苷口服后，二醇组皂苷经过肠道代谢后生成M1，M1经过血液循环进入肝脏，在肝脏中代谢为脂肪酸酯EM1，现代药理学研究表明，EM1在集体代谢后的主要抗肿瘤活性形式，肠内菌代谢产物可以直接发挥抗癌作用。人参皂苷Rh₂和人参皂苷M1是同分异构体，同时是人参皂苷Rg₃的主要代谢产物，我们推测人参皂苷Rh₂亦会经过肝脏代谢生成脂肪酸酯类物质，本研究小组经过研究发现人参皂苷Rh₂的脂肪酸酯类物质具有很强的抗肿瘤作用。

酶是一种高效生物催化剂，与化学催化剂相比，其催化反应条件十分温和、

反应过程简单，同时具有高度的立体选择性、区域选择性，因此酶被广泛地应用于生物、有机合成等多种领域。自从1984年美国Klibanov首次发现酶在有机溶剂中具有极高的热稳定性和较高的催化活性以来，酶的使用范围得到了拓宽-酶从水介质的应用拓展到非水介质中。近二十年，酶在非水介质中的催化研究取得了突破性的进展，使得传统酶学领域迅速生长出一个全新的分支-非水酶学。相对于常规的水介质而言，有机介质中，酶具有极高的热稳定性、酶可重复使用性、增大强极性底物的溶解性和减少副反应发生等显著优点，非水介质中的酶催化已用到有机合成、手性合成或拆分、药物改性、生物表面活性剂合成、聚合物制备等，得到工业上重要的产品。澳大利亚学者Teng R W利用固定化酶novozyme区域选择性乙酰化人参皂苷，研究发现人参皂苷Rh₂乙酰化主要发生在糖基的C’-6位上，然而其未进一步研究人参皂苷长链脂肪酸的酰化和对合成产物的药理活性报道。

本研究小组研究了人参皂苷Rh₂脂肪酸酯类化合物的两种合成方法即化学合成法和酶法催化合成。

经检索未见上述人工合成产物的文献报道。

3发明内容

本发明提供一种具有药用价值的人参皂苷Rh₂的脂肪酸酯类化合物。

本发明提供了人参皂苷Rh₂的化学合成方法和酶催化合成方法，适用于工业化生产，产量高，杂质少，底物反应完全。

本发明进一步提供了以该化合物为活性成分的药物组合物，用于抗癌研究。

本发明用人参皂苷Rh₂通过化学合成和酶法催化合成获取Rh₂脂肪酸衍生物，经过体内外相结合的药理活性筛选，对于肺癌，肝癌，胃癌，结肠癌，前列腺癌，胶质瘤，喉癌，食管癌等多种癌症有效。

采用本发明所制备得到的化合物具有以下结构式：

其中R为C₄-C₂₂脂肪酰基

上述的C₄-C₂₂脂肪酰基为天然存在的饱和或不饱和直链脂肪酸的酰基、及人工合成的饱和或不饱和直链脂肪酸的酰基。本发明制备的化合物为具有以上通式的R为C₄-C₂₂的化合物。

本发明的化合物可以用如下方法制备。

本发明的化学合成法制备：将人参皂苷Rh₂溶解在有机溶剂中并不停搅拌，缓慢向其中加入脂肪酰氯或脂肪酸酐，再滴加一定剂量的催化剂量的催化剂(对于价格昂贵的长链脂肪酸如DHA可以向反应体系中加入适量DCC)，反应12-24h，然后用饱和食盐水、水洗涤3-8次，减压回收溶剂得干物质，干物质用甲醇溶解，过滤，甲醇溶液减压回收得干物质。干物质经硅胶或C-18键合硅胶柱层析分离得目标化合物(R连接在母核的C-12位)，收率以人参皂苷Rh₂计为50％-70％。

化学合成法制备采用的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、吡啶，催化剂为三乙胺、吡啶、N，N-二甲基苯胺、N，N-二甲基吡啶、DCC、四甲基乙二胺、碳酸钾。反应条件为0-30℃搅拌。

本发明的酶法制备：将人参皂苷Rh₂和脂肪酸或脂肪酸酯在真空干燥器中干燥1-3周。反应溶剂用脱水试剂处理5-10d，脱水试剂事先在150-500℃ 下活化24-72h，用量大约1L液体中加100-500g。将人参皂苷Rh₂和脂肪酸或脂肪酸酯溶于反应溶剂中，加入一定量的酶，机械搅拌器搅拌。反应一定时间后，加入脱水试剂去除酯化反应生成的水；反应48-96h结束，滤去酶和脱水试剂，终止反应。真空蒸除溶剂，得干物质。干物质经硅胶或C-18键合硅胶柱层析分离得目标化合物(R连接在糖链的C’-6位)，收率以人参皂苷Rh₂计为30％-70％。

采用的溶剂为吡啶、丙酮、叔丁醇、叔戊醇、丁酮、二氧六环、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺中的一种或几种的组合也可以采用新型溶剂离子液体，反应条件为20-70℃。使用的酶为Candida Antarctica lipase B、Candida rugosa lipase、Candida Antarctica lipase A、Pseudomonas sp.Lipase。脱水试剂为3A分子筛、4A分子筛、5A分子筛。离子液体为[bmim]PF₆，[nmim]PF₆，[bmim]BF₄，[nmim]BF₄，[omim]BF₄，[4-mbp]BF₄，[bmim]NTf₂，[mmim]meSO₄，[emim]benzoate。

本发明的化合物可以用下列方法合成

化学合成方法1

化学合成方法2

本发明的制备方法以人参皂苷Rh₂计算，收率在30％-70％。

经过药理学实验筛选，上述化合物具有抗癌生理活性。

本发明的药物组合物以上述化合物为主要活性成分，以及含有一种或多种药学上可以接受的载体。

本发明的化合物和组合物可用于治疗和预防癌症。

上述所述的药学上可接受的载体为常规的药物载体，包括稀释剂、赋形剂、填充剂、黏合剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、甜味剂等。

本发明化合物可以以组合物的形式通过口服、直肠、静脉、肌肉和胃肠外给药方式施用与癌症治疗的患者。也可以制备成片剂、冲剂、胶囊、栓剂、喷雾剂和注射剂；优选与直接作用在病灶部位的高效剂型。

本发明的药物组合物位5％-99.5％的活性成分Rh₂脂肪酸衍生物。优选为 8％-85％的活性成分。最优为本发明90％的活性成分。

本发明的施药量可根据给药途径，患者年龄、体重、疾病和患病程度等变化，日剂量为0.2-10mg/Kg。

附图说明

图1：实施例4样品HPLC图谱；

图2：实施例4中C-Rh₂标准品HPLC图谱；

图3：化合物C-Rh₂的体外抗HepaG2人源肿瘤细胞活性作用。

4具体实施例

4.1.实施例1

a)人参皂苷次级苷Rh₂，将人参二醇组皂苷、NaOH溶于丙三醇中，在220℃水解40min，反应完毕加入冷水，过滤干燥，得人参皂苷Rh₂粗品，粗品经常规硅胶柱层析和重结晶相结合的方法纯化样品，得到纯品。

b)取Rh₂ 5g溶于100mL三氯甲烷中，备用。量取辛酰氯4.1g，三乙胺4.5g，置于100mL三氯甲烷溶液中，反应15-30min，后缓慢滴加Rh₂的三氯甲烷溶液。反应12-48h；然后用水、饱和食盐水洗涤4次，减压回收三氯甲烷，得到干物质。

c)干物质用甲醇溶解，过滤，硅胶柱层析，氯仿-甲醇(30∶1-10∶1)洗脱，薄层色谱检测合并目标产物，减压回收得干物质3.05g。即人参皂苷次级苷脂肪酸酯衍生物C-Rh₂，其中脂肪酰基为C₈的脂肪酰基(脂肪酰基连接在母核的C-12位)。

上述化合物经光谱分析，分别具有如下理化特性：

C-Rh2为白色无定型粉末，易溶于甲醇，氯仿等低极性试剂。Liebermann-Burchard反应呈阳性，Molish反应呈阳性。

TOF-MS谱中，m/z[M+Na]⁺为771，其分子量为748。它的碳谱数据归属见下表

(¹³C-NMR溶剂C₅D₅N)

4.2.实施例2

a)人参皂苷次级苷Rh₂，常规硅胶柱层析和重结晶相结合的方法纯化样品，得到纯品。

b)取Rh₂ 5g溶于100mL三氯甲烷中，备用。量取辛酰氯4.1g，三乙胺4.5g，置于100mL三氯甲烷溶液中，反应15-30min，后缓慢滴加Rh₂的三氯甲烷溶液。反应12-48h，减压回收三氯甲烷，得到干物质。

c)干物质用甲醇溶解，过滤，ODS柱层析，甲醇和水(80％-100％)洗脱，薄层色谱检测合并目标产物，减压回收得干物质3.27g。即人参皂苷次级苷脂肪酸酯衍生物，其中脂肪酰基为C₈的脂肪酰基(脂肪酰基连接在母核的C-12位)。

4.3.实施例3

b)取Rh₂ 3.0g溶于100mL三氯甲烷中，备用。量取脂肪酰氯3.2g，碳酸钾3.5g，置于100mL三氯甲烷溶液中，混悬15min，后缓慢滴加Rh₂的三氯甲烷溶液。反应12-24h，减压回收三氯甲烷，得到干物质。

c)同实例(2)中的c)。

4.4.实施例4

b)精密称取人参皂苷Rh₂ 50.0mg，用实例1中的方法合成C-Rh₂，得到的干物质用50ml色谱甲醇定容于50ml容量瓶中，0.23μm滤膜过滤样品，HPLC分析备用。

c)精密称取10.0mg C-Rh₂标准品(实验室自制，HPLC检测纯度＞95％)，用色谱甲醇定容于10ml容量瓶中得到1.0mg/ml的标准品，稀释上述标准品依次得到0.75mg/ml，0.5mg/ml，0.1mg/ml，0.05mg/ml，0.01mg/ml标准品溶液，0.23μm滤膜过滤，HPLC分析备用。

d)HPLC分析。条件：流动相为0.5ml/min色谱乙腈等度洗脱60min，检测波长203nm，柱温30℃，色谱柱为Hypersil ODS2(4.6mm×150mm)大连依利特色谱柱，液相色谱分析仪为岛津LC-20A。

e)依次进样各浓度标准溶液20μl，绘制标准曲线，样品进样20μl，重复3次。根据峰面积计算得Rh₂转化率为53.8％。样品HPLC谱图见图-1，标准品HPLC色谱图见图-2

4.5.实施例5

b)辛酸乙烯酯和人参皂苷Rh₂在真空干燥器中干燥1周。叔丁醇用4A分子筛处理5d，4A分子筛事先在150℃下活化24h，用量大约1L液体中加100g。

取2.0g人参皂苷Rh₂和8.0g辛酸乙烯酯溶于叔戊醇中。于60℃加入一定量(4mg/mL)的脂肪酶Novozyme 435(Candida Antarctica lipase B)，机械搅拌器搅拌。反应一定时间后，按1L液体中加100g的用量加入4A分子筛(事先在150℃下活化24h)去除酯化反应生成的水；反应96h结束，滤去酶和分子筛，终止反应。真空蒸除溶剂，得干物质。

c)干物质用甲醇溶解，过滤，ODS柱层析，甲醇和水(80％-100％)洗脱，薄层色谱检测合并目标产物，减压回收得干物质1.16g。即人参皂苷次级苷脂肪酸酯衍生物C’-Rh₂，其中脂肪酰基为C₈的脂肪酰基(脂肪酰基连接在糖链的C’-6位)。

C’-Rh2为白色无定型粉末，易溶于甲醇，氯仿等低极性试剂。Liebermann-Burchard反应呈阳性，Molish反应呈阳性。

(¹³C-NMR溶剂C₅D₅N)

4.6.实验例6化合物C-Rh₂的体内抗癌(H₂₂肝癌)作用

4.6.1实验材料与方法

实验动物：昆明小鼠，雌雄各半，体重18-22g，选取小鼠70只，随机分为7组，12小时明暗循环，随时供应食物和水。

分组情况如下：

方法：取接种7d的鼠腹水癌细胞，用生理盐水制成细胞个数为1×10⁶/ml的细胞悬液，以每鼠0.1ml接种于小鼠右腋皮下肿瘤细胞移植以后，小鼠被随机分成不同的组，每组10只。对照组只给生理盐水。所用的药物采用生理盐水和吐温-80溶解。阳性，阴性组和受试药组为灌胃给药，给药体积为0.2ml/10g。所有的小鼠饲养在温度是22-24℃控制的室内，全天喂粮食和水。第15天称重后处死小鼠，摘取瘤块、胸腺和脾脏，分别称重。

4.6.2数据统计处理

肿瘤抑制率＝(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％。胸腺指数为每g体重胸腺的mg数，脾指数为每g体重中脾脏的mg数，所有的数据均进行均值和方差处理，参数值用均值±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用了Dunnett’s Multiple Comparison test检验，p＜0.05为有显著性差异。抑瘤组间比较：显著性差异^*p＜0.05，^**p＜0.01；免疫组间比较：与正常组比较，显著性差异^Δ＜0.05，^ΔΔP＜0.01；与阴性组比较，显著差异^□p＜0.05，^□□p＜0.01。

4.6.3实验结果

4.6.3.1对小鼠H22荷瘤的抑制作用

注：与对照组(阴性)相比，“^**”P≤0.01，“^*”P≤0.05

从统计结果中我们可以看出，于阴性对照组相比，阳性组(CTX)与其具有极显著性差异(p＜0.01)，受试药中Rh₂低剂量，C-Rh₂高剂量，C-Rh₂低剂量都具有极显著性差异(p＜0.01)。

4.6.3.2对小鼠免疫指数的统计

注：与正常组相比，“^ΔΔ”P≤0.01，“^Δ”P≤0.05

本实验对各组小鼠的脾脏重量进行了测定。脾脏是重要的免疫器官，在给予各组受试药后，对免疫器官进行了考究，目的在于探讨受试药是否通过免疫系统起到抗肿瘤作用。实验结果表明各组的脾指数没有显著性差异，推测本实验可能对脾脏的影响较小。胸腺是中枢免疫器官，是T淋巴细胞的分化成熟产所，在免疫系统中亦起重要作用。本实验考察了各组的胸腺重量，与正常组相比较，阴性组和阳性组具有显著性差异(p＜0.01)，受试药组均没有表现出显著性差异，表明受试药对胸腺基本没有影响，而阴性和阳性均表现出胸腺明显减小，表明其对免疫系统的功能有负向作用。

4.6.4实验讨论

伴随着肿瘤的增长，机体内的免疫组织会产生应答，然而肿瘤细胞产生的某些活性因子能够抑制多种免疫功能。阴性组结果表明H22荷瘤对机体的免疫功能有较大影响。H22荷瘤小鼠的胸腺和脾脏指数明显降低。同时本实验结果表明，阳性组虽然抑瘤率高达62.5％，但是与正常小鼠组相比却明显降低了胸腺和脾脏指数，表明环磷酰胺在杀死肿瘤细胞的同时，对正常细胞亦有较强的毒性，是整个机体的免疫功能下降，为肿瘤后期的治疗造成了不利影响。受试药组对H22荷瘤小鼠的胸腺和脾脏指数均没有显著影响。

4.7实验例7化合物C-Rh₂体外抗HepaG2人源肿瘤细胞作用

4.7.1实验材料和方法

实验材料：细胞株：HepaG2人源肿瘤细胞为吉林大学白求恩医学院药理研究室保存传代细胞株。合成产品C-Rh₂。

方法：

1.复苏HepaG2细胞，在含10％胎牛血清的1640培养基培养24h，再经无血清1640培养基培养24h。

2.选取上述处理的HepaG2细胞(处于对数生长期)，接种在96孔培养板中，实验组换新的含不同浓度被测样品的培养基，对照组则换含等体积溶剂的培养基，每组设3个平行孔，另设药液对照孔，在37℃的5％CO₂孵箱中培养24h；弃去上清液，每孔加入100μl无血清的培养基和10μl 5mg/mL的MTT，在37℃的5％CO₂孵箱中培养4h，小心弃上清，并加入100μl DMSO溶解MTT甲瓒沉淀，用微型振荡器混匀后，在酶标仪上经波长为540nm测定光密度值A。

肿瘤细胞生长的抑制率(％)＝(1-A样品/A对照)×100％。

4.7.2数据统计

按此公式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：肿瘤细胞生长的抑制率％＝(1-实验组光密度值/对照组光密度值)×100％。同一样品的不同浓度对肿瘤细胞生长的抑制率作图可得到剂量反应曲线，从中可以求出样品的半数杀伤度IC₅₀。

4.7.3实验结果

C-Rh₂的体外抗肿瘤活性测定结果见表7-1，剂量反应曲线见图-3。C-Rh₂在40μL浓度下，抑制率达75.60％，IC₅₀为18.10μM。

表7-1化合物C-Rh₂的体外抗HepaG2人源肿瘤细胞活性作用

4.8实施例8

抗癌片剂的制备：取实施例1制备的化合物10g，加入赋形剂药用环糊精30g，混合均匀，造粒压片，制的片剂，每片含C-Rh₂ 10mg。

4.9实施例9

抗癌胶囊的制备：取实例1制备的化合物10g，加入赋形剂药用环糊精10g，混合均匀，造粒，装入胶囊，每粒含C-Rh₂ 10mg。

4.10实施例10

抗癌注射剂的制备：取实例1制备的化合物10g，加入药用丙二醇，注射用水800ml，溶解，膜过滤(0.2μm)，分装，每瓶2ml，含C-Rh₂ 20mg。所有操作均应在无菌条件下进行。

以上实施例可以更详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

Claims

1.具有药用价值的人参皂苷Rh₂脂肪酸酯衍生物具有以下结构。

2.根据权利要求1所述的人参皂苷Rh₂脂肪酸酯，其特征在于：R为C4-C22脂肪酰基为天然存在的饱和或不饱和直链脂肪酸的酰基、及人工合成的饱和或不饱和直链脂肪酸的酰基。

3.根据权利要求1所述的人参皂苷Rh₂脂肪酸酯衍生物化学合成法制备，其特征在于：取酰氯或酸酐和人参皂苷Rh₂在有机溶媒中进行反应而得，有机溶剂是二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、吡啶一种或其中的组合物，反应温度为0-30℃。

4.根据权利要求1所述的人参皂苷Rh₂脂肪酸衍生物酶法合成制备，其特征在于：取脂肪酸或脂肪酸酯合人参皂苷Rh₂在有机溶媒中以生物酶为催化剂，加入脱水剂反应而得，反应温度为20-70℃。

5.根据权利要求3所述的人参皂苷Rh₂脂肪酸酯衍生物化学合成法制备，其特征在于：酯化反应在催化剂的存在下进行，催化剂为三乙胺、吡啶、N，N-二甲基苯胺、N，N-二甲基吡啶、DCC、四甲基乙二胺、碳酸钾。

6.根据权利要求3所述的人参皂苷Rh₂脂肪酸酯衍生物化学合成法制备，其特征在于：取人参皂苷Rh₂一重量份于锥形瓶中，加入0.4-4倍重量份的C4-22脂肪酸酰氯或酸酐用30-100倍重量份的有机溶剂超声溶解后，加入0.5-5倍重量份催化剂，于0-30℃下反应0.5-48h，减压回收溶剂至干，干物质用柱层析分离纯化，得到的目标化合物用甲醇或甲醇-氯仿重结晶。

7.根据权利要求4所述的人参皂苷Rh₂脂肪酸酯衍生物酶法制备，其特征在于：取脂肪酸或脂肪酸酯与人参皂苷Rh₂和生物酶在有机溶媒中进行反应而得。

8.根据权利要求7所述的人参皂苷Rh₂脂肪酸酯衍生物酶法制备，其特征在于：反应溶媒包括吡啶、丙酮、叔丁醇、叔戊醇、丁酮、二氧六环、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺中的一种或几种的组合也可以采用新型溶剂离子液体。所使用的生物酶包括：Candida Antarctica lipase B、Candida rugosa lipase、Candida Antarcticalipase A、Pseudomonas sp.Lipase。所使用的脱水剂包括：3A分子筛、4A分子筛、5A分子筛。所使用的离子液体包括：[bmim]PF₆，[nmim]PF₆，[bmim]BF₄，[nmim]BF₄，[omim]BF₄，[4-mbp]BF₄，[bmim]NTf₂，[mmim]meSO₄，[emim]benzoate。

9.一种药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1的化合物和药学上可接受的赋形剂。

10.权利要求1的化合物在制备治疗肿瘤的辅助治疗药物中的用途，肿瘤包括肺癌，肝癌，胃癌，结肠癌，前列腺癌，胶质瘤，喉癌，食管癌。