CN104825479A - 淫羊藿次苷类化合物、其制备方法,及其在促进人细胞产生γ-干扰素作用和在疾病治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

一种如式I所示的淫羊藿次苷类化合物(icariside derivatives)，为中药淫羊藿的天然化学成分，或基于这些天然产物的化学修饰产物或全合成产物。它们具有促进人体细胞产生γ-干扰素(interferon-gamma，IFN-γ，一种具有抵抗疾病功能的细胞因子)的功能，能够显著提高人体的免疫力。实验显示淫羊藿次苷类化合物在防治包括肺结核、流感、乙肝和丙肝等感染性疾病，及肿瘤的免疫治疗方面具有重要应用前景；也可用于制备与提高人体免疫力相关的保健药品、饮品、美容护肤品等。淫羊藿次苷属于传统中药的有效成分及其结构修饰产物，毒副作用小，使用安全。式I淫羊藿次苷类化合物(Icariside derivatives)。

Description

淫羊藿次苷类化合物、其制备方法,及其在促进人细胞产生γ-干扰素作用和在疾病治疗中的应用
技术领域
本发明涉及一种淫羊藿次苷类化合物及其制备方法，该类化合物在促进人体细胞产生γ-干扰素，显著提高人体免疫力的作用；以及基于此原理所涉及的在疾病治疗、保健品、美容护肤品等方面的应用。
背景技术
人体的免疫力是指机体抵抗寄主细胞外或寄主细胞内致病因子感染或入侵的抵御能力，即维护人体内正常和稳定环境的能力。人类生存环境中，如空气、水、食物、及人类生活所接触物品等，都含有各种各样有害健康的微生物，如细菌、病毒、支原体、衣原体、真菌等病原体(寄主细胞外致病因子)。人体内也可能受环境变化影响，出现病毒或细菌在寄主细胞内的潜伏，或基因变异所产生的癌细胞等(寄主细胞内致病因子)的感染或入侵。当这些致病因子感染或侵入机体时，在正常情况下，人体将通过自身的免疫系统产生相应的抗体或各种细胞因子(如干扰素等)，将感染或侵入的致病因子吞噬和消灭。当人体的免疫体系所产生的免疫力(抗体或细胞因子等)不足以对抗致病因子的进攻时，人就会生病。
提高人体自身免疫力，对于保持身体健康，防止或减少疾病的发生具有重要意义。通过药物增强人体免疫力是预防和治疗感染性疾病及癌症等的有效方法，即免疫治疗。发现和发展增强人体免疫力的有效药物对于自身免疫力低下，特别是对患有自身免疫性疾病的人群尤为重要。
从总体上看，能够用于免疫治疗的药物很少。目前，临床上使用的增强人体免疫力药物，主要是大分子的肽类或蛋白类药物，如胸腺肽、免疫球蛋白、干扰素等，这些药物都有特定的适应症，有很大的局限性,并且易降解、半衰期较短、生物利用度差、大规模合成与分离纯化难度大。
国内外以天然产物为基础发展的提高人体免疫力的制剂，基本上属于保健品范畴，实际效果很难保证。迄今为止，寻找具有良好增强免疫效果的小分子化合物的尝试均告失败。尚无小分子化合物用于免疫治疗的报道。
淫羊藿是一味传统中药材，现有技术中对其使用均为在中医理论指导下使用淫羊藿植株煎汤、浸酒、熬膏，制丸散等。对于其中有效成分的分离并系统研究较少，特别是其中的淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷C，由于其含量极低(它的同系物-淫羊藿苷含量较高)，难以进行有效的研究，产业化应用更无从谈起。
发明内容
本发明人长期致力于中药有效成分在免疫治疗方面的研究。本发明人建立了基于检测人外周血单个核细胞(PBMCs)产生γ-干扰素水平的免疫学试验模型。应用这个模型，可以从包括传统中药、药用植物等在内的多种来源的化学成分中，筛选出具有促进(或抑制)人外周血单个核细胞(PBMCs)产生γ-干扰素水平的化合物。由于人γ-干扰素是人体的一种重要的抵抗疾病的免疫蛋白(细胞因子)，它的产生水平，与人体的免疫力直接相关。因此，该模型是筛选和发现具有提高人体免疫力功能药物的理想技术。
在筛选过程中，本发明人非常惊讶地发现，淫羊藿中含量极低的两种成分——淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷C，显示出了能够显著促进人外周血单个核细胞(PBMCs)产生γ-干扰素水平的作用。而淫羊藿所含的其它天然化学成分，几乎没有任何相关的活性。这个研究结果表明，淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷C能够直接促进人体细胞产生重要的免疫蛋白——γ-干扰素，表明该类化合物在提高人体免疫力方面具有重要应用前景。
在上述重大发现的基础上，本发明人以天然化合物，如淫羊藿苷、淫羊藿新苷A、淫羊藿次苷I或淫羊藿次苷C为基本原料，通过化学转化方法(半合成)得到其它的淫羊藿次苷类化合物，部分淫羊藿次苷类化合物也可以通过全合成方法获得。经筛选模型检验证明，这些物质也具备类似淫羊藿次苷I或淫羊藿次苷C的活性。
因此，本发明的第一个目的，是提供一种淫羊藿次苷类化合物(如式I所示)。
淫羊藿次苷类化合物
(Icariside derivatives)
式I中的R1,R2和R3所代表的基团如下面各项所定义：
(1)R1为H，OH,OCH3,CH3COO,CH3,CF3，NH2,CH3NH,CH3CONH,CN,Br,Cl,F等。
(2)R2为H,OH,OCH3,CH3COO,NH2,CH3NH,(CH3)2N,CH3CONH,CN等。
(3)R3选自H，OH,OCH3,CH3COO,CH3,CF3,以及，C1-C6-NH2(其中C1-C6为具有1-6个C的烷基、环烷基、烯烃基、环烯烃基，尤其是环戊基氨基、环己基氨基；以及吗啡啉基，甲基哌嗪基)，NH2,CH3NH,(CH3)2N,(CH3CH2)2N，CH3CONH,CN,Br,Cl,F，氨基酸酰基，氨基酸酰氨基(R’-CH-CONH-)，寡肽酰基，寡肽酰氨基等。
本发明通过分离纯化方法，从淫羊藿提取物中得到了淫羊藿次苷I(即R1＝OH,R2＝OH，且R3＝OCH3)和淫羊藿次苷C(即R1＝OH,R2＝OH，且R3＝OH)[传统中药淫羊藿中，淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷C的含量很低，而它的同系物-淫羊藿苷(式I中，R1＝OH,R2＝鼠李糖苷Rha,R3＝OCH3)，和淫羊藿新苷A(式I中，R1＝OH,R2＝鼠李糖苷Rha,R3＝OH)的含量比较高]。
因此，本发明第二个目的在于，通过例如酶转化技术，将淫羊藿中含量丰富的成分淫羊藿苷转化成淫羊藿次苷I，将淫羊藿新苷A转化成淫羊藿次苷C。
本发明再一个目的在于，提供以淫羊藿苷、淫羊藿新苷A及淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷C等天然产物衍生化得到式I所示的淫羊藿次苷类化合物的方法。
由于人γ-干扰素是人体内一种重要的抗疾病免疫蛋白(细胞因子)，可以抑制病毒的复制，也能够有效抵抗其他的致病性物质，如细菌、癌细胞等的侵入和感染。我们进一步通过淫羊藿次苷类化合物(单独或与抗原共同作用)促进抗结核感染细胞因子产生试验，小鼠体内抑制肿瘤生长试验和裸鼠异体移植瘤试验等，证明了淫羊藿次苷类化合物能够显著提高人体的免疫力，有效提高人体对致病因子(寄主细胞外和寄主细胞内)感染或入侵的抵御能力。可用于预防和治疗包括流感、乙肝、丙肝和肺结核等感染性疾病及肿瘤的发展和转移过程等，显示了该类化合物具有发展成为新型的细胞免疫治疗药物前景。也可用于制备与提高人体免疫保健功能相关的保健药品、饮品、美容护肤品等方面。
因此，本发明的又一个目的在于提供以式I淫羊藿次苷类化合物，包括淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷C等为主要成分的用于预防和治疗与人免疫力低下有关疾病的药物或保健品、食品和美容护肤品等。其含有的主要有效成分为1种淫羊藿次苷类化合物，如淫羊藿次苷I或淫羊藿次苷C，或同时含有2种以上淫羊藿次苷类化合物，包括淫羊藿次苷I或淫羊藿次苷C等，以及药学或保健品、食品和美容护肤品中可接受的辅助剂等。可以制备成包括片剂、丸剂、胶囊、注射剂、悬浮剂、乳剂、外用涂抹剂、面膜等制剂形式使用。
本发明通过毒理学研究证明，淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷C的毒副作用小(DC50>2g/kg体重)，使用安全。
另外，本发明的一切成果都基于本发明人建立了非常有效的筛选模型，因此本发明的再一个目的在于，提供一种筛选具有影响(增强或抑制)免疫效果物质的实验模型。该模型系应用外源抗原刺激人外周血单个核细胞(PBMCs)，产生细胞因子IFN-γ，通过将待测药物加入到外源抗原与人外周血单个核细胞(PBMCs)的混合体系中，测定对IFN-γ产生水平的影响，以筛选具有提高人体免疫力或抑制人体免疫力的小分子化合物。具体地，该方法是采集正常人的新鲜血液，分离制备人的外周血单个核细胞(PBMCs)。应用外源抗原，如单克隆刺激分子Anti-CD3，Anti-CD3/Anti-CD28，不同人的外周血单个核细胞，或被其它致病因子(如病毒、病菌、癌细胞等)感染刺激的人体细胞等进行刺激。经过上述刺激后的人外周血单个核细胞将产生新的细胞因子IFN-γ。然后再加入不同浓度梯度的待测药物(待筛选化合物)并充分混匀。把经过刺激完毕的PBMCs种植培养于96孔的微型圆底培养板，在37℃和5％CO2的培养箱中培养。最后应用ELISA方法，分别测定不同时间点的培养液中IFN-γ产生的水平。IFN-γ产生的水平升高，说明受测化合物具有提高免疫力作用。如果IFN-γ产生的水平降低，说明受测化合物具有抑制人免疫力作用。因此，本方法也可用于筛选具有抑制人免疫力-即免疫抑制剂的小分子化合物。
附图简述
图1表示实施例1中：由淫羊藿苷通过酶法转化制备淫羊藿次苷I的反应
图2表示实施例2中：由淫羊藿新苷A通过酶法转化制备淫羊藿次苷C的反应
图3表示实施例3中：由淫羊藿苷通过化学法和酶法转化制备淫羊藿次苷类化合物(Y-5XS-1)的反应
图4是表示实施例4中：由淫羊藿次苷I通过化学法转化制备淫羊藿次苷类化合物(Y-3XS-1)的反应
图5表示实施例6中：药物淫羊藿次苷I(PBMCs经抗CD3处理)刺激并促进IFN-γ的产生及促进百分率。
图6表示实施例6中：药物淫羊藿次苷I(经抗CD3和抗CD28联合处理)刺激并促进IFN-γ的产生及促进百分率。
图7表示实施例7中：药物淫羊藿次苷I促进混合淋巴细胞培养IFN-γ的产生。
图8表示实施例8中：不同的淫羊藿次苷I类化合物对混合淋巴细胞产生IFN-γ水平影响[淫羊霍次苷I类化合物：(1)淫羊藿苷；(2)淫羊藿次苷I；(3)淫羊藿次苷C；(4)Y-3XS-1；(5)Y-5XS-1；(6)Y-4’XS-1]
图9表示实施例9中：药物淫羊藿次苷I对PBMCs和PFMCs产生IFN-γ水平影响
图10表示实施例11中：淫羊藿次苷I对裸鼠异体移植瘤影响(生长曲线)
图11表示实施例11中：淫羊藿次苷I对裸鼠异体移植瘤影响(肿瘤最终重量变化)
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
淫羊藿次苷I的制备
(1)从淫羊藿中分离制备淫羊藿次苷I。
参考文献报道的方法[李文魁等，中草药，1995,26(9)，453-455]，从淫羊藿全草中分离纯化得到含量为95％以上的淫羊藿次苷I。产品化学结构已通过1H NMR、MS等鉴定。
(2)以淫羊藿苷为原料用酶法转化制备淫羊藿次苷I。
A.淫羊藿苷的制备：参考文献报道的方法[李文魁等，中草药，1995,26(9)，453-455]，从淫羊藿全草中分离纯化得到含量为95％以上的淫羊藿苷。产品化学结构已通过1HNMR、MS等鉴定。
B.淫羊藿次苷I的制备：
淫羊藿苷(含量98％)2克溶于PH6.8的磷酸盐缓冲溶中，加入固定化鼠李糖苷酶1克，在60℃，搅拌下反应24小时，析晶，过滤收集固体，甲醇重结晶处理。得1.3克淫羊藿次苷I，含量为95％。产品化学结构已通过1HNMR、MS等鉴定。具体反应式见图1。
实施例2：
淫羊藿次苷C的制备
(1)从淫羊藿中分离制备淫羊藿次苷C。
参考文献报道方法[李文魁等，中草药，1995,26(9)，453-455]，从淫羊藿全草中分离纯化得到含量为95％以上的淫羊藿次苷C。产品化学结构已通过1H NMR、MS等鉴定。
(2)以淫羊藿新苷A为原料用酶法转化制备淫羊藿次苷I。
A.淫羊藿新苷A的制备：淫羊藿新苷A是淫羊藿中含量较多的成分之一。参考文献报道方法[徐绥绪等，中草药，1981,14，24-26]，从淫羊藿全草中分离纯化得到含量为95％以上的淫羊藿新苷A。产品化学结构已通过1HNMR、MS等鉴定。
B.淫羊藿次苷C的制备：以淫羊藿新苷A为原料，应用实施例1中(2)的方法，用鼠李糖苷酶将淫羊藿新苷A分子中的3-O-鼠李糖基除去，即可得到所需的淫羊藿次苷C。产品化学结构已通过1HNMR、MS等鉴定。具体反应式见图2。
实施例3：
基于R1基团修饰制备的淫羊藿次苷类化合物
以淫羊藿苷为原料，选择性的将其中R1的OH基，用化学方法(不影响分子中存在的糖基)转变成其它基团。最后，再应用实施例1中(2)的方法，将已修饰的淫羊藿苷中的R2Rha基用酶法去除，即可以得到所需的淫羊藿次苷类化合物。
制备实例：取50mg淫羊藿苷，加入2ml的氯仿，10mg碘甲烷(CH3I)，再加入10mg氧化银(Ag2O)，，在室温条件下搅拌24小时。用旋蒸方法除去氯仿，用95％乙醇溶解后，用柱层析方法(硅胶柱)纯化，即得到R1基为甲氧基的产物。最后，再应用实施例1中(2)的方法，将已修饰的淫羊藿苷中R2Rha基用酶法去除，即可以得到所需的R1基为甲氧基的淫羊藿次苷类化合物(Y-5XS-1)。产品化学结构已通过1H NMR、MS等鉴定。具体反应式见图3。
实施例4：
基于R2基团修饰制备的淫羊藿次苷类化合物
以淫羊藿次苷I为原料，选择性的对3-位的OH基(即R2＝OH)，进行修饰。即可以得到所需的淫羊藿次苷类化合物。
制备实例：取100mg的淫羊藿次苷I，加入5ml乙醇(95％)，和30mg硫酸二甲酯，再加入15mg氢氧化钠。在室温下搅拌5小时。反应完成后，加入20ml水，然后用乙醚提取。醚层用无水硫酸钠干燥。去除乙醚后，粗产物用95％乙醇溶解后，用柱层析方法(硅胶柱)纯化，即可以得到所需的R2基为甲氧基的淫羊藿次苷类化合物(Y-3XS-1)。产品化学结构已通过1H NMR、MS等鉴定。此方法还可以得到少量R1基为甲氧基的淫羊藿次苷类化合物(Y-3XS-1)。具体反应式见图4。
实施例5：
基于R3基团修饰制备的淫羊藿次苷类化合物
以淫羊藿新苷A为原料，选择性将其中R3的OH基，用化学方法(不影响分子中存在的糖基)转变成其它基团。最后，再应用实施例1中(2)
的方法，将修饰的淫羊藿苷产物中的R2Rha基用酶法去除，即可以得到所需的淫羊藿次苷类化合物。
制备实例：取100mg淫羊藿新苷A，加入5ml的含5％水的异丙醇和30mg硫酸二异丙酯，再加入15mg氢氧化钠。在室温下搅拌10小时。反应完成后，加入20ml水，然后用乙醚提取。醚层用无水硫酸钠干燥。去除乙醚后，粗产物用乙醇溶解，再用柱层析方法(硅胶柱)纯化，即得到R3基为异丙氧基的修饰产物。最后，应用实施例1中(2)的方法，将已修饰的淫羊藿苷产物中的R2Rha基用酶法去除，即可以得到所需的R3基为异丙氧基的淫羊藿次苷类化合物(Y-4’XS-1)。产品化学结构已通过1H NMR、MS等鉴定。
实施例6：
淫羊藿次苷I促进人γ-干扰素产生，提高人体免疫力试验(I)
淫羊霍次苷I对正常人外周血单个核细胞(PBMCs，经单抗处理)产生γ-干扰素(interferon-gamma，IFN-γ)的促进作用(模拟人体内提高免疫力试验模型)。
(1)淫羊藿次苷I试验溶液的制备。将10mg淫羊藿次苷I溶于1ml DMSO中(初始浓度为10mg/ml),溶解好后分装，贮存在-80℃冰箱中待用。
(2)正常人外周血单个核细胞(PBMCs)的制备
分别抽取健康志愿者外周静脉全血，用肝素(血液：肝素＝10ml:80ul)抗凝。用Hank’s液等体积稀释，将稀释的血液缓慢铺于Ficoll分离液上(Ficoll的稀释血液比为3:4)，然后进行Ficoll密度梯度离心(22℃，2200r/min，20min)，离心后管内分为三层，在上、中层界面处有一条以单个核细胞为主的黄白色云雾层狭窄带，用吸管吸取单个核细胞，置于另一离心管中，以获取外周血单个核细胞(PBMCs)，再用Hank’s液洗涤2次(1800r/min，8min)。末次离心后，弃上清，加入完全RPMI 1640培养液重悬细胞，混匀；用台盼蓝计数液计数单个核细胞。加入完全RPMI 1640培养液调整细胞数到所需浓度。
(3)淋巴细胞体外药物刺激培养
将新鲜分离获得的外周血单个核细胞(PBMCs)用RPMI 1640完全培养液调整其细胞浓度为2×106/ml，然后加或不加单克隆刺激分子Anti-CD3(1ug/ml)或Anti-CD3(1ug/ml)/Anti-CD28(1ug/ml)，然后再加入三个不同浓度梯度的药物淫羊藿次苷I(其终浓度为1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml),并充分混匀。把刺激完毕的细胞种植培养于96孔的微型圆底培养板，每组刺激条件进行3个复孔，每孔细胞浓度为4×105/ml(200ul/孔)，并在37℃和5％CO2的培养箱中培养四个时间点：12h、24h、36h及48h，最后分别收取不同时间点的上清液待测。
(4)ELISA检测细胞因子IFN-γ的产生情况
将不同时间点收集到的细胞培养上清液，进行ELISA的方法检测产生的细胞因子IFN-γ。ELISA试剂抗体，ELISA检测方法的操作及使用均根据试剂公司所提供的操作及使用说明进行。所有数据分析和图表制作均使用分析软件GraphPad Prism 5版本进行。结果如图5和图6所示。图5和图6表明：淫羊霍次苷I显著促进了单克隆刺激分子诱导PBMCs产生的IFN-γ水平，并且是以淫羊霍次苷I的剂量依赖方式显著的促进IFN-γ的产生。
PBMCs经抗CD3处理后，再加入不同浓度(ng/ml)的药物淫羊藿次苷I。图5A:淫羊藿次苷I以时间和剂量依赖的方式显著增加细胞因子IFN-γ的产生。图5B:淫羊藿次苷I以不同浓度梯度及不同时间点的促进IFN-γ的产生百分比。
PBMCs经抗CD3和抗CD28联合处理后，再加入不同浓度(ng/ml)的药物淫羊藿次苷I。图6A：细胞因子IFN-γ的产生量随着药物淫羊藿次苷I的不同浓度梯度及不同时间点的变化曲线。图6B：药物淫羊藿次苷I的不同浓度梯度及不同时间点的促进百分比。*P<0.05；**—***P<0.01
实施例7：
淫羊藿次苷I促进人γ-干扰素产生，提高人体免疫力试验(II)
淫羊霍次苷对人外周血混合淋巴细胞培养过程中产生γ-干扰素(interferon-gamma，IFN-γ)的促进作用(模拟人体内提高免疫力试验模型)。
(1)正常人外周血单个核细胞(PBMCs)的制备：按照实施例5(2)所述方法，制备2个正常人外周血PBMCs。
(2)混合淋巴细胞药物刺激培养反应(MLC)：
将新鲜分离获得的外周血单个核细胞(PBMCs)用RPMI1640完全培养液调整其细胞浓度为5×105/ml。将两个健康人的淋巴细胞等体积混合培养，使其总细胞浓度保持为1×106/ml，再加或不加入不同浓度梯度的淫羊藿次苷I(其终末浓度为100ng/ml、1000ng/ml),并充分混匀。然后把刺激完毕的细胞种植培养于96孔的微型圆底培养板，每孔细胞浓度保持为2×105/ml(200ul/孔)，并且在37℃、5％CO2的培养箱中培养120h，检测细胞因子IFN-γ。
(3)ELISA检测细胞因子IFN-γ的产生情况
按照实施例5(4)所述方法，检测人外周血混合淋巴细胞培养反应(MLC)产生的γ-干扰素。
结果如图7所示。图7表明：两个正常人淋巴细胞经混合培养后，IFN-γ有所增加。加入淫羊霍次苷I后，呈剂量依赖方式显著促进(最高达到300％)混合淋巴细胞培养中IFN-γ的产生。
将等细胞浓度的健康人淋巴细胞混合培养5天(120h)，加(不同药物浓度梯度)或不加入药物淫羊藿次苷I。实验结果表明，药物淫羊藿次苷I能显著促进细胞因子IFN-γ产生的作用。其中，人淋巴细胞A control为只含有1种人的淋巴细胞样品组。人淋巴细胞B control为含有2种人的淋巴细胞样品组。即将2种人的淋巴细胞混合培养、但未加入淫羊藿次苷I的对照组。淫羊藿次苷I的加药浓度分别为0.1和1μg/ml。*P<0.05；**P<0.01.
实施例8：
淫羊藿次苷类化合物促进人γ-干扰素产生能力筛选试验。
以实施例7的试验，即混合淋巴细胞的药物刺激培养反应(MLC)为筛选模型，对不同的淫羊藿次苷类化合物促进人γ-干扰素产生能力进行筛选。
将新鲜分离获得的外周血单个核细胞(PBMCs)用RPMI1640完全培养液调整其细胞浓度为5×105/ml。将两个健康人的淋巴细胞等体积混合培养，使其总细胞浓度保持为1×106/ml，再加入不同的淫羊藿次苷I类化合物(其终末浓度为1000ng/ml),并充分混匀。然后把刺激完毕的细胞种植培养于96孔的微型圆底培养板，每孔细胞浓度保持为2×105/ml(200ul/孔)，并且在37℃、5％CO2的培养箱中培养120h，检测细胞因子IFN-γ产生的水平。
结果如图8所示。图8表明：两个正常人淋巴细胞经混合培养后，IFN-γ有所增加。加入不同的淫羊霍次苷I类化合物(其终末浓度为1000ng/ml)后，混合淋巴细胞培养中IFN-γ的产生水平存在较大的差异。说明不同的化合物，对细胞免疫力的影响也不同。
试验结果显示，淫羊藿次苷I促进人γ-干扰素产生能力最好，淫羊藿苷几乎没有作用，其它类似物具有不同程度的促进作用。
实施例9：
淫羊藿次苷I促进结核病人胸水细胞产生人γ-干扰素，提高人体抵御结核病菌感染能力试验。
(1)人外周血单个核细胞(PBMCs)的分离：按照实施例5(2)所述方法，制备正常人外周血PBMCs。
(2)结核病人胸水细胞(PFMCs，即被结核病菌感染刺激的细胞)的分离：抽取志愿者(结核病人静脉血)，肝素抗凝，Hank’s液等体积稀释。离心1次(1800rpm，22℃，8分钟)，弃上清，加入适量ELS(红细胞裂解液)重悬。3-5分钟后加入适量Hank’s液终止，离心2次(1800rpm，22℃，8分钟)，用RPMI1640完全培养液调整PBMC浓度为2×109细胞/L。
(3)PBMCs和PFMCs细胞药物刺激培养反应(MLC)：应用淫羊藿次苷I分别以0.1μg/ml、0.5μg/ml和1μg/ml分别刺激PBMC和PFMC，在37℃、5％CO2条件下培养48小时。
(4)ELISA法检测IFN-γ：按照实施例5(4)所述方法，检测PBMCs和PFMCs细胞在药物刺激培养后产生的γ-干扰素水平。
结果如图9所示。图9表明：使用淫羊藿次甙I刺激培养后，对PBMCs细胞产生IFN-γ无明显促进作用；而对PFMCs细胞产生IFN-γ具有显著的，并呈剂量依赖方式的促进作用。提示：淫羊藿次苷I能显著促进被结核病菌感染的PFMC细胞(结核病人胸水细胞)产生人γ-干扰素。本试验结果非常明确的提示：淫羊藿次甙I可以提高人体抵御结核病菌感染能力，在结核病的免疫治疗方面具有重要应用前景。
将健康人PBMCs细胞和结核病人PFMCs细胞分别培养2天(48h)，加入(不同药物浓度梯度)或不加入药物淫羊藿次苷I。实验结果表明，淫羊藿次苷I能显著促进结核病人PFMC细胞中细胞因子IFN-γ的产生水平。其中，淫羊藿次苷I的加药浓度分别为0.1、0.5和1μg/ml。*P<0.05；**—***P<0.01。
实施例10：
淫羊藿次苷I在小鼠内抑制肿瘤发生和发展试验
试验采用NIH小鼠，取18-22克小鼠分组，每组10只。将小鼠S180腹水肿瘤液体0.2ml接种于小鼠腋窝皮下。接种后次日，对每组小鼠分别腹腔注射给药：(1)生理盐水组；(2)溶剂对照组(DMSO)；(3)阳性对照组[环磷酰胺60mg/(kg·d)]；(4)低剂量1组：淫羊藿次苷I 2mg/(kg·d)；(5)低剂量2组：淫羊藿次苷I 5mg/(kg·d)；(6)中剂量组：淫羊藿次苷I10mg/(kg·d)；(7)高剂量组：淫羊藿次苷I 20mg/(kg·d)。连用10天，停药次日称体重、处死小鼠，剥瘤块称重，分别以生理盐水组和溶剂组为对照计算抑瘤率。结果如表1所示。
表1：淫羊藿次苷I在小鼠内抑制肿瘤生长试验结果
表1结果表明，淫羊藿次苷I能够显著抑制小鼠体内肿瘤的发生和发展。效果优于阳性对照药环磷酰胺。
实施例11：
淫羊藿次苷I对裸鼠异体移植瘤生长影响试验
试验采用4-6周龄BALB/c(nu/nu)裸小鼠,体重18-22g,雌性，饲养于SPF级无菌饲养室,自由摄取食物和水。对40只裸鼠进行肿瘤块移植建模，待肿瘤长至给药初始体积(100mm3)时，重新分组，每组10只。对每组裸鼠分别腹腔注射给药：(1)空白对照组注射0.1ml/10g的溶剂(5％DMSO+95％生理盐水)；(2)阳性药物组注射组[环磷酰胺(0.6mg/10g)]；(3)给药组(淫羊藿次苷I)：高浓度组注射给药：0.1mg/10g的；低浓度组注射给药：0.02mg/10g。给药周期为2天一次，持续30天。每两天用游标卡尺测量肿瘤最长径(L)和横径(S),按V(cm3)＝0.5×L×S2计算出肿瘤的近似体积，绘制肿瘤生长曲线。药物处理后剥瘤称重记录。结果如图10和11所示。显示淫羊藿次苷I能够显著抑制裸鼠体内肿瘤块移植生长和发展。效果优于阳性对照药环磷酰胺。
实施例12：
淫羊藿次苷I的急性毒性试验
取18-22克小鼠随机分六组，每组10只小鼠，分别用生理盐水，DMSO 2.5ml/kg，淫羊藿次苷I 2000mg/kg、1000mg/kg、500mg/kg、100mg/kg处理(口服)，观察14天，结果无一例试验小鼠死亡。显示淫羊藿次苷I对小鼠的急性毒性LD50值大于2000mg/kg，急性毒性很小，使用安全，可用于制备用于预防和治疗与人免疫力有关疾病的药物或保健品、食品和美容护肤品等。

Claims (15)

1.一种如式I所示的淫羊藿次苷类化合物：
式I中的R1,R2和R3所代表的基团如下面各项所定义：
(1)R1选自H，OH,OCH3,CH3COO,CH3,CF3，NH2,CH3NH,CH3CONH,CN,Br,Cl,F；
(2)R2选自H,OH,OCH3,CH3COO,NH2,CH3NH,(CH3)2N,CH3CONH,CN；
(3)R3选自H，OH,OCH3,OC2H5,OC3H7,CH3COO,CH3,CF3,C1-C6-NH2(其中C1-C6为具有1-6个C的烷基、环烷基、烯烃基、环烯烃基，尤其是环戊基氨基、环己基氨基；以及吗啡啉基，甲基哌嗪基)，NH2,CH3NH,(CH3)2N,(CH3CH2)2N，CH3CONH,CN,Br,Cl,F，氨基酸酰基，氨基酸酰氨基(R’-CH-CONH-)，寡肽酰基，寡肽酰氨基等。
2.权利要求1所述的式I的淫羊藿次苷类化合物，其中R1＝OH,OCH3；R2＝OH,OCH3；R3＝OH,OCH3,OC3H7。
3.权利要求1或2所述的式I的淫羊藿次苷类化合物，其中所述化合物是：
(1)R1＝OH,R2＝OH,R3＝OH；
(2)R1＝OH,R2＝OH,R3＝OCH3；
(3)R1＝OH,OCH3,R2＝OH,OCH3,R3＝OH,OCH3,OC3H7；
(4)R1＝OCH3,R2＝OH,R3＝OCH3；
(5)R1＝OH,R2＝OCH3,R3＝OCH3；
(6)R1＝OH,,R2＝OH,R3＝OC3H7。
4.一种制备权利要求1-3任意一种式I的淫羊藿次苷类化合物的方法，其特征在于：以淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷C等天然产物衍生化得到式I所示的淫羊藿类化合物的方法。
5.一种淫羊藿次苷I或淫羊藿次苷C的制备方法，其特征在于通过例如酶转化技术，将淫羊藿中含量丰富的成分淫羊藿苷转化成淫羊藿次苷I。
6.权利要求5所述的淫羊藿次苷I的制备方法，其特征在于以淫羊藿苷为原料，溶于磷酸盐缓冲溶液中，加入固定化鼠李糖苷酶反应并重结晶。
7.权利要求5所述的淫羊藿次苷C的制备方法，其特征在于以淫羊藿新苷A为原料，加入固定化鼠李糖苷酶反应将淫羊藿新苷A分子中的3-O-鼠李糖基除去，得到淫羊藿次苷C。
8.一种药物组合物，其含有式I淫羊藿次苷类化合物中的至少一种物质，例如淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷C以及药学上可接受的载体和/或辅剂。
9.一种保健品组合物，其含有式I淫羊藿次苷类化合物中的至少一种物质，例如淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷C以及保健领域可接受的载体和/或辅剂。
10.一种美容护肤品组合物，其含有式I淫羊藿次苷类化合物中的至少一种物质，例如淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷C以及美容护肤领域可接受的载体和/或辅剂。
11.权利要求8-10的组合物，其可以是片剂、丸剂、胶囊、注射剂、悬浮剂、乳剂、外用涂抹剂、面膜。
12.权利要求1-3、8-10任意一种物质或组合物用于制备药物的用途，该药物用于治疗任何与人体免疫力有关的疾病，特别是能够通过促进人体细胞产生γ-干扰素(interferon-gamma，IFN-γ)，提高人体的免疫力相关的疾病的用途。
13.权利要求1-3、8-10任意一种物质或组合物用于制备药物的用途，该药物用于治疗任何与人体内TH1型的免疫应答(诱导细胞免疫应答)相关的疾病的用途。
14.权利要求12或13的制药用途，其中用于治疗的疾病为肺结核、流感、乙肝和丙肝等感染性疾病，以及肿瘤。
15.一种用于筛选具有增强人体免疫效果物质的实验模型。该模型系应用不同的外源抗原刺激人外周血单个核细胞(PBMCs)，产生细胞因子IFN-γ，将待测药物加入到外源抗原与人外周血单个核细胞(PBMCs)的混合体系中，测定对IFN-γ产生水平的影响，以筛选具有提高人体免疫力或抑制人体免疫力的小分子化合物。
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Denomination of invention: Epimedium glycoside compounds, their preparation method, and their application in promoting human cell production of interferon gamma and in disease treatment

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Pledgee: Guangdong Nanhai rural commercial bank Limited by Share Ltd. Sanshui branch

Pledgor: GOLDEN HEALTH BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

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