CN109369748A - 一种淫羊藿次苷ⅰ类化合物、衍生物、药物组合物及其应用 - Google Patents

一种淫羊藿次苷ⅰ类化合物、衍生物、药物组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本公开提供了一种淫羊藿次苷Ⅰ类化合物以及衍生物，其结构式如式I所示的化合物

Description

一种淫羊藿次苷Ⅰ类化合物、衍生物、药物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及淫羊藿次苷Ⅰ类化合物、衍生物、药物组合物及其应用，该类化合物在预防或治心脑血管系统疾病、骨质疏松症、癌症中的作用，以及基于此原理所涉及的在疾病治疗和保健品等方面的应用。
背景技术
天然产物的主要有效成分的单一化合物作为化学药物本身或药物研发的先导化合物是多年来药物研发人员从事化学药物研发的重要研究方法之一，黄酮苷类化合物淫羊藿苷也成为研究的热点。表明淫羊藿苷具有抗肿瘤功效、壮骨、调节免疫功能、改善心血管功能、抗衰老和抗氧化功能、增强抗毒病能力和增强性功能等生理活性。
淫羊藿是一味传统中药材，现有技术中对其使用均为在中医理论指导下使用淫羊藿植株煎汤、浸酒、熬膏，制丸散等。
发明内容
发明人通过对天然有效成分的研究，同时发明人长期从事生物合成学的研究，发现淫羊藿苷/素通过生物酶工程的方法得到合成生物效果更好、经济效益更高的淫羊藿次苷Ⅰ类衍生物。可以用于制备预防或治疗心脑血管系统疾病、骨质疏松症及癌症的药物。
技术方案如下：
一种淫羊藿次苷Ⅰ类化合物以及衍生物，其结构式如式I所示的化合物
或式I所示化合物的立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药；其中，
1)R1选自H、OH、OCH3、OC2H5、OCH(CH3)2、CH3COO、NH2、CH3NH、(CH3)2N、CH3CONH或CN；
2)R2选自H、OH、OCH3、OC2H5、OCH(CH3)2、OC3H7、CH3COO、CH3、CF3、C1-C6-NH2、NH2、CH3NH、(CH3)2N、(CH3CH2)2N、CH3CONH、CN、Br、Cl、F、氨基酸酰基、氨基酸酰氨基、寡肽酰基或寡肽酰氨基；其中，所述C1-C6-NH2的C1-C6为具有1-6个C的烷基、环烷基、烯烃基、环烯烃基、环戊基氨基、环己基氨基、吗啡啉基、甲基哌嗪基；
3)R3选自H或异戊二烯基；
4)R4选自H或异戊二烯基；
5)R5选自H、OH、OCH3、OC2H5或OC3H7；
6)R6选自H、OH、OCH3、OC2H5或OC3H7。
优选地，R1为OH或OCH3；R2为OH、OCH3或OC3H7；R3为H；R4为R5、R6为H。又或者，R1为OH或OCH3；R2为OH、OCH3或OC3H7；R3为R4为H；R5、R6为H。再或者，R1为OH或OCH3；R2为OH、OCH3或OC3H7；R3为R4为R5、R6为H。
所述淫羊藿次苷Ⅰ类化合物以及衍生物的合成原料选自槲皮素、芹菜素、山奈酚、黄芩素、野黄芩素、白杨素、黄豆苷元、染料木素、异鼠李素、杨梅黄酮、木犀草素、漆黄素或淫羊藿素。
同时，还公开了一种药物组合物，包含上述淫羊藿次苷Ⅰ类化合物或衍生物，以及药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、媒介物或它们的组合。
上述任意一种化合物、衍生物或组合物可作为制备预防、减轻或治疗骨质疏松症的药物的用途。
上述任意一种化合物、衍生物或组合物可作为制备预防、减轻或治疗心脑血管系统疾病的药物的用途。
上述任意一种化合物、衍生物或组合物可作为制备预防、减轻或治疗癌症的药物的用途。
通过化学合成和生物工程的方法可以让自然界中存在较高的黄酮化合物(如芹菜素、槲皮素等)合成生物效果更好、经济效益更高的淫羊藿次苷Ⅰ类化合物及其衍生物。目前国内外并没有通过芹菜素、槲皮素等天然黄酮化合物来合成淫羊藿次苷Ⅰ类化合物及其衍生物的报道，且通过发明人对本发明的化合物进行了一系列的生物实验，证明了本发明的化合物-淫羊藿次苷Ⅰ类化合物及其衍生物具有预防或治疗患者性功能障碍、心脑血管系统疾病、骨质疏松症和治疗癌症中的用途。因此，本发明具有很好的应用前景。
附图说明
图1是实施例1所述的淫羊藿次苷Ⅰ衍生物的制备流程图；
图2是实施例2所述的淫羊藿次苷Ⅰ衍生物的制备流程图；
图3是实施例3所述的淫羊藿次苷Ⅰ衍生物的制备流程图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明，本发明以芹菜素为实例来说明本发明构思，但并不局限于芹菜素，亦包括槲皮素、芹菜素、山奈酚、黄芩素、野黄芩素、白杨素、黄豆苷元、染料木素、异鼠李素、杨梅黄酮、木犀草素、漆黄素、淫羊藿素等。本发明的实例并不局限于具体的实例，只是一种合成思路。
实施例1：6，8–二异戊二烯基取代芹菜素的制备
1)将2g芹菜素，2-2.4倍当量的醋酸酐，2-4倍的哌啶，于100～140℃反应2～24h，产物为Ⅱa，收率为92.4％；
2)将Ⅱa2g和1～5倍的苯硫酚，0.1～1倍的咪唑，以N-甲基吡咯烷酮为溶剂，在0℃，反应5～25h，产物为Ⅱb产率为89.2％；
3)将Ⅱb和1～5倍的(2-甲基丁-3-烯-2-基)碳酸异丁酯，三苯基膦为催化剂，THF溶液中，-20～0℃反应12h得到Ⅱc产率为95.6％；
4)将Ⅱc2g加入2倍当量的醋酸酐和10倍的醋酸铵，甲醇中回流24小时得到产物Ⅱd产率为93.1％，化学结构通过1H NMR鉴定，δ在1.64～2.03出有新的甲基特征峰。主要核磁测试数据：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.02(s,1H),10.22(s,1H),10.05(d,J＝7.2Hz,1H),7.67(d,J＝10.6Hz,1H),7.34(d,J＝9.5Hz,2H),6.85(d,2H),5.31(d,J＝7.7Hz,2H),3.85(d,4H),1.73(d,6H),1.66(d,6H)。
实施例2：6-异戊二烯基取代芹菜素的制备
1)将2g芹菜素，3～4倍当量的醋酸酐，1～2倍的吡啶，于100～140℃反应2～24h，产物为Ⅲa，收率为90.5％；
2)将Ⅲa2g和1～5倍的苯硫酚，0.1～1倍的咪唑，以N-甲基吡咯烷酮为溶剂，在0℃，反应4～20h，产物为Ⅲb产率为85.1％；
3)将Ⅲb和2～4倍的(2-甲基丁-3-烯-2-基)碳酸异丁酯，三苯基膦为催化剂，THF溶液中，-20～0℃反应12h得到Ⅲc产率为92.1％；
4)将Ⅲc2g加入2倍当量的醋酸酐和10倍的醋酸酐，甲醇中回流24小时得到产物Ⅲd产率为88.0％，化学结构通过1H NMR鉴定，δ在1.71～1.96出有新的甲基特征峰，主要核磁测试数据：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.08(s,1H),10.22(s,1H),10.03(d,J＝7.2Hz,1H),7.61(d,J＝10.1Hz,1H),7.32(d,J＝7.1Hz,2H),6.84(d,2H),5.23(d,J＝7.0Hz,1H),3.85(d,2H),1.79(d,3H),1.64(d,3H)。
实施例3：：8-异戊二烯基取代芹菜素制备
1)将2g芹菜素，3.3～5倍当量的醋酸酐，2～4倍的4-甲基哌啶，于100～140℃反应4～21h，产物为Ⅱa，收率为91.8％；
2)将Ⅱa2g和2～6倍的苯硫酚，0.1～1倍的咪唑，以N-甲基吡咯烷酮为溶剂，在0℃，反应6～23h，产物为Ⅱb产率为86.9％；
3)将Ⅱb和4～5倍的(2-甲基丁-3-烯-2-基)碳酸异丁酯，三苯基膦为催化剂，THF溶液中，-20～0℃反应12h得到Ⅱc产率为92.1％；
4)将Ⅱc2g加入2倍当量的醋酸酐和10倍的醋酸酐，甲醇中回流12小时得到产物Ⅱd产率为90.1％，化学结构通过1H NMR鉴定，δ在1.66～1.89出有新的甲基特征峰，主要核磁测试数据：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.09(s,1H),10.21(s,1H),10.02(d,J＝7.7Hz,1H),7.61(d,J＝10.1Hz,1H),7.38(d,J＝7.3Hz,2H),6.88(d,2H),5.36(d,J＝7.1Hz,1H),3.84(d,2H),1.74(d,3H),1.62(d,3H)。
实施例4：R1基团的修饰
取5g实施例3制得的8-异戊二烯基取代芹菜素制备，加入150mL的氯仿，1g碘甲烷(CH3I)，再加入1g氧化银(Ag2O)，在室温条件下搅拌24小时。用旋蒸方法除去氯仿，用95％乙醇溶解后，用柱层析方法(硅胶柱)纯化，即得到R1基为甲氧基的产物(CY-81)，化学结构通过1H NMR鉴定，δ在3.82～4.01出有新的甲基特征峰，主要核磁测试数据：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.08(s,1H),10.22(s,1H),10.03(d,J＝7.2Hz,1H),7.64(d,J＝10.1Hz,1H),7.34(d,J＝5.1Hz,2H),6.86(d,2H),5.32(d,J＝7.6Hz,1H),4.13(s,2H),3.86(d,2H),1.85(d,3H),1.62(d,3H)。
实施例5：R2基团的修饰
取1g的实施例3制得的8-异戊二烯基取代芹菜素制备，加入50mL乙醇(95％)，和300mg硫酸二甲酯，再加入150mg氢氧化钠。在室温下搅拌5小时。反应完成后，加入200mL水，然后用乙醚提取。醚层用无水硫酸钠干燥。去除乙醚后，粗产物用95％乙醇溶解后，用柱层析方法(硅胶柱)纯化，即可以得到所需的R2基为甲氧基的8-异戊二烯基取代芹菜素(CY-82)，化学结构通过1H NMR鉴定，δ在0.98～1.05出有新的甲基特征峰，主要核磁测试数据：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.08(s,1H),10.22(s,1H),10.03(d,J＝7.2Hz,1H),7.61(d,J＝10.1Hz,1H),7.34(d,J＝7.1Hz,2H),6.89(d,2H),5.35(d,J＝7.4Hz,1H),3.93(s,2H),3.87(d,2H),1.78(d,3H),1.62(d,3H)。
实施例6：同时对R1和R2基团进行修饰
取1g实施例3制得的8-异戊二烯基取代芹菜素制备，加入50mL的含5％水的异丙醇和300mg硫酸二异丙酯，再加入150mg氢氧化钠。在室温下搅拌10小时。反应完成后，加入200mL水，然后用乙醚提取。醚层用无水硫酸钠干燥。去除乙醚后，粗产物用乙醇溶解，再用柱层析方法(硅胶柱)纯化，即得到R1、R2基为异丙氧基的修饰产物(CY-83)，化学结构通过1HNMR鉴定，δ在3.70～3.84有新的基特征峰，主要核磁测试数据：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.04(s,1H),10.17(s,1H),10.00(d,J＝7.65Hz,1H),7.51(d,J＝10.8Hz,1H),7.28(d,J＝7.7Hz,2H),6.89(d,2H),5.33(d,J＝7.2Hz,2H),3.99(d,4H)，3.87(d,4H),1.79(d,6H),1.66(d,6H),1.39(d,6H)。
将实施例4、5或6制得的化合物通过葡萄糖基转移酶在7位接上葡萄糖得到淫羊藿次苷Ⅰ类化合物的衍生物。
实施例7：淫羊藿次苷Ⅰ类衍生物的制备
将实施例6制得的CY-83(含量98％)2克溶于pH 6.8的磷酸盐缓冲溶中，加入固定化葡萄糖基转移酶1克，UDP葡萄糖2克，在60℃，搅拌下反应24小时，析晶，过滤收集固体，甲醇重结晶处理。得1.3克淫羊藿次苷Ⅰ类似物的衍生物(CY-83P)，含量为95％。
实施例8：CY-83P的纯度分析
1、液相分析条件：色谱柱(型号C18 250×4.6mm)；流速：2.0mL/min；流动相：0.5％醋酸溶液：甲醇＝6:4；检测波长：270nm；进样量:10μL。
2、流动相的制备：用超纯水与冰乙酸(试剂纯)制备0.5％的醋酸溶液1000mL，过0.22μ滤膜，超声半小时除气泡；取500mL甲醇(分析纯)，过0.22μ滤膜，超声半小时除气泡。
3、已知浓度样品溶液的配制及分析：取5.0mg样品分别溶于10mL 50％DMSO溶液中，震荡使完全溶解。用注射器及针筒式滤膜过滤器过滤每种浓度溶液1mL于液相进样瓶中，做高效液相分析。
4、样品纯度分析：取任意一浓度的样品溶液做高效液相分析，通过峰面积百分比计算纯度。
从峰面积可以得到CY-83P纯度为96.1％。
实施例9：CY-83P的衍生物的生物利用度测定
1、样品制备：取实施例7制得的CY-83P样品；
2、试验方法：试验动物采用体重约2kg的健康家兔40只(由中山大学实验动物中心提供)，动物随机分为四组，预先禁食12h后，分别灌胃给予上述样品，剂量为320mg/kg(相当于70kg成人日服用剂量4g)，给予样品后密集测定血浆中CY-83P的含量，至达峰时间后半小时，检测血药峰浓度(Cmax)；
试验样品灌胃结束后，停药一段时间，至动物体内样品完全代谢，然后静脉注射给予等剂量样品溶液，并测定血浆中样品含量(μg/mL)，以此作为参比数据；结果见表1：
表1：CY-83P的衍生物的生物利用度
试验样品 CY-83P
给药量(g) 0.60
样品含量(％) 2.66
样品给药剂量(mg) 16.00
静脉给样血浆样品浓度(μg/mL) 72.91
口服给样血浆中样品峰浓度Cmax(μg/mL) 36.18
吸收率(％) 90.06
试验结果表明：本发明所述CY-83P具有良好的生物利用度，具有很高的应用前景。
实施例10：
CY-83P的溶解度和溶出速率测定
1、溶解度的测定
CY-83P颗粒剂溶于水，溶解能力的大小直接影响到药物在溶液体系和细胞体系的应用。因为CY-83P在水溶液中稳定，所以我们利用紫外分光光度法对饱和状态的CY-83P的水溶液进行溶解度值的测定。本实验中，我们配制0.3g/L普鲁宁的水溶液，按照一定比例稀释后测吸光度做出标准曲线，对270nm区间的特征峰进行积分作为纵坐标。再测定配制的饱和溶液稀释液的吸光值，通过内标法得到稀释液的浓度，最后计算出饱和溶液浓度。标准曲线图如图3。
标准曲线方程为y＝1624.2495A-18.96,R2＝0.9935。饱和溶液经50倍稀释后，吸光度积分值为645.27，浓度为0.209g/L，则CY-83P的溶解度是10.03g/L。
2、溶出速率的测定
1)分析方法学的建立
检测波长的确定：分别称CY-83P和辅料适量，用甲醇配制成适宜浓度的溶液，并以甲醇为空白对照，于200～700nm范围内进行扫描。结果表明在270nm处有CY-83P的最大吸收峰；而辅料在此处对CY-83P的测定均无干扰。因此，选定270nm作为测定波长。标准曲线：精密称CY-83P适量，用甲醇配制成系列浓度的溶液，于270nm处测定吸收度，以浓度(C)对吸收度(A)进行线性回归。
2)CY-83P溶出度的测定方法
称取化含有CY-83P 83nmol(46mg)的固体颗粒，以及含有CY-83P 83nmol的固体颗粒样品进行溶出度试验。每组样品平行测定3份，按中国药典2015版第二法进行。溶出介质为900mL的蒸馏水，温度为37±0.5℃，转速为100±3rpm。分别在3、6、9、12、15min取样5mL并补入相同体积的溶出介质，样品经0.8μm微孔滤膜过滤。取续滤液稀释后于270nm处测定吸收度，计算化CY-83P的溶出度。
3)测定结果
标准曲线方程C＝13.5941A+0.2651,R2＝0.9907，线性范围：1.051～53.246μg/mL。本发明采用体外溶出度实验以CY-83P原料药为对照，测定CY-83P在体外的溶出情况，结果表明，CY-83P在体外溶出情况良好。结果见表2。
表2CY-83P-聚乙烯吡咯烷酮K30颗粒的溶出速率
时间(min) 溶出速率
3 80.54±3.75
6 84.28±3.99
9 88.37±4.18
12 91.26±4.51
15 93.55±4.94
本发明的CY-83P在3～15min内达到标量的80.54～93.550％，药物的体外释放速度良好，能够被生物体很好的利用。
实施例11：CY-83P的毒理学实验
在28±1℃的温度，70±5％的湿度条件下，选取7～8周龄，健康的清洁级NIH小鼠20只雌雄各半，体重在20～22g。将饲料和水消毒，试验前和试验的观察期内，均按正常饲料条件饲养。
将CY-83P溶解在0.5％Tween80中，浓度为300mg/mL，将该液体经口给药小鼠，给药剂量为0.4mL/20g小鼠体重。给药后观察1,4,8,12小时，以后每12h观察一次。观察死亡情况，每天记录小鼠体重变化以及其他的症状。第10天，断颈处死小鼠，取各器官进行病理检查。
在第10天，全部小鼠存活，2.0g/kg剂量的CY-83P未见毒性反应。小鼠各器官病理检查正常，没有发现病变，10天内小鼠体重未见减轻。因此，说明本发明的CY-83P药物在口服给药动物时未见毒性。
实施例12：CY-83P在防护、处理、治疗、心脑血管系统疾病药物中的用途
对大鼠“兔脑粉-高分子葡聚糖”造成脑梗塞的治疗作用的药效学试验。
原理：因为心脑血管疾病均可导致血液流变学的改变，所以可设计药物对大鼠“兔脑粉-高分子葡聚糖”造成脑梗塞的治疗作用的药效学试验，以测定不同切变率下的全血粘度考察脑梗塞后血液流变性的改变，以红细胞蛋白任氏液粘度考察红细胞的变形能力，从而考察药物对心脑血管疾病的治疗作用。
材料：动物：大鼠，体重250～300g，雌雄各半。器材：锥板粘度计、离心机、刻度离心、试管、眼科剪、眼科镊及常用手术器械、0号手术丝线、血管夹等。
药品及试剂：试验组1：淫羊藿次苷I；试验组2：CY-83P；对照组1：CY-82；对照组2：CY-83。以上药物采用常规方法制备得供试品。
以市售灯盏花素注射液为阳性药对照；兔脑粉(兔脑粉凝血活酶粉)。取分样筛120～150目之间的兔脑粉，颗粒为100～120μm。高分子葡聚糖：分子量500万。栓塞剂的配制：将25mg兔脑粉混于10％高分子葡聚糖溶液100mL中，置于37℃水浴中40分钟。然后，放于-18℃冰箱备用。快速医用ZT胶。小牛血清白蛋白、任氏液。肝素钠：按20u/mL血剂量加入试管，40℃以下烘干备用。
试验方法：1、大鼠脑梗塞模型制备：大鼠乙醚麻醉，仰卧固定，皮肤剪毛消毒，颈部切开，分离左侧颈总动脑、颈内、颈外动脉。分别夹闭颈外动脉、颈总动脉近心端。在远心端处再夹一血管夹。将栓塞剂摇匀后，用0.25mL注射器按0.03mL/100g大鼠剂量刺进颈总动脉，打开远心端血管夹，将栓塞剂注入。然后，夹闭颈总动脉远心端，拔出针头，用医用胶粘合针孔。1分钟后依次放开颈总动脉远心端、近心端、颈外动脉的血管夹，恢复血流，清理创口，缝合皮肤。
药物对脑梗塞后不同时间的血液流变学影响：将大鼠分为给药组(试验例1～3组或对照例1～3组+动物模型组)、生理盐水组(生理盐水+动物模型组)、假手术组(对照组)，每组12只大鼠。给药组、生理盐水组均按上述方法施以手术操作，假手术组手术操作完全相同，但不注射栓塞剂，以生理盐水代替栓塞剂，注射于颈内动脉。给药组于手术前3天口服药物(试验例、对照例)1.42g/Kg。阳性药于手术前1小时腹腔注射药物1.0mg/Kg。生理盐水组注射同量生理盐水。假手术组不注射任何药物。以后每天上午给药1次，连续3天。在术后第3天将大鼠麻醉(25％乌拉坦0.3mL/100g体重，腹腔注射)，右颈总动脉放血于肝素试管中，在2小时内用锥板粘度计测定不同切变率下的全血粘度。再将全血以1500rpm离心，吸去上层血浆。然后用0.25％牛血清白蛋白-任氏液漂洗红细胞三次，每次1500rpm离心10分钟。最后，在刻度试管内配制成红细胞：蛋白任液＝6:4的红细胞蛋白任氏液，在20秒1切变率下测定其粘度。以红细胞蛋白任氏液粘度作为红细胞变形能力。所有实验均在25℃恒温下进行，对实验结果进行统计学检验。具体数值及结果见表3。
表3：对大鼠脑梗塞后不同时间的全血粘度影响(单位：mPa.s)
注：**P＜0.05***P＜0.01均与生理盐水组比较。
由表3试验结果可知，梗塞3天时，生理盐水组与假手术组相比，全血粘度上升(P<0.05)，说明动物模型造模成功，各给药组均可不同程度地降低全血粘度，其中以本申请药物糖基化效果最好(P<0.01)，无糖基化效果次之，对照药物效果较差。与生理盐水组比，全血粘度下降，统计学处理有显著性意义。
实施例13：CY-83P的防护、处理、治疗癌症药物中的用途
1)培养细胞：选用前列腺癌细胞作为实验对象。将细胞接种于直径为10cm的培养皿后，使用10％的胎牛血清DMEM培养基，37℃，5％CO2环境中培养。
2)接种细胞：将细胞接种于96孔板的培养皿中，细胞密度约为2000/mL,然后在37℃，5％CO2环境中培养15h。
3)吸走板空中培养液，加入配好浓度的本发明化合物溶液。本发明化合物用DMSO溶液配制，处理浓度分别为0μM、0.1％DMSO、10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM。每个浓度处理三次。
4)将药物处理后的96孔板置于在5％CO2、37℃培养箱中分别培养24h、48h以及72h。
5)吸取培养液，往每孔中加入5mg/mL的MTT，2 0μL。再次放入培养箱中静置4h。
6)形成甲醇结晶后，吸走多余MTT溶液，在每孔中加100μLDMSO溶液并充分震荡，使黄色结晶溶解。
8)用酶标仪检测吸光值并读数，记录读出结果并用软件计算细胞的抑制率。最后，对结果进行统计分析表4。
表4：本发明化合物不同浓度对前列腺癌细胞的抑制率
样本 浓度 细胞存活率
空白对照 0.1％DMSO 95.8％
实例1 1μM 104.5％
实例2 5μM 95.3％
实例3 10μM 78.6％
实例4 20μM 65.2％
实例5 30μM 43.7％
实例6 50μM 36.1％
从表4中可以看出，本发明的CY-83P对前列腺癌细胞具有良好的抑制作用，可以作为抗癌药物的选择。
实施例14：CY-83P的防护、处理、治疗骨折和骨质疏松症药物中的用途
原理：单核的破骨前体细胞在分化细胞因子(如RANKL，M-CSF)诱导下，能够逐渐融合分化为多核的成熟破骨细胞。破骨前体细胞不具备溶骨的能力，只有分化成熟的破骨细胞才具有溶解固执的能力，因此，破骨细胞的分化水平能够反应其溶骨能力。
方法：将破骨前体细胞系或原代分离培养的小鼠破骨前体细胞接种到12孔培养板中，10000细胞/孔。设置对照组，单加药组1(CY-83P)、单加药组2(RANKL)和双加药组(CY-83P+RANKL)。待细胞贴壁过夜后，加入不同剂量的本发明化合物和/或50ng/mL的RANKL，持续培养3～5天。等单加RANKL的细胞融合完全后，用37度预热的蒸馏水洗细胞一次，加入甲醇固定30秒，37度预热的蒸馏水洗细胞三次，然后进行TRAP染色，在显微镜下计数TRAP阳性的多核细胞数。
结果与评价：结果见表5所示。与对照组相比较，加入本发明化合物后，无论在破骨前体细胞系或原代分离培养的小鼠破骨前体细胞中，由RANKL诱导分化的破骨细胞数量明显减少，这个结果证明：本发明化合物能够有效地抑制RANKL诱导的破骨细胞的分化。
表5CY-83P对原代培养的骨髓BMMs细胞向破骨细胞分化的影响
化合物 浓度 增值率(％)
空白对照 -/- 0.00
单加药组1 0.5μM 28.6％
单加药组2 1.0μM 22.5％
双加药组 1.0μM 20.1％
从表5可以看出，与对照组相比较，加入CY-83P后，无论在破骨前体细胞系或原代分离培养的小鼠破骨前体细胞中，由RANKL诱导分化的破骨细胞数量明显减少，这个结果证明：CY-83P能够有效地抑制RANKL诱导的破骨细胞的分化。

Claims (8)

1.一种淫羊藿次苷Ⅰ类化合物以及衍生物，其特征在于：其结构式如式I所示的化合物
或式I所示化合物的立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药；其中，
1)R1选自H、OH、OCH3、OC2H5、OCH(CH3)2、CH3COO、NH2、CH3NH、(CH3)2N、CH3CONH或CN；
2)R2选自H、OH、OCH3、OC2H5、OCH(CH3)2、OC3H7、CH3COO、CH3、CF3、C1-C6-NH2、NH2、CH3NH、(CH3)2N、(CH3CH2)2N、CH3CONH、CN、Br、Cl、F、氨基酸酰基、氨基酸酰氨基、寡肽酰基或寡肽酰氨基；其中，所述C1-C6-NH2的C1-C6为具有1-6个C的烷基、环烷基、烯烃基、环烯烃基、环戊基氨基、环己基氨基、吗啡啉基、甲基哌嗪基；
3)R3选自H或异戊二烯基；
4)R4选自H或异戊二烯基；
5)R5选自H、OH、OCH3、OC2H5或OC3H7；
6)R6选自H、OH、OCH3、OC2H5或OC3H7；
其合成原料包括槲皮素、芹菜素、山奈酚、黄芩素、野黄芩素、白杨素、黄豆苷元、染料木素、异鼠李素、杨梅黄酮、木犀草素、漆黄素或淫羊藿素。
2.根据权利要求1所述的淫羊藿次苷Ⅰ类化合物以及衍生物，其特征在于：R1为OH或OCH3；R2为OH、OCH3或OC3H7；R3为H；R4为R5、R6为H。
3.根据权利要求1所述的淫羊藿次苷Ⅰ类化合物以及衍生物，其特征在于：R1为OH或OCH3；R2为OH、OCH3或OC3H7；R3为R4为H；R5、R6为H。
4.根据权利要求1所述的淫羊藿次苷Ⅰ类化合物以及衍生物，其特征在于：R1为OH或OCH3；R2为OH、OCH3或OC3H7；R3为R4为R5、R6为H。
5.一种药物组合物，其特征在于：包含权利要求1～4任一项所述的淫羊藿次苷Ⅰ类化合物或衍生物，还包含药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、媒介物或它们的组合。
6.权利要求1～5任意一种化合物、衍生物或组合物用于制备药物的用途，该药物用于预防、减轻或治疗心脑血管系统疾病中的用途。
7.权利要求1～5任意一种化合物、衍生物或组合物用于制备药物的用途，该药物用于预防、减轻或治疗骨质疏松症中的用途。
8.权利要求1～5任意一种化合物、衍生物或组合物用于制备药物的用途，该药物用于预防、减轻或治疗癌症中的用途。
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