CN101683350B - 没食子酰基葡萄糖类化合物的制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药用植物南酸枣中所含没食子酰基葡萄糖类化合物的提取、纯化方法，以及所述没食子酰基葡萄糖类化合物作为活性成分用于制备抗肿瘤药物，或抗缺氧药物或保健品等功能性食品的用途。

Description

没食子酰基葡萄糖类化合物的制备方法与用途

技术领域：

本发明涉及药用植物南酸枣提取物中所含没食子酰基葡萄糖类化合物的制备方法，以及这些化合物用于制备抗肿瘤或抗缺氧药物、抗缺氧保健品等功能性食品的用途。

背景技术：

氧在人的生命活动中是不可或缺的，在体内组织和细胞的能量代谢中氧分子发挥着重要作用。多种因素可导致人体组织和细胞的供氧不足，如某些疾病或身处特殊低氧环境(如高原)等，而缺氧又反过来可造成细胞、组织损伤乃至各种严重疾病，如严重的呼吸系统疾病以及并发的心脑血管疾病、免疫机能低下等。严重缺氧往往还成为许多相关危重病人死亡的直接原因。因此，抗缺氧剂的研究与开发受到关注。

癌症严重威胁人类的生命，全世界每年死于癌症的病人约500万；最近的统计资料表明，我国每年有160万肿瘤患者，近130万人死于肿瘤，且肿瘤的发病率呈逐年上升和年轻化的趋势，其死亡率占总死亡人口的1/5，成为人类健康的主要杀手之一。癌症的研究已有上百年的历史，但至今癌症仍然在猖獗肆虐，因此如何预防和治疗癌症在二十一世纪仍然是人类面临的一大难题。

南酸枣Choerospondias axillaries(Roxb.)Burtt.et Hill.为漆树科南酸枣属植物，其树皮和果实入药(江苏新医学院编，中药大辞典，上册，上海，上海人民出版社，1977年，第397-398页和第1564页)，干燥果实已作为中药“广枣”收入我国2005年版药典(国家药典委员会，中华人民共和国药典，一部，北京，化学工业出版社，2005年，第29-30页)。南酸枣的化学成分有些已有报道，其粗提物、总黄酮或某些单体化合物的抗菌、抑制血小板聚集、抗肿瘤等活性也有报道(李长伟等；南酸枣的研究进展：解放军药学学报，2008年第24卷第3期，第231-234页)。此外，南酸枣果实总黄酮的缺氧保护作用也曾有文献记载(李增晞等；广枣总黄酮对动物耐缺氧和急性心肌缺血的保护作用：中草药，1984年第15卷第6期，第25-27页)，但其中抗缺氧活性成分尚未阐明。本发明涉及的从南酸枣提取物中分离制备的没食子酰基葡萄糖类化合物的抗缺氧、抗肿瘤活性及其用途至今未见报道。

发明内容：

本发明人发现药用植物南酸枣的含水醇浸膏、其乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、柱层析组分等多种提取物具有很好的抗缺氧活性及抗肿瘤活性，并从这些提取物中首次发现并分离制备了具有抗缺氧及抗肿瘤活性的1-O-没食子酰基-β-D-葡萄吡喃糖(化合物I)、1，6-二-O-没食子酰基-β-D-葡萄吡喃糖(化合物II)，1，4-二-O-没食子酰基-β-D-葡萄吡喃糖(化合物III)，1，4，6-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄吡喃糖(化合物IV)、1，3，4，6-四-O-没食子酰基-β-D-葡萄吡喃糖(化合物V)等五个没食子酰基葡萄糖类化合物。

因此，本发明的第一个方面涉化合物I～V及其药学上可接受的盐，以及这些化合物的抗缺氧、抗肿瘤相关生物活性。

本发明的第二个方面涉及制备化合物I～V及其盐类的方法，所述方法包括用醇或含水醇对植物原料如南酸枣进行提取，再经过分离纯化得到目的化合物。

本发明的第三个方面涉及上述化合物I～V及其盐类作为活性成分的抗缺氧及抗肿瘤药物组合物、抗缺氧保健品等功能性食品。

上述化合物I～V的制备方法是，用含水醇浸泡提取南酸枣植物材料，获得含有上述化合物的粗浸膏，再用分离手段，纯化制备粗浸膏中的上述化合物。所述含水醇是60％～95％(v/v)的含水乙醇，所述分离手段包括天然产物化学领域的专业人士所熟知的液-液萃取、柱层析、薄层层析、高效液相层析及重结晶等。

本发明采用大鼠嗜铬细胞瘤株PC12和人白血病细胞K562，用MTT法测试评价了化合物I～V的抗缺氧及抗肿瘤活性，并经实验证实，上述化合物对K562细胞有明显抗肿瘤活性，同时对PC12细胞的缺氧损伤均具有很好保护作用。

本发明的化合物I～V可作为抗缺氧剂用于防治各种缺氧性疾病、或改善和减轻低氧环境下的缺氧相关各种不适症状。化合物I～V还可用作抗肿瘤药物用于治疗各种肿瘤。

本发明化合物可以单独或两个以上组合，或再组合药学上可接受的各种载体、赋形剂或辅料配伍，制成抗缺氧药物及抗肿瘤药物，用于防治缺氧引起的各种疾病及肿瘤，也可以制成具有抗缺氧功能的保健品或食品添加剂，用于预防、改善或减轻缺氧条件下的各种症状。

本发明中的术语“药学上可接受的盐”是指药用无机或有机盐。化合物I～V中所含酚羟基等酸性基团可以使化合物与碱金属或碱土金属形成药用盐，也可以形成药用铵盐，优选但不限于铵(或胺)盐、钠盐、钾盐、镁盐或钙盐。

本发明的化合物可以单独或以药物组合物的形式给药。给药途径可以是口服、非肠道或局部给药。药物组合物可根据给药途径配成各种适宜的剂型。

本发明化合物的药物组合物可以以下面的任意方式施用：口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，局部用药，非肠道用药，如皮下，静脉，肌内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中优选口服、腹膜内或静脉内给药方式。

当口服用药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊制剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。

当皮肤局部施用时，本发明提取物和化合物可制成适当的软膏、洗剂或霜剂制剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、吐温60、十六烷酯蜡、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。

本发明化合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液或无菌注射溶液。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。

另外需要指出，本发明提取物和化合物的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、各种提取物或各种化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。优选的使用剂量介于0.01-500mg/kg体重/天。

具体实施方式：

下列实施例将进一步说明本发明，但并不对本发明构成限制。

在以下实施例中，以下称为化合物I的是“1-O-没食子酰基-β-D-葡萄吡喃糖”；称为化合物II的是“1，6-二-O-没食子酰基-β-D-葡萄吡喃糖”；称为化合物III的是“1，4-二-O-没食子酰基-β-D-葡萄吡喃糖”；称为化合物IV的是1，4，6-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄吡喃糖”；称为化合物V的是“1，3，4，6-四-O-没食子酰基-β-D-葡萄吡喃糖”。

实施例1.化合物I～V的分离制备

原材料药用植物南酸枣的提取和萃取分离

南酸枣Choerospondias axillaries(Roxb.)Bu rtt.et Hill.的干燥树皮3.2kg(1999年8月采自云南勐腊地区)粉碎后用市售医用95％(v/v)乙醇室温浸提，每次用乙醇25升浸泡7天，共提4次，合并提取液，减压浓缩干燥，得乙醇提取物750g。该乙醇提取物750g悬浮于3升水中，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各种溶剂每次用3升，分别各萃取4次，合并相同萃取液，减压浓缩干燥，得到氯仿萃取物60g、乙酸乙酯萃取物310g、正丁醇萃取物300g和水层残留物80g。

从正丁醇萃取物中化合物I～III的分离制备

将上述南酸枣的正丁醇萃取物300g用适量甲醇溶解，加适量大孔树脂AB-8吸附、干燥，上大孔树脂AB-8柱(水中柱床8.5cm×48cm)，用不同体积比的水-乙醇梯度洗脱，根据薄层检测结果收集合并洗脱液，减压浓缩干燥，依洗脱流出顺序得两个水洗组分B-1(20g)、B-2(38g)和若干后续流出含水乙醇洗脱组分(共计230g)。

组分B-1(20g)用适量水溶解，直接上Sephadex LH-20凝胶柱(水中柱床3.6cm×50cm)，用不同体积比的水-乙醇梯度洗脱，根据薄层检测结果收集合并洗脱液，减压浓缩干燥，得五个组分：B-1-1(13g，水洗脱部分)、B-1-2(1.1g，水洗脱部分)、B-1-3(1.4g，水-乙醇80:20洗脱部分)、B-1-4(0.25g，水-乙醇60:40洗脱部分)、B-1-5(0.8g，水-乙醇30:70洗脱部分)、B-1-6(3.2g，乙醇洗脱部分)。B-1-5(0.8g)用适量体积百分数70％的甲醇水溶解，添加到用相同体积百分数70％甲醇水装填的Sephadex LH-20柱上，并用体积百分数70％的甲醇水洗脱精制，得到化合物I(35mg)。

组分B-2(38g)用适量甲醇溶解，加适量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(水中柱床7.5cm×18.5cm)，用不同体积比的水-丙酮梯度洗脱，根据薄层检测结果合并所收集的洗脱液，减压浓缩，得八个组分：B-2-1(10g，水洗脱部分)、B-2-2(2g，水洗脱部分)、B-2-3(1.5g，水-丙酮9:1洗脱部分)、B-2-4(1.7g，水-丙酮9:1洗脱部分)、B-2-5(2g，水-丙酮9:1洗脱部分)、B-2-6(5g，水-丙酮7:3洗脱部分)、B-2-7(5g，水-丙酮5:5洗脱部分)和B-2-8(5g，丙酮洗脱部分)。组分B-2-5(2g)用适量甲醇溶解，加适量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(乙酸乙酯中柱床2.8cm×30cm)，用不同体积比的乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集洗脱液并根据薄层检测结果合并，减压浓缩干燥，得B-2-5-1(1g，乙酸乙酯-甲醇6:1洗脱部分)、B-2-5-2(0.6g，乙酸乙酯-甲醇4:1洗脱部分)和B-2-5-3(0.4g，乙酸乙酯-甲醇2:1洗脱部分)。B-2-5-1(1g)用适量体积比70:30的甲醇-水溶解，直接上Sephadex LH-20柱(甲醇-水70:30中柱床2.8cm×45cm)，用相同体积比70:30的甲醇-水溶剂洗脱，收集洗脱液并根据薄层检测结果合并含化合物V的洗脱组分，减压浓缩并经甲醇中重结晶精制，得化合物II(白色针晶，270mg)。

B-2-5-2(0.6g)用适量甲醇溶解，加适量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(乙酸乙酯中柱床1.8cm×33cm)，用体积比20:10的乙酸乙酯-甲醇洗脱，根据薄层检测结果收集洗脱液，减压浓缩干燥，依洗脱流出先后顺序分为B-2-5-2-1(350mg)和B-2-5-2-2(200mg)两个组分。B-2-5-2-2(200mg)用适量甲醇溶解，加适量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(乙酸乙酯中柱床1.8cm×33cm)，用乙酸乙酯-甲醇(体积比4:1)洗脱，根据薄层检测结果收集含化合物III的洗脱液，减压浓缩干燥，再次同法用相同聚酰胺柱层析分离，收集含化合物III的洗脱组分，减压浓缩干燥，并经甲醇中重结晶精制，得化合物III(结晶型粉末，27mg)。

从乙酸乙酯萃取物中化合物IV和V的分离制备

将南酸枣的乙酸乙酯萃取物100g用适量甲醇溶解，加适量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(乙酸乙酯中柱床7.0cm×50cm)，用不同体积比的乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集洗脱液并根据薄层检测结果合并，减压浓缩干燥，得到四个层析粗组分：E-1(4g，乙酸乙酯洗脱部分)、E-2(35g，乙酸乙酯-甲醇9:1洗脱部分)、E-3(25g，乙酸乙酯-甲醇1:1洗脱部分)和E-4(15g，甲醇洗脱部分)。

E-4(15g)用适量甲醇溶解，加入约2倍量聚酰胺吸附、干燥，进行聚酰胺柱层析(柱床3.8cm×50cm)用氯仿(C)-甲醇(M)溶剂系统梯度洗脱，收集洗脱液并根据薄层检测结果合并，减压浓缩干燥，得到2个组分E-4-1(2.0g，V_C:V_M＝1:1洗脱部分)和E-4-2(12.0g，甲醇洗脱部分)。E-4-2(12.0g)用适量体积百分数90％的甲醇水溶解进行SephadexLH-20凝胶柱层析，用相同体积百分数90％的甲醇水洗脱，收集洗脱液并根据薄层检测结果合并，减压浓缩干燥，得到3个组分：E-4-2-1(7.2g)、E-4-2-2(2.3g)和E-4-2-3(2.5g)。其中，E-4-2-1用适量甲醇溶解后放置易析出结晶，经预实验选择体积比30％的甲醇水溶液进行重结晶精制，得化合物IV(4g)；E-4-2-2经反复Sephadex LH-20柱层析，用体积百分数60％的甲醇水洗脱，收集含目的化合物的洗脱组分，并在甲醇中反复重结晶精制，得化合物V(152mg)；

化合物I～V的光谱数据

化合物I为白色结晶型粉末(甲醇)，熔点为203-205℃。正离子ESI-MSm/z：355[M+Na]⁺，与其分子组成C₁₃H₁₆O₁₀相应分子量332一致。¹H-NMR(400MHz，piridine-d₅)δ：7.58(2H，s，没食子酰基的2＂，6＂-H)，6.67(1H，d，J＝7.6Hz，葡萄糖的1-H)，4.12-4.80(6H，m，葡萄糖的2～6-H)；¹³C-NMR(100MHz，piridine-d₅)δ：166.2(没食子酰基的C-1′)，147.5(没食子酰基的C-3＂，5＂)，141.4(没食子酰基的C-4＂)，120.4(没食子酰基的C-1＂)，110.5(没食子酰基的C-2＂，6＂)，96.1(葡萄糖的C-1)，79.4(葡萄糖的C-3)，78.5(葡萄糖的C-5)，74.2(葡萄糖的C-2)，70.7(葡萄糖的C-4)，61.8(葡萄糖的C-6).

化合物II为白色针晶，(甲醇)，熔点为175-177℃。正离子TOF-MSm/z：507[M+H]⁺，523[M+K]⁺；负离子TOF-MS m/z：483[M-H]^-；与其分子组成C₂₀H₂₀O₁₄相应分子量484吻合。¹H-NMR(400MHz，MeOH-d₄)δ：7.12，7.06(2H×2，s，没食子酰基的2＂，6＂-H)，5.68(1H，d，J＝7.6Hz，葡萄糖的1-H)，4.54(1H，dd，J＝12.2，2.0Hz，葡萄糖的6-Ha)，4.39(1H，dd，J＝12.2，4.8Hz，葡萄糖的6-Hb)，3.70(1H，m，葡萄糖的5-H)，3.48-3.54(3H，m，葡萄糖的2～4-H)；¹³C-NMR(100MHz，MeOH-d₄)δ：168.0，166.6(没食子酰基的C-1′×2)，146.1(没食子酰基的C-3＂，5＂×2)，140.1，139.5(没食子酰基的C-4＂×2)，120.9，120.2(没食子酰基的C-1＂×2)，110.2，109.8(没食子酰基的C-2＂，6＂×2)，95.6(葡萄糖的C-1)，77.6(葡萄糖的C-3)，76.1(葡萄糖的C-5)，73.7(葡萄糖的C-2)，70.8(葡萄糖的C-4)，64.1(葡萄糖的C-6)。

化合物III为结晶性粉末(甲醇)，熔点为162-164℃。正离子TOF-MSm/z：507[M+Na]⁺；负离子TOF-MS m/z：483[M-H]^-；与其分子组成C₂₀H₂₀O₁₄相应分子量484一致。¹H-NMR(400MHz，MeOH-d₄)δ：7.14，7.10(2H×2，s，没食子酰基的2＂，6＂-H)，5.75(1H，d，J＝8.4Hz，葡萄糖的1-H)，5.04(1H，t，J＝9.6Hz，葡萄糖的4-H)，3.79(1H，t，J＝9.6Hz，葡萄糖的3-H)，3.73(1H，m，葡萄糖的5-H)，3.65(1H，dd，J＝3.6，12.4Hz，葡萄糖的6-Ha)，3.61(1H，dd，J＝8.4，9.2Hz，葡萄糖的2-H)，3.54(1H，dd，J＝5.6，12.4Hz，葡萄糖的6-Hb)；¹³C-NMR(100MHz，MeOH-d₄)δ：167.6，166.9(没食子酰基的C-1′×2)，146.5(没食子酰基的C-3＂，5＂×2)，140.4，140.1(没食子酰基的C-4＂×2)，121.0，120.5(没食子酰基的C-1＂×2)，110.5，110.3(没食子酰基的C-2＂，6＂×2)，95.8(葡萄糖的C-1)，77.0(葡萄糖的C-3)，76.0(葡萄糖的C-5)，74.3(葡萄糖的C-2)，72.0(葡萄糖的C-4)，62.0(葡萄糖的C-6)。

化合物IV为白色结晶型粉末(体积比30％的甲醇水)，熔点为174-176℃。ESI-MS m/z：659[M+Na]⁺，675[M+K]⁺，与其分子组成C₂₇H₂₄O₁₈相应分子量636吻合。¹H-NMR(400MHz，MeOH-d₄)δ：7.15，7.10，7.07(2H×3，s，没食子酰基上2＂，6＂-H)，5.79(1H，d，J＝8.4Hz，葡萄糖的1-H)，5.23(1H，t，J＝9.6Hz，葡萄糖的4-H)，4.44(1H，dd，J＝12.6，2.0Hz，葡萄糖的6-Ha)，4.22(1H，dd，J＝12.6，4.8Hz，葡萄糖的6-Hb)，4.07(1H，m，葡萄糖的5-H)，3.84(1H，t，J＝9.2Hz，葡萄糖的3-H)，3.65(1H，dd，J＝8.4，9.6Hz，葡萄糖的2-H)；¹³C-NMR(100MHz，MeOH-d₄)δ：166.7，166.1，165.6(没食子酰基的C-1′×3)，145.2，145.2，145.1(没食子酰基的C-3＂，5＂×3)，139.2，138.8，138.6(没食子酰基的C-4＂×3)，119.8，119.6，119.1(没食子酰基的C-1＂×3)，109.2，109.0，108.9(没食子酰基的C-2＂，6＂×3)，94.5(葡萄糖的C-1)，74.7(葡萄糖的C-3)，73.1(葡萄糖的C-5)，72.9(葡萄糖的C-2)，70.5(葡萄糖的C-4)，62.3(葡萄糖的C-6).

化合物V为棕色结晶型粉末(甲醇)，熔点为166-168℃。正离子ESI-MS m/z：806[M+NH₄]⁺，827[M+K]⁺，与其分子组成C₃₄H₂₈O₂₂相应分子量788吻合。¹H-NMR(400MHz，MeOH-d₄)δ：7.15，7.07，7.01，6.95(2H×4，s，没食子酰基的2＂，6＂-H)，5.93(1H，d，J＝8.1Hz，葡萄糖的1-H)，5.58(1H，t，J＝9.4Hz，葡萄糖的3-H)，5.45(1H，t，J＝10.0Hz，葡萄糖的4-H)，4.47(1H，dd，J＝12.4，1.6Hz，葡萄糖的6-Ha)，4.31(1H，dd，J＝12.4，4.4Hz，葡萄糖的6-Hb)，4.30(1H，m，葡萄糖的5-H)，3.93(1H，dd，J＝8.1，9.4Hz，葡萄糖的2-H)；¹³C-NMR(100MHz，MeOH-d₄)δ：167.4，167.2，166.6，166.2(没食子酰基的C-1′×4)，146.1，145.9，145.9，145.8(没食子酰基的C-3＂，5＂×4)，140.1，139.7，139.4，139.4(没食子酰基的C-4＂×4)，120.5，120.4，119.8，119.8(没食子酰基的C-1＂×4)，110.1，109.8，109.7，109.7(没食子酰基的C-2＂，6＂×4)，95.2(葡萄糖的C-1)，75.9(葡萄糖的C-3)，73.7(葡萄糖的C-5)，72.0(葡萄糖的C-2)，69.4(葡萄糖的C-4)，62.8(葡萄糖的C-6).

实施例2.抗缺氧活性测试

细胞系与细胞培养：活性测试采用大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞株，细胞用含10％新生小牛血清和青霉素、链霉素各100μg/mL的DMEM培养基，于37℃通入5％CO₂和95％空气的培养箱中常规培养和继代维护。

被测样品与样品溶液配制：实施例1中化合物I、IV和V。精密称量被测样品适量，用含10％新生小牛血清和青霉素与链霉素各100μg/mL的DMEM培养基溶解，配制成50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL的样品溶液，供活性测试用。

活性测试方法：取对数生长期的PC12细胞，用含10％新生小牛血清和青霉素、链霉素各100μg/mL的新鲜DMEM培养基配成细胞密度为每毫升1×10⁵个的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔150μL，于37℃通入5％CO₂和95％空气的培养箱中培养18～24h，吸引弃去培养液，分成正常对照组、缺氧对照组和缺氧给药组，各组每个样品均设三孔。正常对照组和缺氧对照组每孔加含10％新生小牛血清、青霉素和链霉素各100μg/mL的新鲜DMEM培养基各150μL，缺氧给药组每孔加样品溶液各150μL。对照组和给药组于培养箱中培养1h，缺氧对照组和缺氧给药组以31.25μM CoC1₂处理2h造成对细胞的缺氧损伤，然后于培养箱中正常培养24h。培养结束后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液(用0.01M的PBS液配制)各15μL，混匀，37℃孵育4h，翻板法弃去孔内培养液，每孔加DMSO各150μL，振荡10min使MTT紫色产物充分溶解，用酶标仪测量每孔于490nm处的OD值。数据以正常对照组为100％，取各组OD平均值按下式计算缺氧对照组和缺氧给药组的细胞存活率：细胞存活率(％)＝缺氧对照组或缺氧给药组OD平均值/正常对照组OD平均值×100％。取8次独立实验数据，计算相应细胞存活率(％)，并用Student-t检验法，统计检验缺氧对照组和缺氧给药组两组间细胞存活率的显著性差异。

实验结果：见表1。

表1化合物I、IV和V对PC12细胞缺氧损伤的保护作用

^＊星号表明与相应缺氧对照组相比有显著性差异，P<0.01

表1中所示测试结果表明，本发明化合物I、IV和V在所试浓度范围内对PC12细胞的缺氧损伤具有显著保护作用。

实施例3.抗肿瘤活性测试

细胞系与细胞培养：活性测试采用人白血病K562细胞系，细胞用含10％胎牛血清和青霉素与链霉素各100μg/mL的RPMI-1640培养基，于37℃通入5％CO₂和95％空气的培养箱中常规培养和继代维护。

被测样品与样品溶液配制：实施例1中化合物I～V。精密称量被测样品适量，用甲醇溶解，配制成10mg/mL的样品溶液，供测活性。

活性测试方法：收集对数生长期的K562细胞，用新鲜RPMI-1640培养基配制成细胞密度为2×10⁵个细胞/mL的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200μL。将接种后的细胞于37℃、通入5％的CO₂和95％空气的细胞培养箱中培养4h后，每孔加2μL不同浓度的样品溶液，每个浓度设三个平行孔，同时设三孔阴性对照。加药后继续培养24h，培养结束后首先在光学显微镜下观察药物处理后引起的细胞形态变化，判断有无细胞凋亡或细胞坏死的形态学特征，必要时拍照，继而每孔加入20μL MTT溶液(用0.01M的PBS液配制的5mg/mL的MTT溶液)，继续置于37℃培养箱中培养4h。2000r/min离心10min，吸弃孔内培养上清液。每孔加150μL DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解，利用酶标仪在570nm处测定每孔溶液的OD值。取平均OD值，按如下公式计算不同浓度样品对细胞增殖的抑制率：抑制率％＝(OD_空白对照-OD_样品)/OD_空白对照×100％。相同试验分别独立进行三次，求算不同浓度样品对细胞增殖的平均抑制率，再利用Bliss法计算化合物的半数抑制浓度IC₅₀。

实验结果：见表2。

表2化合物I～V对K562细胞增殖的抑制活性

表2中所示测试结果表明，本发明化合物I～V在所试浓度范围内对K562细胞的增殖具有不同程度的抑制活性。

结论：

本发明化合物I、IV和V对PC12细胞的缺氧损伤具有显著的保护作用，同时本发明化合物I～V对人白血病K562细胞还有明显抗肿瘤活性。因此，本发明的上述化合物可作为抗缺氧、抗肿瘤的活性成分用于制备抗缺氧或抗肿瘤药物以及抗缺氧保健品等功能性食品。

Claims (3)

1.没食子酰基葡萄糖类的化合物I 1-O-没食子酰基-β-D-葡萄吡喃糖、化合物II 1，6-二-O-没食子酰基-β-D-葡萄吡喃糖、化合物III1，4-二-O-没食子酰基-β-D-葡萄吡喃糖、化合物IV 1，4，6-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄吡喃糖和化合物V  1，3，4，6-四-O-没食子酰基-β-D-葡萄吡喃糖，或其药学上可接受的盐类作为活性成分用于制备抗白血病药物的用途。

2.没食子酰基葡萄糖类化合物I 1-O-没食子酰基-β-D-葡萄吡喃糖、化合物IV 1，4，6-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄吡喃糖和化合物V1，3，4，6-四-O-没食子酰基-β-D-葡萄吡喃糖，或其药学上可接受的盐类作为活性成分用于制备抗缺氧药物或抗缺氧保健品的用途。

3.权利要求1所述化合物I、II、III、IV、V的制备方法，该方法包括以下步骤：

取南酸枣的干燥树皮3.2kg粉碎后用市售医用95％v/v乙醇室温浸提，每次用乙醇25升浸泡7天，共提4次，合并提取液，减压浓缩干燥，得乙醇提取物750g；该乙醇提取物750g悬浮于3升水中，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各种溶剂每次用3升，分别各萃取4次，合并相同萃取液，减压浓缩干燥，得到氯仿萃取物60g、乙酸乙酯萃取物310g、正丁醇萃取物300g和水层残留物80g；

将上述南酸枣的正丁醇萃取物300g用适量甲醇溶解，加适量大孔树脂AB-8吸附、干燥，上大孔树脂AB-8柱，用不同体积比的水-乙醇梯度洗脱，根据薄层检测结果收集合并洗脱液，减压浓缩干燥，依洗脱流出顺序得两个水洗组分20g的B-1、38g的B-2和共计230g的若干后续流出含水乙醇洗脱组分；

20g的组分B-1用适量水溶解，直接上Sephadex LH-20凝胶柱，用不同体积比的水-乙醇梯度洗脱，根据薄层检测结果收集合并洗脱液，减压浓缩干燥，得五个组分：13g的水洗脱部分B-1-1、1.1g的水洗脱部分B-1-2、1.4g的水-乙醇80∶20洗脱部分B-1-3、0.25g的水-乙醇60∶40洗脱部分B-1-4、0.8g的水-乙醇30∶70洗脱部分B-1-5、3.2g的乙醇洗脱部分B-1-6；0.8g的B-1-5用适量体积百分数70％的甲醇水溶解，添加到用相同体积百分数70％甲醇水装填的Sephadex LH-20柱上，并用体积百分数70％的甲醇水洗脱精制，得到35mg化合物I；

38g的组分B-2用适量甲醇溶解，加适量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱，用不同体积比的水-丙酮梯度洗脱，根据薄层检测结果合并所收集的洗脱液，减压浓缩，得八个组分：10g的水洗脱部分B-2-1、2g的水洗脱部分B-2-2、1.5g的水-丙酮9∶1洗脱部分B-2-3、1.7g的水-丙酮9∶1洗脱部分B-2-4、2g的水-丙酮9∶1洗脱部分B-2-5、5g的水-丙酮7∶3洗脱部分B-2-6、5g的水-丙酮5∶5洗脱部分B-2-7和5g的丙酮洗脱部分B-2-8；2g的组分B-2-5用适量甲醇溶解，加适量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱，用不同体积比的乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集洗脱液并根据薄层检测结果合并，减压浓缩干燥，得1g的乙酸乙酯-甲醇6∶1洗脱部分B-2-5-1、0.6g的乙酸乙酯-甲醇4∶1洗脱部分B-2-5-2和0.4g的乙酸乙酯-甲醇2∶1洗脱部分B-2-5-3；1g的B-2-5-1用适量体积比70∶30的甲醇-水溶解，直接上Sephadex LH-20柱，用相同体积比70∶30的甲醇-水溶剂洗脱，收集洗脱液并根据薄层检测结果合并含化合物V的洗脱组分，减压浓缩并经甲醇中重结晶精制，得270mg的白色针晶化合物II；

0.6g的B-2-5-2用适量甲醇溶解，加适量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱，用体积比20∶10的乙酸乙酯-甲醇洗脱，根据薄层检测结果收集洗脱液，减压浓缩干燥，依洗脱流出先后顺序分为350mg的B-2-5-2-1和200mg的B-2-5-2-2两个组分；200mg的B-2-5-2-2用适量甲醇溶解，加适量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱，用体积比4∶1的乙酸乙酯-甲醇洗脱，根据薄层检测结果收集含化合物III的洗脱液，减压浓缩干燥，再次同法用相同聚酰胺柱层析分离，收集含化合物III的洗脱组分，减压浓缩干燥，并经甲醇中重结晶精制，得27mg的结晶型粉末化合物III；

将上述的南酸枣的乙酸乙酯萃取物100g用适量甲醇溶解，加适量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱，用不同体积比的乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集洗脱液并根据薄层检测结果合并，减压浓缩干燥，得到四个层析粗组分：4g的乙酸乙酯洗脱部分E-1、35g的乙酸乙酯-甲醇9∶1洗脱部分E-2、25g的乙酸乙酯-甲醇1∶1洗脱部分E-3和15g的甲醇洗脱部分E-4；

15g的E-4用适量甲醇溶解，加入2倍量聚酰胺吸附、干燥，进行聚酰胺柱层析用氯仿-甲醇溶剂系统梯度洗脱，收集洗脱液并根据薄层检测结果合并，减压浓缩干燥，得到2个组分，2.0g的V氯仿∶V甲醇＝1∶1洗脱部分E-4-1和12.0g的甲醇洗脱部分E-4-2；12.0g的E-4-2用适量体积百分数90％的甲醇水溶解进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，用相同体积百分数90％的甲醇水洗脱，收集洗脱液并根据薄层检测结果合并，减压浓缩干燥，得到3个组分：7.2g的E-4-2-1、2.3g的E-4-2-2和2.5g的E-4-2-3；其中，E-4-2-1用适量甲醇溶解后放置易析出结晶，经预实验选择体积比30％的甲醇水溶液进行重结晶精制，得4g的化合物IV；E-4-2-2经反复Sephadex LH-20柱层析，用体积百分数60％的甲醇水洗脱，收集含目的化合物的洗脱组分，并在甲醇中反复重结晶精制，得152mg的化合物V。